Синтез аналогов бактериального ундекапренилфосфата и ундекапренилдифосфатсахаров тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. Н.Д. ЗЕЛИНСКОГО РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

ВИННИКОВА Анна Николаевна

СИНТЕЗ АНАЛОГОВ БАКТЕРИАЛЬНОГО УНДЕКАПРЕНИЛФОСФАТА И УНДЕКАПРЕНИЛДИФОСФАТСАХАРОВ

02.00.03 - Органическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

3 О ОКТ 2014

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва — 2014

005554087

005554087

Работа выполнена в лаборатории полинепредельных соединений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института органической химии им Н.Д. Зелинского РАН и частично в университете Куинс (Queen's University, Kingston, Canada).

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор, зав. лаб.

полинепредельных соединений № 7 ФГБУН ИОХ им. Н.Д. Зелинского РАН Веселовский Владимир Всеволодович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор, главный

научный сотрудник лаборатории химии липидов ФГБУН ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Молотковский Юлиан Георгиевич

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ФГБУН ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН (г. Пущино, Московская обл.) Ивашина Татьяна Владимировна

Ведущая организация: Московский государственный университет

тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 16 декабря 2014 г в И— на заседании Диссертационного совета Д 002.222.01 по химическим наукам при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН по адресу: 119991 Москва, Ленинский проспект, 47.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОХ РАН.

Автореферат разослан 20 октября 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета ИОХ РАН,

доктор химических наук -у Людмила Александровна Родиновская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность_проблемы. Ундекапренилфосфат (УФОС) 1 и

ундекапренилдифосфатсахара (УДФС) 2 представляют собой уникальные природные соединения, которые принимают участие в биосинтезе ряда углеводсодержащих биополимеров, в число которых входят О-специфические полисахариды (О-антигены) грамотрицательных бактерий, где УФОС играет ключевую роль в инициировании сборки углеводной цепи, а УДФС участвуют в продолжении ее построения.

О 1:11 = 0-;

-о-р-я о

О- 2:Я= 0-Р-[8и§]п

О"

Бщ = моносахаридный остаток Тонкая структура О-антигенов определяет специфичность взаимодействия бактерии с другими биологическими системами, в том числе специфичность иммунного ответа высших животных и человека на инфекцию. Изучение их биосинтеза имеет первостепенное значение для поиска способов преодоления приобретенной резистентности штаммов болезнетворных грамотрицательных бактерий к известным антибиотикам. Вместе с тем изучение процессов с участием соединений 1 и 2 ограничено сложностью их выделения из природных объектов, в которых, к тому же, они содержатся в малых концентрациях. Преодолеть это препятствие оказалось возможным только посредством разработки эффективных методов синтеза биологически активных аналогов данных соединений. Особый интерес для изучения биохимии бактериальных УФОС и УДФС представляет использование синтетических и полусинтетических аналогов, содержащих фотоактивные метки*. Наличие последних позволяет существенно увеличить чувствительность детектирования этих соединений и продуктов реакций с их участием при анализе методами ВЭЖХ и ТСХ.

Цель работы. Целью настоящей работы является синтез аналогов бактериальных УФОС и УДФС, содержащих фотоактивные группы на со-конце липидной цепи и изучение их субстратных свойств в модельных реакциях сборки О-антигенов ряда грамотрицательных бактерий.

* В понятие «фотоактивные» метки здесь и далее автор включает флуоресцентные и хромофорные группы атомов.

Л

V «V

Научная новизна н практическая ценность работы. Был осуществлен синтез новых аналогов УФОС и УДФС, содержащих в липидной части молекул фотоактивные группировки, и было показано, что эти соединения являются субстратами гликозилтрансфераз ряда грамотрицательных бактерий в иницировании сборки и наращивании цепи О-антигенов. Так, реализована оригинальная восьмистадийная трансформация доступной смеси растительных полипренолов в аналог УФОС с феноксигруппой на со-конце изопреноидной цепи. Разработан и осуществлен синтез ранее неизвестных флуоресцентных неизопреноидных аналогов бактериальных УФОС и УДФС - 11-[(9'-антраценил)метокси]ундецилфосфата, 11-[(9'-антраценилкарбонил)амино]унде-цилфосфат, Р'-{ 11-[(9'-антраценил)метокси]ундецил}-Р^-(а-1)-галактопиранозил)дифосфа-та и Р'-{ 11-[(9'-антраценил)метокси]ундецил}-Р2-(2-ацетамидо-2-дезокси-а-£>-галакто-пиранозил)дифосфат. Получены четыре новых флуоресцентных пирофосфатных соединения с различной протяженностью липофильной части: />/-{16-[(9'-антраце-нил)окси]гексадецил} -, Р'-{11 -[(9' -антраценил)окси]ундецил} -, Р'-{ 6-[(9'-антраценил)-окси]гексил}- и /,;-[2-(9'-антраценил)этил]-/>г-(а-£)-галактопиранозил)дифосфаты. С помощью этих соединений впервые показано влияние длины углеводородной цепи на акцепторные свойства неизопреноидных флуоресцентных аналогов бактериальной ундекапренилдифосфатгалактозы в ферментативной реакции построения О-специфического полисахарида Salmonella newport. С практической точки зрения, использование синтезированных флуоресцентных аналогов УФОС и УДФС позволяет отказаться от применения дорогостоящих и неэкологичных радиоактивных соединений при исследованиях метаболизма грамотрицательных бактерий, имеющих первостепенное значение для поиска способов преодоления приобретенной устойчивости к известным антибиотикам и создания новых антибактериальных препаратов.

Апробация работы. Основные результаты исследований представлены на V Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2009), 8th National Symposium recent Advances in Carbohydrate Science (Banff Alberta, Canada, 2012), 5th Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates (Suzdal, Russia, 2012) и на II Всероссийской конференции «Фундаментальная гликобиология» (Саратов, 2014).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы б научных статей в отечественных и зарубежных рецензируемых журналах и тезисы 5 стендовых и устных докладов на конференциях.

Объем диссертации н ее структура. Диссертация изложена на 98 страницах и состоит из введения, обзора литературы на тему "Синтез линейных изопреноидов, содержащих фотоактивные метки", обсуждения результатов собственных экспериментальных исследований, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 124 наименования.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

К началу настоящей работы ассортимент доступных для биохимических исследований аналогов бактериальных УФОС и УДФС ограничивался фосфатами и дифосфатами изопреноидной природы, а также используемыми с недавних пор 11-феноксиундецилфосфатом и его фосфогликозилированными производными. Очевидным достоинством феноксиундецильных аналогов ундекапренилфосфата и ундекапренилдифосфатсахаров является их химическая стабильность, а также наличие в молекулах хромофорной феноксигруппы, которая позволяет детектировать содержащие ее соединения в специфической области УФ-поглощения.

В настоящей работе, с целью расширения ассортимента и повышения функциональности синтетических аналогов бактериальных ундекапренилфосфата и ундекапренилдифосфатсахаров были получены новые липидфосфаты и липиддифосфатмоносахариды с хромофорными, а также флуорофорными группировками. Наличие последних в еще большей степени повышает чувствительность детектирования содержащих их соединений. Продемонстрирована их биологическая активность по отношению к гликозилтрансферазам ряда грамотрицательных бактерий.

1. Синтез аналога бактериального ундекапренилфосфата, содержащего феноксигруппу на со-конце олигоизопреновон цепи.

В качестве исходного соединения для синтеза целевых фосфатов 3 (схема 1) был использован морапренол (4) — нативная смесь полипренолов из листьев шелковицы Morus

nigra, одним из основных компонентов которой является умдекапренол*. Согласно выбранному плану синтеза на первой стадии исходные полипренолы 4 превращали в ацетаты 5. Их двухстадийная трансформация через стадию бромгидринов 6 в терминальные эпоксиды 7 по ван Тамелену оказалась препаративно приемлемой и дала искомый продукт 7 с суммарным выходом ~35%. Окислительная деградация последнего под действием HI04"2H20 гладко привела к альдегидоацетатам 8, селективно восстановленным в гидроксиацетаты 9. Их трансформация в феноксиацетаты 10, которые далее гидролизовали в соответствующие спирты 11, осуществлялась посредством одного из вариантов реакции Мицунобу с последующим мягким гидролизом полученной в результате смеси феноксиацетатов 10.

Схема 1

Реагенты и условия: a. AciO, Ру, 20 °С (-100%); Ъ. NBS, aq. THF, 20 °С (55%); с. К2СОз, PhH-MeOH, 20 °С (62%); d. НЮ4-2Н20, Et20-THF, 20 °С (98%); е. NaBH4, DME, 20 °С (60%);/ PhOH, DEAD, РЬзР, THF, 0->20 °С (44%); g. К2СО3, PhH-MeOH, 20 °С (66%); h. 1) CCI3CN, BU4NH2PO4, CH2CI2, 20 °С, 2) Dowex 50 W><8 (NH4+), Bu'OMe-MeOH, 3) хроматография на DEAE-целлюлозе DE-52(OAc"), NH4OAc, MeOH (49%).

Полученные в итоге семи рассмотренных стадий с суммарным выходом ~6% феноксиспирты 11 далее подвергались фосфорилированию. Для этой цели была использована хорошо себя зарекомендовавшая для фосфорилирования полипренолов

' Растительный ундекапренол WT3C7OH имеет отличия в структуре от бактериального WT2C8OH, где «W» — ш-концевое изопреновое звено олигоизопреновой цепи, а «Т» и «С» — внутренние транс-и i/ыс-изопреновые звенья соответственно

система реагентов CCI3CN-B114NH2PO4. Фосфаты 3 получали в виде аммониевых солей после обмена на катион аммония катиона в продукте фосфорилирования на смоле Dowex 50 W><8 (NH4+), последующей анионообменной хроматографией на DEAE-целлюлозе (АсО") с элюированием раствором AcONH4 в МеОН и удаления избытка АсОЫШ во фракциях его осаждением толуолом.

Строение неизвестных ранее соединений 3, 5 - 11 подтверждено совокупностью физико-химических данных. В их спектрах ЯМР 'Н и 13С присутствуют сигналы, характерные для линейных олигоизопреноидов, содержащих (£)- и (2)-изопреновые фрагменты; имеются также сигналы, отвечающие функциональным группам, находящимся в со- и а-звеньях цепи. В ЯМР 31Р обнаруживался синглет фосфатной группы синтезированного соединения. Данные ИК-спектров соответствуют структуре описываемых соединений. Фосфаты 3 - охарактеризованы также масс-спектром, полученным при ионизации электрораспылением (electrospray ionisation, ESI), в котором содержатся пики молекулярных ионов олигомергомологов, причем их интенсивность соответствует их содержанию в полученном продукте.

Биологическую активность фосфатов 3 исследовали в реакции инициирования сборки повторяющегося звена О-антигенных полисахаридов, катализируемой UDPGlcNAc : полипренилфосфат-ИсЫАс-фосфотрансферазой цитоплазматических мембран грамотрицательных бактерий S. arizona серогруппа 0:59 и Aeromonas hydrophila АН-1 с использованием радиоактивного уридиндифосфат-М-ацетилглюкозамина

(UDP[I'lC]GIcNAc) в качестве донора моносахарида [14C]GlcNAc (схема 2). В контрольных экспериментах субстратом-акцептором служил морапренилфосфат.

Схема 2

Продукты ферментативных реакций анализировали методом ТСХ (8102) с применением метода жидкостного сцинциляционного счета радиоактивности. В экспериментах с обоими указанными выше биологическими объектами найдено, что оснавная радиоактивность полученных продуктов обнаруживается на пластинах ТСХ в

О' сг

области с Яг 0.2 (рис. 1). Практически такое же значение Яг наблюдалось для синтетического образца морапрепилдифосфат-а-О-глюкозы, полученного ранее.

Из сравнения уровня радиоактивности продуктов реакции с участием морапренилфосфата с таковым при использовании фосфатов 3 в качестве субстрата-акцептора следует, что относительная эффективность процесса в последнем случае ниже и составляет, соответственно, ~50 % и ~66 % от контроля для ферментов 5. апгопа и А. ИуФоркИа АН-1.

ИМП-МИН"' а ИМП-МПН-1 А

Рис. 1. Распределение радиоактивности (импмин"1) на хроматограмме продуктов ферментативной реакции с участием фосфата морапренола (1) фосфатов 3 (2), ШР-[14С]С1сЫАс и препарата мембран клеток А. НусЬ-оркИа АН-1 (а) и ап:опа серогруппа 0:59 (6).

Наблюдаемый уровень активности фосфатов 3 является приемлемым для их использования в модельных системах при изучении подобных ферментативных процессов, а наличие в их молекулах феноксигруппы позволяет детектировать содержащие ее соединения, в том числе продукты биохимических реакций по специфическому поглощению ароматического ядра в УФ-области.

2. Синтез флуоресцентных аналогов бактериального ундекапренилфосфата.

Ранее, учеными ИОХ РАН было обнаружено, что 11-(фенокси)ундецилфосфат 12 (схема 3) может участвовать в реакции инициирования сборки О-антигена грамотрицательных бактерий 5. апгопа 0:59. В настоящей работе были получены флуоресцентные производные ундецилфосфата 13а,Ь и 14 и продемонстрирована их способность служить фосфогликозилакцепторами в ферментативных реакциях, моделирующих инициирование сборки повторяющегося звена О-антигена 5. пемрог!.

Ь:Х =Н

14: Я = О

X =N3

Для синтеза 11-[(9-антраценилкарбонил)амино]ундецилфосфатов 13а,Ь в качестве исходного вещества использовали 11-бромундеканол 15 (схема 4), Обработка последнего фталимидом калия 16 привела к К-алкилфталимиду 17, из которого в стандартных условиях был получен ТНР-эфир 18. Последний далее был превращен в амин 19 под действием гидразингидрата, который затем ввели в реакцию с 9-антраценкарбоновой кислотой 20 в присутствии Ы,>Г-дициклогексилкарбодиимида (ОСС) с образованием амида 21.

Схема 4

Реагенты и условия: а. 16, ОМИ, 80 °С (60%); Ь. РРТЭ, ОНР, СНгСЬ, 20 °С (98 %); с. ЫзШНгО, ЕЮН, 20 °С (90%); (1. 20, ОСС, СНгСЬ, 20 °С (50 %); е. ТзОНШО, МеОН, 20 °С (53 %); / 1) ССЬСЫ, ВшЫНгРОд, (СН2С1)2, 20 °С; 2) ЫаОН (води, р-р), 20 °С; 3) НС1 (водн. р-р), 20 °С (41 %)•

Полученный после удаления ТНР-защиты спирт 22 фосфорилировали по стандартной методике с использованием избытков дигидрофосфата тетрабутиламмония и трихлорацетонитрила. Строение натриевой соли 13а, полученной после обработки

щелочным раствором продуктов реакции фосфорилирования, подтверждено данными ИК-и УФ-спектроскопии и масс-спектрометрии. Так, в УФ-спектре соединения 13а наблюдались максимумы поглощения (А.тах 250 и 360 нм), подтверждающие наличие антраценильной группы. Следует отметить, что чрезвычайно низкая растворимость этого соединения в воде и органических растворителях не позволила получить его ЯМР. Это обстоятельство послужило также препятствием для использования фосфата 13а в биохимических экспериментах. Подкисление суспензии фосфата 13а в воде до рН ~ 0 привело к более растворимому дигидрофосфату 13Ь. Строение ранее неизвестных соединений 13Ь, 17—19, 21 и 22 подтверждено совокупностью данных ЯМР-, ИК- и масс-спектрометрии.

Исходным соединением для синтеза 11-[(9'-антраценил)метокси]ундецилфосфата 14 послужил ундец-10-ен-1-ол 23 (схема 5). Реакция его алкоголята с 9-(хлорметил)антраценом 24 в присутствии каталитических количеств BmNI дала простой эфир 25, содержащий терминальную двойную связь. Гидроборирование последней с помощью генерируемого in situ BFh'THF и последующее окисление промежуточных борсодержащих соединений Н2О2 в присутствии NaOAc привело к спирту 26. Его фосфорилирование двумя эквивалентами смеси РОСЬ и Et3N с последующим гидролизом промежуточно образующегося фосфодихлорида водным раствором NaOH привело к образованию динатриевой соли 14 с общим выходом на три стадии 34 %.

Реагенты и условия: а. 24, NaH, B114NI, DMF, 20 °С (83%); b. 1) NaBH4, ВРз ШгО, THF, 20 °C; 2) H2O2, NaOAc, 20 °C (55 %); с. 1) РОСЬ, Et3N, THF, 20 °C; 2) NaOH (водн. p-p), 20 °C (75 %).

Схема 5

HO

b

Строение неизвестных ранее соединений 14, 23, 25 и 26 подтверждено совокупностью методов ЯМР и масс-спектрометрии. Так, в УФ-спектре целевого фосфата 14 наблюдались максимумы поглощения (Lis 250 и 360 нм) антраценильной группы.

Способность синтезированных фосфатов 13Ь и 14 служить акцепторами галактозилфосфатного остатка уридиндифосфатгалактозы (UDP-Gal) под действием галактозилфосфотрансферазы (GalP-T) из клеточных мембран S. newport определялась в ферментативной реакции с радиоактивной UDP-[14C]Gal в качестве донора остатка гликозилфосфата (схема 6). Фосфат 13Ь вводили в инкубационную смесь, содержащую препарат мембран из клеток S. newport и радиоактивную UDP-[14C]Gal. После проведения инкубации смесь хроматографировали на картридже с обращенной фазой С18 (ДиаПак). Водорастворимые компоненты, включая непрореагировавший нуклеотидсахар, элюировали водой, а липидсодержащие компоненты, в том числе ожидаемый продукт ферментативной реакции 27, - метанолом. Фракции элюатов анализировали методом ТСХ на пластинках SiCh.

Схема 6

l!DP-[IJClGal

131), 14

13b, 27: R = TIN.

ОЮ.Х;

GalP-T(S. newport)

13b: X = H

14: X =Na

27,28

О О

-P-0-P-0-[l4C]Gal

14,28: R = O.

У фракций метанольного элюата наблюдалась зона с характерной хроматографической подвижностью, отличной от таковой исходного фосфата 13Ь. Эта зона была также радиоактивной, что соответствовало наличию в продукте реакции остатка фосфата радиоактивной галактозы, а также флуоресцировала при облучении пластинки УФ-светом с длиной волны 360 нм, что указывало на присутствие в нем антраценильной группы. Ферментативная реакция с участием фосфата 14, приводящая к гликозилдифосфату 28, была проведена аналогично.

3. Синтез неизопреноидных флуоресцентных аналогов бактериальных ундекапреннлдифоефатсахаров.

Следующий этап настоящего исследования состоял в синтезе новых неизопреноидных аналогов бактериальных УДФС, содержащих флуорофорные

группировки, которые, как указывалось выше, перспективны в качестве инструментов для изучения процесса биосинтеза повторяющихся звеньев О-антигенов. Для получения первых двух из них - />|-{11-[(9'-антраценил)метокси]ундецил}-Р2-(а-£)-галактопиранозил)дифосфата 29 и Р'-{11-[(9'-антраценил)метокси]ундецил}-Р2-(2-ацетамидо-2-дезокси-а-£>-галактопиранозил)дифосфата 30 (схема 7) - была использована упомянутая выше динатриевая соль фосфата 14.

Схема 7

В первом случае, полученный из нее кислый фосфат 31 (схема 8), переводили в триэтиламмониевую соль, обрабатывали избытком ЛуУ-карбонилдиимидазола (CDI) и образующийся при этом in situ соответствующий имидазолид 32 вводили в конденсацию с бис-триэтиламмониевой солью a-D-галактопиранозилфосфата 33 в смеси THF и DMSO.

Схема 8

Реагенты и условия: а. НС1 (вода, р-р), 20 °С; Ъ. 1) Е1зЫ для 29, для 30) 20 °С; 2)

С01, ТНР, 20 °С; 3) МеОН, 20 °С; с. 33, ТНР-ОМЗО, 37 °С (15 %); й. 34, ТНР, 37 °С; е. МеОНа, МеОН, 20 °С (25 %).

Для выделения образовавшегося дифосфата 29 реакционную смесь разбавляли МеОН и фракционировали на колонке с DEAE-целлюлозой DE-52 (АсО~-форма), элюируя вещества ступенчатым градиентом ацетата аммония в метаноле. Состав фракций анализировали методом ТСХ. Фракции, содержащие ожидаемый продукт 29, объединяли, концентрировали и хроматографировали ступенчатым градиентом МеОН в воде, выделяя индивидуальный гликозилдифосфат 29 с выходом 15% в виде аммониевой соли. Строение полученного соединения 29 подтверждено масс-спектром высокого разрешения и данными спектров ЯМР.

Синтез 11-[(9'-антраценил)метокси]ундецил}-/,2-(2-ацетамидо-2-дезокси-а-£>-

галактопиранозил)дифосфата 30 проводили аналогично, конденсацией имидазолида 32 с бис-диизопропиламмониевой солью 3,4,6-три-0-ацетил-2-ацетамидо-2-дезокси-а-0-галактопиранозилфосфата 34 (схема 8). Промежуточный ацетат выделяли хроматографией на колонке с гелем (Sephadex-G15) и обрабатывали метилатом натрия для удаления защитных ацетильных групп. Целевой дифосфат 30 выделяли с выходом 25 % на колонке с обращенной фазой С18 (SepPak) в виде динатриевой соли.

Строение флуоресцентного соединения 30 подтверждено данными ЯМР-и масс-спектрометрии. Максимум спектра поглощения для производного 30 был зафиксирован при 247 нм, а флуоресценции - при 415 нм.

Способность синтетических флуоресцентных аналогов УДФС 29 и 30 служить субстратами-акцепторами соответствующих гликозилтрансфераз исследовали в модельных реакциях сборки О-антигенов ряда грамотрицательных микроорганизмов. В частности, активность соединения 29 изучали в ферментативной реакции переноса остатка маннозы, катализируемой маннозилтрансферазой (Man-Т) из S. newport (схема 9).

Схема 9

ОгМфДю-kc* GDP-["C1Man %Г0^0-?-0-?-0-Са,.[-С]Ма„

|П V /9 ¿. ¿. Man-T {S. псм-роп) ° 0

10 29 ^ Na+ U 35

Так, дифосфат 29 вводили в инкубационную смесь, содержащую препарат мембран из клеток 5. newport и радиоактивную гуанидиндифосфатманнозу (GDP-[14C]Man). После проведения инкубации, коагуляции белка и осаждения коагулята центрифугированием

супернатант фракционировали на картридже С18 (ДиаПак). Водорастворимые компоненты, включая непрореагировавший нуклеозиддифосфатсахар, элюировали водой, а липидсодержащие компоненты, в том числе ожидаемые продукты ферментативной реакции дифосфат 35, - метанолом. Фракции элюатов анализировали методом ТСХ. При этом, как это обычно наблюдается в подобных случаях, дисахарид 35 имел меньшую хроматографическую подвижность по сравнению с исходным моносахаридом 29. Соответствующая продукту зона была радиоактивной, что указывало на присутствие остатка радиоактивной маннозы, и так же, как и исходное соединение 29, обладала голубой флуоресценцией при облучении пластинки УФ с длиной волны 365 нм, что отвечало наличию в продукте реакции антраценильной группы. Совокупность этих данных подтверждает образование в изучаемой ферментативной реакции дисахаридцифосфата 35.

Для изучения субстратных свойств производного 30 использовали ферментные препараты, которые содержали трансферазы, продуцируемые бактериями Е. coli BL21 с внедренными в них клонированными генами wbdN (Е. coli 0157) или wbwC {Е. coli 05). Так, дифосфат 30 вводили ферментативные реакции с радиоактивной или нерадиактивной уридиндифосфатглюкозой (UDP-Glc), катализируемые глюкозилтрансферазой (GIc-T) WbdN из £ coli Ol 57 (схема 10).

Схема 10

После проведения инкубации реакционную смесь наносили на картридж С18 (SepPak) и фракционировали, как в случае продуктов ферментативной реакции дифосфата 29. Метанольные фракции, содержащие радиоактивность, концентрировали в вакууме и анализировали ВЭЖХ на обращенной фазе RP-18 (УФ-детектор, 247 нм), собирая фракции

по 1 мл. При этом было зафиксировано два пика с временами удержания 26 и 38 мин, причем последний соответствовал исходному дифосфату 30 (рис. 2а, линия А247). В полученных фракциях измеряли радиоактивность (рис. 2, линия СРМ) и флуоресценцию При 415 НМ (ЛИНИЯ р415).

В результате было установлено, что для фракций, содержащих продукт с временем удерживания 26 мин наблюдается совпадение максимального уровня радиоактивности и максимального значение флуоресценции, что однозначно свидетельствует о протекании желаемой ферментативной реакции с образованием ожидаемого производного дисахарида 36.

В экспериментах с нерадиоактивным углеводным донором (1ГОР-01с), дифосфат 36 выделяли препаративно и характеризовали масс-спектром высокого разрешения.

Fui

37

А

| 4

I Í I i

f 1

V и \

. | ч . , i чщ I. » ■ . I гН-'

13 г9 » « м ее llpcu« уяриашп М Bp«M улсрхша (шш>

Рис. 2 Распределение поглощения при 247 нм (А247), радиоактивности (СРМ) и флуоресценции при 415 нм (F415) во фракциях ВЭЖХ, полученных при разделении продуктов ферментативных реакций с участием гликозилдифосфата 30, катализируемых Glc-T WbdN из Е. coli 0157 (а) и Gal-T WbwC из Е. coli 05 (6).

Гликозилакцепторные свойства дифосфага 30 были также изучены в ферментативной реакции с UDP-Gal, катализируемой Gal-T WbwC из Е. coli 05 (схема 8). Образование продукта этой реакции 37 подтверждали аналогично описанному выше для дисахарида 36

(рис. 2b). Кроме того, было продемонстрировано, что соединение 30 также является субстратом-акцептором Gal-T WbwC из Е. coli 0104.

Таким образом, впервые синтезированные неизопреноидные флуоресцентные аналоги бактериальных УДФС 29 и 30 оказались активными в модельных ферментативных реакциях сборки О-антигенов ряда грамотрицательных бактерий и могут служить инструментами для изучения деталей метаболизма этих микроорганизмов.

На заключительном этапе, было проведено исследование, направленное на оптимизацию структурных параметров неизопреноидных аналогов ундекапренилдифосфатгалактозы 38 и, в частности, размеров их липофильной части, он /ОН

\ 1 о о он

о—у—о—Р—о-о- О"

38

Для этой цели был осуществлен синтез четырех новых флуоресцентных аналогов 39-42 гликозилдифосфата 38 с разной протяженностью липофильного фрагмента (схема 11) и проведено сравнение их эффективности в качестве гликозилакцепторов в ферментативной реакции, катализируемой Мап-Т из 5. пем>рог1.

Схема 11

он -он

но

он

39-42

О О

■ J1 II

О-Р—О—Р—OR

О" О"

2NH4+

R-OPO3-' 43-46

R-OH 47-50

39,43,47:п = |;Х = -СНГ; 40,44, 48: п = 6: X =-0-СН2-: 41,45,49: n = 11; X =-О-: 42,46,50: n = 16; X = -О-

Синтез галактозилдифосфатов 39-42 осуществляли по общей схеме фосфогалактозилированием фосфоэфиров 43-46 соответствующих спиртов 47-50. Так, 2-(9-Антраценилокси)этанол 47 был получен, исходя из 9-(хлорметил)антрацен 24.

Последний конденсировали с цианидом натрия и образующийся нитрил 51 последовательным действием DIBAH и NaBH4 восстанавливали до целевого спирта 47. Неизвестные ранее спирты 48-50 были получены на основе доступных предшественников (схема 12). Для синтеза 6-(9'-антраценилметокси)гексан-1-ола 48 был использован коммерчески доступный гекс-5-ен-1-ол 52, алкоголят которого конденсировали с 9-(хлорметил)антраценом 24 в присутствии каталитического количества BiuNI с образованием 6-(9'-антраценилметокси)гекс-1-ена 53. Гидроборирование последнего, генерируемым in situ ВНз, и последующее окисление промежуточных борсодержащих соединений Н2О2 дало целевой спирт 48 с общим выходом на две стадии 62 %.

Схема 12

а b R_____ _

R Cl -- R CN -- ^„OH

24 51

47

52 53 3 48 ''

R-OCHj --—

56

OH

49,55, 60: n = 9 50,59,61: n = 14

Реагенты и условия: a. 1) NaCN, DMF, 20°C; 2) 3M aq. NaOH, 20°C (77 %); b. 1) DIBAH, THF, -10°C—»20°C; 2) NaBH4, THF, -10°C->20°C (31%); с. 1) 51, NaH, BiuNI, THF, 20°C, (85%); d. 1) NaBH4, BF3-Et20, 20°C; 2) 3M aq. NaOAc, 30% aq. H2O2, (73% для 49, 31% для 50); е. 54, TsOMe, PhH, 80°C, (56%);/ 1) 58, BiuNBr, 48% aq. КОН, РЬСНз, кипячение; 2) 30% aq. HC1, (38% для 60, 61% для 61); g. 1) NaBH4, BF3-Et20, 20°C; 2) H2O, (82% для 49, 86% для 50).

Синтез 11-(9'-антраценилокси)ундекан-1-ола 49 был осуществлен двумя альтернативными способами из доступных ундец-10-ен-1-ола 54 и 11-бромундекановой кислоты 55. В первом случае гидроксиолефин 54 использовали для переалкилирования 9-

(метокси)антрацена 56, катализируемого TsOMe. Продукт реакции - терминальный олефин 57 - превращали в целевой спирт 49 аналогично описанной выше процедуре гидроборирования-окисления. По альтернативной схеме алкилирование бромкислоты 55 антроном 58 в присутствии щелочи и каталитического количества BiuNBr привело к образованию 11-(9'-антраценилокси)ундекановой кислоты 60, которую затем восстанавливали в спирт 49 полученным in situ комплексом ВШ-THF. 16-(9'-Антраценилокси)гексадекан-1-ол 50 получали аналогично, исходя из коммерчески также доступной 16-бромгексадекановой кислоты 59 через стадию образования 16-(9'-антраценилокси)гексадекановой кислоты 61.

Спирты 47-50 фосфорилировали избытком РОСЬ в присутствии Et3N с последующим щелочным гидролизом промежуточно образующихся фосфодихлоридов (схема 13). Подкислением образующихся при этом натриевых солей разбавленной соляной кислотой получены соответствующие кислые фосфаты 43-46 с выходами от 35% до 92%, которые далее вводили в пирофосфатный синтез с галактозилфосфатом.

Схема 13

47-50

43-46

39-42

62-65

62: n = I. X = -СНГ; 63: п =6. X = -ОСИ,-; 64: n = 11. X = -О-; 65: п = 16, X = -О-Реагенты и условия: а. 1) РОСЬ, NEt3, THF, 20°С; 2) 2.5 M aq. NaOH; 3) 3 % aq. HCl; b. 1) CDI, THF, 20°C; c. 1) a-D-галактопиранозилфосфата бистриэтиламониевая соль, THF, DMSO, 37 °C; 2) хроматография на DEAE-целлюлозе DE-52 (OAc"), NHîOAc, MeOH; 3) хроматография на картридже С-18 (SepPak).

Так, полученные in situ бис-триэтиламмониевые соли фосфатов 43-46 избытком CDI переводили в соответствующие имидазолиды 62-65, которые без выделения конденсировали с бис-триэтиламмониевой солью a-D-галактопиранозилфосфата в смеси THF и DMSO. Образовавшиеся целевые дифосфаты 39—42 выделяли аналогично описанному выше для />1-{11-[(9'-антраценил)метокси]ундецил}-/>2-(а-1)-галактопиранозил)дифосфата 29.

Строение неизвестных ранее соединений 39-46, 48-50, 53, 57, 60 и 61 подтверждено совокупностью физико-химических данных. В их ЯМР 'Н и |3С спектрах присутствуют сигналы, характерные для функционализированных линейных углеводородов и антраценильного фрагмента. В ЯМР 'Н спектрах галактозилпирофосфатов 39-42 четко идентифицируются сигналы галактозильного остатка. Положение полос, как в спектрах поглощения, так и флуоресценции для дифосфатов 39-42 оказалось практически одинаковым. В качестве примера на рис. 3 приведены спектры галактозилпирофосфата 39 в водном растворе (максимум поглощения X 253 нм, максимум флуоресценции X 415 нм).

Ь

D. отн. ед. 2,5

1,5

I. отн. ед. 2.5

1.5

400 500

А, НМ

450

550

650

Рис.З а - спектр поглощения дифосфата 39 (аммониевая соль), 2-10"5 М водный раствор; Ь -спектр флуоресценции дифосфата 39 (аммониевая соль), 2-Ю"5 М водный раствор.

Способность дифосфатов 39-42 служить субстратами-акцепторами маннозилтрансферазы клеточных мембран бактерий S. newport и сравнение их эффективности в этом процессе определяли в ферментативных реакциях аналогично описанному выше протоколу (для каждого в двух независимых экспериментах). Так, соединения 39-42 инкубировали с препаратом клеточных мембран S. newport, содержащем указанную трансферазу, и, в качестве углеводного донора, радиоактивную GDP-[14C]Man (схема 14). Продукты ферментативных реакций 66-69 выделяли хроматографией на обращенной фазе С18 (картриджи SepPak).

Схема 14

66: п = I. X = -СНГ: 67: п =6. X = -ОСНг: 68: п = 11. X = -О-: 69: п = 16, X = -О-

Водорастворимые компоненты, включая непрореагировавший радиоактивный нуклеозиддифосфатсахар, элюировапи водой, а липидсодержащие компоненты, в том числе, ожидаемые дифосфаты 66-69, - метанолом. Продукты реакции идентифицировали методом ТСХ по совпадению на пластинах флуоресценцирующих (365 нм) и радиоактивных зон, что обнаруживает в составе молекул этих соединений фрагменты исходных гликозилакцепторов 39-42 и меченного маннозильного остатка.

ИМП-МНН"1 1200

1000

800

600 •■

400 [

200 ■

|

0 39 40 41 42

Номер галактонплдггфосфата, участвующего в ферментативной реакции

Рис. 4. Сравнение уровней радиоактивновности липофильных продуктов биохимических реакций с участием галактозилдифосфатов 39-42 и ООР-[14С]Мап, катализируемых маннозилтрансферазой из клеток 5. печ>роП.

При сопоставлении результатов ферментативных реакций в ряду галактозилпирофосфатов 39-42, сравнением уровней радиоактивности соответствующих метанольных фракций, можно сделать вывод, что самой высокой активностью в, качестве

субстрата-акцептора маннозилтрансферазы клеточных мембран бактерий S. newport обладает соединение 42 с наибольшей протяженностью липидного фрагмента, а наименьшей - производное 39 с самым коротким липидным остатком (см. рис. 4).

Также, была проведена указанная ферментативная реакция с применением нерадиоактивной GDP-Man в качестве субстрата-донора и дифосфата 42 в качестве субстрата-акцептора с увеличением количеств ее компонентов в 30 раз по сравнению с описанным выше экспериментом. Целевой продукт 69 выделяли с помощью ВЭЖХ на обращенной фазе (RP-18) и идентифицировали масс-спектрометрией (ESI) высокого разрешения.

Выводы

1. Разработаны оригинальные методы синтеза неизвестных ранее биологически активных аналогов бактериальных УФОС и УДФС, содержащих легко детектируемые фотоактивные группировки. В их числе:

(a) полученный впервые на основе растительных полипренолов аналог бактериального УФОС, содержащий феноксигруппу на ю-конце олигоизопреновой цепи.

(b) серия новых неизопреноидных аналогов УФОС различной структуры, содержащих флуоресцентные группировки в составе их липофильных фрагментов;

(c) представители новых флуоресцентных аналогов УДФС неизопреноидной природы.

2. С использованием ферментативных систем ряда грамотрицательных бактерий показана способность вновь синтезированных соединений участвовать в инициировании (аналоги УФОС) и наращивании (аналоги УДФС) повторяющегося звена соответствующих О-антигенных полисахаридов и установлено, что эффективность синтетических субстратов-акцепторов растет с увеличением длины углеводородной цепи.

3. Показано влияние размеров липофильных фрагментов флуоресцентных аналогов ундекапренилдифосфатгалактозы на эффективность их участия в модельных ферментативных реакциях, катализируемых маннозилтрансферазой из клеток Salmonella newport.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

1. Веселовский, В. В. Аналог ундекапренилфосфата, содержащий феноксигруппу на со-конце олигоизопреновой цепи. / В.В. Веселовский, JI.JI. Данилов, А.Н. Винникова, Т.Н. Дружинина // Изв. АН. Сер.хим. - 2010. - №6. - С. 1240-1244.

2. Gao, Y. Functional identification of bacterial glucosyltransferase WbdN. / Y. Gao, A.N. Vinnikova, I. Brockhausen // Meth. Mol. Biol. - 2013. - V. 1022. - P. 199-214.

3. Vinnikova, A. N. Synthesis of a fluorescent acceptor substrate for glycosyltransferases involved in the assembly of O-antigens of enterohemorrhagic Escherichia coli 0157 and 05. / A.N. Vinnikova, T.N. Druzhinina, L.L. Danilov, N.S. Utkina, V.I. Torgov, V.V. Veselovsky, B. Liu, L. Wang, I Brockhausen // Carbohydr. Res. - 2013. - V. 366. - P. 1724.

4. Винникова, A. H. Синтез и акцепторные свойства 11-[(9'-антраценил)метокси]ундецилфосфата и Р'-{ 11-[(9'-антраценил)метокси]ундецил}-Р2-(а-О-галактопиранозил)дифосфата в ферментативных реакциях, катализируемых галактозилфосфотрансферазой и маннозилтрансферазой Salmonella newport. / А.Н. Винникова, Н.С. Уткина, Л.Л. Данилов, В.И. Торгов, Т.Н. Дружинина, В.В. Веселовский // Биоорган, химия. - 2013. - Т. 39. - № 1. - С. 99-104.

5. Данилов, Л. Л. Синтез 11-[(2-пиридил)амино]- и 11-[(9-антраценилкарбонил)-амино]ундецилфосфата и исследование их акцепторных свойств в ферментативной реакции, катализируемой галактозилтрансферазами из клеток Salmonella. / Л.Л. Данилов, Н.М. Балагурова, А.Н. Винникова, Н.С. Уткина, В.И. Торгов, Н.А. Калинчук, Т.Н. Дружинина, В.В. Веселовский // Биоорган, химия. - 2014. - Т. 40, № 1.-С. 99-107.

6. Wang, S. Characterization of two UDP-Gal: GalNAc-diphosphate-lipid pi,3-galactosyltransferases WbwC from Escherichia coli serotypes 0104 and 05. / S. Wang, D. Czuchry, B. Liu, A.N. Vinnikova, Y. Gao, J.Z. Vlahakis, W.A. Szarek, L. Wang, L. Feng, I. Brockhausen //J. Bacteriol. - 2014,-V. 196.-P. 3122-3133.

7. Винникова, A. H. Химико-ферментативный синтез фрагментов О-антигенных полисахаридов грамм-отрицательныхбактерий с использованием синтетических липидных акцепторов / А.Н. Винникова, Т.Н. Дружинина, Л.Л. Данилов, В.В.

Веселовский // V Молодежная школа-конференция с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва - 2009. - С. 101.

8. Vinnikova, А. N. P,-ll-(9-Antracenylmethoxy)undecyl, P2-acetamido-2-deoxy-a-D-galactopyra-nosyl diphosphate as an acceptor substrate analog for the study of glycosyl transferases involved in the biosynthesis of O-antigene repeating units / A.N. Vinnikova, V.I. Torgov, V.V. Veselovsky, I. Brockhausen // 8th National Symposium recent Advances in Carbohydrate Science, Banff Alberta, Canada- 2012. - P. 18.

9. Vinnikova, A. N. Synthesis and investigation of acceptor properties of 11-(9'-anthracenyl)methoxyundecyl diphosphate a-d-galactose and 2-acetamido-2-deoxy-a-d-galactose in the enzymic reactions catalyzed by glycosyl transferases from Salmonella newport and Escherichia coli / A.N. Vinnikova T.N. Druzhinina, N.C. Utkina, V.I. Torgov, L.L. Danilov, I. Brockhausen, V.V. Veselovsky // 5th Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates, Russia, Suzdal - 2012. - P. 15.

10. Utkina, N. S. Chemical synthesis of fluorescent undecyl phosphate derivatives and assay of their acceptor properties in the enzymic reactions catalyzed by galactosylphosphotransferases from S. anatum and S. newport / N.S. Utkina, T.N. Druzhinina, A.N. Vinnikova, K.A. Demirova, V.I. Torgov, N.A. Kalinchuk, L.L. Danilov, V.V. Veselovsky // 5th Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates, Russia, Suzdal - 2012. -P. 15.

П.Винникова, A. H. Синтез аналогов бактериальной ундекапренилдифосфогалактозы, содержащих флуоресцентную метку / А.Н. Винникова, К.А. Демирова, Т.Н. Дружинина, В.В. Веселовский // II Всероссийская конференция «Фундаментальная гликобиология», Саратов - 2012. - С. 24.

Подписано в печать: 10.10.2014 Объем: 0,8 п.л. Тираж: 80 экз. Заказ № 2023 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, Мясницкие Ворота д. 1, стр. 3 (495)971-22-77; www.reglet.ru