Новый подход к синтезу 21-азотсодержащих стероидных производных тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ
|
Стулов, Сергей Владимирович
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2013
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.10
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
На правах рукописи
СТУЛОВ Сергей Владимирович
НОВЫЙ ПОДХОД К СИНТЕЗУ 21-АЗОТСОДЕРЖАЩИХ СТЕРОИДНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ
02.00.10 - биоорганическая химия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
11 ОКТ 2013
Москва-2013
005536294
Работа выполнена в лаборатории Синтеза физиологически активных соединений Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича» Российской академии медицинских наук.
Научный руководитель:
Официальные оппоненты:
Ведущая организация:
Мишарин Александр Юрьевич
кандидат химических наук
доктор биологических наук, профессор
Степанов Александр Евгеньевич
доктор химических наук, профессор, вед. науч. сотр. Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В .Ломоносова" (ФГБОУ ВПО МИТХТ)
Левина Инна Соломоновна
доктор химических наук, вед. науч. сотр. Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского Российской академии наук (ИОХ РАН)
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологически активных веществ Российской академии наук (ИФАВ РАН)
Защита состоится «25» ноября 2013 г. в /6 часов ЗсРминут на заседании диссертационного совета Д 212.120.01 при Московском государственном университете тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова по адресу 119571, Москва, пр. Вернадского, 86.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу 119571, Москва, пр. Вернадского, 86.
Автореферат разослан октября 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук, старший научный сотрудник
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Направленная химическая модификация стероидной молекулы является одним из наиболее эффективных и плодотворных подходов к созданию новых биологически активных соединений. Синтетические стероидные производные были и остаются в настоящее время важнейшим инструментом для фундаментальных исследований в различных областях биохимии, медицинской химии, эндокринологии, клеточной и молекулярной биологии, а также основой для разработки новых лекарственных препаратов. Успехи в рациональном дизайне и результаты биологических испытаний свидетельствуют, что для новых стероидных производных можно предсказать наиболее вероятные биологические мишени, а успешный поиск новых соединений с заданной биологической активностью целесообразно проводить среди соединений, обладающих определенными структурными особенностями.
Стероидные производные, модифицированные азотсодержащими заместителями в кольце О, являются эффективными и специфичными ингибиторами важнейших ферментов из семейства цитохромов Р450; агонистами, антагонистами и модуляторами стероидных рецепторов; регуляторами сигнальных процессов. Соединения этого ряда обладают высоким фармакологическим потенциалом, некоторые уже используются в практической медицине, как средства для лечения андроген-зависимых онкологических заболеваний, а также как лекарственные препараты с противовирусной, противогрибковой, анти-бактериальной и антипаразитарной активностью.
В настоящее время химический синтез стероидных производных с азотсодержащими заместителями в кольце Б представляет собой обширную и хорошо разработанную область. Тем не менее, прогресс в этой области во многом сдерживается сложностью, трудоемкостью и высокой стоимостью существующих методов. Очевидно, что поиск новых синтетических схем, разработка эффективных экспериментальных методик и направленный синтез новых стероидных производных с азотсодержащими заместителями в кольце Б являются важной и актуальной задачей.
Цель и задачи работы. Цель работы - создание оригинальной схемы синтеза 21-азотсодержащих стероидных производных на основе перегруппировки 20-кетостероидных 17,21-дигалогенидов под действием аминов и использование этой схемы в синтезе новых стероидных производных - изомерных 17(20)2- и 17(20)£-прегна-5,17(20)-диен-21-оиламидов и 2'-{[(£>андрост-5-ен-17-илидсн]-
метил}оксазолинов с различными функциональными заместителями в азотсодержащем фрагменте.
о
но'
но'
но'
В ходе выполнения данной работы были поставлены и успешно решены следующие задачи:
1) Изучение перегруппировки 17а-бром-21-иод-Зр-ацетоксипрегн-5-ен-20-она в Зр-ацетоксипрегна-5,17(20)-диен-21 -оиламиды.
2) Получение, характеристика, структурное исследование и молекулярное моделирование изомерных 17(20)7- и 17(20)£'-прегна-5,17(20)-диен-21-оиламидов.
3) Разработка метода циклизации 11(20)2- и 17(20)£-гтрегна-5,17(20)-диен-21 -оил-(2'-гидроксиэтил)-амидов; синтез, структурное исследование и молекулярное моделирование 2'-{[(£)-андрост-5-ен-17-илиден]метил}-оксазолинов.
4) Первичное тестирование биологической активности синтезированных соединений в культуре клеток млекопитающих.
Настоящая диссертационная работа является составной частью исследований, проводимых в лаборатории Синтеза физиологически активных соединений ФГБУ "ИБМХ" РАМН в рамках направления "Поиск молекулярных мишеней, компьютерное конструирование и получение биологически активных веществ, исследование их фармакологического действия и безопасности. Создание систем транспорта лекарств". Работа поддержана грантами РФФИ 09-04-00454_а; 10-04-90044-бел_а; 11-04-01537_а и 12-04-31075-мол_а.
Научная новизна. В работе установлено, что взаимодействие 20-кетостероидных 17,21-дигалогенидов с аммиаком, первичными и вторичными аминами приводит к прегна-5,17(20)-диен-21-оиламидам. Изучен механизм перегруппировки; на ее основе разработана оригинальная схема синтеза 17(20)2- и 17(20)£'-прегна-5,17(20)-диен-21-оиламидов с различными заместителями в амидном фрагменте. Изучена циклизация 17(20)2- и 17(20)1?-прегна-5,17(20)-диен-21-оил-(2'-гидроксиэтил)-амидов в 2'-{[(Е)-андрост-5-ен-17-илиден]-метил} оксазолины. Осуществлен направленный синтез 34 новых 21-азотсодержащих стероидных производных; проведено структурное исследование, молекулярное моделирование и первичное тестирование биологической активности синтезированных соединений в культуре клеток. Показаны существенные различия в структуре и биологической активности 21-азотсодержащих стероидных производных, обусловленные различной ориентацией азотсодержащего фрагмента относительно стероидного цикла; среди синтезированных соединений найдены новые потенциальные агонисты ядерного рецептора ЬХЯ и регуляторы липидного обмена.
Практическая значимость. В работе предложен новый подход к синтезу 21-азотсодержащих стероидных производных исходя из 20-кетостероидных 17,21-дигалогенидов; разработана оригинальная схема, позволяющая получать целевые 17(20)2- и 17(20)£-прегна-5,17(20)-диен-21 -оиламиды и 2'-{[(£)-андрост-5-ен-17-илиден]-метил} оксазолины в три стадии. Основными преимуществами нового подходы являются простота и эффективность. Имеющийся в настоящее время практически неисчерпаемый набор аминосодержащих исходных блоков и
использование стратегии параллельного синтеза дают возможность применить предложенный в диссертации подход для направленного получения больших серий стероидных производных. Экспериментальные методики, разработанные в ходе исследования не требуют дорогостоящих реагентов, катализаторов и специальных приемов для проведения синтеза и выделения продуктов. Синтезированные в работе 21-азотзамещенные производные могут быть использованы в фундаментальных биохимических и биомедицинских исследованиях, а также представляют интерес в качестве новых потенциальных регуляторов гомеостаза холестерина, липидов, глюкозы в различных биологических системах.
Основные положения, выносимые на защиту.
1) Перегруппировка 20-кетостероидных 17,21-дигалогенидов под действием аммиака, первичных и вторичных аминов, приводящая к соответствующим 17(20)Z- и 17(20)£-прегна-5,17(20)-диен-21 -оиламидам.
2) Синтез 17(20)Z- и 17(20)£'-прегна-5,17(20)-диен-21-оиламидов, различающихся структурой амидного фрагмента, разделение 17(20)2- и 17(20)£-изомеров; определение конфигурации заместителей при двойной связи 17(20) и структурное изучение синтезированных соединений.
3) Циклизация 17(20)Z- и 17(20)£-прегна-5,17(20)-диен-21-оил-(2'-гидроксиэтил)-амидов в 2'-{[(£)-андрост-5-ен-17-илиден]-метил}оксазолины; синтез, структурное изучение и молекулярное моделирование синтезированных соединений, в том числе (4'Я)- и (4'S)- 4'-замещенных 2'-{[(£)-андрост-5-ен-17-илиден]-метил} оксазолинов.
4) Обнаружение способности синтезированных соединений регулировать биосинтез холестерина и триглицеридов в клетках Hep G2, а также моделировать биологическую активность эндогенных стеринов, оксигенированных в боковой цепи.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались на I Всероссийской конференции «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2010 г.); Конкурсе - конференции научных работ ИБМХ РАМН (Москва, 2011 и 2013 гг.); VI Международной конференции по нитроксидным радикалам (Spin 2011, Марсель, Франция, 2011 г.); VI Международной конференции «Менделеев 2012» (Санкт-Петербург, 2012 г); Международной конференции «Химия биологически активных веществ» (Саратов,
2012 г.); III Международной интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2012 г.); XV Международной конференции «Гетероциклы в биоорганической химии» (Рига, Латвия, 2013 г.); I Российской конференции по медицинской химии «MedChemRussia-2013» (Москва,
2013 г.)
Объем и структура работы. Диссертация состоит из Введения, Литературного обзора, Результатов и обсуждения, Экспериментальной части, Заключения, Выводов и Списка литературы. Диссертация изложена на 150 страницах, содержит 56 схем, 5 таблиц и 21 рисунок, список литературы включает 200 источников.
3
1. ПЕРЕГРУППИРОВКА 17а-БРОМ-21-ИОД-Зр-АЦЕТОКСИ-ПРЕГН-5-ЕН-20-ОНА В 3ß-АЦЕ ТОКСИПРЕГНА-5,17(20)-ДИЕН-21 -ОИЛАМИДЫ.
1.1. Механизм перегруппировки
В работе предложен простой метод синтеза 21-азотзамещенных стероидных производных, основанный на перегруппировке 20-кетостероидных 17,21-дигалогенидов под действием аминов. Мы изучили эту перегруппировку и синтезировали новые 3 р-ацетоксипрегна-5,17(20)-диен-21 -оиламиды.
В качестве исходного соединения использован известный 17а-бром-21-иод-ЗР-ацетоксипрегн-5-ен-20-он (4) {Julian, Karpel, 1950), получаемый из доступного прегненолона (1) по схеме, включающей защиту гидроксильной группы ацетилированием, исчерпывающее бромирование ацетата (2) в кислой среде и обработку тетрабромида (3) избытком Nal, что приводит к регенерации л5 и избирательному замещению атома брома на иод при С21. Взаимодействие 17а-бром-21-иод-ЗР-ацетоксипрегн-5-ен-20-она (4) с аммиаком, первичными и вторичными аминами приводит к смеси 17(20)Z- и 17(20)£'-Зр-ацетоксипрегна-5,17(20)-диен-21-оиламидов (5) (схема 1). Эта реакция, родственная перегруппировке Фаворского, гладко проходит в диоксане, бензоле, ацетонитриле или их смесях с выходом > 50%.
Схема 1
Предлагаемый механизм образования продуктов (5.2) и (5Е) представлен на схеме 2. Перегруппировка начинается с отщепления протона от С21 под действием амина (или другого основания), что приводит к образованию мезомерного аниона
[A]. Интермедиат [А] превращается в циклопропаноновый интермедиат [В] при отщеплении брома из положения 17а. Нуклеофильная атака амина на интермедиат
[B] приводит к образованию интермедиата [С], который превращается в конечный продукт перегруппировки — сопряженный амид (5) с конфигурацией 17(20)2 или 17(20)£ при отщеплении иода.
(52) (5 Е)
Схема 2
Справедливость предложенного механизма подтверждают результаты нижеприведенных экспериментов.
1) Необходимым условием перегруппировки является достаточно высокая основность амина (или присутствие в реакционной смеси другого сильного основания). Нагревание соединения (4) с 5-кратным избытком анилина не приводит к перегруппировке. Нагревание соединения (4) с 5-кратным избытком триэтиламина вызывает медленное разложение исходного соединения и образование 17а-бром-Зр-ацетоксипрегн-5-ен-20-она. Однако, нагревание соединения (4) с 5-кратным избытком анилина в присутствии 5 эквивалентов триэтиламина приводит к смеси 17(20)2- и 17(20)£-3|3-ацетоксипрегна-5,17(20)-диен-21-оиланилидов с выходом 56%.
2) Доказательством образования циклопропанонового интермедиата [В] и механизма перегруппировки, включающего атаку амина на интермедиат [В], является соотношение образующихся продуктов перегруппировки (5г) и (5Е). В случае существования плоского циклопропанона [В] нуклеофильная атака амина с обеих сторон равновероятна и, очевидно, должна приводить к эквимолярной смеси 17(20)2- и 17(20)£'-изомеров, что и наблюдается. Возможный альтернативный механизм - нуклеофильная атака амина на интермедиат [А] с синхронным или последующим отщеплением 17а-брома -представляется маловероятным: в этом случае следовало бы ожидать значительного преобладания одного из продуктов, соответствующего атаке амина из (3-области.
1.2. Синтез Зр-ацетоксипрегна-5,17(20)-диен-21-оиламидов (7) - (19)
Перегруппировка 17а-бром-21-иод-Зр-ацетокси-прегн-5-ен-20-она под
действием аминов является простым и эффективным методом получения Зр-ацетоксипрегна-5,17(20)-диен-21-оиламидов, содержащих различные заместители в амидном фрагменте. Формулы полученных продуктов (7) - (19) представлены на рисунке 1.
(7), Х-Ас (22), Х-Н
(10), Х-Ас <25>, X - [ I
(11),Х = АС
ав),х=н
(12), Х-Ас (27>,Х-Н
(13), X - Ас (28), Х-II
¥* /? > н он
¿И^-ОИ
ДсО
(16)
аю
о
МсГЧ) «4-соосн, а —сн,он
М1
Н3СООС-|-11 сн-он
(18)
(19)
Рис. 1. Формулы полученных ЗР-ацетоксипрегна-5,17(20)-диен-21-оиламидов (7) - (19) и Зр-гидроксипрегна-5,17(20)-диен-21-оиламидов (22) - (28).
Максимальный выход продуктов перегруппировки был получен при использовании 5-кратного избытка амина и безводного ацетонитрила в качестве растворителя. Выход соединений (7) - (19) составлял от 40 до 67 %; соотношение 17(20)2- и 17(20)£-изомеров во всех случаях было близким к 1 : 1 (по интегральной интенсивности характеристичных сигналов в спектре 'Н-ЯМР продуктов). При проведении перегруппировки в бензоле или смеси диоксан-бензол замечено незначительное преобладание 17(20)£-изомера (до 64%). При проведении перегруппировки под действием аммиака [синтез соединения (7)] использовался 7М раствор аммиака в метаноле или в смеси метанол-диоксан. В случае проведения перегруппировки с амином, нерастворимым в ацетонитриле [трис-гидроксиметиламинометан, синтез соединения (15)] использовался раствор амина в пиридине. Аммиак, первичные и вторичные амины (пирролидин) реагировали с близкими скоростями. При проведении перегруппировки с эфирами аминокислот [синтез соединений (18) и (19)] в реакцию вводили соответствующие хлоргидраты и добавляли эквимолярное количество триэтиламина.
2.17(20^- И 17(20)Е-ПРЕГНА-5,17(20)-ДИЕН-21-ОИЛАМИДЫ 2.1. Разделение и характеристика 17(20)^- и 17(20)£'-изомеров
Наличие 17(20)-двойной связи приводит к тому, что в 17(20)2- и 17(20)£'-изомерах заместители в амидном фрагменте расположены различно по отношению к стероидному фрагменту, что обеспечивает характерные различия в структуре и спектральных свойствах изомеров, а также делает возможным их простое разделение.
Ацетаты (7), (11) и (12) удовлетворительно разделялись колоночной хроматографией на силикагеле в смеси петролейного эфира и ацетона (3:1) с последующей дополнительной очисткой полученных фракций колоночной или препаративной ТСХ в той же системе. Ацетаты (8), (9), (10) и (15) разделяли препаративной ТСХ в системе петролейный эфир-ацетон (4:1). Ацетаты (17), (18) и (19) разделяли препаративной ТСХ в системе петролейный эфир-этилацетат (5:2). Попытки разделения 17(20)2- и 17(20)£'-изомеров соединений (14) и (15) препаративной ТСХ были неудачными; однако после обработки соединений (14) и (15) уксусным ангидридом в пиридине, полученные ацетаты (20) и (21) были удовлетворительно разделены препаративной ТСХ в системе петролейный эфир-ацетон (3:1) (схема 3).
Удаление ацетатных защитных групп в разделенных 17(20)2- и 17(20)£'-изомерах соединений (7) - (13), (16), (20) и (21) проводили нагреванием с К2С03 в водном метаноле, что дало Зр-гидроксипрегна-5,17(20)-диен-21-оиламиды (22) - (30) (рис. 1 и схема 3) с выходом близким к количественному. Все выделенные изомеры были гомогенными, по данным ТСХ и ВЭЖХ, охарактеризованы МСВР, спектрами 'НЯМРи13СЯМР.
(15)
Ас20/Ру
"1/—OAc _ / Me
Me OAc
(20)
(21)
Схема 3
о
Me Jf "NH
ox
Me
ox
(20E), X = Ac n (29E), X = H ^
XO-^M« о
(20Z), X = Ac ^ (29Z),X = H J
.OX
(21Z), X = Ac^ (30Z),X = HJ
Отнесение конфигурации заместителей при двойной связи в изомерах было получено при анализе спектров 'Н 2D NOESY ЯМР ацетатов (7) - (12), (15), (19), (20) и ЗР-гидроксиамидов (22) — (30). В обоих изомерах всех вышеуказанных соединений наблюдались характеристичные и сильные NOE сигналы для протона Н-20.
На рисунке 2 (а и Ь) приведены фрагменты NOESY спектров соединений (27Z) и (27Е). В 17(20)2-изомере (соединении с большей хроматографической подвижностью) протон Н-20 локализован вблизи протонов Н-1 б, на что указывает NOE взаимодействие (наличие перекрестных сигналов) при 5.63 м.д. и 2.51 м.д.; а также при 5.63м.д. и 2.25 м.д. (рис. 2 а). В 17(20)£'-изомере (соединении с меньшей хроматографической подвижностью) протон Н-20 развернут в противоположную сторону и находится вблизи протона Н-12, на что указывает NOE взаимодействие (наличие перекрестных сигналов) при 5.44 м.д. и 1.22 м.д.; а также при 5.44 м.д. и 1.78 м.д. (рис. 2 Ь). В !Н 2D NOESY ЯМР спектрах каждой пары изомеров всех полученных соединений видны были аналогичные взаимодействия.
г--Г-Г-Г" ""■•I--М.0 '1-—1-г--1-1-га
5.7 5.6 5.5 5.4 5.3 ррш 5.7 5.6 5.5 5.4 5.3 ррсп
Рис. 2. Фрагменты 20 'Н ШЕ5У ЯМР спектров Зр-гидроксипрегна-5,17(20)-диен-21-оил-(2'-гидроксиэтил)амидов (272) и (27Е): а - 17(20)2- изомер; Ь -17(20)£- изомер.
'Н ЯМР спектры соответствующих пар 17(20)2- и 17(20)£-изомерных амидов демонстрировали характерные различия в значениях хим. сдвигов протонов Н-16, Н-18 и Н-20. Очевидно, это связано с эффектом полярной амидной группы, различно ориентированной в 17(20)2- и 17(20)£- изомерах относительно этих протонов. В спектрах 17(20)2-изомеров синглет Н-18 сдвинут в более слабое поле (8 = 1.02 м.д.), чем в спектрах 17(20)£'-изомеров, для которых хим. сдвиг Н-18 имеет обычное значение (5 = 0.82 м.д.). В спектрах 17(20)г-изомеров хим. сдвиги двух Н-16 протонов сильно различаются (мультиплеты при 2.51 м.д. и 2.25 м.д., соответственно), а в спектрах 17(20)£-изомеров оба протона Н-16 проявляются как один мультиплет при 2.86 м.д. В спектрах соединений (277) и (27Е) сигнал Н-20 представлял собой триплет, обусловленный взаимодействием с двумя протонами Н-16 (I ~ 2 Гц); во всех 17(20)г-изомерах этот сигнал был сдвинут в сильное поле на 0.2 м.д. по сравнению с таковым во всех 17(20)£-изомерах.
Пространственная структура изомерных амидов (26Z) и (26Е), содержащих парамагнитные фрагменты 2',2',6',6'-тетраметилпиперидинил-1 '-нитроксила (TEMPO) исследовалась методами рентгеноструктурного анализа и ЭПР. На рисунке 3 показано относительное расположение стероидного и TEMPO фрагментов в соединениях (26Z) и (26Е). В 17(20)Я-изомере прямая, соединяющая атомы нитроксильного азота и С4'- в TEMPO фрагменте практически совпадает с главной осью стероидного цикла (соединяющей атомы СЗ и С17), а в 17(20)Z-H3OMepe расположение этих осей близко к перпендикулярному.
Рис.3. Данные рентгеноструктурного анализа кристаллов [ 17(20)2Г]-Зр-гидроксипреп1а-5,17(20)-диен-21 -оил-(ТЕМРО)амида (2бг) и моногидрата [17(20)£]-3р-гидроксипрегна-5,17(20)-диен-21 -оил-(ТЕМРО)амида (2 6Е).
Различия в пространственной структуре изомеров (26^ и (26Е) проявляются в спектрах ЭПР. На рисунке 4 приведены экспериментальные спектры ЭПР соединений (26Е) и (262) в хлороформе при -40°С. Сравнение спектров указывает на значительные различия в анизотропии движения этих зондов (разные соотношения компонент триплета).
Симулированные спектры, полученные с использованием программы (Ттю/ееу е/ а!., 1993), демонстрируют отличное совпадение с экспериментальными и позволяют рассчитать времена вращательной корреляции молекул (262) и (26£) относительно координатных осей нитроксильного фрагмента (таблица 1).
ТАБЛИЦА 1
Соединение тх(нсек) Ту(нсек) tz(нсек)
(262) 0.19 0.17 2.00
(2 6Е) 0.01 0.40 1.90
2.2.17(20)Z- и 17(20)£'-прегна-5,17(20)-диен-21-оиламиды с полярными заместителями в амидном фрагменте
Мы предположили, что синтезированные в данной работе 17(20)Z- и 17(20)£-3ß-гидроксипрегна-5,17(20)-диен-21 -оиламиды, содержащие гидроксильные группы в амидном фрагменте [соединения (27Z), (НЕ), (28Z), (28Е), (29Z), (29£), (30Z), (ЗОЕ)] могут рассматриваться как конформационно жесткие структурные аналоги эндогенных стеринов, гидроксилированных в боковой цепи. Хорошо известно, что эндогенные оксистерины [24(8)-24-гидроксихолестерин, 25-гидроксихолестерин, 27-гидроксихолестерин] являются важнейшими регуляторными молекулами в организме млекопитающих (Schroepfer, 2000; Björkhem, 2002, 2007, 2009; Javitt, 2008; Olkkonen, 2009). Синтетические аналоги оксистеринов - метиловый эфир Зр-гидроксихол-5-еновой кислоты (метилхоленоат) и Ы^-диметиламид Зр-гидроксихол-5-еновой кислоты (диметилхоленамид, DMCA) эффективно регулируют метаболизм липидов в культуре клеток и in vivo, активируя ядерные рецепторы LXRa и LXRß (Janovski et al., 1999; Spencer et al., 2001; Quinet et al., 2004; Svensson et al., 2003; Williams et al., 2003).
Мы провели синтез новых аналогов метилхоленоата и Ы,Ы-диметилхолснамида, соединений (Ъ\Е) и (32Е) из метилового эфира N-{[ 17(20)£]-ЗР-ацетокси-21-оксопрегна-5,17(20)-диен-21-ил}глицина (17Е) (схеме 4).
Одновременное удаление двух сложноэфирных защитных групп в соединении (17Е) в щелочной среде (К2С03 в водном метаноле или IN NaOH в этаноле) приводило к кислоте (33). Обработка кислоты (33) избытком диазометана давала соединение (31£) с выходом 92% (в расчете на исходный (ME)).
Реакция кислоты (33) с пентафторфенилтрифторацетатом в хлористом метилене в присутствии триэтиламина давала пентафторфениловый эфир (34), который при обработке избытком диметиламина превращался в соединение (32Е) с выходом 76% в расчете на исходный (17Е).
Избирательное удаление ЗР-ацетатной группы в соединении (Y1E) было успешно проведено двумя методами: (1) метанолизом в присутствии цианида {Mori, Sasaki, 1979) и (2) ферментативным гидролизом в присутствии холестерин эстеразы.
Избирательное расщепление сложноэфирной группы в соединении (17£) было проведено обработкой Lil в кипящем пиридине (Magnus, Gallagher, 1984). Последовательная обработка зр-ацетилированной кислоты (35Е) пентафторфенилтрифторацетатом в хлористом метилене в присутствии триэтиламина давала ЗР-ацетилированной пентафторфениловый эфир (36Е), который после обработки диметиламином и удаления ЗР-ацетата под действием К2С03 в водном метаноле превращался в N- {[ 17(20)£]-3 Р-гидрокси-21 -оксопрегна-5,17(20)-диен-21 -ил}глицил-диметиламиду (32Е) с выходом 58% в расчете на исходный (17Z).
N-{[17(20)£]-3 Р-Гидрокси-21 -оксопрегна-5,17(20)-диен-21 -ил }глицилдиметил-амид (32£) был также получен с выходом 86% при обработке соединения (17Е) избытком диметиламина в этанольном растворе при 60° в течение 48 ч. Данные МСВР, спектров 'Н ЯМР и ,3С ЯМР полностью подтверждали структуру полученных продуктов (31£) и (32Е).
Таким образом, в работе был осуществлен синтез одиннадцати 17(20)2-3 Р-гидроксипрегна-5,17(20)-диен-21-оиламидов и тринадцати 17(20)£-ЗР-гидроксипрегна-5,17(20)-диен-21 -оиламидов.
3.2'-{[(£)-АНДР0СТ-5-ЕН-17-ИЛИДЕН]-МЕТИЛ}0КСА30ЛИНЫ 3.1. Циклизация прегна-5,17(20)-диен-21-оил-(2'-гидроксиэтил)-амидов в 2'-{[(£)-андрост-5-ен-17-илиден1-метил}оксазолины
Следующим этапом работы был синтез 2'-[(андрост-5-ен-17-илиден)-метил]оксазолинов из прегна-5,17(20)-диен-21-оиламидов, содержащих
гидроксильную группу. Мы нашли, что кратковременная обработка ЗР-ацетоксипрегна-5,17(20)-диен-21-оиламидов, содержащих гидроксильную группу в амидном фрагменте [соединений (12), (13), (14), (16), (18) и (19)] хлорокисью фосфора в сухом пиридине вызывает циклизацию в соответствующий оксазолин (37) - (42) (схема 5).
Неожиданным фактом явилось то, что во всех случаях циклизация и 17(20)2-изомера, и 17(20)Я-изомера, а также их смеси, вызывала образование только одного оксазолина. Спектры 20 Н ЫОЕЯУ ЯМР позволили однозначно идентифицировать конфигурацию заместителей при двойной связи 17(20) в полученных продуктах (37) - (42). Фрагмент спектра 20 'н Ж)Е8У ЯМР соединения (39) представлен на рисунке 5.
протонов.
Взаимодействие протона Н-20 с протонами Н-18 и Н-12 (наличие перекрестных сигналов при 5.67 м.д. и 0.82 м.д.; при 5.67 м.д. и 1.27 м.д.; при 5.67 м.д. и 1.80 м.д.) однозначно доказывает П(20)Е- конфигурацию. В 'Н 2D NOESY ЯМР спектрах соединений (37) - (42) видны были аналогичные взаимодействия, также свидетельствующие о 17(20)£- конфигурации.
13
Из этих данных можно заключить, что циклизация любого из изомеров прегна-5,17(20)-диен-21-оиламида, содержащего гидроксильную группу в амидном фрагменте, в соответствующий оксазолин под действием РОСЬ сопровождается изомеризацией. Из двух возможных механизмов циклизации, проходящей под действием хлорокиси фосфора: (1) атаки РОС13 на гидроксил с образованием легко уходящей группы и отщепления этой группы в результате нуклеофильной атаки амидного кислорода на соседнюю СН2 группу; (2) реакции, проходящей через активированный интемедиат [Е], мы выбрали второй, поскольку только этот механизм позволяет объяснить образование 17(20)£'-оксазолина из 17(20)2- и 17(20)£'-прегна-5,17(20)-диен-21 -оил-(2'-гидроксиэтил)амидов (схема 6).
Оба изомерных амида под действием РОС13 в сухом пиридине образуют один и тот же активированный комплекс [Е], в котором двойная связь мигрирует из положения 17(20) в положение 20(21); интермедиат [Е] превращается в оксазолин под действием нуклеофильной атаки гидроксильной группы на С21; трансформация интермедиата [Е] в оксазолин вызывает обратную миграцию двойной связи в положение 17(20); конфигурация заместителей при л 17(20) в образующемся продукте соответствует термодинамически выгодному продукту.
Для того, чтобы экспериментально проверить утверждение, что РОС13 в пиридине вызывает образование активированного интермедиата [Е] и изомеризацию прегн-17(20)-ен-21-оиламидов в наиболее термодинамически выгодный продукт, мы провели опыт, в котором в реакцию с хлорокисью фосфора вводили 30-ацетоксипрегна-5,17(20)-диен-21-оил-(Ы-пирролидин)амид (9) - соединение, которое не может циклизоваться в оксазолин. Обработка эквимолярной смеси пирролидиламидов (92) и (9Е) РОС13 в пиридине в течение 10 минут с последующим разложением реакционной смеси и хроматографическим разделением продуктов в результате дала один продукт - [17(20)£]-ЗР-ацетоксипрегна-5,17(20)-диен-21-оил-(Ы-пирролидин)амид (9Е) с выходом 79%.
Е- изомер
Схема 6
ТАБЛИЦА 2.
ЦИКЛИЗАЦИЯ 3 Р- АЦЕТОКСИПРЕГНА-5,17(20)-ДИЕН-21 -ОИЛ-(2'-ГИДРОКСИЭТОКСИ)-АМИДОВ В 2'-{[(£)- Зр-АЦЕТОКСИАНДРОСТ-5-ЕН-17-И ЛИДЕН]-МЕТИЛ} ОКСАЗОЛИНЫ
Амид Оксазолин Выход (%) МСВР
о Ме /Г1ЧН 3 32 Рассчитано для
х> [С25НзбЖ>з]+: 398.2695;
(122) + (12 Е) (37Е) найдено: 398.2701
о Ме N11 Ме Л^ЛУ^ Ме 65 Рассчитано для [С27Н4оМ03]+: 426.3008;
(132) + (13£) (38-Е) найдено: 426.2994
^ЯО 62 Рассчитано для [СзоНиМОз]*: 466.3321;
(162) + (16Е) (39 £) найдено: 466.3302
о Ме /Г0^N11 „„ г> л^ С1 J 55 Рассчитано для
л> [С27Нз9С1Ж)з]+: 460.2618;
(142) + (14Е) (40Е) найдено: 460.2595;
о Ме/Г^Ш ["А Н-)—СООСНз СН2ОН (182)+ (18Е) ^^гГ^ОСНз (41Е) 37 Рассчитано для [С27Н38Ж)5]+: 456.2750; найдено: 456.2728
35 Рассчитано для
Н3СООС-]-Н СН2ОН 3 (42 Е) [С27Н38Ж>5]+: 456.2750; найдено: 456.2728
(192)+ (19 Е)
Результаты молекулярного моделирования показали значительную разницу в величинах свободной энергии для изомеров (9Е) и (92). Значения минимумов свободной энергии для соединений (9Е) и (92), рассчитанные с использованием силового поля ММРБ94 составляли 166 ккал/моль и 172 ккал/моль, соответственно.
Примеры синтеза оксазолинов (37Е) - (42Е) из амидов (12), (13), (14), (16), (18) и (19) сведены в таблицу 2. Выход целевых продуктов зависел от условий проведения реакции. Циклизация прегна-5,17(20)-диен-21-оиламидов, в которых отсутствовали а-Н атомы в амидном фрагменте [(13), (14) и (16)] проходила с большим выходом, по сравнению с амидами, в которых а-Н атомы в амидном фрагменте присутствовали [(12), (18), (19)]. По-видимому, снижение выхода оксазолина в этом случае можно объяснить конкурирующей реакцией дегидратации исходного соединения.
Циклизация соединения (14), содержащего в амидном фрагменте две эквивалентные гидроксиметильные группы, приводила к рацемическому ацетату (40Е), в котором гидроксиметильная группа, не участвующая в циклизации, превращалась в хлорметильную.
Циклизация прегна-5,17(20)-диен-21-оиламидов (18) и (19), содержащих в амидном фрагменте остатки метиловых эфиров (¿)-серина и (Д)-ссрииа, соответственно, привела к 4'-метоксикарбонилсодержащим оксазолинам (41Е) и (42Е) с хиральным центром в положении 4'.
Удаление ацетатных защитных групп в соединениях (37Е), (38Е), (39Е) обработкой К2СОз в водном метаноле привело с количественным выходом к ЗР-гидроксистероид-замещенным оксазолинам (43Е), {ЛАЕ), (45£).
(43£) (44£-) (45Е)
3.2. (4'/?)- и (4'5)- 4'-замещенные 2'-{[(£)-андрост-5-ен-17-илиден]-метил}оксазолины Синтез (4'Л)- и (4'5)- 4'-замещенных 2'-{[(£)-андрост-5-ен-17-илиден]-метил}оксазолинов {А6Е) — (49Е) был проведен из соединений (41£) и (42Е) (схема 7). Обработка изомерных ЗР-ацетилированных 4'-метоксикарбонилсодержащих оказолинов (4'5-41£) и (4'Л-42£) 1лА1Н4 приводила к соответствующим ЗР-гидроксилсодержащим 4'-гидроксиметилоксазолинам (4'А-46Е) и (4'5-47£) с выходом 90%. Следует заметить, что (4'5)-изомер (41£) превращался в продукт (46Е) с конфигурацией (4'Л), а (4'Л)-изомер (42Е) превращался в продукт (47Е) с конфигурацией (4'5), что обусловлено сменой формального старшинства заместителей при хиральном центре 4'. Спектры 'Н-ЯМР энантиомерных
соединений (4'Д-46£) и (4'5-47Е) демонстрировали заметные различия в хим. сдвигах протонов Н-18, Н-4', Н-5' и СН2-4'; значения хим. сдвигов для соответствующих сигналов в спектрах 13С-ЯМР отличались друг от друга в интервале от 0 до 0.35 м. д.
Ферментативный гидролиз соединений (41£) и (42Е) в присутствии холестерин эстеразы проходил без затрагивания хиралыюго центра и позволил получить целевые соединения (4'5-48£) и (4'Л-49Я) с выходом 50%; стереохимическая чистота полученных продуктов превышала 94%.
X = Н; СОГЧ(СНз)2; У = Н; CON(CHз)2 Схема 7
Попытки получения индивидуальных 4'-замещенных (4'5)- и (4'Я)- оксазолинов (48£) и (49Е) другими методами были неудачными из-за рацемизации. Щелочной гидролиз соединений (41Е) или (42 Е) с последующим метилированием образующегося карбоксилата диазометаном приводил к полностью рацемизованному продукту - эквимолярной смеси метиловых эфиров (48Е) + {49Е). Аналогичная рацемическая смесь получалась при дезацетилировании соединения (41Е) метанолизом в присутствии №СЫ.
Очевидно, что расщепление сложноэфирной связи под действием основания или нуклеофила приводит к карбоксилату, находящемся в равновесии с таутомерной формой [Т] (схема 8). Стабилизация структуры |Т] сопряжением обеспечивает высокую лабильность протона в а-положении к карбоксильной группе и, вследствие этого легкую рацемизацию при С4'.
Все попытки получения индивидуальных (4',S)- и (4 7?)-4'-карбоксамидов (50Е) и (51£) из ЗР-ацетилированных 4'-метоксикарбонилсодержащих оказолинов (4'5-41Е) и (4'Ä-42£) не привели к положительному результату. Расщепление метилового эфира (4'5-48£) под действием Lil в кипящем пиридине с последующим превращением образующейся кислоты в диметиламид (через промежуточный пентафторфениловый эфир) и нагревание соединения (4'5"-41£) с диметиламином давали в результате рацемическую смесь (4'ftS)-(50£) + (51£).
2'-{[(Е)-Андрост-5-ен-17-илиден]-метил}оксазолины обладают жесткой и почти плоской структурой. Благодаря сопряжению двух двойных связей [17(20) и 2'C=N], стероидный фрагмент и оксазолиновый цикл лежат в одной плоскости, при этом заместители в положении 4' должны располагаться над или под этой плоскостью в зависимости от конфигурации атома 4'-С и величины двугранного угла С17=С20-С2'-С>Г (0С2О-С2-)-
Для каждого из 4'-замещенных 2'-{[(Е)-андрост-5-ен-17-илиден]-метил}оксазолинов с хиральным центром при 4'-С возможно существование двух стабильных конформеров: первого - с аноти-ориентацией (6ciü-cy = 0°) и второго - с сгот-ориентацией (0с2о-с2' = 180°). Зависимость значений относительных энергий конформеров от величины двугранного угла 0С2о-с2' Для (4'R)- и (4'S)- 2'-{[(£)-андрост-5-ен-17-илиден]-метил}оксазолинов приведена на рисунке 6.
Таким образом установлено, что циклизация 17(20)Z- и 17(20)£-прегна-5,17(20)-диен-21-оил-(2'-гидроксиэтил)-амидов является удобным методом получения 2'-{[(£)-андрост-5-ен-17-илиден]-метил}оксазолинов. С использованием этого метода синтезировано и охарактеризовано восемь 2'-{[(£)-андрост-5-ен-17-
о
Схема 8
нлиден]-мстил ¡оксавдлннон, в том числе четырех 4'-замещенных оксазолинов с хиральным центром в положении 4*.
со»-(еЬк1«<Г) «-«»•(&»■:» ■ 180")
Рис. 6. Зависимость рассчитанных значений внутренней свободной энергии от величины двугранного угла Ощ-г.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ПЕРВИЧНОГО ТЕСТИРОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ СИНТЕЗИРОВАННЫХ СОЕДИНЕНИЙ.
4.1. Влияние синтезированных соединений на пролиферацию и жизнеспособность клеток MCF-7, LNCaP и Hep G2.
В ходе настоящего исследования осуществлено предварительное тестирование синтезированных соединений на культуре клеток карциномы молочной железы человека линии MCF-7, карциномы простаты человека линии LNCaP и гепатобластомы человека линии Hep G2.
Оценка влияния соединений (22Z). (22£). (23Z), (23£), (24Х), <24£"), (27Z). (27Е). (28Z), (28Е). (29Z), (29Е). (30Z). (30£), (31Е). (32Е). (43Е). (44F). (45А") на жизнеспособность и пролиферацию клеток MCF-7. LNCaP и Hep G2 проводилась классическим методом. основанном на цветной реакции митохондрнального восстановления тетразолиевого красителя 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетраюлий бромида (МТТ) (Мошапп. ¡983). Ни одно из синтезированных соединений не показывало высокой цитотоксичности - при концентрации исследуемых соединений в среде 30 цМ жизнеспособность клеток состав-пяла не менее 65%.
В андро ген-зависимых клетках LNCaP соединения (22Z). (22 Е). (24Z), (24£), (27Z), (27£) в концентрациях 100 нМ и 300 нМ существенно усиливали пролиферацию (рис. 7).
180160 140 120 100 80 60 40 20 0
"i—
0.1
—I—
10
Рис. 7. Зависимость пролиферативной активности клеток LNCaP от концентрации исследуемы* веществ.
Зависимость пролиферативной активности клеток LNCaP от концентрации исследуемых веществ имела двухфазный характер. Следует отметить, что подобная зависимость от концентрации гормонов, их аналогов и некоторых лекарств неоднократно наблюдалась ранее в гормон-зависимых клетках. Наличие двухфазной зависимости объясняется тем, что исследуемое соединение в низких концентрациях активирует один из факторов пролиферации, а наблюдаемое снижение пролиферации при увеличении концентрации обусловлено цитотокснческим эффектом (Baratta et al.. 2000; Migliaccio et al.. 2000; Hara et al.. 2003).
4.2. Влияние 17(20)Z- и 17(20)£"-прегна-5,17(20>-Днем-21 -оиламидов на биосинтез триглицеридов и холестерина в кленках Hep G2
Проведено тестирование синтезированных 17(20)Z- и 17(20)£-прегна-5,17(20)-диен-21 -оиламидов в качестве потенциальных регуляторов биосинтеза холестерина и триглицеридов в клетках гепатобластомы человека линии Hep G2. Эта линия, как известно, является адекватной клеточной моделью для изучения регуляции метаболизма липидов в печени человека (Javitt, 1990). Уровень биосинтеза холестерина и триглицеридов определяли по включению радиоактивного ацетата по стандартному протоколу (Goldstein etal.. 1983).
При одновременном добавлении к клеткам Hep G2 исследуемых соединений (в концентрациях до 20 цМ) и ["CJ-ацетата, уровень биосинтеза холестерина и триглицеридов практически не изменялся, что указывает на отсутствие прямого эффекта исследуемых соединений на активность ключевых ферментов биосинтеза холестерина и триглицеридов.
Однако, если клетки предварительно инкубировались с некоторыми из исследуемых соединений в течение 14 часов, с последующим добавлением [,4С)-ацегата, уровень биосинтеза холестерина был снижен, а уровень биосинтеза триглицеридов повышался (рис. 8 и 9). Это свидетельствуют о регуляторном эффекте соединений, проявляющемся на уровне транскрипции. Наиболее эффективным регулятором являлось соединение (НЕ). В наших опытах его эффект был сходен с эффектом 25-гидроксихолестерина, используемого в качестве положительного контроля. Ни один из 17(20)2-изомеров не обладал регуляторной активностью.
| к Л (*"*) (Х»»> <"е,(32е> 25К
Рис. 8. Уровень биосинтеза триглицеридов в клетках Мер 02, прелннкубнрованных с исследуемыми соединениями (5 цМ) и 2$-гидроксихолестерином (25ИС. 2 цМ).
I
2" 120-1
100 во во -
5 <о -
!! II
II
20 -
1.111111
(Г27« (г28е, (г29*) (Г30*. <3,£> 2$нс
Рис. 9. Уровень биосингоа холестерина в клетках Нер С2, прслинк>бированнмх с исследуемыми соединениями (5 цМ) и 25-гилрокснхолсстсрнном (25НС, 2 цМ).
Совокупность полученных данных позволяет считать, что нетоксичные 17(20)£-прсгна-5,17(20)-диен-21-оиламиды способны моделировать регуляторные эффекты эндогенных оксистеринов в культуре клеток и могут оказаться новыми полезными регуляторами биосинтеза и метаболизма липндов в клетках печени.
4.3. Молекулярный докннг синтезированных соединений в участок связывания оксистеринов ялерного рецептора 1.Х1<р.
Чтобы оценить вероятность активации LXR синтезированными соединениями мы провели их молекулярный докннг в участок связывания лиганда ядерного рецептора LXRp (pdb 1PSD). Трехмерные структуры комплексов лнгаид-связывающего домена LXRP с природным активатором 24{S)-24,25-эпоксихолестерином и соединениями (27£). (4'#f-46£) и (4*S-47£) представлены на рисунке 10. Стероидный фрагмент соединений (27Е), (4'Я-4б£) и (4'5>'-47Е) связывается с рецептором аналогично стероидному фрагменту 24(S)-24,25-зпокснхолестерина и находится в том же гидрофобном окружении.
Анализ результатов докинга 17(20)Z- и 17(20)£-изомсрных амидов 27(Z), 27(£), 28(Z), 28(Е), 29(2). 29(£), 34(2), 30(£) покатал, что ни один из I7(20)Z-изомеров не помешался в центр связывания лиганда LXRP; для всех 17(20)£-нзомеров параметры докинга были практически одинаковыми. При связывании всех 17(20)£-изомеров реализовалась конфирмация лиганда, в которой значение двугранного угла ©aui было близким к а амидный фрагмент локализовался в области остатка His-435. Это свидетельствует о возможности образования соответствующей водородной связи, необходимой для правильной ориентации лиганда в центре связывания ( Williams et al.. 2003: Svcnsson et. al., 2003).
Рис. 10. Структуры комплексов 1.ХЯр с 24(5)-24.25->покснхолсстсрином (А) и с соединениями (27£) (В), (4'/?-46£) (С) и (4"£-47£) (О), полученные в результате докинга. Атомы О и N в днгандах показаны большими темными и малыми светлыми шарами, соответственно, пунктир - водородная связь между полярной группой литанда и Н¡5-435.
Докинг оксазолинов (4'/f-46£) и (4'.S-47£) продемонстрировал, что стерсохимическая конфигурация атома С4' и размер 4'-заместителя играют ключевую роль в образовании комплекса с рецептором. При образовании комплекса с рецептором оксазолиновый цикл соединения (4'К-46Е) принимает апти-конформацию. а соединения (4'5-47/Г) - гии-конформацню. Это приводит к тому что 4'-гидроксиметшьная группа изомеров (4'Я-46£) и (4'S-47£) занимает различные положения в лиганд-связывающем центре рецептора. 4'-Гидроксиметильная группа (4'Я-46Я>изомера сближена с остатком llis-435 (Рис. 10С). что указывает на возможность образования водородной связи, а расстояние между 4'-гидроксиметильной группой (4'5-47£>изомера и остатком His-435 слишком велико для образования водородной связи (Рис. I0D). Докинг изомерных соединений (4'5-48/Г) и (4'/?-49£"), содержащих 4'-метоксикарбонилы1ый заместитель дал практически те же результаты.
Докинг изомерных оксазолинов (4\S-50£) и (4'Я-51£") содержащих 4'-диметалкарбоксамидный заместитель показал, что их связывание с LXRß возможно только в л/м-конформации (ÖCjo-cr " 0"). Объемистый 4'-замсститсль существенно затрудняет образование комплекса с LXRß, исключает образование водородной связи между кислородом амидной группы и остатком His-435 и существенно снижает значения параметров докинга.
Рис. II. I - Суперпозиция структур (4'/?-46£.) (а); (4\5-48£) (Ь); (4'5-50£1 (с), полученных в результате молекулярного докинга п центр связывания лиганла II - Суперпозиция структур (4\У-47£) (а); (4'К-49Е) (Ь); (4'Я-51Я) (с) полученных в результате молекулярного локннга в центр связывания лиганла ЬХКр. Атомы О и N показаны большими темными н малыми светлыми шарами, соответственно.
Таким образом, результаты экспериментов (раздел 4.2) и молекулярного докинга свидетельствуют, что амид (27Е) и оксазолины (4'Я-46А") и (4'^-48/Г) могут рассматривании как 1кпенциальные агонисты ЬХИр, в отличие от остальных 21-азотзамещенных стероидных производных.
В разделе "Экспериментальная часть" приведены методики синтеза и константы полученных соединений, в разделе "Заключение" проведено сравнение разработанной в диссертации новой синтетической схемы с известными, отмечены главные преимущества новой схемы, а также обсуждены перспективы применения синтезированных в работе стероидных производных в биохимических и биомедицинских исследованиях.
5. ВЫВОДЫ
1) Установлено, что взаимодействие 20-кетостероидных 17,21-дигалогенидов с аммиаком, первичными и вторичными аминами приводит к прегна-5,17(20)-диен-21-оиламидам (смеси соответствующих 17(20)Z- и 17(20)£-изомеров); изучение механизма этой перегруппировки продемонстрировало образование циклопропанонового интермедиата.
2) На основе перегруппировки разработана оригинальная схема синтеза 17(20)Z- и 17(20)£'-прегна-5,17(20)-дисн-21 -оиламидов с различными заместителями в амидном фрагменте; проведены структурное изучение и молекулярное моделирование синтезированных соединений.
3) Изучена циклизация 17(20)Z- и 17(20)£-прегна-5,17(20)-диен-21 -оил-(2'-гидроксиэтил)-амидов в 2'- {[(£>андрост-5-ен-17-илиден]-метил} оксазолины; проведены синтез, структурное изучение и молекулярное моделирование 2'-{[(Е)-андрост-5-ен-17-илиден]-метил}оксазолинов, в том числе соединений с хиральным центром при С4'.
4) Проведено первичное тестирование биологической активности синтезированных соединений в культуре клеток; результаты свидетельствуют, что некоторые 17(20)£-прегна-5,17(20)-диен-21 -оиламиды и 2'-{[(£>андрост-5-ен-17-илиден]-метил}оксазолины способны регулировать биосинтез холестерина и триглицеридов в клетках Hep G2.
Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи
1) Stulov S.V., Zavialova M.G., Mehtiev A.R., Novikov R.A., Tkachev Y.V., Timofeev V.P., Misharin A.Y. [17(20)£]- and [17(20)Z]-Pregna-5,17(20)-dien-21-oylamides. Facile synthesis and primary evaluation for cancer cells proliferation. // Bioorg. Med. Chem. Lett. - 2010. - V. 20. - P. 5495-5498.
2) Stulov S.V., Tkachev Y.V., Novikov R.A., Zavialova M.G., Timofeev V.P., Misharin A.Y. Synthesis of 21-nitrogen substituted pregna-5,17(20)-dienes from pregnenolone. // Steroids - 2012. - V. 77. - P. 77-84.
3) Стулов C.B., Мишарин А.Ю. Синтез стероидов с азотсодержащими заместителями в кольце D (Обзор). // Химия. Гетероцикл. Соед. - 2012. - С. 15361582.
4) Stulov S.V., Mankevich O.V., Dugin N.O., Novikov R.A., Timofeev V.P., Misharin A.Y. Pregna-5,17(20)-dien-21 -oyl amides affecting sterol and triglyceride biosynthesis in Hep G2 cells. // Bioorg. Med. Chem. Lett. - 2013. - V. 23. - P. 2014-2018.
24
5) Stulov S.V., Mankevich O.V., Novikov R.A., Tkachev Y.V., Timofeev V.P., Dugin N.O., Pozdnev V.F., Fedyushkina I.V., Scherbinin D.S., Veselovsky A.V., Misharin A.Y. Synthesis and molecular modeling of (4'Л)- and (4\S> 4'-substituted 2'-{[(£> 3ß-hydroxyandrost-5-en-17)-yliden]methyl}oxazolines. // Steroids - 2013. -V. 78 - P 521-527.
6) Федюшкина И.В., Стулов C.B., Дугин Н.О., Мишарин А.Ю., Мехтиев А.Р., Морозевич Г.Е., Веселовский A.B. Молекулярное моделирование взаимодействия 17(20)Z- и 17(20)Е-прегна-5,17(20)-диен-21-оиламидов с ядерным рецептором LXRß. // Биомед. химия - 2013. - Т. 59. - С. 321-329.
Тезисы докладов
7) Стулов C.B., Новиков P.A., Ткачев Я.В., Мехтиев А.Р., Мишарин А.Ю. Синтез и биологическая активность новых азотсодержащих производных 5,17(20)-прегнадиен-21-овой кислоты. // Сборник тезисов I Всероссийской конференции «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» Россия, Санкт-Петербург, 2010, стр. 64-65.
8) Стулов C.B. Синтез новых биологически активных азотсодержащих прегна-5,17(20)-диенов. // Конкурс - конференция научных работ ИБМХ РАМН Россия, Москва, 2011.
9) Misharin A.Y., Stulov S.V., Tkachev Y.V., Timofeev V.P. Spin labeled [17(20)Z]-and [ 17(20)£]-pregna-5,17(20)-dien-21-oylamides. Synthesis, structure, and possible applications. // VI International conference on nitroxide radicals «SPIN 2011» France, Marseilles, 2011, p. 140.
10) Стулов C.B., Новиков P.A. Синтез и биологическая активность новых азотсодержащих прегна-5,17(20)-диенов. // Сборник тезисов VI Всероссийской конференции молодых учёных, аспирантов и студентов с международным участием «Менделеев 2012» Россия, Санкт-Петербург, 2012, стр. 111-112.
11) Стулов C.B., Манкевич О.В., Федюшкина И.В., Дугин Н.О., Новиков P.A. Новые азотсодержащие производные прегна-5,17(20)-диена: синтез, структура, молекулярное моделирование и оценка биологической активности. // Сборник тезисов Всероссийской школы - конференции молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием «Химия биологически активных веществ» Россия, Саратов, 2012, стр. 128.
12) Федюшкина И.В., Стулов C.B., Мишарин А.Ю., Веселовский A.B. Дизайн, моделирование и синтез новых азастероидных агонистов ядерных рецепторов LXRa и LXRß. // Сборник тезисов III Международной нтернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» Россия, Казань, 2012, стр. 320.
13) Stulov S.V., Novikov R.A., Fedyushkina I.V., Misharin A.Yu. Synthesis, structure and molecular modeling of 2'-{[(E)-androst-5-en-17-ylidene]-methyl}oxazolines. // XV International conference "Heterocycles in Bio-organic chemistry", Latvia, Riga, 2013 p. 173.
14) Стулов C.B., Новиков P.A., Тимофеев В.П., Мишарин А.Ю. Синтез 21-азотсодержащих прегна-5,17(20)-диенов. // Сборник тезисов I Российской конференции по медицинской химии (MedChemRussia-2013) с международным участием. Россия, Москва, 2013, стр. 264.
Заказ № 72-Р/10/2013 Подписано в печать 21.10.13 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,25
ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76 www.cfr.ru; е-тай: info@cfr.ru
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича» Российской академии медицинских наук
Л / ПЛ/1 ч / / л / я
ич^иI1^0
На правах рукописи
СТУЛОВ Сергей Владимирович
НОВЫЙ ПОДХОД К СИНТЕЗУ 21-АЗОТСОДЕРЖАЩИХ СТЕРОИДНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ
02.00.10 - биоорганическая химия
Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук
Научный руководитель:
кандидат химических наук,
доктор биологических наук,
профессор Мишарин Александр Юрьевич
Москва-2013
ОГЛАВЛЕНИЕ
стр.
ВВЕДЕНИЕ 5
Используемые сокращения и обозначения 9
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
СИНТЕЗ СТЕРОИДОВ С АЗОТСОДЕРЖАЩИМИ 12 ЗАМЕСТИТЕЛЯМИ В КОЛЬЦЕ В
1.1. Синтез азотсодержащих производных из 17-кетостероидов 13
1.2. Синтез азотсодержащих производных из 20-кетостероидов 29
1.3. Прочие методы синтеза стероидов с азотсодержащими заместителями в кольце Б
2.2.2. 17(20)2-и 17(20)£-прегна-5,17(20)-диен-21-оиламиды с полярными заместителями в амидном фрагменте
2.3.1. Циклизация прегна-5,17(20)-диен-21 -оил-(2'-гидроксиэтил)-амидов в 2'-{[(Е)-андрост-5-ен-17-илиден]-метил}оксазолины
41
2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 54
2.1. Перегруппировка 17а-бром-21-иод-Зр-ацетокси-прегн-5-ен-20-она в 55 Зр-ацетоксипрегна-5,17(20)-диеи-21-оиламиды
2.1.1. Механизм перегруппировки ^
2.1.2. Синтез 3(3-ацетоксипрегна-5,17(20)-диен-21-оиламидов 58 2.2.17(20^- и 17(20)£'-прегна-5,17(20)-диен-21-оиламиды 63
2.2.1. Разделение и характеристика 17(20)2- и 17(20)£'-изомеров 63
70
2.3. 2'-{[(£)-андрост-5-ен-17-илиден]-метил}оксазолины 77
77
2.3.2. (4'/?)- и (4'5)- 4'-замещенные 2'-{[(£)-андрост-5-ен-17-илиден]- ^ метил} оксазолины
2.4. Результаты первичного тестирования биологической активности
синтезированных соединений.
2.4.1. Влияние синтезированных соединений на пролиферацию и ^
жизнеспособность клеток MCF-7, LNCaP и Hep G2.
2.4.2. Влияние 17(20)2- и 17(20)£- прегна-5,17(20)-диен-21-
оиламидов на биосинтез триглицеридов и холестерина в клетках ^ Нер в2
2.4.3. Молекулярный докинг синтезированных соединений в центр
У о
связывания оксистеринов ядерного рецептора ЬХГф.
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 103
3.1. Реактивы 104
3.2. Инструментальные методы 104
3.3. Хроматографические методы 105
3.4. Синтез исходных соединений и необходимых стандартов 105
3.4.1. Зр-Ацетоксипрегн-5-ен-20-он 105
3.4.2. ЗР-Ацетокси-5а,6р,17а,21-тетрабром-20-кетопрегнан 105
3.4.3. Зр-Ацетокси-17а-бром-21-иодпрегн-5-ен-20-он 106
3.4.4. 3{3-Ацетокси-17а-бромпрегн-5-ен-20-он 106
3.4.5. Циклогексанонциангидрин 106
3.4.6. 1,3-Диазаспиро[4,5]декан-2,4-дион 107
3.4.7. 1-Аминоциклокексилкарбоновая кислота 107
3.4.8. Метиловый эфир 1-аминоциклокексилкарбоновой кислоты 107
3.4.9. (1-Аминоциклогексил)метанол 108
3.5. Синтез прегна-5,17(20)-диен-21-оиламидов 108
3.5.1. 3(3-Ацетокси-21-(амино)-21-оксопрегна-5Д7(20)-диен 108
3.5.2. Общая методика синтеза 3(3-ацетоксипрегна-5Д7(20)-диен-21- . по
1ОУ
оиламидов
3.5.3.3 З-Ацетокси-21 - {[2-(бис-2,2-диацетоксиметил)-2-иропил]-1 -амино}-21-оксопрегна-5,17(20)-диен и 3(3-Ацетокси-21-{[(трис-
2,2,2-триацетоксиметил)метил]-1 -амино} -21 -оксопрегна- \ 09 5,17(20)-диен
3.5.4. Разделение 17(20)2- и 17(20)Я-Зр-ацетоксипрегна-5,17(20)-диен-21 -оиламидов
3.5.5. Общая методика удаления ацетатных защит [синтез 17(20)2- и 17(20)£-3 (З-гидроксипрегна-5,17(20)-диен-21 -оиламидов]
3.5.6. Метиловый эфир К-[ЗР-гидрокси-21-оксопрегна-5,17(20)-диен-21-й л] глицина
3.5.7. Диметиламид 14-{[ 17(20)£]-3р-ги дрокси-21 -оксопрегна-5,17(20)-диен-21 -ил} глицина
3.6.1. Общая методика синтеза 2'-{[(£)-ЗР-ацетоксиандрост-5-ен-17-илиден]метил} -оксазолинов
3.6.2. 2' - {[(£)-3 (З-гидроксиандрост-5-ен-17-и ли ден] метил } -оксазолины
3.6.3. 17- {[(4 '/?)-4' -(ги дроксиметил)-4' ,5' -дигидро-1' ,3' -оксазол-2' -ил]метилен}-андрост-5-ен-3(3-ол и 17-{[(4'£)-4'-(гидроксиметил)-4' ,5' -дигидро-1' ,3' -оксазол-2' -ил]метилен}андрост-5-ен-Зр-ол
3.6.4. Метил (4'5)-2'-{[(£)-Зр-гидроксиметиландрост-5-ен-17-илиден]метил}-4',5'-дигидро-1 ',3'-оксазол-4'-карбоксилат и метил (4'Я)-2'-{[(£)-Зр-гидроксиметил-андрост-5-ен-17-илиден]метил} -4' ,5 '-дигидро-1 ',3 '-оксазол-4'-карбоксилат
115
3.6. Синтез 2'-{[(£)-андрост-5-ен-17-илиден]- метил}оксазолинов 117
117
119
120
120
3.6.5. Метил (4'/?5)-2'-{[^-3(3-гидроксиметиландрост-5-ен-17- ^ илиден]метил} -4' ,5' -дигидро-1' ,3 '-оксазол-4' -карбокси лат
3.6.6.(4'Л5)-2'-{[(£)-3(3-гидроксиметиландрост-5-ен-17-илиден]метил}-^М-диметил-4',5'-дигидро-1 ',3'-оксазол-4'- 122 карбоксамид.
3.7. Молекулярное моделирование 123
3.8. Биологическая активность синтезированных соединений 125
3.8.1. Культуры клеток 125
3.8.2. Влияние соединений на жизнеспособность клеток 125
3.8.3. Влияние соединений на уровень биосинтеза холестерина и триглицеридов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 127
ВЫВОДЫ 129
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 130
ВВЕДЕНИЕ
Стероиды - важнейший класс регуляторных молекул, возникший в процессе эволюции живых организмов. В течение многих десятилетий стероиды приковывают к себе внимание биохимиков, эндокринологов, медиков, химиков и фармакологов. Направленная химическая модификация стероидной молекулы является одним из наиболее эффективных и плодотворных подходов к созданию новых биологически активных соединений. Синтетические стероидные производные были и остаются в настоящее время важнейшим инструментом для фундаментальных исследований в различных областях биохимии, медицинской химии, эндокринологии, клеточной и молекулярной биологии, а также основой для разработки новых лекарственных препаратов.
Среди синтетических биологически активных стероидов важное место занимают азотсодержащие производные (азастероиды). В настоящее время разработаны общие подходы к синтезу производных стероидов, содержащих атомы азота в различных положениях цикла и в периферических заместителях, а также к синтезу аналогов стеринов и желчных кислот с азотсодержащей боковой цепью. Синтетические схемы постоянно совершенствуются, развиваются и дополняются новыми, что обеспечивает возможность получения множества новых биологически активных азастероидов. Работы по синтезу и структурному исследованию азастероидов ежегодно цитируются в тематических обзорах "Steroids: reactions and partial synthesis", публикуемых в журнале "Natural Products Reports".
Успехи в рациональном дизайне азастероидов и результаты биологических испытаний свидетельствуют, что для новых соединений этого ряда можно предсказать наиболее вероятные биологические мишени, а успешный поиск новых азастероидов с заданной биологической активностью целесообразно проводить среди соединений, обладающих определенными структурными особенностями. В частности, стероидные производные, модифицированные азотсодержащими заместителями в кольце D являются эффективными и специфичными ингибиторами важнейших ферментов из семейства цитохромов Р450 [1,2], агонистами или антагонистами стероидных рецепторов [3,4], регуляторами сигнальных процессов в клетке [5]. Соединения этого ряда обладают высоким фармакологическим потенциалом, некоторые уже используются в практической
медицине, как средства для лечения андроген-зависимых онкологических заболеваний [6-9], а также как лекарственные препараты с противовирусной, противогрибковой, анти-бактериальной и анти-паразитарной активностью [10,11].
Дизайн, синтез и изучение новых стероидных производных с азотсодержащими заместителями в кольце Б, обладающих разной структурой и различной ориентацией азотсодержащего фрагмента относительно стероидного цикла, привлекают пристальное внимание химиков в течение двух последних десятилетий. В настоящее время химический синтез этих соединений представляет собой обширную и хорошо разработанную область (см. обзор литературы настоящей диссертации). Тем не менее, прогресс в этой области во многом сдерживается сложностью, трудоемкостью и высокой стоимостью существующих методов. Очевидно, что поиск новых синтетических схем, разработка эффективных экспериментальных методик и получение новых стероидных производных с азотсодержащими заместителями в кольце Б являются важной и актуальной задачей.
Настоящая диссертационная работа является составной частью исследований, проводимых в лаборатории Синтеза физиологически активных соединений ФГБУ "ИБМХ" РАМН в рамках направления "Поиск молекулярных мишеней, компьютерное конструирование и получение биологически активных веществ, исследование их фармакологического действия и безопасности. Создание систем транспорта лекарств"
Цель настоящей работы - создание оригинальной схемы синтеза 21-азотсодержащих стероидных производных на основе перегруппировки 20-кетостероидных 17,21-дигалогенидов под действием аминов.
По этой схеме в данной работе осуществлен синтез двух серий новых азотсодержащих стероидных производных - изомерных 17(20)2- и 17(20)£-прегна-5,17(20)-диен-21-оил амидов и 2'-{[(£)-андрост-5-ен-17-илиден]-
метил}оксазолинов с различными функциональными заместителями в азотсодержащем фрагменте.
Наличие в синтезированных соединениях сопряженной 17(20)-двойной связи приводит к конформационно жестким структурам с различной ориентацией боковых заместителей по отношению к стероидному фрагменту. Эти структурные особенности, очевидно, должны влиять на свойства синтезированных соединений в биологических системах.
В ходе выполнения данной работы были поставлены и успешно решены следующие задачи:
1) Изучение перегруппировки 17а-бром-21-иод-Зр-ацетоксипрегн-5-ен-20-она в Зр-ацетоксипрегна-5,17(20)-диен-21 -оиламиды.
2) Получение, характеристика, структурное исследование и молекулярное моделирование изомерных 17(20)2- и 17(20)£-прегна-5,17(20)-диен-21-оил амидов.
3) Разработка метода циклизации 17(20)2-и 17(20)£-прегна-5,17(20)-диен-21 -оил-(2'-гидроксиэтил)-амидов; синтез, структурное исследование и молекулярное моделирование 2'- {[(£)-андрост-5-ен-17-илиден]- метил} оксазолинов.
4) Первичное тестирование биологической активности синтезированных соединений в культуре клеток млекопитающих.
Основные положения, выносимые на защиту.
1) Перегруппировка 20-кетостероидных 17,21-дигалогенидов под действием аммиака, первичных и вторичных аминов, приводящая к смеси соответствующих 17(20)2- и 17(20)£-прегна-5,17(20)-диен-21 -оиламидов.
2) Синтез 17(20)2- и 17(20)£'-прегна-5,17(20)-диен-21-оиламидов, различающихся структурой амидного фрагмента, разделение 17(20)2- и 17(20)£-изомеров; определение конфигурации заместителей при двойной связи 17(20) и структурное изучение синтезированных соединений.
3) Циклизация 17(20)2- и 17(20)£'-прегна-5,17(20)-диен-21-оил-(2'-гидроксиэтил)-амидов в 2'-{[(£)-андрост-5-ен-17-илиден]-метил}оксазолины; синтез,
структурное изучение и молекулярное моделирование синтезированных соединений, в том числе (4'/?)- и (4',5)- 4'-замещенных 2'-{[(£)-андрост-5-ен-17-илиден]- метил} оксазолинов.
4) Обнаружение способности 17(20)£'-прегна-5,17(20)-диен-21 -оиламидов и 2'-[ (-£)-андрост-5-ен-17-илиден]-метил }оксазолинов регулировать биосинтез холестерина и триглицеридов в клетках Нер 02, а также моделировать биологическую активность эндогенных стеринов, оксигенированных в боковой цепи.
ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ
Ас20 - ангидрид уксусной кислоты;
АсОН - уксусная кислота;
AIBN - динитрил азобисизомасляной кислоты;
BINAP - 2,2'-бис(дифенилфосфино)-1 Д'-бинафтил;
BzCl - бензоил хлорид;
DCM - метилен хлористый;
DDQ - 2,3-Дихлор-5,6-дициан-1,4-бензохинон;
DEAD - диэтилазодикарбоксилат;
DHP - дигидропиран;
DIAD - диизопропилазодикарбоксилат;
DibaH - диизобутилалгоминийгидрид;
DIC - (диметиламино)изопропилхлорид хлоргидрат;
DIPEA - диизопропилэтиламин;
DMAP - 4-диметиламинопиридин;
DMCA - 1\[,]\[-диметиламид Зр-гидроксихол-5-еновой кислоты;
DMF - 1Ч,М-диметилформамид;
DMSO - диметилсульфоксид;
EDC - 1,2-дихлорэтан
Et3N - триэтиламин;
ЕЮ Ас - этиловый эфир уксусной кислоты ЕЮН - этиловый спирт
FmocOSu - 9-флуоренилметил N-сукцинимидил карбонат;
HepG2 - линия клеток гепатобластомы человека;
HFIP - гексафтороизопропиловый спирт;
НМРА - гексаметилфосфотриамид;
HOBt - N-гидроксибензотриазол;
КО Ас - ацетат калия;
LDA - литий диизопропилами;
LNCaP - линия клеток карциномы простаты человека;
LXRa и LXR(3 (liver X receptors) - активируемый (248)-24,25-эпоксихолестерином
ядерный рецептор, контролирующий экспрессию многих генов, учавствующих в
метаболизме липидов и липопротеинов; существуют альфа- и бета- изоформы;
MCF-7 - линия клеток карциномы молочной железы человека;
шСРВА - м-хлоропероксибензойная кислота;
MeCN - ацетонтрил;
Mel - иодистый метил;
МеОН - метиловый спирт;
MsCl - метансульфонилхлорид;
МТТ - 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид;
MW - микроволновое излучение;
NaOAc - ацетат натрия;
NaOEt - этилат натрия;
NBS - N-бромсукцинимид;
n-BuOH - н-бутиловый спирт;
NH4OAC - ацетат аммония;
PBS (phosphate buffered saline) - фосфатсодержащий физиологический раствор; РСС-А1203 - пиридиний хлорхромат на оксиде алюминия; PhMe - толуол;
PPTS - пиридиний-4-толуолсульфонат;
PS-TrCl - трифенилхлорметан на полистирольной подложке;
p-TSA - п-толуолсульфокислота;
Ру- пиридин;
РуВОР - бензотриазол-1-ил-окситрипирролидинофосфоний гексафторофосфат;
SREBP (sterol regulatory element-binding protein) - регуляторный белок, протеолиз
которого контролирует экспрессию важнейших генов стероидогенеза;
TBAF - тетрабутиламмоний фторид;
TBSC1 - трет-бутилдиметилсилил хлорид;
t-BuOK - трет-бутилат калия;
THF - тетрагидрофуран;
TMG- 1,1,3,3-тетраметилгуанидин;
TMSC1 - триметилхлорсилан;
ТвС1 - п-толуолсульфохлорид.
В разделе "1. Обзор литературы" для обозначения обсуждаемых соединений использована нумерация арабскими цифрами; в разделах "2. Результаты и обсуждение" и "3. Экспериментальная часть" для обозначения исследованных в работе соединений использована нумерация арабскими цифрами в круглых скобках.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ СИНТЕЗ СТЕРОИДОВ С АЗОТСОДЕРЖАЩИМИ ЗАМЕСТИТЕЛЯМИ В КОЛЬЦЕ Э
В настоящее время во многих научных центрах и в исследовательских отделах фармацевтических компаний активно проводятся работы по химическому синтезу азотсодержащих стероидных производных, подавляющих активность некоторых ферментов из семейства цитохромов Р450 (в первую очередь ингибиторов 17сс-гидроксилазы-17/20-лиазы СУР 17, ароматазы СУР19) и 24-стерол метилтрансферазы (8МТ) - соединений с противораковой и противоинфекционной активностью). Значительное количество современных публикаций посвящено синтезу новых азотсодержащих регуляторов сигнальных процессов - агонистов и антагонистов стероидных рецепторов.
Работы по химическому синтезу азотсодержащих стероидных производных ранее неоднократно обсуждались в обзорной литературе [12-18]. В настоящем обзоре, состоящем из трех глав, собрана информация о работах по химическому синтезу биологически активных стероидов с различными азотсодержащими заместителями в кольце Б, опубликованных за последние 15 лет. В обзоре цитируются работы посвященные синтезу целевых азастероидов исходя из 17-кетостероидов (глава 1), из 20-кетостероидов (глава 2), а также прочим синтетическим подходам (глава 3). Вопросы структурного изучения полученных соединений, их взаимодействия с биологическими мишенями и установления корреляции "структура-активность" в данном обзоре не рассматриваются.
1.1. СИНТЕЗ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ ПРОИЗВОДНЫХ ИЗ 17-КЕТОСТЕРОИДОВ
Соединения, способные избирательно блокировать биосинтез андрогенов и активность 17а-гидроксилазы-17/20-лиазы (СУР 17) в клетках простаты, широко применяются в терапии андроген-зависимых онкологических заболеваний и являются наиболее эффективными препаратами для лечения рака простаты [19-23]. В рамках программы по поиску и химическому синтезу ингибиторов СУР 17 был осуществлен синтез нескольких тысяч стероидных производных с азотсодержащими заместителями в кольце Б и разработаны оригинальные синтетические схемы, включающие превращение 17-кетостероида в
)
активированное производное и последующую реакцию с подходящим нуклеофилом.
Поттер и соавторы [24] провели синтез серии ингибиторов СУР 17 - 17-пиридилзамещенных А16-стероидов 3 - 6 из 3[3-ацетоксиандрост-5-ен-17-она 1 (схема 1).
Рс1(РРИ)2С12 Ме Ртг тнг, н2о
^СЛ Ка?СО,
2. N004, МеОН/ Н20
НО
"И2пС1
СП 2
^-Рс1(РРИ3)2Вг
'К^гпа
Рс1(РРН3)2С12
2. ЖаОЯ, МеОН/
н2о
[4-Ру(МеО)3В] и Рс1(РРИ3)2С12
4(55%) 5 (53%)
Схема 1
Кетон 1 был превращен в 17-енолтрифлат 2 обработкой ангидридом трифторметансульфокислоты в присутствии 2,6-дитретбутил-4-метилпиридина, и полученный продукт 2 вводился в реакцию с пиридилсодержащими нуклеофилами в присутствии палладиевых катализаторов Целевые продукты получали после удаления ацетатной защиты. В синтезе 17-(3-пиридил)-андроста-5,16-диена 3 в качестве реагента и катализатора использовались: диэтил(3-пиридил)боран и бис-(трифенилфосфин)палладий(П) хлорид; в синтезе 17-(2-пиридил)-андроста-5,16-диена 4 использовались (2-пиридил)цинк хлорид и (изопропенил)-бис-(трифенилфосфин)палладий(П) бромид; в синтезе 17-(2-пиридилметил)-андроста-5,16-диена 6 использовались (2-пиколил)цинк хлорид и (изопропенил)-бис-(трифенилфосфин)палладий(П)-бромид. Из-за нестабильности 4-пиридил-
металлоорганических реагентов в синтезе 17-(4-пиридил)-андроста-5,16-диена 5 был использован полученный in situ триметокси-(4-пиридил)боронат лития в присутствии бис-(трифенилфосфин)палладий(П) хлорида.
Хартман и соавторы [25] использовали тот же 17-енолтрифлат 2 для получения серии стероидных оксимов 11-14, ингибирующих СУР 17 (схема 2).
2
Схема 2
Реакция 17-енолтрифлата 2 с этилвиниловым эфиро�
