Синтез разветвленных олигосахаридов - фрагментов О-антигенных полисахаридов Salmonella и растительного ксилоглюкана тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ
Нечаев, Олег Анатольевич
АВТОР
|
||||
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
1993
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.10
КОД ВАК РФ
|
||
|
vv» v
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ' ИНСТИТУТ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ имени Н.Д.ЗЕЛИНСКОГО
На правах рукописи
УДК 547.458,118,915.5.057:579.842.14:577.124.5
НЕЧАЕВ Олег Анатольевич
Синтез разветвленных олигосахаридов - фрагментов О-антигешшх полисахаридов Salmonella и растительного ксилоглюкана
02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природ!шх и физиологически активных веществ■
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва 1993
Работа выполнена в лаборатории химии углеводов ордена Трудового Красного Знамени Института органической химии имени Н.Д.Зелинского Российской Академии наук
Научные руководители: доктор химических наук, профоссор ШИБАЕВ В.Н. кандидат химических наук ТОРГОВ В.И.
Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Дмитриев Б.А. кандидат химических наук, доцент Морозова Н.Г.
Ведущая организация: Российский Государственный Педагогический Университет имени В»И.Ленина.
Защита состоится "4$.". .Ч-.^НЛ____ 1993 г.
лл0 °
в и.лУ." часов на заседании специализированного, совета К 002.62.02 в Институте органической химии им. Н.Д.Зелинского РАН (П7913 Москва, Ленинский проспект, 47, конференц-зал).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института органической химии им. Н.Д.Зелинского РАН
Автореферат разослан Л&.ЧЖ.. 1993 г.
Ученый секретарь специаличгтпр|йннпт,п совета К 002.62.02,
доктор химических наук
Н.Я.Григорьева
Актуальность проблемы. Исследование связи структуры, тформяции и биологической активности сложных уг.чпводсодержа-IX биополимеров - одна из важнейших задач современной гоорганичоской химии. Существенное место в решении этой подочи шимаот целенаправленный синтоз олигосяхаридов определенного •роения, необходим« для проведения структурных, шко-химических и биологических исслодовпний.
Предметом настоящей работа является направленный мичеекий синтез ряда разветвленных олигосахаридов и их юизводннх, которые представляют значительный интерес в связи разработкой бездеструктивного метода анализа структуры тулярннх полисахаридов по их спектрам 13С-ЯМР, развитием [мико-ферментативного синтеза разветвленных бактериальных >лисахаридов, а также в связи с подавно появившимися данными » активности олигосахаридшх фрагментов растительного :илоглюкона как (Хштогормонов, что вызывает необходимость ¡следования связи структур» и биологической активности в этом [ду соединений.
Цель работы. Настоящая работа состоит из двух частой, ¡утри каждой из которых решаются две конкретнее синтетические дачи.
Целые первой части работа является сиитез разветвленных псах аридных Фрагментов о-специфических полисахаридов льмонелл серогрунн В и С3> а также родственных соединений. В мках этой части решились следующие задачи:
1. Синтез набора производи!« разветвленных грисахаридов, держащих остаток (5 м^тил-Пгалактопирпнозида, гликозилирован-Я но пишшалмшм СИ-группам различными моносахаридами, а
кже родственных дисахарилшх производных.
1
2. Синтез полипренилполифосфатных производных да-трисахаридов, представляющих интерес как Возможные субстрат химико-ферментативного синтеза разветвленных О-специфически полисахаридов Сальмонелл.
Целью второй части работа бил синтез разветвлении олигосахаридов-фрагмонтов растительного ксилоглюкана. литературе имелись данные об антиауксишюй активност нонаеахаридного фрагмента этого полисахарида. В связи исследованием связи структуру и биологической активности 5тог соединения были поставлены следующие синтетические задачи:
1. Синтез шнтасахаридного фрагмента ксилоглюкана соответсгьуилцого по структуре "правой части" биологическ; активного нонасахарида, а также его трисахаридного фрагмента.
2. Синтез тетрасахаридаого фрагмента, отвечающего "лево; части" биологически активного нонасахарида, а также ег аналогов, содержащих остаток р-В-ксилогшранозы.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые
синтезированы разветвленные трисахариддые фрагмент!
О-антигешшх полисахаридов бактерий рода 8аЫопеИ>
серологических групп В и С3 и некоторые их модифицирование
аналоги. Исследование 13С- и 1Н-ЯМР спектров получении:
соединений позволило получить даяние о связи структуры 1 я
конфирмации и С-ЯМР спектров олигосахаридов при вининально: замещении остатка галактозы.
Шесть полученных олигосахаридов превращены ] соответствующие а-моратгренилдифосфатные производные, которые били использованы для получения химико-ферментативным синтеза разветвленных 0-антигенных полисахаридов £. кетиску и 5 гургЛтиПт или, их аналогов.
Впервые синтезированы три-, тотрн- и пеитасахаридше агмонти растительного ксилоглюкаиа. Исследование полученных единений позволило обнаружить высокую биологическую тивность для пентасахаридного Фрагмента.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на кон-рсо молодых .ученых ИОХ РАН (1989 г.), VIII Всесоюзной нфорепции по 'химии и биохимии угловодов (Тбилиси, Í987 ), V ропоПском симпозиуме по углеводом (Прпга, ЧСФР, Í989), XV ждупародном симпозиуме по углеводам (Иокогама, Япония, 1990), Советско шведском симпозиуме по химии и биохимии угловодов унл, Швеция, 4РЭ0).
Публикации. По теме диссертации имеотся 11" публикаций. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, терятурного обзора, посвященного синтезу разветвленных нгосахаридов, обсуждения результатов, экспериментальной части выводов. Работа изложено на ? стр., содержит < рис., с. табл. и Ж литературных ссылок.
Содержание работы Синтез олигосахаридов, моделирующих фрагменты О-антигенных полисахаридов Salmonella
В рамках первой части работы был проведен синтез 5ора олигосахаридов - производных метил-р-П-гплоктопиршюзи-, включашцего в собя десять дисахаридоп, в которых остаток гил-р-Р-галактозы моногликозилирован по ОН-2, 01Г-3 или, ОН-4 -10)*, четыре трисахарида с вицинальшм З^-зпмевдетк-м 1-14) и семь триспхяридов с вицинальным ?,,.Ч-эг1мещенным ¡-21).
¡al, Glc, Mnn, Xyl -D-конфигурацил. Filia, Fue -I,--конфигурация.
Glcwl-4Gaip0Hu 1: w-a; 2: utp; Manul-3GalpOMe 5: (¿=a; 6: Glcul 3GaipOMu 3: u>=a; 4: w=p; Rliawl -3GalpOMe 7: uwi; 8: u>=p Glcu)1-2CaipOMu 9: 10 u^p;
Manal-3(Glcu1-4)GaipOMe Rhaa1-3(Glcwl • 4)GalpOMe
11: 12: u^p 13: ома; 14: w=(3
Glcul-2 (Manal-3)GalpOMo Clcw1-2(IUiaa1-3)GalpOMti
15; w»a; 16: u-p 17: u-a; 18: w-p
Glcal-2(Glcw1-3)GaipOMu Glcp1-2(Ulcp1-3)GuipOMu
19: u^p; 20: w=-a; 21
Схема синтеза разрабатывалась с расчетом боле
рационального получении моделей для комплексных структурных
Ф13ико-хммичйских и биохимических исследований. Объектами там
исследований в данной работе являются О-сгюцифичоск»
полисахарида S.typtitmurlm (coporpyima В) 22 и S. kentuct
(серогрупно Сд), причем для последнего полисахарида первонач«
льно била предложена структура 23, о затем (по результат
исследований нашей лаборатории) - структура 24.
-2)Маш1 -4Rhaa1-3Gal (а1 - -4 )Шшр1 -2Ыапа1 -2Mam1 -3Gal (pi -3 4 3 X
loAbe laGlc . laAbe Glcal
23: X=4
22 S. typhlmurlvm 24: X=2 s- bentuck¡j
Для анализа спектров 13С-ЯМР полисахарида S. копIиску его фрагментов с цель») однозначного подтверждения структур было необходимо иметь модельные соединения, соответствуют структурам 11 и 15. В этой связи витал вопрос о более детали! исследовании спектров ПМР и 13С-ЯМР раэьотшютшх трисахаридо содержащих остаток галактозы, гликоэилиронашшй по ОН 2 и ОН или ОН-3 и ОН-4, и соотьчтствуицих модельных дисахаридов. Э задача обусловила выбор структуры дисахаридов и разветвлен)!
рисзхаридов, синтез которых был осуществлен н настоящей абото. Для облегчения спектроскопических исследований все «дельные соединения этого ряда получены в виде р-мотилгликози-:ов. Кромо конкретных структурных исследований полисахарида 5. :еп1иску синтезированный набор соединений позволяет изучить 1лия1гие осношшх структурных Факторов на спектры 13С-ЯМР в ютатке (З-В-галактоггаранозы, замощенном по вицинолышм •идроксилыгам группам,.что крайне полезно для изучения строения (ругих полисахаридов, содержащих такие остатки.
Наряду с р-мотилгликозидами, нами был осуществлен также шитез некоторых полипренилпирофосфатсахаров, представляющих штерес для биохимических исследовании. Разработанный в нашей 1аборатории химико-ферментативный подход к синтезу •етерополисахаридов бактерий предполагает получение химическим митозом или комбинацией химических и ферментативтх реакций юлипренилпирофосфатолигосахаридов - биосинтетических предшественников бактериальных полисахаридов и проведения заключительной поликондчнсации повторяющихся звеньев с помощью (юрментатипной реакции. Для . проверки ' применимости шмико-ферментатитюго подхода к синтезу разветвленных толиспхаридов Э. 1урЬ.[тиг1ш и 5. ^»хсйт/ и их
юдиФициропанннх производных было необходимо иметь
юлипречгалпирофосфатные производные дисахаридов 25, 26 и разветвленных трисахаридов 27-30.
31си1 -2Па1(а)-рр- Мрг ГШяа!-3(01сш1 -4)Ся1(а)-рр-Мрг
55: «-а; 26: о>-р 27: о>-а; 20: <.)=•()
Пси1 -2(Мапа1 -3 )Са1 (а) - рр-Мрг 29: м=а; 30: о>-р
НоС.
Мрг = ^ )ОС11-СН
НоС усп-■3 у,-Г, с
гли /01! п3су чн
1.1. Синтез дисахаридов и разветвленных трисахаридов 1.1.1. Производные трисахаридов с остатком И-галактозы, заиа-щанныы по 0-3 к 0-4, и соответствующие ыодельные дасахариды.
Для синтеза олигосахаридов 1-14 в качестве ключевого предшественника сил использован метил-2,6-ди-0-бензил-р-В-талакто-пиранозид 31. Его взаимодействие с диэтилацеталем бензальдеги-да в присутствии р-толуол'сульфокислоты приводило к смеси экэо-и знОо-бензилиденовых производных 32 и 33 с выходами 44% и 47%, соответственно. Восстановительное раскрытие бензилиденовогс цикла с помощью реагента А1С13-ЫА1Н4 протекало с высокое стереоизбирательностью - продуктом реакции в случае соединена 32 был метил-2,3,6-три-0-бензил-р-Б-галактопиранозид 34 (выхо; 80%), а в случае соединения 33 - метил-2,4,6-три-0-бензил-р-О-галактошранозид 35 (85%).
Эти моногидроксильные производные . были использованы, соответственно, в синтезе (1-4)- и (1-3)-связанных, дисахаридов, а для получения трисахаридов 11-14 исходным веществом служи; метил-2,6-ди-0-бензил-3-0-бензош1-р-Ю-галактопиранозид 36, полученный из диола 31 селективним бензоилированиом (см. схему 1)
СН30Вг>
ко/ о
ОМа
Схема 1
он«
ОВп
ОВп
ОВп
1 РШ1(0Ег)2, 11 ИА1Н4-А1С13, Ег20; 1И ВгО!, Ру, 4°С.
Взаимодействие 2,3,4,6-тотра-0 -ацетшьа-Г-манношфпнозил -бромида 37 с галактозидом 35 в условиях реакции Гельфериха СНв(СМ)2, СНдСШ приводило с выходом 94% к защищенному производному 38. Аналогично гликозилированием галактозида 35 2,3,4-три-0~ацетил-а-Ь-рашюпиранозилбромидом 39 било получено дисахаридное производное 40 с виходом 95% (схема 2).
Схема 2.
СНаОАс СНаОДс СН3ОВп
35 • 6
37 38 овп
1 Ий(СМ)2. СН3СМ, 4 А; 11 Г) ИеОКа, МеОН, 2) Рй/С, 1{?.
Синтез дисахаридов 6 и 8 с 1,2-цис-конфигурацией маннозидной и рампозидной связей включал гликозилирование моногидроксильного 1фоизводного 35 бромидами с несоучаствуетцей группой при С-2. При взаимодействии 2,3-0-карбонил-4.г щ-0-ацетил-а-Б-маннопиранозилбромида 41 с галактозидом ■-> в присутствии А£?0 образуется зэщищогаюе производное 42 с выходом 51%. Взаимодействие 2,3-0-кар0ошл-4~0-ацетил-а-Ь-рамнозилбро-мида 43 с галактозидом 35 в аналогичных условиях приводило с выходом 42% к защищешюму производному 44 (Схема 3).
Для синтеза дисахаридов 1-4 мы использовали нестереоспецкфичность гликозилироватьт 2,3,4,6-тетра-0-бензил--а-Г-глюкопиранозилбромидом 45 в системе ОЛ^С^-НвССН^, что
Схема 3
СНаОАс
СН20Дс СН20Вп
35
43
V
V 44
ОВп
1 л«20. СН2С12, 4А; 11 1) МеСШ, МеОН, 2) Рй/С,
позволяет сразу получить необходимую пару изомеров (схема 4
СНаОВп
СН,ОВп СНдОВп
-о _„ )-о
, ОВп ВпО\| /Вг
34
45
ОВп
Вп1
СНаОВп
СНаОВп
оме 11
Вп(
45 + 35
I Н8(СЮ2, СН2С12. 4А
II РЙ/С, н2
Вп(
11
ВпО
СНаОВп СНаОВп
чоме 11 овп 49 овп
8
4
ликозилирование бромидом 45 галактозидов 34 и 35 привело в эрвом случав к смоси(а1-4/-и (р1-4)-производных 46 и 47 (выделен-их с помощью ВЭЖХ с выходами 44% и 46%), а во втором случае к иеси.(а1-ЗЬ и (р1-¿^-производных 48 и 49 (выходы 45% и 47%).
При аналогичном • гликозилировании 3-0-бензоильного роизводного 36 бромидом 45 (схема Б) образуется смесь (а1-4Ь и 1-4-дисахаридов 50 и 51, выделенных ВЭЖХ с виходами 24% и 50%, □ответственно. Омшюше производных 50 и 51 обработкой втилятом натрия в метаноле приводит к моногидроксилышм роизводным 52 и 53, которые служили исходными веществами для интеза разветвленных трисахаридов 11-14.
СН,ОВп
СН,ОЭп
45 + 36
Нй(СЮ2, СН2С12,
4А
Вп(
Вп(
Схема Б.
?Мв 50: И = В2 52: Я = Н
51: И = Вг 53: И = Н
ОВп
ОВп
Мтпюзилированиэ соединений 52 и 53 ацетоброммашюзой 37 в гловиях реакции Гольфориха (Нй(СН)2> (Ш3СИ) дало защищенные рисахариды 54 и 55 с выходами 80% и 75%. Подобным жо образом змнозилированиэ ацетобромрамнозой 39 производных 52 и 53 дает эщищеннне трисахариды 56 и 57 с выходами 73% и 85%.
Удаление защитных групп с полученных производных 46-49, 3, 42, 40, 44, 54-57 приводило с высокими выходам ¡с эответствующим свободным метилгликозидам 1-8, 11-14.
он«
55 (Я = ^>-»-12
57 (Н =
ОВп ОВп АсО О Ас
1.1.2. Производные трисахаридов с остатком Б-галактозы, заме. щешшм по 0-2 и 0-3 и соответствующие модельные дасахарида.
При синтезе разветвленных трисахаридов 15-21 первоначально были получены защищенные производные (1 -2)- связанных изомерных дисахаридов 9 и 10 со свободной гидроксильной группой при С-3.
В качестве исходного соединения был выбран мэт1«-3-0-бензоил-4,б-ди-0-бензил~рЧ)~галактогшранозид 58, синтез которого, включающий в качестве ключевой стадии селективное 3-0-бензоилирование метил-4,6-0-бензил-р-В-галакто-пиранозида, подробно описан в диссертационной работе. Для синтеза дисахаридов 9 и 10 мы использовали подход, основанный на нестереоспецифичности гликозилировашя . производного 58 глюкозилбромидом .45 в системе СН2С12-Н£(СН)2 (схема 6). Гликозшшрование бромидом 45 галактозида 58 привело к смеси производных 59 и 60 с а- и ^-конфигурацией гликозидной связи, продукты выделены ВЭЖХ с выходами 42% и 50%. Омыление дисахаридных производных 59 и 60 дало моногидроксилыше производные 61 и 62, которые служили исходными веществами для синтеза разветвленных трисахаридов 15-21, а в результате гидрогенолиза соединений 61 и 62 получены дисахариды 9 и 10.
. ВпО
ОН«
45
1 не(сш2, сн2с12,
Взаимодействие ацетобромманнозы 37 с производными дисаха->идов 61 и 62 в условиях реакции Гольфериха [Нз(СИ)2, СН3СЫ] гриводило к защищенным трисахаридним производным 63 и 64 с ¡нходом 86% и 87%. Подобным же образом рамнозилирование [роизводных 61 и 62 ацетобромрамнозой 39 в аналогичных условиях ,ает защищенные трисахариды 65 и 66 с выходами 94Я и 96%.
СНдОВп СН,ОВп
.ОМ*
Вп<
?п<
61 (Н=Н)
63 Ш=Я,)-*-15
65 (Н=%)-«-17
68 (й=В)-»-20
69 (Н=А)-»-19
62 (П-Н)
64 (Н=Я<)-*-16
66 (П=1у —*-18
67 (Н=В)-*-21
СН,ОАс / АсО\
оТЗИ'
Дс(
V
АсО ' ОДа
СНдОАс
Ас(
ОАс
О Ас
икозилирование производных 61 и 62 ацетобромглюкооой в.
аналогичных условиях приводило к разным результатам. Если i случае производного 62 нарушения стереоспецифичности hi наблюдалось и ожидаемый трисахарид 67 с ß-конфигурацией (1-2)-: (1 -3)-глюкозилгалактозидшх связей образовывался с выходом 93% то в случае производного 61 в результате глинозилировани получена пара изомеров 68 и 69 с (01 -3)-глюкозилгалактозидно связью, которые выделены ВЭЖХ с выходами 44Ж и 11% соответственно.После омыления производных 63-69 и последующег гвдрогенолиза получены свободные трисахариды 15-21.
1.1.3. Исследование спектров ЯМР свободных олигосахаридов
Данные 13С-ЯМР спектров полученных олигосахаридов, во все случаях однозначно подтверждающие приписываемую им структуру более подробно обсуждены в диссертации. Совместно с д.х.н А.С.Шашковнм и д.х.н. Г.М.Лишиндом был проведен боле детальный анализ влияния структуры олигосахаридов на эффект гликозилирования в спектрах 13С-ЯМР, детальное исследование v. спектров 1Н-ЯМР, включающее определение ЯЭО и конформационнъ анализ синтезированных олигосахаридов. Результаты этой, работь имеют существенное значение для выяснения связи структурь конформации и спектров ЯМР олигосахаридов, а также для развита бездеструктивного метода определения.строения полисахаридов.
1.1.4. Превращение иетилгликозидов в соответствующие полные ацетаты олигосахаридов
Ацетилирование метилгликозидов 9, 10 и трисахаридов 13-' и последующий ацетолиз производашх 70-75 (2% HgS04, Ас20, 4 ' 20°С) приводили с выходами, близкими к количественным соответствующим октаацэтатам 76 и 77 и ундекаацетатам 78-8 которые служили исходными соединениями при синте: а-гликозилфосфатов - производных этих олигосахаридов. Д
70,76 Нз=Н4=Ас, П2=А; 71,77 Н3=Н4=Ас, Н2-В; 72,78 Н2=Лс, 1^=11, Н4=А; 73,79 Н^Ас, 1^=5, Н4=В; 74,80 И2=А, Н3=Р1) й4=Ас; 75,81 Г^В, Яд^й,, Я4=Лс.
дополнительного подтверждения неизменности углеводного состава в процессе ацетолиза ацетаты 78 и 79 путем омыления метилатом натрия в метаноле переводили в свободные трисахариды 82 и 83.
1.2. Синтез полипренилпирофосфатсвхаров
Исходными веществами для синтеза целевых полилренил-пирофосфатолигосахаридов .являются а-гликозилфосфаты - производные олигосахаридов.
Сплавление ацетатов 76-81 с 6-8-кротным избытком безводной фосфорной кислоты (2 ч, 60°С, в вакууме) с последующим омылением действием ИОН и очистка ионообменной хроматографией привело к а-гликозилфосфатам 84-89 с выходами 40-60%. . С1сш1-2аа1(а)~Р 84: а>=а; 85: а>=Р;
Ш1аа1 -3(С1сш1 -4)0а1 (а)-Р 86: 87 «=р; 01со}1-2(Мапа1-3)Са1(а)-Р 88: и=а; 89
Отроение гликозилфосфатов 84-89 однозначно следовало из анализа их 13С-ЯМР спектров, данные которых и их обсуждение правопет в диссертации.
Для получения полипренилпирофосфатолигосахаридов был в качестве исходного вещества использован фосфат морапренола (растительный ундекапренол три-транс-, поли-цис-типа из листьев шелковицы (см. формулу на стр. 5), который близок по строению к бактериальному ундекапренолу, относящемуся к ди-транс-, поли-цис-типу). При синтезе пирофосфатов применен разработанный в нашей лаборатории ' метод, основанный на реакции полипренилфосфоимидазолидов с незащищенными гликозилфосфатами.
О 0 0 0
+ Бив-0-1-0Н :-»- Мгр-О-Ы-О-Бие
ЫНз-иА ^ 8*1-89 ¿Н-гНОсЦ 2£-30 нА ¿Н-2Ж3
Бия: Й1си)1 -2Са1(а)- 84,25: ю=а; 85,26: и=р;
Ш*а1 ~3 (С.1.сы1 -4)Са1(а)~ 86,2Т: ш=а; 87,28: и=р;
С1си)1-2(Мапа1-3)Са1(а)- 88,29: ш=а; 89,30: ы=р;
Взаимодействие морапренилфосфоимидазолида 90 (получен из морепренола и кароонилдиимвдазола) и бис-(три-н-октил)аммониевой соли гликозилфосфатов 84-89 в смеси абс. ТНР-ШЗСМ:1 (37°С, 18 ч) приводило к полипренилпирофосфатсахарам 25-30. Целевые соединения 25-30 были очищены ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-целлшозэ и получены с выходом 25-30%. Строение соединений 25-30 было подтверждено результатами специфической деградации под действием фенола или водного аммиака.
Проведенные в нашей лаборатории Т.Н.Дружининой и О.В.Сизовой биохимические исследования соединений 25-30 показали, что данные соединения можно ферментативными реакциями достроить до биосинтетических предшественников соответствующих О-антигешшх . полисахаридов ЗаШопеЫа или их аналогов, содержащих повторяющееся звено с. остатком а- или р-глюкозы в разветвлении и. использовать их в реакциях ферментативной
полимеризации. В результате . бил впервые осуществлен химико-ферментативный синтез регулярных разветвленных полисахаридов, соответствующих О-специфическим полисахаридам Salmonella серогруппы В и С3, лишенным 3,6-дидезоксисахара С91, 93), и их аналогов (92, 94). В более поздней работе синтезированные нами полипренилпирофосфатолигосахариды бы,пи применеш для синтеза полных О-специфических полисахаридов S. typhlmurlvm 22 и S. Kentucky 24.
-2)Mam1-4Rhaa1-3(Glcu>1-4)Gal(a1- 91: ш=а; 92: w=ß
-4)Rhaß1 -2Мапа1 -2Маш1 -3(Glcwl-2)Gal(ßl- 93: o>=a; 94: w=ß
2. Синтез фрагиентов ксилоглюкана растительных клеток
Вторая часть диссертационной работы посвящена синтезу олигосахаридов 95-97 - фрагментов ксилоглюкана клеточной стенки растительных клеток, а также' их аналогов, содержащих остаток ß-D-ксилопиранози - -олигосахаридов 98 и 99.
Растительный ксилоглюкан содержит линейную цепь из Р(1-4)-связашшх остатков D-глюкозы, которые на 60-75% замещены по 0-6 остатками a-D-ксилозы, последние, в свою очередь, на 20-40% ß-D-галвктозилированн по 0-2 и, наконец, некоторые из остатков галактозы замещены a-L-фукозой по 0-2. При расщеплении данного полисахарида действием эндо-1,4-0-глюканазы образуется ряд олигосахаридных фрагментов, среди которых основной
Fucal -2Galß1 -2Xyl 95 Fuca1-2Galß1-2Xyla1-6Glc(J1-4Gl<; 96
Xylu1-6Glcß1 -4(Xyla1-6)C.lc 97: м; 98: u=ß Glcß1-4(Xylß1-6)Glc 99 1aXyl 1aXyl
i 4
Glcß1-4Glcß1-4Glcß1-4Glc 100 6
?uca1 -2fial ßl -?.X,y lal
компонент - нонасахарид 100 обладает высокой биологической активностью как ингибитор ауксина. Выбор целевых олигосахаридов 95-99 связан с тем, что доступность этих соединений, позволяет начать биологические исследования по выявлению связи структуры олигосахаридаых фрагментов ксилоглюкына с их биологической активностью.
2.1. Синтез трмсахарнда Fuca1-2Gaipi-2Xyl (95)
Схема синтеза трисахарида 95 заключалась в ступенчатом наращивании моносахаридних остатков на невосстанавливающий конец цепи и предполагала первоначальное галактозилирование по ОН-2 моногидроксилыюго производного ксилозы.
RÓ
Vf
О Ас OR
Не
101: R=Ac 103 Н=0Ас 105 R=Ac
102: R=Bn 104 Н=Вг 106 R=H
I 1) Н+; 2) Ас20, Ру; 3) НВГ, СН2С12.
II 1) Hg(CN)г, СН3СГ?, А110Н; 2) МеоМ,
В качестве исходного производного ксилозы нами был выбран аллил~3,4-да-0-0ензнл-р-Б-ксилошранозид 106, который получали в шесть стадий, исходя из 3,4-ди-0-ацетил-1,2-метшюртоацетил--а-П-ксилопиранозида 101 (схема 7). Бензилирование ортоэфира 101 в присутствии НаОН с количественным выходом приводило к бензилгликозиду 102, из которого обработкой 90% АсОН и исчерпывающим ацетилированиом получали диацетат 103. Обработка последнего раствором НВг в С^С^ при комнатной температуре дала с количественным выходом а-бромид, взаимодействие которого с аллиловнм спиртом ССНдСЫ, Не(СН)21 привело к ¡3-эл.лижсилозиду 105. В результате омылв1шя
МеОН
последнего получен в кристаллическом виде целевой ксилозид 106.
Для введения остатка (З-Р-галактозы мы выбрали 2-0-бензоил-3,4,6-три-0-бензил-а-0-галактопиранозилхлорид 110. Для получения галактозилхлорида 110 использовали 3,4,б-три-О-бонзил-1,2-0-мотилорпоацетил-а-0-галактопиранозид 107 (схема 8). Раскрытие ортоэфира 107 90% АсОН и последующее бензоилирование количественно дало кристаллическую 1-О-ацв-тил-2-0-бензоил-3,4,6-три-0-бензоил-а-0-галактопиранозу 108,
Схема 8.
1 I) Н+; 2) Bzci, Ру;. 110: RrH> R^01-
11 1) Et3N, МеОН; 2) С1С0С0С1, DMPA
избирательное деацетилированио которой было достигнуто действием триэтиламина в метаноле при 4°С. Обработка полученного 1-ОК производного 109 оксалилхлоридом в DMFA количественно дает а-гликозилхлорид 110.
Взаимодействие гликозйлхлорида 110 с моногидроксилышм призводннм 106 с CHgCN в присутствии Hg(CN)2 с выходом 55% приводит к (1-2)связанному дисахаридному производному 111. В результате омыления соединения 111 получено кристаллическое моно-гидроксильное дисахаридное производное 112, которое использовали на заключительном этапе синтеза трисахарида 95 (схема 9).
BnO
CHjOBn
ОЛ1 |
BnO
111: R=Bz; 112: R=H i Hg(CN)2, CH3CN, 4A
Гликозилирование соединения 112 2,3,4-три-0-0ензил-а-Ь-фукопиранозилбромидом 113 в присутствии Et, ,МБг, DMPA и
о
молекулярных сит 4 А привело с выходом 97% к трисахпридному производному 114 (схема 10).
Схема 10.
вы
112
114: R|-0А11, R2=H; 115 (R^R^H.OH) -» 95 i Et4NBr, DMFA, 4A 118: R1=H, R^Cl; 119: R, =R2=H,-тиопиридил В результате удаления аллильной защиты с гликозида 114 обработкой трет.-бутилатом калия в DM30 .и последующего гидролиза 1-пропенилгликозида действием Hg(0Ac)2 в водном ацетоне с высоким выходом было получено трисахаридное производное 115 со свободным полуацетальным гидроксилом, которое, с одной стороны, использовали в синтезе пентасахаридного фрагмента ксшюглюкана 96; с другой стороны, гидрогенолиз 115 привел к свободному трисахариду 95.
2.2. Синтез пентасахарида Fucot1-2Galß1-2Xyla1-6Glcß1-4Glc (96).
Синтез был проведен по схеме (3f2) путем гликозилировагая производным трисахарида 115 первичной гидроксилыюй группы
избирательно защищенного производного целлобиози р-бенэил-2,3,6,2',31-понта-0-бензилцэллобиоэида 116. Бензилцол-лобиозид 116 получали, исходя из р-бензилцеллоОиозвда 117 путем введения 4'«б'-бонзилиденовой группы, дальнейшего бензили-рования в присутствии КОН и последующего кислотного гидролиза бензилиденовой группы. В результате кристаллический продукт 116 был выделен о 80% выходом.
СНаОВп СНа0Н
. ОВгл ч ОВгл
СВп
ОВп
116 117
Гликозидироваше 4',6'-доола 116 как гликозилхлоридом 11В
(см. схему 10) (получен из _ 1-ОН приэводного 115 действием оксалилхлорида аналогично получению 110) .в толуоле в
о
присутствии CFgSOgOAg, 2,4,6-коллидина и мол. сит 4, при ~60°С, так и тиогликозидом 119 (см. схему 10) (получен из 1-ОН производного 115 действием BüqP и дштиридилдисульфида) в С!1,С12 в присутствии Ci-Ljl, . мол. сит 4., при 50°С приводило к пентасахаридному производному 120, выход его в обоих случаях составил 15%.,
В результате гидрогенолиза производного' 120 получен нолевой пентасахарид 96.
Bnl
ОВ.Ч
ОВп
ОВп
2.3. Синтез тетрасахарида Ху1а1-6С1ср1-4(Ху1а1-6)С1с (97) и
родственных соединений.
Для синтеза тетрасахарида 97 было использовано последовательное введение остатков а-ксилозы в молекулу частично защищенного р-бензилцеллобиозида, сначала по 0Н-6, затем по ОН-6'. Для реализации такой последовательности гликозилировашя бал выбран 2,3,2',3'-тетра-0-бензил-4',6'-0-бензилиден-р-бензилцеллобиозвд 121.Исходный целлобиозид 121 получали исходя из р-бензил-4'.б'-бензилиденцеллобиозида 122
путем последовательного тритилирования, бензилирования 6-0-тритильного производного и удаления тритильной защиты.
Взаимодействие моногидроксильного производного 121 с 2,3,4-три-0-бенэил-а-0-ксилошрыюзилбромидом 123 n CH^Clg в
о
присутствии Hg(CH>2 и молекулярных сит 4 приводило к смеси а- и p-трисахаридных производных 124 и 125, выделенных с выходами 78% и 16% (схсма 11).
Удаление 4,6-бензилиденовой группы в производном 124 путем обработки СРдСООН привело с выходом 90% к трисахаридаому диолу 126, повторное ксилозилироваше которого в условиях предыдущего синтеза протекало региоизбиртелыю, и давало смесь а- и р-производных (схема 12). Тетрасахарида 127 и 128 выделены с выходами 58 и 29%, соответственно.
В результате гидрогенолиза производных 127, 128 и 125 гюлуч свободные олигосахарида 97-99.
.ОВп ЕЬйМ /Вг
121
ОВп
123
N ОВп ВпОМ / О-
Схема 11.
--СЩ
ОВп
Я1ОСНа
. ОВп
к,о
ОВп
. ОВп
ОВп ОВп
124: й^й^РШк; 126: Й,=Й2=Н. —о „
. Ойп
-сн.
ЭСН,
ВпО
РЬ
Н8(СЮ2. СН2012, 4А
ОВп н'\
-О
ОВп
ОВп
ой1
ОВп
125
99
Схема 12.
?3+126
Нв(СМ)2. сн2012, ксвп
4 Л .ВпО
овг. 128
Биологический испытания полученных синтетических фрагментов ксилоглюкана проводятся во ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН (А.В.Бабаков и сотр.). В настоящее время показано, что синтезированный нами пенгасахарид 96 обладает высокой ингибирующей активностью при стимуляции роста семядолей тыквы как цитокшшном, так и фузикокцином. При внесении его в питательную среду для культивирования незрелых зародышей пшеницы это соединешю стимулирует каллусообрэзование и вызывает ризогенез. Эти результаты показывают перспективность синтетических исследований в области синтеза олигосахаридннх фрагментов растительного ксилоглюкана; обнаруженная биологическая активность может иметь практическое значение.
ВЫВОДЫ
1. Разработана удобная схема синтеза производных разветвленных трисахаридов, содержащих остаток р-метил-Б-галактопира-нозида, глакозилированный по ОН-3 и ОН-4 или ОН-3 и ОН-2.
Впервые получены 11 соединений-этого ряда, а также 10 родствон-
1 ч 1
шх дисахаридных производных. Исследование С- и [{-ЯМР спектров полученных соединений позволило получить данные о связи структуры, конформации и ,3С-ЯМР спектров олигосахаридов при вицина.; ыюм замощении остатка галактозы, что позволяет расширить область применения разработанного в лаборатории компьютерного метода анализа структуры полисахаридов.
2. На примере производных дисахаридов и трисахаридов, являющихся фрагментами О-антигеншх полисахаридов Сальмонелл серогруппы С3 1С1са1-2Са1,Маш1-3(С1са1-2)0а1] и В
[Шта1-3(С.1са1-4)Са1], а также их аналогов, содержащих остаток р-Г-глюкопиранози, разработана оптимальная схема превращения (3-метилгликозидов в а-морапренилдифосфатше производные.
Использование этих соединений в качество субстратов позволило провести химико-ферментативный синтез разветвленных О-специфических полисахаридов Сальмонелл.
3. Впервые осуществлен синтез три- и пентасахаридного фрагментов растительного ксилоглюкана Fuccx1-2Galß1-2Xyl и Fuca1-2Galß1-2Xyla1-6Glcß1-4Glc, представляющих интерес в связи с известной антиауксинной активностью нонасахаридного фрагмента этого полисахарида. Исследование полученных соединений позволило впервые обнаружить высокую биологическую активность для пентасахарида.
4. Проведен первый синтез тетрасахаридного фрагмента другого участка молекулы растительного . ксилоглюкана Xylai-6Glcß1-4(Xyla1-6)Glc, a также его аналогов, содержащлх остаток ß-B-ксилопиранози.
Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:
1. Нечаев O.A., Торгов В.И., Шибаев В.Н., Мамян С.С. Синтез ß-метилгликозидов ди- и трисахаридов с остатком D-галактози, замещенным по 03, 04 или 03 и 04. // Биоорган.химия, т. 14. (1988). № 3. С. 359-370.
2. Нечаев O.A., Торгов В.П., Шибаев В.К. Синтез ß-мвтилгликози дов ди- и трисахаридов с остатком D-галактозы, монозомещен-ным по 02 и дизамещеншлл по 02 и 03. // Биоорган.химия.
Т. 14. (1988). Л 9. С. 1224-1233.
3. Нечаев O.A., Сизова О.В., Дружинина Т.Н., Торгов В.И., Шибаев В.Н. Превращение металгликозидов ди- и трисахаридов в морапронллтфофосфатные производные и использование пое
■ ледних для изучения субстратной специфичности маннозилтрано фораз Salmonella kcnîucky. // Биоорган.химия, т. 14. (1988). » 9. С. 1290-1292.
4. Торгов В.И., Дружинина Т.Н., Нечаев O.A., Шибаев В.Н. Синтез морипренилпирофосфатних производных З-О-а-Ь-рамиопи
ранозил- (4-0--а-В-глюко1транозил)-а~1У-глюкопиранозн и 3-0--а-Ъ-рамношфанозил-(4-0-р-Р-г,люкоггиранозил)-о.-0-глю1сотфя-нозы и исследование их субстратных свойств в реакциях Сио-синтетиза О-ашигенных полисахаридов Salmonella typhtmurlum и Salmonella cmatum. // Биоорган.химия, т. 13. (1987). №7. С. 947-957.
б. Торгов В.И., Нечаев O.A., Усов А.И., Шибаев В.К. Синтез три-сахариднго и пентасахаридного фрагментов растительного кси-логлюкана - потенциальных ингибиторов ауксина. // Биоорган.химия, т. 16. (1990). Л 6. С. 854-857.
6. Торгов В.И., Нечаев O.A., Усов А.И., Шибаев В.Н. Синтез фрагмента растительного ксилоглюкана - тетрасахарида Xylal -6GIcpt—<<Kyla.t-6)Glc и его три- и тетрасохприщшх аналогов. // Биоорган.химия, т. 17. (1991). №3. С.424-426.
7. Лшкиид Г.М., Мамян С.С., (Пашков A.C., Нечаев O.A., Торгов В.И., Шбавв В.Н., Кочетков Н.К. Ядерный эффект Оперхаузера и конформации 1-3- и 1-4-связашшх гликозилгалогенидов.
// Биоорган.химия, т. 14. (1988). J6 3. С. 340-351 .
8. Лиикиид Г.М., Шашков A.C., Нечаев O.A., Торгов В.И., Шибаев В.Н., Кочетков Н.К. Конформации разветвленных трисахаридов с вищшалышм замещением по данным ядерных эффектов Оверхаузера и теоретических расчетов. 1. Трисяхяриды с замещением по положениям 3 и 4 остатков галактозу.
// Биоорган.химия, т. 15. (1989). » 5. С. 656-669.
9. Липнинд Г.М., Шаьлсов A.C., Нечаев O.A., Торгов В.И., Шибаев В.Н., Кочетков Н.К. Конформации разветвленных трисахаридов с вициналыгим замещением по данным, ядерных эффектов . Оверхаузера и теоретических расчетов. 2. 'Грисахарнлы с замещением по положениям 2 и 3 остатков галактозы.
// Биоорган.химия, т. 15. (1989). * 5. С. 670-680.
Ю.Липкинд Г.М., Шашков A.C., Нечаев O.A., Торгов В.И., Шибаев В.Н., Кочетков Н.К. Конформации разветвленных трисахаридов с вицинальшм замещением по данным ядерных эффектов Оверхаузера и теоретических расчетов. 3. Спектры ^С-ЯМР и конформации трисахаридов с остатками галактозы в узле разветвления. // Биоорган.химии, т. 15. (1989). Л Ю. С. 1366-1374.
1l.ravlova Z.N., Ash O.A.,. VnuchKova V.A., Babakuv A.V., Torgov V.I., Necliaev O.A., Uaov A.I., Stilbaev V.N. Biological activity of a oynthetlc pentasaccharide fragjnent of xyloglucan. // Plant Science, v. 85. (1992) P. 131-134.