Синтез, спектроскопия ЯМР и конформации вицинально разветвленных олигосахаридов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

0Л '¿7 да «85

Р0ССИЙСКАЙ§6САДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРРАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М.М. ШЕМЯКИНА

и Ю.А. ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

НИФАНТЬЕВ Николай Эдуардович

Синтез, спектроскопия ЯМР и конформации вицинально разветвленных олигосахаридов

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора химических наук в форме научного доклада

Москва - 1995

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Ю.А. Берлин доктор химических наук, профессор А.И. Усов доктор химических наук, профессор Ю.А. Устынюк

Ведущая организация: Институт пищевых веществ РАН

Защита состоится 19 апреля 1995 г. в 10 часов на заседании специализированного Совета Д.002.35.01 при Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117871, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

Автореферат разослан 13 марта 1995 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат химических наук

В.А. Несмеянов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Полисахариды являются одними из наиболее распространенных природных полимеров, участвующих в целом ряде важных биохимических процессов. Эти макромолекулы построены из разнообразных моносахаридных остатков, отличающихся стереохимической конфигурацией и неуглеводными заместителями и соединенных различными типами межмоноса-харидных связей. Данные свойства полисахаридов определяют исключительною сложность их структурного анализа, и поэтому развитие и совершенствование эффективных методов установления строения полисахаридов является одной из наиболее актуальных задач современной химии углеводов.

Структурный анализ полисахаридов с использованием традиционного подхода, основанного на расщеплении полимерных цепей на олиго- и моноса-харидные фрагменты и их исследовании, является трудоемким и во многих случаях неуспешным из-за ограничений при проведении селективного расщеп-пения полисахаридов по требуемым гликозидным связям, а также при разделении олигосахаридных фрагментов. Поэтому особо перспективным представляется предложенный в ИОХ РАН и в ряде зарубежных центров метод Компьютерного бездеструктивного структурного анализа полисахаридов. Он основывается на компьютерном расчете спектров 13С-ЯМР всех возможных полисахаридов с цанным моносахаридным составом и Поиске структуры, для которой наблюдается наилучшее совпадение рассчитанного и экспериментального спектров. Компьютерный метод широко и успешно применяется в настоящее время для установления строения регулярных линейных полисахаридов.

. Исследование возможности применения компьютерного подхода для определения строения вицинально разветвленных (разветвленных по соседним по-тожениям) полисахаридов, анализ которых особенно труден, показало, что их :пектры не могут быть в общем случае рассчитаны с использованием уравнений I баз данных, применяемых при расчете спектров линейных полисахаридов. Проведенные ранее исследования ряда модельных соединений показали, что для шцинально разветвленных олигосахаридов характерны специальные спектраль-ше эффекты, заключающиеся в отклонениях химических сдвигов 13С от аддитивности (далее - отклонения от аддитивности), без знания которых расчет ¡пектров вицинально разветвленных полисахаридов невозможен. Настоящая ра-юта посвящена актуальной теме - систематическому исследованию вицинально »азветвленных олигосахаридов с целью определения величин отклонений от ад-штивности, выяснению причин их возникновения и приложению полученных [анных для развития компьютерного метода структурного анализа регулярных ицинально разветвленных полисахаридов.

Цель работы. Целью данной работы были направленный химический син-

тез серий модельных олигосахаридов (А-Е) и некоторых других, содержащих 2,3-диэкваториальный (А-В), 2-аксиально,3-экваториальный (Г,Д), и 3,4-диэк-ваториальный (Е) узлы разветвления, а в качестве заместителей Sug1 и Sug2 -моносахарвдные остатки с a-D-, p-D-, a-L- и p-L-конфигурациями; детальное исследование спектров '^С-ЯМР и определение величин отклонений от аддитивности; конформационный анализ олигосахаридов с использованием теоретических расчетов методами молекулярной механики и экспериментов по ядерным эффектам Оверхаузера и выявление структурных параметров, определяющих возникновение отклонений от аддитивности в спектрах '^С-ЯМР разветвленных олигосахаридов; систематизация найденных спектральных характеристик исследованных олигосахаридов и применение их в компьютерном структурном анализе природных вицинально разветвленных полисахаридов.

А К1 - ОМе, К2 - К3 - Н, 1Е4 -ОН ГДЕ

Б И1 - К' - Н. К1 - ОМе, К4 -ОН В* К1 - ОМе, К2 - Н« - Н, К3 -ОН

- остатки моносахаридов

Научная новизна. Впервые проведен эффективный стереонаправленный синтез серий 2,3-ди-О-гликозилированных а-Ь-рамнопиранозидов, а-В-манно-пиранозидов, а- и р-О-глкжопиранозидов, (З-О-галактопиранозидов и 3,4-ди-О-гликозилированных а-Ь-рамнопиранозидов, содержащих 2-аксиально,3-эквато-риальный, а также 2,3- и 3,4-диэкваториальный узлы разветвления. При получении целевых трисахаридов систематически изучено гликозилирование гликозил-ацетатами в присутствии триметилсилилтрифлата, тиогликопиранозидами под действием тритилперхлората, бензобромальдозами при промотировании солями ртути и трифлатом серебра.

Предложен новый подход к синтезу а-Ь-фукозилированных производных, основанный на гликозилировании бензобромфукозой в условиях реакции Гель-фериха; выявлены структурные особенности гликозил-акцепторов, влияющие на эффективность а-фукозилирования. Синтетические возможности" метода продемонстрированы на примерах получения производных природных олигосахаридов - фрагментов гликопротеинов и полисахаридов.

Впервые, основываясь на данных молекулярно-механических расчетов и экспериментов по ядерным эффектам Оверхаузера, проведен теоретический и экспериментальный конформационный анализ широкой серии 2,3-ди-О-глико-зил-а-Ь-рамнозидов, содержащих вицинальный 2-аксиально,3-экваториальный узел разветвления и включающих в качестве заместителей моносахаридные ос-

татки с a-D-, ß-D-, a-L- и ß-L-конфигурациями. В спектрах 13С-ЯМР трисахари-дов определены величины отклонений от аддитивности. Показано, что возникновение этих эффектов связано с различием конформаций дисахаридных фрагментов трисахаридов и соответствующих дисахаридов, и как следствие, изменением внутримолекулярных протон-протонных взаимодействий, влияющих на величины химических сдвигов сигналов в спектрах '3С-ЯМР. Исследована зависимость величин отклонений от аддитивности от структурных особенностей трисахаридов - конфигурации С2 и С4 атомов в терминальных моносахаридных остатках и характера структурных фрагментов при их С2, а также при 01 бис-гликозилированного остатка рамнозы.

Изучены особенности спектров -ЯМР серии 2,3-ди-0-гликозил-а-0-маннозидов, содержащих, как и 2,3-ди-0-гликозил-а-Ь-рамнозиды, 2-аксиаль-ио,3-экваториальное разветвление; показано подобие величин отклонений от аддитивности для обеих групп трисахаридов. Проведено спектральное (ЯМР) и конформационное исследование серий 2,3- и 3,4-диэкваториально разветвленных трисахаридов, определены значения отклонений от аддитивности в их спектрах 13С-ЯМР.

Исследована возможность перенесения величин отклонений от аддитивности между группами стереохимически подобных трисахаридов, а также трисахаридов с одинаковым типом разветвления, но в разных положениях.

Составлена компьютерная программа для структурного анализа регулярных вицинально разветвленных полисахаридов, основанная на расчете спектров 13С-ЯМР разветвленных полисахаридов с использованием величин отклонений от аддитивности, определяемых из спектров, модельных трисахаридов. Компьютерный анализ использован при установлении строения О-антигенных полисахаридов бактерий Escherichia coli и Pseudomonas solanacearum, состоящих из сложных пентасахаридных повторяющихся звеньев.

Определены величины отклонений от аддитивности в спектрах 13С-ЯМР группы линейных трисахаридов, 1,2-дизамещенных в центральном звене. Най-ценн'ые спектральные характеристики использованы при модификации программы компьютерного структурного анализа разветвленных полисахаридов, в том шсле 1,2-дизамещенных в основной цепи.'Модифицированная программа применена для структурного анализа О-антигенного полисахарида из Е. coli OlB.

Практическая значимость. Осуществлен направленный синтез широкой Труппы разнообразных линейных и разветвленных олигосахаридов, необходимых щя физико-химических и биохимических исследований. Предложены новые и усовершенствованы известные методики гликозилирования, что расширяет арсе-гал методов построения гликозвдных связей, повышает их эффективность и шрощает условия их проведения.

Исследованы спектры ЯМР и конформации синтезированных олигосаха-ридов; измерены величины ядерных эффектов Оверхаузера, наблюдаемых в результате предоблучения аномерных протонов моносахаридных остатков в олиго-сахаридах. Полученные данные об особенностях конформационного строения разветвленных олигосахаридов необходимы для выяснения пространственно!! организации более сложных олиго- и полисахаридов, содержащих подобные структурные фрагменты.

Определены значения спектральных эффектов гликозилирования в спектрах l^c-ЯМР дисахаридов и отклонений от аддитивности в спектрах 2,3- и 3,4-вицинально разветвленных олигосахаридов, а также в линейных трисахаридах с 2-О-гликозилированным ("1,2-дизамещенным") цешральным монорахаридным звеном. Найденные характеристики использованы для дополнения имеющихся и составления новых баз данных для компьютерного анализа линейных и разветвленных полисахаридов.

Составлены и использованы программы для компьютерного структурного анализа вицинально разветвленных полисахаридов, в том числе содержащих 1,2-дизамещенные моносахаридные звенья в основной цепи.

Апробация полученных данных. Результаты настоящей работы докладывались на XVI и XVII Международных углеводных симпозиумах (Париж 1992, Оттава 1994), VI и'VII Европейских симпозиумах по углеводам (Эдинбург 1991 Краков 1993), Международной конференции по гдикотехнологии (Сан Диего 1994), Гордоновской конференции по углеводам (Тилтон, 1993), X Симпозиуме по гликоконьюгатам (Краков 1993), III и IV Советско-Шведских симпозиума> по химии и биохимии углеводов (Киев 1988, Лунд 1990), Симпозиуме по кон-формационным исследованиям олигосахаридов, полисахаридов и гликоконью-гатов (Ле Круазик 1992).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 32 статьи, в том числе 2 обзорные, в отечественных и международных журналах, а также 10 тезисов докладов на международных конференциях.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Синтез модельных олигосахаридов.

Проведенные ранее исследования показали, что величины химически; сдвигов сигналов в спектрах 13С-ЯМР олиго- и полисахаридов в значительно! степени зависят от стереохимических параметров образующих моносахаридньо остатков и прежде всего их абсолютной и аномерной конфигураций. Поэтому I ходе выполнения данной работы необходимо было располагать широкой группой модельных олигосахаридов, в которых бы варьировались не только типы узлов разветвления, но и аномерные и абсолютные конфигурации терминальны;

моносахаридных заместителей. Таким образом, для изучения спектральных закономерностей для каждого из рассмотренных типов разветвленных структур, минимально необходимо было располагать серией из соответствующих 16 разветвленных трисахаридов, содержащих моносахаридные заместите;!» с а-О-, р-О-, а-Ь- и р-Ь-конфигурациями и различающихся между собой комбинацией абсолютных и аномерных конфигураций заместителей.

Направленный химический синтез олигосахаридов является сложной и трудоемкой задачей. Поэтому при выборе концепции синтеза требуемого широкого набора модельных олигосахаридов. и их конкретных структур нами учитывалось, что в общем случае при проведении реакций гликозилирования более эффективно и стереоизбирательно проводится построение 1,2-/лрдас-гликозид-ной связи при условии использования гликозил-доноров с соучаствующими защитными группами при 0-2. В соответствии с этим, в качестве основных целевых соединений прежде всего рассматривались олигосахариды, содержащие терминальные а-И-манно-, р-0-глюко-, р-ХЗ-галакто-, а-Ь-рамно- и (¡-Ь-фуко-пира-нозильные заместители, а в качестве основного типа гликозилирующих агентов (но не для галактозилирования) выбраны соответствующие бензобромсахара. Необходимо отметить, что эти легкодоступные соединения ранее не имели широкого использования при проведении реакций гликозилирования, однако ре-¡ультаты настоящей работы и других недавних исследований показали рад их зажных преимуществ по сравнению с ацетобромсахарами.

Кроме этого, в данной работе синтез ряда целевых олигосахаридов был :планирован таким образом, чтобы одновременно провести систематическое 1сследование и ряда других типов гликозилирующих агентов. Так, было пред-гожено и подробно изучено ос-фукозилирование бензобромфукозой в условиях реакции Гельфериха (раздел 1.6), исследовано гликозилирование тиопиранози-мми при катализе перхлоратом трифенилметилия (ТгСЮЦ) и гликозилацетатами 1ри промотировании триметилсилилтрифлатом (ТМБСШ) (разделы 1.2, 1.7).

1.1. Синтез 2,3-ди-О-гликозшированных метш-а-Ь-рамнопиранозидов [1,3,4,7-9,15,26,281.

2,3-Ди-О-гликозилированные метид-а-Ь-рамнопиранозиды являются са-юй широкой группой из исследованных в данной работе вицинально разветв-[енных олигосахаридов. Для выяснений взаимосвязи строения этих соединений I особенностей их спектров ЯМР нами синтезированы трисахариды 1-26, раздающиеся между собой аномерной и абсолютной конфигурациями моносахаридных остатков при 02 и 03, конфигурацией С2\ С2", С4' и С4" атомов, а таксе природой заместителя при С2' и С2" (ОН, NHAc).

В зависимости от типа моносахаридного заместителя при 02 и ОЗ метил-

рамнозидного остатка в трисахаридах 1-26 нами использована различная последовательность наращивания олигосахаридной цепи. Так, трисахариды 1,4,9, содержащие одинаковые заместители при 02 и 03, были получены бис-гликози-лированием диола 27 бензобромглюкозой, -маннозой и -рамнозой в условиях реакции Гельфериха и последующим дебензоилированием (Схема 1).

а-Ь-ЯЬа-ОМе 8иё2(1-3)/

№ 8и81 Йи82

1 а-О-Мап а-О-Мап

2 а-О-Мап р-о-етс

3 Р-И-вк а-О-Мап

4 Э-Б-Ис /З-О-вк

5 а-О-Мап а-Ь-КЬа

6 а-О-Мап р-Ь-Рис

7 р-о-етс а-Ь-Юм

8 Р-О-СТс Р-Ь-Рис

9 а-Ь-Шп а-Ь-Шм

10 а-Ь-Рис Р-Ь-Рис

11 р-Ь-Рис а-Ь-Шш

12 р-Ь~Рис р-Ь-Рис

13 а-Ь-Рис а-О-Мап

№ 8иЙ2

14 а-Ь-Рис р-О-СТс

15 р-Ь-Рис а-О-Мап

16 Р-Ь-^ис Р-О-етс

17 а-Ь-Юш а-О-Ис

18 а-О-Ос а-Ь-Юш

19 а-Ь-Юш р-о-етс

20 а-Ь-Ши Р-Ь-Рис

21 р-о-етс Р-0-Са1

22 Р-О-Ои^Ас P-D-GlcNAc

23 P-D-GlcNAc а-Ь-Шю

24 а-Ь-Юш P-D-GlcNAc

25 а-О-ас P-D-GIcNAc

26 З-О-етсИАс а-О-Ис

Для получения большинства трисахаридов с не одинаковыми моносаха-ридными заместителями при 02 и ОЗ на первой стадии проводился синтез (1-3)-связанных дисахаридных предшественников 30 (Схема 2) гликозилированием

ВхО^-—'

+ "^тЧ

«идО-г^

а-ЬМм-ОМ« 5чд(1 -з/

1,4,9

Схема 1

II

а-ЬИм-О

Оюиа2

-----

1

м

+

метил-рамнозида 28 соответствующим бензобромсахаром. Образующиеся в результате дисахариды подвергались дебензилированию, 4-О-бензоилированию и избирательному дезацетилированию. Полученные таким образом дис.лхаридные блоки 30 использованы в качестве гликозил-акцепторов в синтезах трисахаридов 2,3,5-8,17, и 19-21. Дисахаридные блоки 29 со свободной ОН-гругшой при'О-4 были использованы далее при получении 3,4-ди-О-гликозилированных метил-а-Ь-рамнозидов (раздел 1.5).

Гликозилирование диола 27 бензобромфукозой 31 (1,5 эквивалента) в условиях реакции Гельфериха, проведенное с целью синтеза трисахарида 12 по Схеме 1, привело к неожиданному результату. В качестве двух главных продуктов были выделены дисахарид 32 (48%) и трисахарид 33 (40%), фукозильные заместители в котором при 02 и 03 имеет соответственно а- и р-конфигурации, а не только р-конфигурацию, как в ожидавшемся в этой реакции трисахариде 34. Наиболее вероятно, что нежелательный стереохимический результат - образование 2-0-а-Ь-фукозилированного продукта 33 - определяется недостаточной реакционной способностью ОН-группы при С2 в диоле 27 и в дисахариде 32 в реакции фукозилирования. Подобная ситуация - преимущественное образование 1,2-цис-, а не 1,2-шранс-связанного продукта - наблюдалась нами также и при гликозилировании малореакционноспособной ОН-группы при С4 в метил-глю-козаминиде 130 с помощью бензобромгалактозы ф-аналог бромида 31).

Получение трисахарида 12 проводилось взаимодействием дисахарида 32 бензобромфукозой 31 в нитрометане в присутствии трифлатз серебра. Данные условия были выбраны на основании результатов модельных экспериментов (см. оп. 1-3 в таблице 1). Взаимодействием соединений 31 и 32 действительно удалось получить целевой (3,р-трисахарид 34, однако его выход составил лишь 14%, тогда как изомерный а,р-продукг 33 опять доминировал (выход 67%).

Учитывая высокую стереоизбирательность а-фукозилирования, наблюдавшуюся в синтезах трисахарида 10, получение трисахарида 13 было проведено

взаимодействием соответствующего дисахарида типа 30 с фукозилбромидом 31, а не с одним из возможных 2-О-бензильных фукозил-доноров, обычно применяемых в реакциях а-Ь-фукозилирования. В результате с выходом 81% был получен соответствующий защищенный продукт, дебензоилирование которого привело к целевому продукту 13.

а-Фукозилирование производных метил-а-Ь-рамнозида со свободной ОН-группой при С2 наблюдалось не только при использовании-бромида 31, но и других 2-О-ацилированных фукозил-доноров, в том числе ацетилированного тиогликозида 37. Например, гликозилирование глюкозил-рамнозида типа 30 тиофукозидом 37 в присутствии нитрозил-тетрафторбората протекало стереоспе-цифично и приводило к образованию защищенного производного трисахарида 14 с выходом 64%. Учитывая неожиданный стереохимический результат в проведенных реакциях фукозилирования, в дальнейшем было проведено систематическое исследование влияния строения молекулы гликозил-акцептора на стерео-химический результат фукозилирования бромидом 31.

35 Ш - И - ГЦ

37

С учетом приведенных выше результатов фукозилирования дисахаридов типа 30, синтев трисахаридов 6.и 8 (Схема 3), содержащих р-Ь-фукозильный остаток при 02, проводили по схеме, включающей первоначальное образование (1-2)-связанного дисахарцдного предшественника 41 (см. оп. 4,5 в таблице 1), удаление в нем метоксибензильной защиты и последующее З-О-гликозилирова-ние бензобромманнозой и -глюкозой.

Таблица 1. Результаты модельных реакций 2-О-фукозилирования производных

метил-а-Ь-рамнопиранозида.

Опыт Гликозил-донор Гликозил-акцептор Промотор 1,2-час- связанный продукт Выход, % .1,2-транс-связанный продукт Выход, %

1 31 35 Нг(СМ),-Н8Вг, 38 58 40 Следы

2 31 35 СР^ОчАв 38 30 40 32

3 37 35 >ЮВР4 38 31 40 38

4 31 35 Н8(СМ),-Н8Вг, 39 50 41 39

5 31 36 СР^ОчАк 39 28 41 59

38 «1 - Ц2 - ЯЗ >Вх

39 М - 4-МеОВв, В2 - Ва, ВЗ - Вх

40 - Ж* - ИЗ -в,

С 41 Я* - 4-МсОВв, В2 • Ва, ВЗ - Вх М - Н, И - Ва, ИЗ - Вх

Схема 3

Подобная стратегия использована и в синтезах трисахаридов 18 и 25, включавших на первом этапе получение а-0-глюкозил-(1-2)-а-Ь-рамнозида 46 (Схема 4) взаимодействием избирательно защищенного рамнозида 36 с бензили-рованным глюкозилбромидом 43 (выход 62%). Показано, что выход и стереоиз-бирательность данной реакции существенно зависят от температуры, а применение в качестве гликозилдоноров трихлорацетимидата 44 или тибпиридильного производного 45 дает худший результат.

__ЛВп

ВгО---Г-А--

■*>--\—-- +4« — —

ОВп /у /

43 II = Вг(а) ИУу\

44 И- 0С(-МН)СС1з(Р) с

45 И - (2-пиряд11л)-П|0(а,р)

46 Схема 4

Нами была получена также группа трисахаридов (22-26), содержащих терминальные остатки ГЧ-ацетил-О-глкжозамина. В синтезах трисахаридов 24, 26 и упоминавшегося выше 25 (Схема 4), введение глюкозаминового звена проводилось на завершающем этапе построения олигосахаридиой цепи. В качестве глю-козаминил-доноров использовались 2-дезокси-2-фталимидо-Б-глюкозилброми-ды, а получение бис-глкжозаминил-рамнозида 22 проводилось и гликозилиро-ванием диола 27 глюкозаминил-ацетатом 139 в присутствии ТМЯСЛТ (раздел 1.7).

1.2. Синтез разветвленного рамнотетраозида 50 и исследование гликозилирования тиогликозидами в присутствии перхлората тритилия [26].

В ходе настоящей работы в качестве модельного соединения использовался разветвленный тетра-рамнозид 50, синтез которого был проведен по Схеме 5 бис-рамнозилированием диола 48, образующегося после удаления изопропили-деновой защиты в дисахариде 47.

Схеме 5

Для получения дисахарида 47 изучено гликозилирование тритилового эфира 53 тиорамнозидом 51 в присутствии Т1СЮ4. В ходе данного синтеза проверялась возможность гликозилирования тритиловых эфиров тио"пиранозидами. Ранее в лаборатории химии углеводов ИОХ РАН проводилось гликозилирование тритиловых эфиров тиофруктофуранозидами, однако не было сведений о применимости данной реакции для гликозилирования тиогликозидами других Сахаров и, в том числе, тиопиранозидами.

Предварительные эксперименты показали, что тиорамнозид 51 легко вступает во взаимодействие с тритиловыми эфирами в хлористом метилене в присутствии 1 экв. ТгСЮф но гликозилирование сопровождается значительным де-тритилированцрм и другими процессами деструкции. Реакция может быть проведена в каталитическом режиме, в присутствии значительно меньшего количества ТгСЮ4, например 0,2 экв., что не уменьшает эффективности гликозилирова-ния, а лишь незначительно замедляет его. Детритилирование гликозил-акцепто-ра происходит в меньшей степени в нитрометане, а побочные процессы деструкции, как при гликозилировании тИофруктофуранозидами, могут быть исключены прибавлением к смеси небольшого количества коллидина.

Результаты гликозилирования тиорамнозидом 51 тритиловых эфиров 5355 в найденных оптимальных условиях приведены в таблице 2. Строение образующихся дисахаридов, в частности ^-конфигурация межзвеньевой гликозидной связи, было установлено после удаления защитных групп и превращения в известные соединения. Таким образом была доказана стереоспецифичность гликозилирования тиорамнозидом 51.

Таблица 2. Результаты гликозилирования тиорамнозидами 51 и 52

Гликозил- Гликозил- Дисахаридный Выход

донор акцептор продукт

йш м.—7-—0--7 7-^0-7 47 69%

51 53 Л и^-г—о 85%

51 51 г 54 55 56 м*аС ¿йД 57 Г 90%

54 74%

52 4 1, ^Т > VI

С целью выяснения границ применения гликозилирования тригиловых эфиров Сахаров тиопиранозидами исследовалась возможность гликозилирования тиогликозидами 52 и 59-61. Было найдено, что бензилированный тиорамнозид

52 (см. таблицу 2), как 2,3-ацетонид 51, удовлетворительно взаимодействует с тритиловыми эфирами Сахаров. Тиогалактозид 60 обладает меньшей реакционной способностью и требует использования большего количества промотора, что вызывает" побочные процессы деструкции. Тиогликозиды 59 и 61, содержащие электроноакцегггорные группировки при С2, не вступают со взаимодействие с гритиловыми эфирами даже при нагревании, до 60°С и при давлении .то 10 кбар. Таким образом, ТГСЮ4 является селективным промотором, дифференцирующим гликозил-доноры. Это может быть плодотворно использовано в практике гликозидного синтеза, т.к. варьируя природу заместителя при 02, можно исключать или придавать тиогликозидам гликозилирующую активность, а также про-зодить реакцию гликозилирования "активным" тиогликозидом в присутствии 'неактивного".

В заключение отметим, что рассмотренный метод гликозилирования мо-кет оказаться полезным не только при получении разнообразных олигосахари-:ов, но и открывает перспективы для нового подхода к синтезу полисахаридов юликонденсацией бифункциональных мономеров, содержащих как тиоглико-идную, так и тритилокси группировки.

1.3. Синтез 2,3-ди-О-гликозшированных метил-а-О-маннопиранозидов [7-9].

В качестве модельных трисахаридов, содержащих 2-аксиалъно-З-экватори-льное разветвление, также изучались 2,3-ди-О-гликозилманнозиды 62-65.

Ди-фукозилировинные соединения 62 и 63 получены гликозилированием етил>-4,6-0-бензилиден-а-0-маннопиранозида 126 с помощью бензобромфуко-I (раздел 1.6), а трисахариды 64 и 65 синтезированы с использованием дисаха-1дного предшественника 67 по схеме 6.

№ Эъ^!__

5иё1(1-2)\

а-О-Мап-ОМе 8ие2(1-3)/

62 а-Ь-Рис Р-Ь-Рис

63 Р-Ь-Рис р-Ь-Рис

64 а-Ь-Шт а-Э-С1с

65 а-О-Мап а-О-СТс

— 64,65

Схема 6

1.4. Синтез 2,3-ди-О-гликозилированных метил-а- и р-О-глкжопиранозидов

и метил-р-П-галактопиранозидов [6,9,10,11,28]. Среди трисахарвдов с 2,3-диэкваториальным разветвлением нами были исследованы 2,3-ди-О-гликозилированные производные метил-а- и -р-В-глю-копиранозидов 68-90 и метил-р-В-галактопиранозида .91 и 92.

&«1(1-2)\ БивЦЬгД

р-В-С1с-ОМе а-Б-вк-ОМе

81182(1-3)/ 8«в2(1-3)/

№ 8щ1 8и«2 № 8481 8ив2

68 а-Б-Мап а-В-Мап 86 а-В-Мап а-В-Мап

69 р-Б-ва! а-В-Мап 87 р-В-Оа1 р-В-Оа1

70 а-Ь-Шм а-В-Мап 88 а-Ь-ЯЪа а-Ь-Ш1а

71 Р-Ь-Рис а-В-Мап 89 а-Ь-Рис р-Ь-Рис

72 а-В-Мап Р-В-Оа1 90 Р-Ь-Рис Р-Ь-Рис

73 р-В-Оа1 р-В-Оа1

74 а-Ь-Шю Р-В-Оа1

75 Р-Ь-Рис Р-В-Оа1 БивЩ-гД

•76 а-В-Мап а-Ь-Юю р-В-ОаЮМе

77 р-В-ва1 а-Ь-Рис 8482(1-3)/

78 а-Ь-Шм а-Ь-Юш

79 р-Ь-Рис а-Ь-Шю №

80 а-Б-Мап Р-Ь-Рис 91 а-Ь-Рис Р-Ь-Рис

81' Р-В-Са1 Р-Ь-Рис 92 р-Ь-Рис р-Ь-Рис

82 а-Ь-Рис Р-Ь-Рис

83 Р-Ь-Рис Р-Ь-Рис

84 а-Ь-Рис а-Ь-Рис

85 а-Б-Мап а-Ь-Рис

Дифукозил-Б-глюко- и -галактозиды 82, 83 и 89-92 получены гликозили-рованием 4,6-О-бензилиденовых производных соответствующих метил-гликопи-ранозидов с помощью бензобромфукозы (см. раздел 1.6). Аналогично синтезированы и диманнозил- и дирамнозил-глюкозиды 68, 78, 86 и 88. Получение ди-галактозил-глюкозидов 73 и 87 рассмотрено в разделе 1.7.

Синтез дигликозил-р-В-глюкопиранозидов, содержащйх неодинаковые моносахаридные заместители при 02 и ОЗ, был проведен по схеме 7 с использованием ступенчатого .наращивания олигосахаридной цепи, начиная с построения (1-2)-связанных дисахаридных предшественников типа 94. Эти соединения получены гликозилированием моногидроксильного производного 93 с помощью бензобромманнозы, -рамнозы и -фукозы, а также пентаацетата галактозы (см. раздел 1.7).

Гликозилирование дисахаридов типа 94 проводилось с использованием в качестве гликозил-доноров бензобромманнозы, -рамнозы и -фукозы в условиях

реакции Гельфериха, а также 0-(2,3,4,б-тетра-0-ацетил-а-0-галактопиранозил)-трихлорацетимидата 96 в присутствии ТМвОТГ Имидат 96 был выбран в качестве галактозилирующего агента на основании результатов модельных реакций З-О-гликозилирования глюкозида 97 (Схема 8) имидатом 96 и тиогликозидом 95 в присутствии N01^4 (выходы 94 и 57%).

ри—^-о

«г—Т—о--\

—°

но—

вид!-(1-2^

р-0-(31с-0Мв

!-<1-з/

СО.....——ом*

95 Ш - вИ, И2 - Н

96 = Н, = ОС(»Т1Н)СС1Э

С той же целью проводилось модельное гликозилирование глюкозида 97 фукозил-донорами 31 и 37. В результате с выходами 93 и 82% были получены смеси соответствующих 1,2-цис- и 1,2-т/>ане-связанных дисахаридов в соотношении 1:2 и 1:8. Учитывая эти результаты, гликозилирование дисахаридов 94 проводилось бензобромфукозой 31 с тем, чтобы получить сразу пары изомерных трисахаридов, которые и образовывались, как это ожидалось.

1.5. Синтез 3,4-ди-О-гликозилированных метил-а-Ь-рамнопиранозидов.

В качестве модельных трисахаридов с 3,4-диэкваториальным разветвлением нами исследовались 3,4-ди^О-гликозил-а-Ь-рамнопиранозиды 99-114.

вщШ-ЗД

а-Ь-Юи-ОМе 8иб2(1-4)/

№ 8и81 8иВ2

99 а-О-Мап а-О-Мап

100 а-Э-Мап Р-О-Ис

101 а-О-Мап а-Ь-Юм

102 а-О-Мап Р-Ь-Рис

103 р-О-Ис а-О-Мап

104 Р-0-С1с р-О-Ис

105 р-и-ас а-Ь-ЯЬа

106 Р-О-Ис Р-Ь-Иис

№ 5иЙ2

107 а-Ь-Юм а-О-Мап

108 а-ШЬа Р-Б-ас

109 а-НУш а-Ь-Шм

110 а-Ь-Шта р-ЬБис

111 Р-Ь-Рис а-О-Мап

112 р-Ь-Рис р-О-Ис

113 р-Ь-Рис а-Ь-Шш

114 Р-Ь-Рис Р-Ь-Рис

Синтез трисахаридов 99-114 проведен с использованием соответствующих

>

бензобромсахаров в качестве гликозил-доноров, а в качестве гликозил-акцепто-ров - дисахаридов типа 29, диола 115 и ß-L-фукозил-рамнозида 116. Необходимость использования дисахарида 116 вместо акцепторов типа 29 в синтезах три-сахаридов с ß-фукозильной группой при 04 вызвана низкой эффективностью 4-O-ß-L-фукозшшрования З-О-гликозил-рамнозидов.

1.6. а-Фукозширование бензобромфукозой в условиях реакции Гельфериха [3,4,9,27].

Проведенные примеры гликозилирования бензобромфукозой 31 в условиях реакции Гельфериха показали, что фукозилирование в ряде случаев протекает с неожиданным стереохимическим результатом и приводит к преимущественному образованию продуктов а-, а не (3-фукозилирования, как это ожидалось для бромида 31, содержащего соучаствующую Вг-группу при 02. Можно было предположить, что подробное исследование гликозилирования бензобромфукозой позволит разработать новый подход к а-Ь-фукозилированию. Олигосахариды, содержащие а-Ь-фукопиранозильные остатки широко распространены в природе, и поэтому совершенствование методов эффективного а- 1_-фукозилирования является актуальной задачей. В этой связи синтез разнообразных фукозилиро-ванных производных, необходимых для физикохимических исследований, был спланирован таким образом, чтобы одновременно изучить структурные характеристики гликозил-акцепторов, способствующих а-Ь-фукозилированию с помощью бензобромфукозы.

С этой целью было изучено фукозилирование серии моно- и дигидрокси-лированных гликозил-акцепторов, имеющих а- и Р-О-глюко-, $-И-галакто-, а-И-манно- и а-Ь-/?<хш/о-конфигурации. Использованные гликозил-акцепторы отличались между собой стереохимической ориентацией фукозилируемых ОН-групп«и/или природой и стереохимической ориентацией заместителей в соседних положениях.

Результаты проведенных реакций суммированы в таблицах 3 и 4. Их данные свидетельствуют о существовании корреляции между реакционной способностью гликозил-акцепторов и стереоизбирательностью а-Ь-фукозилирования, которое более эффективно протекает в случае малореакционноспособных акцепторов, например соединений 30, 35, 133. Результаты реакций с участием 2,3-ди-олов показали, что а-Ь-фукозилирование гвдроксила при С2, особенно аксиально ориентированного, как в производных с лаяш-конфигурацией, протекает предпочтительнее. Большая избирательность'а-Ь-фукозилирования отмечается и

IIS

Ой1

117 и»- И2 - н

11Я И1 » В*, и2» н 119 я1 = н, в2 - Вж

ЙЧ»-V

КРМЬ

128 И1 = П. И2,Л3 = РЬСН 12^ К» «= И, Л2 - |*3 = Вг 1.10 К1 « Вг, = П. к3 = Ас

120 К' - К2 - И

97 И' = Вг, К2 =■ Н

121 Я1 = Н, К2 =.Вг

93 Я1 - !1, Я2 - В^СЫ

В*0-ч

НО"

■«ь-Л—

Ой1 ом*

123 11' = 1^ = 1!

124 К' = И*. Кг = I!

125 Н1 - И, Я2 = Р/

12. ' - ■ ПТ , .

6;П'-

Таблица 3. Бис-фукозилирования метил-А^-О-бензшшден-гликопирано'пйов

Опыт Гликозил-акцептор Конфигурация Выход продуктов фукозилирования, % РР* аР Ра аа

1 117 р-Т)-галакто 45 34

2 120 Р-О-глюко 54 20 4

3 123 а-О-глюко 61 24 2

4 126 а-Т)-манно 44 48

5 27 а-Ь-манно 13 64

*Аномерные конфигурации моносахарцдных заместителей при 02 и ОЗ.

Опыт Гликозил-акцептор л^к^р^иинкс. ир Конфигурация Соседние Заместители 31 эквив. Выход диса а-фуко- .аридов, % 6-фуко

2-Р-

фукозширование

1 119 р-Х)-галакто МеО-1, ВгО-З 2 42 55

2 121 р-О-глюко МеО-1, ВгО-З 2 39 33

3 93 р-Т)-глюко МеО-1, (4-С1ВпО)-3 2 30 66

4 125 а-О-глюко МеО-1, ВгО-З 2 44 31

5 66 а-~0-манно МсО-1, ВгО-З 3 73 15

б 35 а-Ь-манно МеО-1, ВгО-З 2 58 2

7 36 а-Ъ-манно МеО-1,(МеОВпО)-З 2 50 39

8 132 а-О-галакто АсО-1,3 2 51 38

9 133 $-Т)-галакто ОсОТМЫ, ВгО-З 2,5 76 '8

10 30 а-Ъ'манно МеО-1, ВгдМап-З 2,4 81 не обн.

3-0-

фукозилирование

И 118 $-Т)-галакто ВгО-2, Р11СНО-4 2 42 52

12 97 р-О-глюко ВгО-2, РЬСНО-4 2 32 61

13 124 а-О-глюко ВгО-2, РЬСНО-4 2 27 63

14 127 а-О-манно ВгО-2, РЬСНО-4 1,5 14 73

15 128 р-Х)-глюко КРМЬ-2, РЬСНО-4 2 36 47

16 28 а-Ь-манно АсО-2, ВпО-4 2 82 15

17 131 р-Э-глюко ВгО-2, ВгО-4 3 74 18

18 129 $-Т)-глюко NPhth-2, ВгО-4 3,2 61 -20

4-Р-

фукозилирование

19 130 Р-Б-глюко ВгО-З, АсОСН,-5 3,5 83 10

в случае гликозил-акцепторов, содержащих рядом с ОН-группой ацилокси- и фталимидо-фрагменты, а также объемные остатки моносахаридов. Напротив, присутствие алкокси-группировок рядом с гидроксилом способствует ß-L-фуко-зилированию.

Механизм влияния перечисленных структурных фрагментов на стереохи-мический результат фукозилирования остается до конца не выясненым. Различие соотношений изомерных дисахаридов, образующихся из а-глюкозида 125 и а-маннозида 66, различающихся лишь ориентацией BzO-заместителей при СЗ, свидетельствует, что их влияние не определяется электроноакцепторными свойствами бензоильных групп. Наиболее вероятно, пониженная реакционная способность гидроксила в 125 является следствием пространственного экранирующего эффекта бензоата. Это подтверждают, например, результаты теоретического конформационного анализа молекул глийозил-акцепторов, проведенного на основе молекулярной механики.

С учетом отмеченных выше структурных свойств гликозил-акцепторов можно планировать проведение стереонаправленного а-фукозилирования с помощью бензобромфукозы. Сказанное подтверждают результаты синтеза трисаха-рида 13 и опытов 9 и 17-19 из таблицы 4, проведенных с участием оптимально защищенных акцепторов 129-131 и 133, а-фукозилированием которых получены производные распространенных природных олигосахаридов. Это наглядно демонстрирует, что бензобромфукоза может быть успешно использована в практике олигосахаридного синтеза альтернативно с традиционными, но менее доступными 2-О-бензилированными a-L-фукозилдонорами.

1.7. Синтез олигосахаридов с использованием гликозил-ацетатов [ 19,28].

При получении целевых- олигосахаридов, необходимых для последующих спектральных и конформационных исследований, нами проводилось изучение гликозилирования гликозилацетатами (ГА) в присутствии TMSOTf, которое впервые было предложено Огавой с сотрудниками (Ogawa Т., et al. // Carbohydr. Res- V.93(1981). Р. C6-C9). Перспективность ГА как гликозилирующих агентов определена их доступностью и химической стабильностью, позволяющими нарабатывать ГА в любых количествах, хранить в обычных условиях достаточно долго и после этого использовать в реакциях гликозилирования без специальной доочистки. ГА часто являются синтетическими предшественниками гликозилирующих агентов других типов, например гликозилгалогенидов, тиогликозидов и гликозилтрихлорацетимидатов. Поэтому использование непосредственно ГА может в ряде случаев значительно упростить и удешевить синтезы целевых продуктов гликозилирования.

Несмотря на столь очевидные преимущества, ГА используются до сих пор

в практике олигосахаридного синтеза не очень широко. Для выяснения перспектив и ограничений данного метода гликозилирования нами изучалось гликози-лирование глюкозаминил-(139) и галактозил-ацетатами 134 й 146, причем использовались именно ß-изомеры, так как соответствующие а-ацетаты оказались неактивными как гликозил-доноры.

Рассмотрим результаты гликозилирования глюкозидов 93 и 120 пентааце-татом 134. Для получения дисахарида 135 мы проводили взаимодействие соединений 134 и 93 (2 экв.) в присутствии различных количеств TMSOTf. При использовании эквивалентного по отношению к 93 или меньшего количества промотора в реакцию вступает только 30-40% исходного 93. В присутствии 2 эквивалентов промотора гликозил-акцептор 93 вступал в реакцию практически полностью, превращаясь с выходом 71% в изомерные дисахариды 135 и 136 (-5:1), различающиеся конфигурацией аномерного центра в остатке глюкозы. Кроме того, наблюдалось образование не исследовавшихся нами продуктов деструкции со значительно более низкой, чем у дисахаридов 135 и 136, хроматографи-ческой подвижностью. Побочный процесс аномеризации удалось исключить, а выход целевого дисахарида 135 увеличить до 67% при добавлении промотора двумя равными порциями с интервалом в 16 часов. В этом случае реакционная смесь еще содержала -20% исходного 93, но реакция не продлевалась во избежание образования побочного продукта 136.

Пентаацетат 134 использовался и для бисгалактозилирования диола 120 для получения трисахарида 73. В этом случае не удалось достигнуть удовлетворительного результата. При проведении реакции в присутствии 2 эквивалентов промотора (по отношению к диолу 120) наблюдалось практически только моно-галактозилирование диола 120. При увеличении количества TMSOTf в 2 раза происходило образование целевого трисахарида 137 (19%), его а-метил-изомера 138 (13%) и большого количества продуктов деструкции. Эффективный синтез трисахарида 137 был проведен гликозилированием диола 120 тиогалактозидом 95 в присутствии NOBF4, выход 79%.

Глюкозаминилацетат 139 использовался для гликозилирования диола 27 с

целью синтеза трисахарида 22. При использовании ТМБОТГ в количестве, меньшем, чем 2 эквивалента (по отношению к 27), взаимодействие 27 с 139, как и галактозилирование диола 120 галактозилацетатом 134, протекает неудовлетво-

разуются продукты моногликозилирования (141 и 142), дальнейшее превращение которых в трисахарид 143 происходит медленно и сопровождается значительной деструкцией. Поэтому рассмотренная реакция не может быть использована для препаративного синтеза трисахарида 143. Однако, взаимодействие 27 и 139 оказалось эффективным для направленного синтеза дисахаридов 141 и 142 - при использовании 1,3 эквивалента донора и 2 эквивалентов ТМБОТГ соединения 141-143 были получены с выходами 30,5 , 40 и 13%.

Интересная особенность реакций с участием глкжозаминилацетата 139 -побочное образование в них метил-глюкозаминида 140, например с выходом 13% в препаративном синтезе 141 и 142. Выход гликозида 140 зависит от количества промотора и снижается при его уменьшении.

Таким образом, гликозилирование в реакциях с участием ГА 134 и 139 протекало стереоспецифично, однако сопровождалось побочными процессами, затрагивающими аномерный центр в гликозил-акцепторе и/или соответствующем ему остатке продуктов гликозилирования. В реакциях с участием диола 27 таким побочным процессом было трансгликозилирование (перенос метоксила), а с участием глюкозидов 93 и 120 - аномеризация. Вероятно, оба процесса протекают под действием трифторметансульфокислоты, присутствующей в реакционной смеси в результате реакции силилирования по схеме 9.

Схема 9

Образование силилированных интермедиатов наблюдалось во всех реакциях гликозилирования с помощью ГА, в том числе соединений 93, 128, 130,

рительно. При увеличении количества промотора до 3 эквивалентов гладко об-

143

144 и 145 (см. ниже), однако в случаях 2-гидрокси производных 27, 93 и 120 оно протекало в большей степени, что, видимо, связано с электроноакцептор-ным влиянием ацетальной группировки гликозидного центра. Негативным следствием 2-О-силштирования является не только удаление промотора из сферы реакции и замедление ее, но и то, что в результате генерируются 2 -О- триметлл-силиловые эфиры, которые, вероятно, в большей степени подвержены наблюдавшимся реакциям, затрагивающим аномерный центр. Отметим, что при га-лактозилировании акцепторов 93, 128, 130, 144 и 145, не содержащих ОН-группу при С2, подобные процессы не наблюдались. Возможность протекания рассмотренных побочных процессов вносит ограничения для использования ГА в сочетании с ТМБОТ^ которое в общем случае не может бьггь рекомендовано для гликозилирования акцепторов со свободной ОН-группой при С2.

Таблица 5. Результаты гликозилирования соединений 93, 128, 130, 144 и 145

Галактозил-акцептор Выход дисахарида

—"ОМе 144 NPhth 79%

ИО~-—^—ОМв 128 R = NPhth 93 R = OBnCl-4 30% 85%

Галактозил-акцептор Выход дисахарида

АйО-v но^--- ВгО——ом® MPhth 130 \,2-цис- и 1,2-транс-связанный дисахариды образуются с выходами -5-10% (ТСХ)

ВпО-ч но---^Л—-Д ВлО____________ NPhth 145 84%

Результаты гликозилирования галактозилацетатами 134 и 139 серии акцепторов с- ОН-группами при СЗ, С4 и С6 93, 128, 130, 144 и 145 приведены в таблице 5 и на схеме 10. 6-О-Галактозилирование соединения 144 протекало эффективно и стереодпецифично. Выход же в реакциях 3- и 4-О-галактозилиро-вания зависит от строения акцептора. Так, гликозилирование соединений, не содержащих ацильные защиты рядом с ОН-группой ( 93 и 145), протекает успешно, как и 6-гидрокси-производного 144. Напротив, акцепторы, содержащие ацильные защиты рядом с ОН-группой (128,130), характеризуются низкой реакционной. способностью, причем 4-О-галактозилирование малореакционноспо-собного глюкозаминида 130 отличалось не только низкой эффективностью, но и образованием кроме целевого 1,2-траке-связанного дисахарида еще и 1,2-цис-связанного изомера (например 147 и 148, Схема 10). Таким образом, в реакциях 1,2-т/>анс-гликозилирования с помощью ГА с соучаствующей группой при 02

требования к структуре гликозил-акцептора такие же, как и при использовании гликозил-доноров других типов, например гликозилгалогенидов (см. раздел 1.6) и цианоэтилиденовых производных.

При гликозилировании глюкозаминида 130 с помощью ГА 134 и 146 протекала 06-+04 миграция ацетильной группы и последующее образование (1-6)-связанного дисахарида 149. Таким образом, гликозилирование с. помощью ГА О-ацилированных гликозил-акцепторов может иметь еще одно ограничение, связанное с возможностью миграции ацильной защиты .и как следствие этого -нарушением региоспецифичности реакции.

Подводя итог проведенному исследованию гликозилирования с помощью ГА, можно отметить, что эти соединения являются гликозил-донорами "средней силы" и могут плодотворно использоваться в практике гликозидного синтеза при условии соблюдения требований к структуре гликозил-акцептора. Применение ГА может оказаться весьма полезным для избирательного моно-гликозили-рования полигидроксильных производных.

1.8. Синтез модельных дисахаридов f1,3,4,6-8,10,11,15-21,23,24,27J.

В рамках данной работы была синтезирована большая группа дисахарвдов (таблица 6), необходимых для спектральных и конформационных исследований. Эти соединения получали из защищенных производных, предшественников разветвленных трисахаридов, или синтезированных при исследовании гликозилирования бензобромфукозой или гликозилацетатами.

Помимо приведенных в таблице 6, исследовались и некоторые другие ди-сахариды, например гликозил-(1-3)-р-Б-талопиранозиды 217-220, а также (1-3)-и (1-4)-связанные гликозил-а- и -ß-D-ксилопиранозиды. Последние получали из защищенных прешественников, образующихся при гликозилировании 1,2-0-цианоэтилиденовыми производными тритиловых эфиров метил-ксилозидов. Синтез гликозил-талозидов 217-220 был проведен по схеме 10, включающей стереоизбирательное гликозилирование защищенного талозида 212, полученного из метил-р-О-галактозида 118.

Таблица 6. Синтезированные дисахариды Х-(1-У)-2-0Ме

Тип связи (1-У) Гликозильный заместитель X

а-Э- Мап | СТс р-Б- Ис | ва! ( ОкКАс а-Ь- ЯЬа | Иис 0-Ь- Рис

Гликозил-а-Б-маннопиранозиды

(1-2) (1-3) 150 153 151 152 154

Гликозил-а-Р-глюкопиранозиды

(1-2) (1-3) 155 160 156 161 157 162 158 163 159 164

Гликозил- З-Р-глкжопиранозиды

(1-2) (1-3) 165 170 166 171 167 172 168 173 169 174

Гликозил-2-ацстамидо-2-дезокси-Р-Б-глюкопиранозиды

(1-3) (1-4) (1-6) 181 175 178 182 176 179 177 180

Гликозил- З-Р-галактопиранозиды

(1-2) (1-3) 185 183 186 184 187

Гликозил-а-Ь-рамноПиранозиды

(1-2) (1-3) (1-4) 188 195 203 189 196 190 197 204 198 205 191 199 206 192 200 207 193 201 208 194 202 209

Ме — Вг(

__

а-0-Мал»(1-3)-Р-0-Та1-ОМв 217

Р-О-Мап-<1-3)-р-0-Та1-0М« 218

и« \

219

р-|.-№я-(1>Э)>р-0-Тя1-0м« 220

--

Схема 10

2. Анализ спектров ЯМР модельных-^ олигосахаридов.*

2.1. Применение спектроскопии ЯМР для доказательства строения олигоса-харидов, техника отнесения сигналов и определения спектральных эффектов.

Строение всех синтезированных соединений устанавливалось с помощью спектроскопии ^Н- и '^С-ЯМР, причем дисахаридные производные анализировались до и после удаления защитных групп, а более сложные олигосахариды исследовались в виде свободных метил-гликозидов. Отнесение сигналов в спектрах !Н-ЯМР дисахаридов проводилось с помощью двойного гомоядерного резонанса, а спектров три- и тетрасахарвдов - с помощью двумерной 1Н-1Н корреляционной спектроскопии ЯМР. Сигналы в спектрах ^С-ЯМ? олигосахаридов относились с использованием двумерной 'Н-'^С корреляционной спектроскопии ЯМР. Двумерные спектры получены с использованием пакетов программ фирмы Bruker для компьютеров ASPECT-2000 и ASPECT-3000.

Конфигурацию аномерных центров L-фуко-, D-глюко- и D-галакто-пира-нозильных остатков подтверждали на основании величин химических сдвигов сигналов С1 в спектрах 13С-ЯМР и констант спин-спинового взаимодействия (КССВ) ^Н1,Н2 8 спектрах 'Н-ЯМР. а-Конфигурация D-манно- и Ь-рамно-ттра-нозильных звеньев подтверждалась характеристическим расположением сигналов С5 в спектрах 13С-ЯМР. В ряде случаев для подтверждения аномерной конфигурации моносахаридных остатков привлекались данные по гетероядерным КССВ Ус1,Н1 и величинам ядерных эффектов Оверхаузера (ЯЭО).

Спектры 'Н- и 13с -ЯМР всех синтезированных олигосахаридов приведены в соответствующих статьях, а также включены в международную базу данных спектров ЯМР олигосахаридов SUGABASE.

Помимо величин химических сдвигов сигналов 13С, основными параметрами, используемыми при компьютерном анализе спектров ЯМР олиго- и полисахаридов (см. раздел 2.2), являются спектральные эффекты гликозилирования (Д5С/) и величины отклонений от аддитивности (ДД6С/, в дальнейшем обозначаются ДД). Определение этих характеристик являлось одной из главных целей данной работы.

Под эффектом гликозилирования подразумевается различие химического сдвига сигнала атома Ci в спектре дисахарида и составляющем моносахариде, вызванное введением гликозидной связи. Значения эффектов гликозилирования в спектре дисахаридов, например ß-D-Glc-(l-2)-a-L-Rha-OMe (190), рассчитываются по уравнениям (1) и (2) для атомов глюкозного и метил-рамнозидного звеньев соответственно.

Величины эффектов гликозилирования определялись после отнесения

*) Разделы 2 и 3 выполнены в сотрудничестве с д.х.н. A.C. Шашковым и д.х.н. Г.М. Липкиндом

спектров 13С-ЯМР всех олигосахаридов и затем использовались для уточнения и дополнения базы данных по эффектам гликозилирования, используемой при компьютерном структурном анализе полисахаридов (раздел 3).

(1)

Л5СЯЬа1е_п_пк_(1_2)-а.1^юы-омс = 5СЯ}1а1().п.с1с_(ь21_а_1_к,1а.оме - 5С/а.иЮи.ОМе (2)

В спектрах '3С-ЯМР разветвленных олигосахаридов нами определялись величины отклонений от аддитивности (ДА), под которыми подразумеваются различие между экспериментальными величинами химических сдвигов атомов углерода и рассчитанными по аддитивным схемам с учетом эффектов гликозилирования. Отклонения от аддитивности в спектрах 13с_ямР разветвленных олиго- и полисахаридов наблюдаются для сигналов атомов углерода бис-глико-зилированного моносахаридного остатка, находящегося в узле разветвления, и аномерных атомов углерода моносахаридных заместителей. Величины ДД для других атомов углерода (С2-С6' и С2"-С6"), более удаленных от узла разветвления, практически равны нулю и поэтому не используются в компьютерных расчетах спектров полисахаридов.

Величины ДД рассчитываются по уравнениям типа (3)-(5) (даны примеры уравнений для расчета значений ДД в спектре трисахарида 2), среди которых уравнение (3) используется для определения отклонений от аддитивности сигналов атомов углерода бис-гликозилированного остатка, а (4) и (5) - для атомов углерода терминальных остатков^ в случае трисахарида 2 присоединенных (1-2)-и (1-3)-связью.

а-0-Мап-(1-2)\ а-0-Мап-(1-2)-а-ЬШт-0Ме 188

а-Ь-Шга-ОМе

р-0-01с-(1-3)/ 2 (З-О-СТс-О-ЗЬа-Ь-Шт-ОМе 197

ДД5С/2 = 6С/2 - 8С(расч = 6С<2 - (бС/д.^^д.омс + Д5С/1М + Д5С1197) = 5С'2 - 5С'а-ЦЦ1а-ОМе "(5С'188 " 5С'а-Ь-Ш1а-ОМеИА5С<197 " 5С/а.ь.Ю1а.0Ме)= 6С/2 - 8С<188 - 5С/197 - бС^.^^.оМе' (3)

ДД5С1'г = 6С1'2 - 'бС1"ш (4)

ДД5С1"2 = 6С1"2 - 6С1'197 (5)

В последующих разделах 2.2.-2.4. приводится анализ величин ДД в спектрах 13с-ЯМР исследованных разветвленных олигосахаридов.

2.2. Отклонения от аддитивности в спектрах С-ЯМР олигосахаридов с 2-аксиально,3-экваториалъным разветвлением [2,5,14,15].

Величины отклонений от аддитивности (ДД) в спектрах ^С-ЯМР ди-О-гликозил-рамнозидов 1-26 и ди-О-гликозил-маннозидов 62-65, содержащих 2-аксиалыю,3-экваториальное разветвление, приведены в таблице 7. Отметим, что каждому трисахариду приписан стереохимический код из пяти букв, которые обозначают абсолютные конфигурации заместителей при 02. и 03 и бис-глико-зилированного моносахаридного остатка и аномерные конфигурации заместителей при 02 и ОЗ, соответственно.

2.2.1. Анализ величин отклонений от аддитивности в спектрах МС-ЯМР трисахаридов 1-16.

Наиболее важными стереохимическими параметрами, определяющими спектральные характеристики производных углеводов, являются абсолютная и аномерная конфигурации моносахаридных остатков. Поэтому в качестве первой группы модельных 2-аксиально,3-экваториально разветвленных олигосахаридов нами изучены трисахариды 1-16, в которых варьировались именно.эти параметры и среди которых представлены соединения со всеми возможными комбинациями абсолютных и аномерных конфигураций моносахаридных заместителей при-02 и 03.

Данные таблицы 7 свидетельствуют, что в большинстве случаев величины ДД находятся в интервале от -1.0 до +1.0 м.д., т.е. не превышают или лишь незначительно превышают по абсолютной величине возможную суммарную ошибку (обычно 0,1-0,5 м.д.) при измерениях величин химических сдвигов в спектрах соединений, используемых при расчете отклонений от аддитивности. Однако, в случае некоторых трисахаридов, например соединений 2, 5 и 14, значения ДД заметно превышают эту величину.

Известно, -что величины химических сдвигов сигналов атомов углерода в спектрах ^С-ЯМР определяются внутримолекулярными атом-атомными взаимодействиями, в первую очередь, согласно концепции Гранта-Чини, между протонами, связанными с углеродами. Указанные взаимодействия непосредственно зависят от геометрических параметров молекул. Поэтому возникновение отклонений от аддитивности в спектрах ряда трисахаридов указывает на различие внутримолекулярных атом-атомных взаимодействий, а следовательно и конфор-маций дисахаридных фрагментов этих трисахаридов и соответствующих незамещенных дисахаридов. В связи с этим для выяснения причин возникновения или отсутствия отклонений от аддитивности в спектрах рассматриваемых трисахаридов нами проведен сравнительный теоретический и экспериментальный кон-формационный анализ трисахаридов 1-16 и соответствующих им дисахаридов 188, 190, 192-195, 197 и 200-202 с привлечением молекулярно-механических

расчетов и экспериментов по ядерным эффектам Оверхаузера (ЯЭО), которые, как и химические сдвиги ^с, зависят от межпротонных растояний.

Таблица 7. Отклонения от аддитивности (&&, м.д.) в спектрах _13С-ЯМР трисахаридов 1-26 и 62-65.._

N0 Стереохи- АД

мический С1 С2 сз С4 С5 С6 сг • С1"

кий код

1 ООЦаа 0.2 0.5 0.2 0.1 0 0.1 0 0.4

2 БИЬ.ар 0.6 0.5 -1.3 0.2 0 -0.3 -0.1 0.5

3 ООЦра 0.3 0 0.2 -0.2 -0.1 0 0 0.4

4 ооь,рр 0.6 -0.5 -0.3 -0.4 0.1 0 -0.2 0.1

5 01Х,аа 0.3 0.3 -2.0 1.2 0.3 0.2 -0.5 -0.3

6 ШХ,ар 0.6 1.5 0.7 0.3 -0.1 -0.1 0.4 1.1

7 DLL.pcx 0.8 -0.2 -0.6 0.6 0.4 0.2 0 0.4

8 БЬЦрр 0.4 -0.8 -0.9 -0.4 -0.1 -0.1 -0.5 -0.5

9 1ХЬ,аа 0.6 -0.2 0.2 0.5 0.3 0.6 -0.4 0.3

10 Ь1Х,ар 0.5 -1.0 -0.4 -0.3 0 0 -0.7 -0.2

11 1ХЬ,Ра •0.2 0.4 -1.0 0.2 0.2 0.5 0.1 0.2

12 ых,рр 0.1 -0.8 0.4 -0.6 -0.2 0 -0.3 0.6

13 1_ОЬ,аа 0.4 -0.4 0.4 -0.2 -0.1 0 -0.2 0.5

14 ЫЭЦсф 0.5 -1.7 -0.1 -0.5 0 -0.2 -1.0 0.2

15 LDL,Pа 0.4 0 -0.8 -0.6 -0.1 0 0.8 -0.5

16 0.3 0 -1.1 -0.5 0 -0.2 0.2 0.2

17 1_ОЬ,аа 0,2 -1,0 -0,2 0 -0,1 0 -0,5 0

18 БЬЬ,аа -0,2 -0,2 -2,3 0,9 0,3 -0,1 -0,3 -0,4

19 1ЛЭО,ар 0,3 -1,5 0 -0,3 0,4 -0,2 -0,7 0,1

20 ЬЩоф 0,6 -0,9 -0,5 -0,2 -0,1 -0,2 -0,3 -0,4

21 001.,рр -0,5 -1,3 -0,4 -0,3 0,3 0 -0,9 0

22 ооь,рр 0,7 -1,5 1,3 -0,3 -0,1 0,1 -0,8 0,4

23 01Х,ра 0,8 -0,6 -0,8 0,9 0,5 0,2 -0,4 0

24 ЬОЬ,ар 0,4 -1,7 -0,4 0 -0,4 -0,1 -0,7 -0,7

25 ООЬ,аР 0,3 -0,4 -1,5 0,6 -0,1 -0,2 -0,3 -0,2

26 ООЬ,Ра 0,4 -1,2 -1,3 0,1 0 -0,1 -1,0 -1,0

62 ШЭ.ар -0,6 0,3 -1,4 0,4 -0,2 -0,5 0,1 0,2

63 ш},рр 0,2 -1,9 -0,1 -0,5 -0,2 -0,2 -1,2 0,6

64 1ЛЗО,оса 0,2 0,6 -1,9 1,0 0,3 0,3 -0,5 -0,3

65 ООО.аа 0,5 -0,7 0,5 0,6 0,2 0,3 -0,5 0,1

*) Абсолютные конфигурации моносахаридных заместителей при 02 и 03 и бис-гликозилированного мйносахаридного остатка и аномерные конфигурации заместителей при 02 и 03.

Теоретический конформационный анализ олигосахаридов проводился методами молекулярной механики с использованием атом-атомных потенциальных функций в приближении традиционной для производных углеводов • механической модели (например, 217 для 2,3-ди-0-гликозил-а-метил-Ь-рамнози-дов), в которой молекула олигосахарида представляется как образование из кон-

формационно жестких моносахаридных остатков, соединенных кислородными мостиками. Конформации D- и L-моносахаридов принимались как 4Cj и IC4 соответственно, а координаты атомов определялись из данных РСА соединений, содержащих соответствующие моносахаридные фрагменты. Для получения точных координат атомов а- и p-L-фукопиранозильных остатков, отсутствующих в литературе, проведено рентгено-структурное исследование* кристаллов метил-а-и p-L-фукопиранозидов и дисахарида 154.

В соответствии с выбранной механической моделью в качестве основных параметров конформационного анализа использовались углы вращения вокруг межзвеньевых глико-зидных связей (углы <Р). и Ч>2) и связей 0-С„ (углы V] и 4*2; Сп - атом углерода агликона, участвующий в образовании межзвеньевого мостика), а расчет оптимальных конформа-

ций молекул основывался на минимизации потенциальной энергии молекул за счет изменения углов вращения Ч>2 > и fj.

При конформационном анализе олигосахаридов в качестве определяемых экспериментально характеристик нами использовались ЯЭО, наблюдаемые в результате предоблучения аномерных протонов моносахаридных заместителей, а в ряде случаев и некоторых других протонов. На рисунке 1 в качестве примера приведены спектры 'Н-ЯМР и ЯЭО для трисахарида 2.

На начальном этапе конформационного анализа для каждого олигосаха-рида рассчитывались низкоэнергетические конформеры (один или несколько). После этого строились эквиэнергетические кросс-сечения потенциальной энергетической поверхности в координатах "Pj-Vj (при фиксировании оптимальных значений углов Ч>2 и ^2) и 8 координатах (ПРИ фиксировании оптималь-

ных значений углов Ф] hVj). Полученные таким образом конформационные карты для трисахаридов (рис. 2-4) и соответствующих им дисахаридов сравнивались между собой, что позволяло выявить подобие или различие в статистическом распределении конформеров.

Рассмотрим некоторые результаты проведенного конформационного анализа трисахаридов 1-16. Так, в случае соединений 1, 3 й 4, оба заместителя в которых имеют D-конфигурацию, сравнение величин ЯЭО, зарегистрированных в результате предоблучения протонов HP и НГ (таблица 8), не выявило их заметного отличия от величин ЯЭО в дисахаридах 188, 190, 195 и 197 (таблица 9).

'Совместно с лабораторией чл.-корр. РАН Ю.Т. Стручкова, ИНЭОС РАН; В.А Sadiba-kasov, M.Y. Antipin, Y.T. Stiuchkov, N.E. Nifant'ev, and N.K. Kochetkov, "Crystal structure of methyl a-L-fucopyranoside", Acta Crystallogr. (1995) in press.

Это свидетельствовало о конформационном подобии дисахаридных фрагментов трисахаридов и соответствующих им дис'ахаридов и объясняло отсутствие заметных отклонений от аддитивности в спектрах 13С-ЯМР трисахаридов 1, 3 и 4.

„ у -

I/ Н1

Рисунок 1. Спектр 'Н-ЯМР трисахарида 2 (а) и спектры ЯЭО, зарегистрированные в результате предоблучения Н1" (б) и H Г (в)".

Таблица 8. Величины ЯЭО (%), наблюдаемые в результате предоблучения

протонов H Г и HI" в трисахавидах 1-6*.

No Наблюдаемые ЯЭО No Наблюдаемые ЯЭО

Предоблучение НГ Предоблуч ение-Hl" Предоблучение НГ Предоблучение НГ

1 Н2' Н2 HI 7,8 (1,3) 5,8 (1) 7,2 (1,2) Н2",3 Н2 Н5' 19,2 (2) -, 9,8 (1) 3.8(0,4) 4 НЗ',5' Н2 17,0(1,7) 9,6 (1) Н3",5" НЗ 19,0(2) 9,3(1)

5 Н2' Н2 HI 7,6 (1,2) 6,6 (1) 8,6 (1,3) Н2" НЗ 10,3(1) 10,6(1)

2 Н2' Н-2 HI 5,8 (1) 5,8 (1) 5,8 (1) "Н2" Н3",5" НЗ 3,1(0,3) 21,2 (2) 10,8 (1)

6 Н2' Н2 HI 7,2(1) 7,0(1)-6,2 (0,9) НЗ" Н5" НЗ Н2 6,0(0,7) 7,8(0,8) 9,1 (1) 1,5(0,2)

3 ш-.з'.у Н2 HI 21,4 (3) 7,1 (1) 0,8 (0,1) Н2" НЗ Н2 7,8(1,6) 4,7 (1) 6,1(1,3)

*' В скобках приведены относительные величины ЯЭО.

Икая, ситуация наблюдалась в случае трисахарида 2, в спектре которого Д ДСЗ составляет -1,3 м.д. (таблица 7). Анализ конформационных карт для этого соединения подтвердцл конформационное подобие (1-2)-связанного дисахарид-ного фрагмента и соответствующего ему дисахарида 188, но выявил некоторое отличие конформаций (1-3)-связанного дисахаридного фрагмента и дисахарида 198 (рис. 2). Так, соотношение суммарного ЯЭО на Н3",5" и ЯЭО на НЗ для трисахарида 2 составляет 2:1, а для дисахарида 198 только 1,6:1. Это свидетельствует о большей удаленности HI" от НЗ в трисахариде, чем в дисахариде, что должно вызывать уменьшение эффекта гликозилирования Д6СЗ и, как следствие, приводить к появлению отрицательной величины отклонения от аддитивности для сигнала СЗ (ДД5СЗ -1,3 м.д.).

Табдйца 9. Величины ЯЭО (%), наблюдаемые в результате предоблучения протонов НУ в (1-2)- и (1-3)-связанных дисахаридах 188, 190, 192-195. 198, 200 и 202.

Дисахариды HI H2 H2,2' H2' H2',5' H3' H5'

(1-2)-связанные ■ a-D-Man-(l-2)-<x-L-Rha-OMe 188 P-D-Glc-(l-2)-a-L-Rha-OMe 190 7,1 1,0 10,5 15,9 11,5 8,9

(1-3) -связанные H2 H3 H2' H3' H5' H3',5'

a-D-Man-(l-3)-a-L-Rha-OMe 195 p-D-Glc-( 1 -3)-a-L-Rha-OMe 198 a-L-Rha-(l-3)-a-L-Rha-OMe 200 P-L-Fuc-(l-3)-<x-L-Rha-OMe 202 10,0 4,9 5,7 4,6 11,0 9,1 7,5 1,8 9,1 6,0 7,8 7,5 ■

Причина пространственной удаленности протонов HI" и НЗ в трисахари-де 2 по сравнению с таковой в дисахариде 198 выяснена при сравнении кон-формационных карт для 198 и (1-3)-связанного дисахаридного фрагмента в 2' (рис. 2). Так, наибольшая сближенность рассматриваемых протонов реализуется при значении углов Ч>2 °т "70 до -30°, однако именно при этих значениях углов V2 конформационная подвижность в трисахариде ограничена из-за пространственного взаимодействия остатков Man и Glc.

Рисунок 2. Кросс-сечение потенции-альной энергетической поверхности трисахарида 2 (Ч>] -59,4o, V, -35,0°). Показаны эквипотенциальные уровни с относительной энергией Al, ДЗ и Д5 ккал/ моль; знаком х обозначен локальный минимум;---, энергетический контур с относительной энергией Д1 ккал/моль для дисахарида р-D-Glc-(l-3)-a-L-Rha-OMe (190)

Щш анализе спектров l^C-ЯМР трисахаридов 1-16 самая крупная отрицательная величина ДД (-2,0 м.д.) была обнаружена для сигнала СЗ трисахарида 5. И в этом случае отклонение от аддитивности связано с различием конформаци-онной подвижности (1-3)-связанного фрагмента и соответствующего дисахарида 200 и, в частности, с различием расстояний между протонами HI" и НЗ, взаимодействие которых оказывает влияние на величину химического сдвига сигнала СЗ. Из конформационных карт соединений 5 и 200 (рис. 3) видно, что значения углов 4*2 в области от -20° до -70°, при которых реализуются конформа-ции с наибольшей сближенностью HI" и НЗ, являются запре-щенными для трисахарида 5. Увеличение расстояния Н1"-Н3 ослабляет a-эффект гликозилирова-

ния, что и приводит к появлению отрицательного отклонения от аддитивности для сигнала СЗ в спектре 5.

Рисунок 3. Кросс-сечение потенциальной энергетической поверхности трисахарида 5 ((Р) -65,6°, Ч^ -41,0°)! Показаны эквипотенциальные уровни с относительной энергией Д 1, ДЗ и Д5 ккал/моль; знаком х обозначен локальный минимум;---,

энергетический контур с относительной энергией Д1 ккал/моль для дисахарида <х-Ь-Ю1а-(1-3)-сс-Ь-Ю1а-_ ОМе (192)

В спектре 13С-3!МР трисахарида б выявлено самое-крупное положительное отклонение от аддитивности - ДД5С2 1,5 м.д. Такой эффект мог быть следствием большей сближенности протонов. НГ и Н2 в б, чем в дисахариде 188. Однако это не подтверждалось результатами экспериментов по ЯЭО (таблицы 8,9) и конформационных расчетов, свидетельствовавших о информационном подобии дисахарида 188 и соответствующего ему (1-2)-связанного фрагмента трисахарида 5. Однако, на величину химического сдвига сигнала С2 оказывает влияние не только взаимодействие протонов НГ и Н2, но и протонов Н1" и Н2. Ранее (Shashkov A.S., et al. // Magn.'Res. Chem.- V.26 (1988). P.735-747) при исследовании серии (1-3)-связанных гликозил-рамнозидов было показано, что увеличение у-гош-взаимодействия Н1 гликозильного заместителя и экваториального Н2 остатка Rha вызывает сильнопольный сдвиг сигнала С2 (и Cl'), а ослабление - слабопольный. Данные по ЯЭО наглядно свидетельствуют о более сильном взаимодействии протонов Н1" и Н2 в трисахариде 6, чем в дисахариде 202. Действительно,-в результате предоблучения Н1" в б зарегистрированы ЯЭО на протонах ,НЗ",5", Н2 и НЗ в соотношении 1,5:1:0,2, тогда как соотношение ЯЭО для аналогичных протонах дисахарида 202 составляет 1,5:1:0,5.

Различное расстояние между протонов Н1" и Н2 в трисахариде б и дисахариде 202 подтверждают и результаты теоретического конформационного анализа. Как видно из рис. 4, конформационная подвижность фукозил-рамнозид-ного звена в б более ограничена, чем в дисахариде 202. .При значениях углов Ч^ в области от -30 до -60° реализуются энергетически невыгодные конформации, характеризующиеся сильным взаимодействием моносахаридных заместителей, однако именно в этих конформациях расстояние между протонами Н1" и Н2 наименьшее.

Рисунок 4. Кросс-сечение потенциальной энергетической поверхности трисахарида 6 (Ч>1 -61,0°, V, -41,7Р). Показаны эквипотенциальные уровни с относительйой энергией Д1, ДЗ и Д5 ккал/моль; знаком х обозначен локальный минимум;---, энергетический контур с относительной энергией Д1 ккал/моль для дисаха-рида р-Ь-Рис-(1-3)-а-Ь-Шш-ОМе (194)

экспериментальный конформационный анализ трисахаридов 7-16 и соответствующих им дисахаридов позволил, как и в случае рассмотренных выше соединений, проследить причины возникновения отклонений от аддитивности в спектрах 13С-ЯМР. Исследование трисахарида 9 и тетрасахарида 50 показало конформационное подобие общего разветвленного трирамнозидного фрагмента в них, что полностью соответствует найденным для этих соединений отклонениям от аддитивности, которые также совпадают.

Таким образом, на примере исследования полной серии 2,3-ди-О-глико-зил-рамнозидов, включающей трисахариды со всеми возможными сочетаниями абсолютной и аномерной конфигураций моносахаридных заместителей, было продемонстрировано, что возникновение отклонений от аддитивности в спектрах '3С-ЯМР связано именно с конформационными различиями и изменениями протон-протонных взаимодействий, наблюдаемыми при переходе от дисахаридов к разветвленным трисахаридам. Успех этой части работы определен использованием методологии конформационного анализа, разработанной ранее в ИОХ РАН (Г.МЛипкинд, Конформационный анализ углеводных цепей, докторская диссертация, ИОХ РАН, 1991). Можно отметить, что в проведенном ранее шведскими учеными (Baumann H., et al. // J. Chem. Soc. Perkin Trans 7.-1989.-N12.-P. 2153-2165, P. 2167-2178) исследовании группы 3,4-ди-О-гликозил-галактозидов, аналогичной серии трисахаридов 1-16, не удалось выявить взаимосвязь конформационных и спектральных (13С-ЯМР) свойств, в том числе и отклонений от аддитивности, что скорее всего определено использованием для конформационных расчетов альтернативного метода HSEA.

2.2.2. Анализ величин отклонений от аддитивности в спектрах 13 С-ЯMP трисахаридов 17-26 и 62-65 ¡7,8,15].

На примере трисахаридов 1-16 нами изучена зависимость отклонений от аддитивности от абсолютной и аномерной конфигураций моносахаридных за-

-во

■•О -60 -30 О 30 .0

2

Проведенный теоретический и

местителей. В дальнейшем эти данные были использованы для составления матрицы величин ЛД (см. раздел 3), необходимой для компьютерного структурного анализа полисахаридов. Однако, для корректного использования данной матрицы должен был быть экспериментально изучен вопрос о возможной зависимости величин ДА и от других структурных параметров, в частности, конфигураций атомов С2' и С2", а также природы заместителя (OH.NHAc) при С2' и С2", которые влияют на величины химических сдвигов сигналов атомов С1-С4 и С Г в спектрах (1-2)- и (1-3)-связанных гликозил-рамнозвдов, используемых при расчете значений отклонений от аддитивности. Кроме этого, необходимо было экспериментально подтвердить возможность использования полученных величин ДД и для анализа спектров полисахаридов, содержащих 2,3-ди-О-гликози-лированный остаток a-D-маннопиранозы.

Для решения этих вопросов были изучены трисахариды 17-26 и 62-65, величины ДД для которых приведены в таблице 7. Полученные данные свидетельствуют об удовлетворительном совпадении величин ДД для {¡оединений, имеющих одинаковый стереохимический код (случай трисахарида 21 будет рассмотрен отдельно ниже). Так, в спектрах трисахаридов13 и 17 (LDL,aa) отклонения от аддитивности невелики, максимальное из них, для сигнала С2, составляет всего 0,4 м.д.-, хотя в этих трисахаридах имеются различия в конфигурациях атомов С2', С2" и С4\ Аналогичная близость значений ДД наблюдается и при сравнении данных для пар трисахаридов 5 и 18, а также 14 и 19, относящихся к группам DLL,aa и LDL,aß соответственно, для которых были выявлены большие величины ДД. Таковыми в случае 5 и 18 являются ДДСЗ (-2,0 и -2,3 м.д.), а для пары 14 и 19 - ДДС2 (-1,7.. и -1,5 м.д.). В спектрах соединений 14 и 19 имеются заметные отклонения от аддитивности и для сигнала СГ, которые также близки (-1,0 и -0,7 м.д.).

Сравнение данных спектров трисахаридов 10 и 20 еще раз свидетельствует о сохранении величин ДД для стереохимически подобных трисахаридов. Отметим, что пары соединений 5 и 18, 14 и 19, а также 10 и 20 различаются между собой конфигурациями атомов С2' и С4\ Это свидетельствует о том, что величины ДД в меньшей степени зависят от конфигурации С2-С4 моносахаридных заместителей, чем химические сдвиги атомов углерода, входящие в уравнения (3)-(5) для расчета отклонений от аддитивности. Например, химические сдвиги С2 в дисахаридах a-D-Man-(l-2)-a-L-Rha-OMe и a-D-Glc-(l-2)-a-L-Rha-OMe, с одной стороны, и в трисахаридах 5 и 18-е другой различаются соответственно на 1,4 и 6,9 м.д., однако величины ДД5С2 для соединений 5 и 18 близки: 0,3 и -0,2 м.д.

Совпадение величин ДД наблюдается и при сравнении данных для 2,3-ди-О-гликозилманнозидов 62, 64 и 65 с таковыми для трисахаридов 2, 5 и 18 (оба

соответствуют трисахариду 64) и 9. Рассматриваемые трисахариды различаются не только абсолютными конфигурациями входящих в них моносахаридов, но и конфигурациями С2 и С4 атомов моносахаридных заместителей, например, С2', С4' и С4" в случае трисахаридов 2 и 62. Эти данные свидетельствуют о переносимости в общем случае величин ДА между соответствующими 2,3-ди-О-глико-зил-а-Ь-рамнозидами и а-Б-маннозидами при условии обращения абсолютных конфигураций заместителей при 02 и ОЗ.

Иная ситуация наблюдается при сравнении данных для трисахаридов 4 (ББЦрр) и 63 (ЬЫ),РЗ), в случае которых выявлено большое различие в величинах ДА. Так, в спектре диглюкозил-рамнозида 4 практически не наблюдается заметных отклонений от аддитивности, тогда как в спектре дифукозил-маннози-да 63 они имеются (ДДС2 -1,9 м.д. и ДД СГ -1,2 м.д.). Можно предположить, что несовпадение величин ДД определено конформационным различием трисахаридов 4 и 63, вызванным разной ориентацией ОН-группы при С4". Этот вывод сделан при анализе молекулярных моделей обоих трисахаридов, из которых видно, что обращение конфигурации атома С4" может привести к изменению невалентных взаимодействий моносахаридных заместителей, что, в свою очередь, должно отразиться в спектрах 13С-ЯМР. Для проверки этого предположения был исследован трисахарид 21, имеющий только одно различие с диглюко-зил-рамнозидом 4 - в конфигурации С4". Как и ожидалось, в спектре трисаха-рида 22, как и в случае дифукозил-маннозвда 63 (но в отличие от диглюкозил-рамнозида 4), наблюдаются заметные отклонения от аддитивности для сигналов С2 и СГ (-1,3 и -0,9 м.д.).

Таким образом, в случае вицинально разветвленных трисахаридов, в которых непосредственно несвязанные между собой моносахаридные остатки оказываются пространственно сближенными, обращение конфигурации атомов С2-С4 в заместителях может вызывать конформационные изменения и, как следствие, изменения химических сдвигов сигналов 13С других моносахаридных звеньев триса>&рица. Однако, в целом, полученные спектральные характеристики свидетельствуют о том, что в ряду 2,3-дигликозил-а-рамнозидов и -а-маннозидов величины ДД для стереохимически подобных трисахаридов близки и являются переносимыми параметрами.

При сравнении спектральных характеристик для трисахаридов, содержащих р-О-глюкопиранозильный заместитель, и их глюкозаминильных аналогов, наблюдалось как совпадение (пары 2 и 25, 7 и 23, 14 и 24), так и различие величин ДД (пары 3 и 26, 4 и 24) (таблица 7). Отметим, что несовпадение величин ДД выявлено в случае трисахаридов (22, 26), содержащих в1сЫАс в качестве заместителя при 02.

Наличие или отсутствие расхождений в величинах ДА для трисахаридов 22-26 и их глюкозных аналогов может быть объяснено, а в ряде случаев и ожидаемо с учетом конформационных свойств дисахаридных фрагментов, составляющих рассматриваемые трисахариды. Теоретический конформационный анализ предсказывает для 2-0- и 3-0-(2-ацетамидо-2-дезокси-р-0-глюкопиранозил)-а-Ь-рамнопиранозильных фрагментов существование преобладающего конформе-ра с гош-ориентацией агликона (рамнозный остаток) по отношению к С1-05 связи в глюкозаминовом заместителе. Это дает основание ожидать, что в преобладающих конформерах соединений с (1-3)-связью между СТсЫАс и ЯЬа-ОМе звеньями объемная ацетамидная группировка ориентирована в сторону, противоположную заместителю при 02 дизамещенной рамнозы (см. рис. 5 Б). Поэтому для пар трисахаридов с глюкозаминильным заместителем при 03 и их нейтральных аналогов наиболее вероятно подобие в конформационных свойствах и, как следствие, совпадение величин ДД, что подтверждают данные для пар трисахаридов 2,25 и 14,24.

Противоположная ситуация может бьггь предсказана для трисахаридов с (1-2)-связанным р-О-глюкозаминил-рамнозидным фрагментом, в преобладающем конформере которого ацетамидная группировка ориентирована в сторону второго моносахаридного заместителя, находящегося при 03 остатка рамнозы (рис. 5А). Поэтому для трисахаридов с <ИсЫАс в качестве заместителя при 02 и их нейтральных аналогов можно ожидать конформационное различие и, как следствие, расхождение в величинах ДД. Однако, оно может и отсутствовать в зависимости от характера моносахаридного заместителя при ОЗ, от которого зависит степень взаимодействия с ацетамвдной группой. Так, например, в случае пар трисахаридов 3,26 и 4,22 наблюдаются значительные расхождения в величинах ДД, а в спектрах трисахаридов 7 и 23 они совпадают.

Рисунок 5. Схематическое изображение ориентации ацстамидной группы относительно

второго моносахаридного заместителя в трисахаридах с (1-2)- (А) и (1-3)-связанным (Б) р-О-глюкозаминил-а-Ь-рамнозкдным дисахарвдным фрагментом.

:*

А

Б

Анализ молекулярных моделей трисахаридов 22,23 и 26 с учетом результа-

тов конформационного анализа трисахаридов 4, 7 и 3 позволяет объяснить различие величин ДД в спектрах пар соединений 4,22 и 3,26 и их совпадение в спектрах 7 и 23. Так, для трисахарида 4 найдены две наиболее низкоэнергетические конформации со значениями углов межсвязевого вращения 4*1=57,7° и У] = 19,0° (Е = -7,1 КДж/моль) в первом случае и Ч>1 = 40,6° и 4^= -24,1° (Е= -6,7 КДж/моль) во втором. Однако, при таких значениях углов <Р) и 'С] в трисахариде 22 возможно пространственное взаимодействие между ацетамидной группой при С2' и первичной спиртовой группой (Н06) моносахаридного заместителя при 03, причем оно должно усиливаться с увеличением значения угла Ч'|, т.е. при переходе к более энергетически выгодной конформации.

Различие конформации трисахаридов 4 и 22 было подтверждено с привлечением данных по ЯЭО. Так, в результате предоблучения НГ в трисахаридах 4 и 22 соотношение ЯЭО на Н2 и суммарного ДЭО на Н3'+Н5' составляют 1:1,7 и 1:3,6 соответственно. Это свидетельствует о большем расстоянии между протонами НГ и Н2 в трисахариде 22, чем в 4, и объясняет большее по модулю отрицательное значение величины ДД для С2 в спектре 22, так как ослабление взаимодействия протонов НГ и Н2 уменьшает а-эффект гликозилирования. Анализ величин ЯЭО, вызываемых предоблучением Н1" в 4 и 22, не проводился из-за перекрывания сигналов Н2', НЗ' и Н2" в спектре 1Н-ЯМР диглюкозаминил-рамнозида 22.

Аналогичный сравнительный конформационный анализ трисахаридов 3 и 26; а также 7 и 23, показал причины отклонений от аддитивности в первой паре и отсутствие расхождений во второй.

Таким образом, при переходе от вицинально разветвленных трисахаридов с нейтральными заместителями к стерсохимически подобным трисахаридам, содержащим остатки аминосахаров, могут наблюдаться различия в величинах ДД. В связи с этим, для компьютерного анализа разветвленных полисахаридов желательно расширение используемой базы данных по величинам ДД за счет включения в нее, по мере появления, характеристик для модельных трисахаридов, содержащих остатки аминосахаров, особенно при 02 дизамещенного звена. Результаты исследования трисахаридов 22-26 еще раз продемонстрировали, что использование теоретического конформационного анализа значительно сокращает количество необходимых модельных соединений, так как позволяет предсказывать структуры трисахаридов, для которых возможны отклонения от аддитивности в спектрах 13С-ЯМР.

2.2.3. Сравнение величин отклонений от аддитивности в спектрах ^С-ЯМР 2,3-ди-О-гликозил-рамнозидов и 3,4-ди-О-гликозил-галактозидов [ 14].

При исследовании отклонений от аддитивности в спектрах вицинально

разветвленных олигосахаридов представляло интерес изучить возможность перенесения величин ДД не только на случаи стереохимически подобных трисахари-дов (раздел 2.2.2), но и на случаи трисахаридов, содержащих аналогичный тип разветвления в других положениях. Выяснение этого вопроса имеет значение при составлении баз данных по величинам ДД для компьютерного анализа, т.к. при условии правомочности таких перенесений возможно дальнейшее значительное сокращение количества необходимых модельных соединений. Данный подход использован, например, при формировании базы величин ДД для программы структурного анализа полисахаридов CASPER (Jansson Р.-Е., et al. // Carbohydr. Res.- V.188(1989) P.169-191).

В этой связи нами проведено сравнение величин ДД для 2,3-ди-О-глико-зил-рамнозидов с данными для изученных ранее 3,4-ди-О-гликозил-галактози-дов, также содержащих аксиально-экваториальное разветвление, но в положенях 4,3. В результате показано значительное расхождение величин ДД для обеих групп трисахаридов (особенно для содержащих при 04 галактозы и 02 рамнозы моносахаридный заместитель с L-конфигурацией), что вероятнее всего является следствием различной ориентации заместителя при С5 в гал'актозидах и С1 в рамнозидах. Таким образом, рассмотренный вариант перенесения величин ДД неправомочен (см. также раздел 2.4).

2.3. Величины отклонений от аддитивности в спектрах трисахаридов 68-92, содержащих 2,3-диэкваториалъное разветвление [12,13].

Отклонения от аддитивности (таблица 9) в спектрах трисахаридов 68-92, содержащих 2,3-диэкваториальное разветвление, рассчитаны по уравнениям, подобным (3)-(5). На основании найденных величин ДД можно более или менее четко выделить три группы трисахаридов, характеризующихся различными типами отклонений от аддитивности, и прежде всего для сигналов С2 и СЗ дизаме-щенных остатков.

К первой группе относятся трисахариды 68, 71, 80, 93, 86, 90 и 92, в спектрах которых отклонения от аддитивности как для атомов С2, так и СЗ имеют большие по модулю отрицательные значения (2 м.д. и более). Эти соединения также характеризуются заметными величинами ДД для атомов СГ и/или С1".

Спектры трисахаридов второй группы (70, 73, 74,-76, 77, 81 и 87-89) имеют небольшие по модулю (<1 м.д.) отрицательные или положительные отклонения от аддитивности. Остальные трисахариды, относящиеся к третьей группе, характеризуются только одной значительной по модулю (>1,5 м.д.) величиной Д Д для сигнала С2 или СЗ.

Для объяснения характера величин ДД в спектрах-трисахаридов 68-92 нами проанализированы конформации трисахаридов и соответствующих дисахари-дов с привлечением данных экспериментов по ЯЭО. В результате показано, что,

как и в случае рассмотренных выше трисахаридов с 2-аксиально,3-экваториаль-ным разветвлением, возникновение отклонений от аддитивности связано с конформационными различиями дисахаридных фрагментов трисахаридов и соответствующих незамещенных дисахаридов.

Таблица 9. Отклонения от аддитивности (АЛ, м.д.) в спектрах

13С-ЯМР трисахаридов 68-92.

N0 Стереохи- ДД

мический С1 С2 СЗ С4 С5 С6 С1" С1"

кий код* (1-2) (1-3)

68 ОБО.аа -0,3 -2,7 -3,4 -0,1 -0,1 -0,4 -0,8 -1,3

69 ООО,За 0,7 -1,4 -2,3 0,3 -0,4 -0,1 -0,6 -0,8

70 ЫЗО.аа 0,4 -0,2 -0,2 0,8 -0,1 0,4 0,4 0,2

71 0,6 -3,0 -4,4 1,0 0 -0,4 0 -1,4

72 ООО,ар -0,1 -1,5 -1,2 0,2 -0,3 -0,1 -0,6 -0,6

73 ООБ.РЗ 0,7 -0,6 -0,2 0,4 -0,2 0,1 -0,3 -0,5

74 1ХЮ,аР 0,5 0,2 0 0,5 -0,5 0,3 0,2 -0,3

75 ию.рр 1,6 -0,8 -1,3 0,5 -0,2 -0,2 0,6 0

76 ШЛЭ,аа -0,2 0,5 -1,3 0,2 -0,3 0 0,3 -0,6

77 01ЛЗ,ра 1Д 0,1 -0,3 0,6 -0,3 0 -0,3 0,1

78 1X0,аа 0,2 0,4 1,7 0,6 -0,4 0,2 0,2 0,5

79 ШЭ,Ра 0,5 -0,2 -1,3 0,2 0 -0,1 0,6 0

80 Б Ц),ар 0,7 -2,8 -3,6 1,3 0,1 0 -1,2 0,2

81 БЬО,рр 1,2 1,9 -0,8 1,2 -0,2 0,2 1,5 1,1

82 1ХБ,ар 0,5 0,5 -2,9 1,2 -0(1 0 0,2 0,2

83 шо,рр 0,8 -2,1 -4,5 0,8 0 0,3 -1,2 -1,7

84 ЬЬБ.аа -0,1 -0,3 -0,4 0,1 -0,1 -0,1 0,3 0,5

85 ШЛ),аа 0,3 -0,7 0,4 0,4 -0,4 0 -0,7 -0,2

86 БОО.аа -0,7 -1,2 -3,3 0,8 0,3 0,2 -0,2 -0,8

87 оэо,рр 0 -0,2 -1,1 -0,2 0 0 -0,4 -0,3

88 ШЭ,аа -0,2 0,6 -0,3 0,2 0 0 0 0,2

89 ШЭ,аР 0,7 0 -0,7 1,2 0,3 0,2 0,2 1,0

90 ШЗ,ЗР 1,1 -3,6 -2,7 0,6 0,2 0,2 -0,9 -0,8

91 Ш3,ар 0,3 -0,4 -1,3 -0,5 -0,2 0,1 -0,1 -0,5

92 Ш),33 1,9 -1,1 -3,8 0,8 -0,2 0,2 -1,8 1,0

*) Абсолютные конфигурации заместителей при 02 и 03 и бис-гликозилированного моносахаридного остатка и аномерные конфигурации заместителей при 02 и 03.

Данные таблицы 9 свидетельствуют, что, как правило, для стереохимичес-ки подобных 2,3-диэкваториально разветвленных трисахаридов наблюдаются одинаковые тенденции в изменении величин ДА. Однако, специальный интерес представляло и их количественное сравнение, поскольку такой анализ показывает, в какой степени изменение конфигураций С2-С4 моносахаридных заместителей, а также С1 и С4 бис-гликозилированного остатка, может влиять на величины ДД.

Среди соединений 68-92 стереохимически подобны группы трисахаридов 78, 81 и 88; 83, 90 и 92; 82, 89 и 91; 68 и 86; 73 и 87; 76 и 85. В целом, для этих соединений наблюдается удовлетворительное совпадение величин АД, хотя в ряде случаев имеются и заметные различия. Например, ДД5СЗ для 78 и 88 отличаются на 2 м.д., а ДД6С2 для 90-и 92 на 2,5 м.д. Таким образом, в ряду соединений с рассматриваемым типом разветвления перенесение известных величин ДД на случаи стереохимически'подобных трисахаридов может, быть не всегда точным, и поэтому для компьютерного структурного анализа разветвленных полисахаридов с 2,3-диэкваториально замещенными звеньями желательно накопление баз данных по величинам ДД для каждого возможного случая разветвления. Найденные же в спектрах трисахаридов 68-92 значения отклонений от аддитивности служат основой при составлении базы данных по величинам ДА для 2,3-диэкваториально разветвленных структур.

2.4. Олигосахариды с 3,4-диэкваториалъным разветвлением.

Отклонения от аддитивности в спектрах 13С-ЯМР трисахаридов 99-114 (таблица 10), содержащих 3,4-диэкваториальное разветвление, рассчитаны по уравнениям, подобным (3)-(5). Для соединений 99-114 и составляющих их дисахаридов также проведен конформационный анализ с привлечением экспе-

Таблица 10. Отклонения от аддитивности (АЛ, м.д.) в спектрах _13С-ЯМР трисахаридов 99-114._

N0 Стереохи-мический кий код* ДД

С1 С2 СЗ С4 С5 С6 С11 (1-3) С1" (1-4)

99 БОЬ.аа -0.45 -0.65 -0.05 -3.5 0.55 0.15 0.3 -1.1

100 ОБЬ,ар -0.25 -0.4 -0.3 -3.6 -0.35 -0.15 -0.1 -1.1

101 01Х,аа -0.35 -1.3 -0.55 -1.1 -0.25 -0.15 -1.0 -0.1

102 тх>,ар -0.35 0.8 -1.65 -3.5 1.05 -0.15 -0.4 -0.2

103 БОЬ,Ра -0.3 -1.1 0.2 -3.3 0.15 0.05 -0.9 -1.1

104 БОЬ,рр -0.2 -0.2 0.15 -2.35 -1.9 -0.2 -1.2 0.1

105 Б1Х,Ра -0.25 -0.2 0.4 -1.2 0.1 -0.1 -0.2 -0.1

106 ощрр -0.3 0.35 0.5 -2.5 0.7 -0.4 0.75 0.1

107 ЬОЬ,аа 8.1 0.1 1.8 -2.9 0.45 -0.3 0.4 -0.6

108 ЬОЬ,аР 0.15 0.2 1.35 -3.0 0.3 0.35 0.4 -0.7

109 Ь1Х,аа 0.2 0.2 2.2 -0.2 0.5 0.3 0.5 0.4

110 ЦХ,ар 0.1 0.9 -1.5 -1.4 0.9 0.3 -0.5 0.3

111 1ЛЭЬ,ра -0.35 -0.4 -1.8 -4.7 0.1 -0.15 -0.75 -1.4

112 иэцрр -0.75 -0.8 -1.15 -0.6 0.15 -0.55 -0.35 0.4

113 1_:1Х,Ра 0.4 0 -0.8 -0.6 -0.1 0 0.8 -0.5

114 их,рр -0.25 0.65 -2.6 -3.0 1.1 0.15 -0.45 -1.0

*) Абсолютные конфигурации заместителей при 03 и 04 и бис-гликозилированного моносахаридного остатка и аномерные конфигурации заместителей при ОЗ и 04.

. риментов по ЯЭО и показано, что наличие или отсутствие отклонений от аддитивности в спектрах 13С-ЯМР объясняется теми же причинами, что и в случае рассмотренных выше групп трисахаридов.

Как и в случае аксиально,экваториально разветвленных трисахаридов (раздел 2.2.3), нами изучена возможность перенесения величин ДД между группами трисахаридов, содержащих диэкваториальное разветвление в разных положениях. Для этого проведен сравнительный анализ отклонений от аддитивности в спектрах соединений 68-92, 99-114, а также имевшихся в литературе данных для 2,3-ди-О-гликозил-р-О-галактозидов, 3,4-ди-О-гликозил-О-глкжозидов и -О-глюкозаминидов. В результате найдено, что среди соответствующих друг другу диэкваториально разветвленных соединений обычно наблюдаются подобные качественные тенденции значений отклонений от аддитивности, однако количественно они могут существенно отличаться» Поэтому перенесение величин ДД между группами трисахаридов, содержащих диэкваториальное разветвление в разных положениях, не может считаться правомерным, а базы данных по отклонениям от аддитивности, необходимые для компьютерного анализа соответствующих полисахаридов, должны формироваться отдельно для каждого конкретного случая разветвления.

3. Разработка бездеструктивного метода установления строения регулярных вицинально разветвленных полисахаридов на основе компьютерного анализа данных их спектров 13С-ЯМР.

Одной из главных задач данной работы было не только получение базы данных по отклонениям от аддитивности в спектрах !3С-ЯМР вицинально разветвленных олигосахаридов, но и ее последующее использование для компьютерного структурного анализа вицинально разветвленных полисахаридов. В данном разделе рассматриваются принципы построения компьютерной программы для расчета спектров полисахаридов и поиска наиболее вероятной структуры, а также приведены примеры практического использования разработанного метода для структурного анализа ряда разветвленных полисахаридов.

3.1. Разработка программы Агя компьютерного анализа данных спектров 13С-ЯМР регулярных разветвленных полисахаридов [29]. Метод бездеструктивного компьютерного структурного анализа полисахаридов, развиваемый в настоящее время в ряде исследовательских лабораторий, основан на расчете и анализе спектров 13С-ЯМР полисахаридов с помощью компьютера. Метод включает три основных этапа: генерацию всех возможных структур полисахарида с данным моносахаридным составом и типами замещения, расчет спектров '^С-ЯМР для каждой из этих структур и поиск структуры, рассчитанный спектр которой лучше всего совпадает с экспериментальным.

Расчет спектров полисахаридов проводится по аддитивным уравнениям. Так, химические сдвиги атомов углерода линейной цепи, например, атома / остатка Sj, соединенного с остатками S;+1 и Sj.j связями типов к и к', определяются по уравнению типа (6), в котором суммируются величина химического сдвига атома углерода / в незамещенном моносахариде 50(1) и эффекты гликозилирова-ния А(к,/) и В(к',/), вызванные наличием гликозидной связи к между остатками Sj+j и Sj и связи к' между Sj и Sj_j.

Sj+i - - Sj —-—- Sj.j 6(0 = 5 o(0 + A(k ,/) + B(k',/) (6)

Для расчета химических сдвигов атомов углерода дизамещенного остатка, например, атома т, используется уравнение, подобное (7), которое дополнительно содержит также эффект гликозилирования A(k",m), вызванный наличием гликозидной связи типа к", а также отклонение от аддитивности D(k,k",/n) для данного раз-ветвленного фрагмента.

Si+i ——- si ——- si-l k" Si'

6 (m) = 5 0(m) + A(k,m) + B(k>) + A(k '» + D(k,k'» (?)

Для проведения компьютерного структурного анализа вицинально разветвленных полисахаридов была составлена компьютерная 'Программа*, построенная на основе уравнений (6) и (7) и использующая базы данных по эффектам гликозилирования, определенным из спектров модельных дисахаридов, и величинам отклонений от аддитивности, найденным в результате исследования разветвленных трисахаридов. Первый вариант программы был написан на языке АЛГОЛ-60 и использовался при работе на ЭВМ БЭСМ-6. Модифицированная версия программы, используемая в настоящее время, написана на языке Турбо Паскаль 5.5 и адаптитирована к работе на IBM совместимом персональном компьютере класса AT.

Проверка работы программы проведена на примере компьютерного анализа спектров рада бактериальных полисахаридов, построенных из разветвленных повторяющихся звеньев 218-225, содержащих 2,3-ди-О-гликозилированные звенья a-D-маннопиранозы, а также a-D- и a-L-рамнопиранозы. Данные поли сахариды изучались ранее с привлечением химических деструктивных методов.

* Текст программы написан д.х.н. Г.МЛипкиндом

-2)-a-L-Rha-(1-3)\

a-L-Rha-(1 -3)-a-L-Rha-(1 -

a-D-Fuc3NAc-(1-2)/

218 (S=0,9) Pseudomonas syringae патовар tabaci серогруппа VII

-3)-a-L-Rha-(1-2)\

a-L-Rha-(1 -3)-a-L-Rha-(1 -3)-a-L-Rha-(1 -

a-D-Fuc3NAc-(1-3)/.

219 (S=0,6) Proteus hold 8300 серогруппа I

-3)-p-D-GlcNAc-(1-2)\

a-L-Rha-(1-3)-a-L-Rha-(1-3)'-a-L-Rha-(1-a-D-Glc-(1-3)/

220 (S=l,l) Shigella flexneri тип X

-2)-<x-L-Rha-(1-2)\

a-L-Rha-(1-3)-a-L-Rha-(1-3)-p-D-GlcNAc-(1-a-D-Glc-(1-3)/

221 (S=0,7) Shigella flexneri тип 5а

-3)-ß-D-QuiNAc(1 -2)\

a-L-Rha-(1-3)-a-L-Rha-(1-4)-a-D-GalNAcA-(1-a-D-Glc-(1-3)/

222 (S=0,7) Pseudomonas aeruginosa V (Verder-Evans)

-3)-ß-D-Qui4NAc(1-2)\

a-D-Man-(1-4)-p-D-Gal-(1-3)-ß-D-GlcNAc-(1-a-D-Glc-(1-3)/

223 (S=0,9) Escherichia coli 07

-4)-p-D-Glc-(1-2)\

a-D-Rha-(1 -3)-ß-D-Rha-(1 -a-D-Gal-(1-3)/

224 (S=l,9) Escherichia hermannii штамм ATCC 33650

Для оценки вероятности каждый из структурных вариантов анализируемого полисахарида, предложенных компьютером, характеризовался параметром S, являющимся суммой квадратов отклонений химических сдвигов соответствующих сигналов в экспериментальном и рассчитанном спектрах, нормированной на один моносахаридный остаток. Таким образом, наиболее вероятной структурой исследуемого полисахарида является та, которой соответствует наименьший S-фактор. Учитывая, что в зависимости от условий съемки спектра 'ЗС-ЯМР суммарная погрешность определения величин химических сдвигов сигналов может достигать по абсолютной величине 0,5 м.д., принято, что для возможных кандидатов на вероятную структуру S-фактор должен быть менее 1,5 (0,52x6=1,5).

При анализе спектров полисахаридов 218-223 компьютерный расчет

вьщелял в качестве наиболее вероятных правильные структуры, для которых величины S-факторов были <1,1. При анализе полисахарида 224 из Escherichia hermannii пггам-ма АТСС 33650 S-фактор для правильной структуры составлял 1,9, однако и в этом случае он был наименьшим, а альтернативный структурный вариант с повторяю-щим звеном 225 характеризовался заметно большей величиной S, равной 2,8.

-4)-ß-D-Glc-(1-3)\

a-D-Rha-(1-3)-ß-D-Rha-(1- 225 (S=2,8)

<x-D-Gal-(1-2)/

Таким образом, рассмотренные примеры расчета и анализа спектров полисахаридов, в том числе состоящих из сложных тетра- и даже пентасахаридных повторяющихся звеньев, показали эффективность и перспективность компьютерного метода структурного анализа, применение которого дайт возможность не только существенно сократить список структурных вариантов, нц в ряде случаев и однозначно определять строение полисахаридов. Это позволило нам в дальнейшем корректно использовать составленную компьютерную программу в структурном анализе полисахаридов. .

3.2. Компьютерный структурный;анализ О-специфинеских полисахаридов Escherichia coli 01А и 01С [31].

Компьютерный метод был использован для структурного анализа О-спе-цифических полисахаридов Escherichia coli 01А, 01В и 01С (226-228), проводившегося в сотрудничестве с лабораторией профессора К.Янна (Институт иммунобиологии общества М. Планка, Фрайбург) параллельно с исследованием строения этих полимеров традиционными химическими методами.

_R_

-3)-a-L-Rha-(1-R 226 (01А) -3)-a-L-Rha-(1-3)-ß-L-Rha-(1-4)-ß-D-GlcNAc-(1-ß-D-ManNACr(1-2)/ 227 (01В) -2)-a-L-Rha-(1-2)-a-D-Gal-(1-3)-ß-D-GlcNAc-(1-

228 (01С) -2)-a-L-Rha-(1-3)-a-D-Gal-(1-3)-ß-D-GlcNAc-(1-

Анализ спектра* 13С-ЯМР полисахарида 01А был проведен с учетом того, что его повторяющееся звено содержит (по данным метилирования) один 2,3-дизамещенный остаток L-Rha, два 3-замещенных остатка L-Rha, один 4-заме-щенный остаток D-GlcNAc и один незамещенный терминальный остаток D-ManNAc. Компьютерная обработка спектральных данных выявила группу структур (226, 229-234), первая из которых характеризовалась существенно меньшим S-фактором (0,4), чем остальные (экспериментальный и рассчитанный спектры 13С-ЯМР для звена 226 приведены в таблице 11). Это свидетельствовало о том, что именно эта структура является повторяющимся звеном полисахарида 01А

Этот вывод полностью совпал с результатами химического анализа, включавшего избирательную деструкцию полисахарида и анализ его фрагментов.

-3)-a-L-Rha-(1-3)-a-L-Rha-(1-3)-ß-L-Rha-(1-4)-ß-D-GlcNAc-(1-ß-D-ManNAc-(1-2)1 226 (S=0,4)

-2)-a-L-Rha-(1-3)-a-L-Rha-(1-3)-ß-L-Rha-(1-4)-ß-D-GlcNAc-(1-ß-D-ManNAc-(1-3)/ 229 (S=0,8)

-3)-a-L-Rha-(1 -3)-ß-L-Rha-(1 -4)-ß-D-GlcNAc-(1 -3)-a-L-Rha-(1 -ß-D-ManNAc-(1-2)/ 230 (S=0,9)

-2)-a-L-Rha-(1-3)-ß-L-Rha-(1-4)-ß-D-GlcNAc-(1-3)-a-L-Rha-(1-ß-D-ManNAc-(1-3)/ 231 (S=1,0)

-3)-a-L-Rha-(1-3)-ß-L-Rha-(1-4)-ß-D-GlcNAc-(1-ß-D-ManNAc-(1 -3)-a-L-Rha-(1 -2)/ 232 (S=1,0)

-3)-ß-L-Rha-( 1 -4)-ß-D-GlcN Ac-( 1 -ß-D-ManNAc-(1-3)-a-L-Rha-(1-3)-a-L-Rha-(1-2)/ 233 (S=0,9)

-3)-ß-L-Rha-(1-4)-ß-D-GlcNAc-(1-3)-a-L-Rha-(1-3)-a-L-Rha-(1-ß-D-ManNAc-(1-2)/ 234 <S=0,4)

Недавно (Jansson P.-E., et al. // Carbohydr. Res.- V.211(1991) P. 183-190) строение полисахарида OIA было установлено с использованием химических деструктивных методов и компьютерного расчета по программе CASPER. Это позволяло нам сравнить обе компьютерные программы. При расчете по программе CASPER повторяющиеся звенья 226 и 229-234 были предсказаны, как возможные, однако, их вероятность уменьшалась в несколько ином порядке (226>233>229=234>230> 231>232), а различие между вероятностями наиболее предпочтительных структур не было столь заметным, как при расчете по методу, используемому нами.

При компьютерном анализе спектра 15С-ЯМР полисахарида 01С принималось во внимание, что по данным метилирования его повторяющее звено включает один 2,3-дизамещенный остаток L-Rlia, один 2-замещенный остаток L-Rha, по одному 3-замещенному остатку D-Gal и D-GlcNAc я один незамещенный терминальный остаток D-ManNAc. В качестве наиболее вероятных были выявлены повторяющиеся звенья 228 и 235-237 и некоторые другие.

-3)-a-L-Rha-(1-2)-a-L-Rha-(1-3)-a-D-Gal-(1-3)-ß-D-GlcNAc-(1-ß-D-ManNAc-(1-2)/ 228 (S=0,8)

-3)-a-L-Rha-(1-3)-a-D-Gal-(1-3)-ß-D-GlcNAc-(1-2)-a-L-Rha-(1-ß-D-ManNAc-(1-2)/ 235 (S=0,9)

-3)-a-L-Rha-(1-

ß-D-ManNAc-(1 -2)-a-L-Rha-(1 -3)-ct-D-Gal-(1 -3)-ß-D-GlcNAc-(1 -2)1

236 (S=0,9)

-2)-a-L-Rha-(1-3)-a-D-Gal-(1-3)-p-D-GlcNAc-(1-

p-D-ManNAc-(1-2)-a-L-Rha-(1-3))/

237 (S=1,0)

Структуры 228 и 235-237 характеризовались очень близкими значениями S-факторов, что не позволяло достаточно надежно выделить среди них наиболее вероятный без привлечения дополнительных данных. Среди всех структурных кандидатов с S< 1,5 только повторяющееся звено 228, имеющее наименьший S-фактор, содержит (1-3)-связанный глюкозаминил-рамнозный фрагмент. Поэтому предсташшлось рациональным подтвердить в первую очередь наличие именно такого фрагмента в полисахариде 01С. Ответ был получен с помощью эксперимента по ЯЭО (предоблучение HIGlcNAc, легко идентифицируемого в спектре 1Н-ЯМР), выявившего межмоносахаридный контакт только с H3Rha. Это указывало на присутствие в полисахариде 01С фрагмента GlcNAc-(l-3)-Rha и однозначно подтвердаадо структуру 228 в качестве его повторяющегося звена.

Таким образом, компьютерный анализ данных спектров ^С-ЯМР полисахаридов OIA и 01С был успешным и позволил в первом случае сразу установить повторяющееся звено, а во втором значительно сократить количество возможных структур, из которых правильная была выделена на основании результата только одного эксперимента по ЯЭО.

3.2. Компьютерный структурный анализ О-специфического полисахарида Escherichia, coli 01В, модификация компьютерной программы для расчета спектров полисахаридов с (^2)-связью в цепи [31].

При компьютерном анализе спектра 13С-ЯМР полисахарида 01С принималось во внимание, что по данным метилирования его повторяющееся звено включает один 2,3-дизамещенный остаток L-Rha, по одному 2-замещенному остатку D-Gal и L-Rha, 3-замещенный остаток D-GlcNAc и незамещенный терминальный остаток D-ManNAc. К сожалению, в этом случае не было выявлено ни одной структуры, рассчитанный спектр которой удовлетворительно совпадал с экспериментальным. Расхождение спектров было столь значительным, что даже повторяющееся звено 238, характеризующееся наименьшим S-фактором, представлялось мало вероятным. Всего компьютером было найдено более 50 структур с S<7,5, среди которых бьиа и правильная (227), установленная химическими методами.

-3)-a-L-hha-(1-2)4x-L-Rha-(1-2)^a-D-Gal-(1-3)-p-D-GlcNAc-(1-ß-D-ManNAc-(1-2)/

227 (S=6,6)

-3)-a-L-Rha-(1 -2)-a-L-Rha-(1 -2)-a-D-Gal-(1 -3)-ß-D-GlcNAc-(1-a-D-ManNAc-(1-2)/

238 (S=2,2)

Наибольшая разница в рассчитанном и экспериментальном спектрах полисахарида 01В (таблица 11) отмечена для сигналов галактозного .(Д5СЗ -3,4 м.д.) и глюкозаминового (Д5СЗ -3,3 м.д.) остатков, которые включены в триса-харидный фрагмент 239 с (1-2)-связью.

Таблица 11. Экспериментальные и рассчитанные (в скобках) величины химических (сдвигов Ь, м.д.) сигналов в спектрах МС-ЯМР полисахаридов из Е. coli OIA, Ol В и QIC.

Моносахаридное звено C1 C2 C3 C4 C5 C6

Е. coli OIA (226)

-2,3)-a-L-Rha-(l- 102,5 78,1 80,3 72,5 70,5 17,8

(102,9) (78,2) (80,3) (72,1) (70,2) (18,1)

-3)-a-L-Rha-(l- 103,2 71,1 79,5 72,6 70,4 17,9

(103,5) (71,4) (79,1) (72,9) (70,0) (18,0)

-3)-ß-L-Rha-(l- 101,6 71,7 81,5 72,3 73,3 17,9

(101,9) (71,4) (81,5) (72,5) (73,2) (18,0)

-4)-ß-D-GlcNAc-(l- 103,2 57,3 74,8 ' 78,2 75,8 61,7

(103,6) (57,0) (75,2) (77,9) (75,8) (61,8)

ß-D-ManNAc-(l- 101,1 54,3 .73,3 68,0 77,3 62,2

(101,3) (54,3) (73,3) (67,9) (77,6) (62,1)

E. coli OlB* (227)

-2,3)-ot-L-Rha-(l- 102,2 78,1 80,0 72,4 70,6 17,9

(102,7) (78,2) (80,3) (72,1) (69,9) (18,1)

[102,71 [79,2] [80,31 [72,11 [69,9] [18,1]

-2)-a-L-Rha-(l- 101,2 78,8 71,2 73,4 70,4 17,9

(101,3) (78,8) (71,3) (73,5) (70,0) • (18,0)

[101,7] [79,8] [71,3] [73,5] [70,0] [18,0]

-2)-a-D-Gal-(l- 98,6 74,8 70,2 70,8 72,1 61,9

(100,3) (78,2) (69,5) (70,6) (72,2) (62,4)

[99,1] [75,1] [70,2] [70,6] [72,2] [62,4]

-3)-ß-D-GlcNAc-(l- 102,8 55,9 78,6 72,7 76,8 61,9

(103,9) (55,8) (81,9) (71,9) (77,2) (62,1) '

[103,9] [55,8] 179,2] [71,9] [77,2] [62,1]

ß-D-ManNAc-(l- 101,0 54,2 73,3 68,1 77,4 61,8

(101,3) (54,3) (73,3) (67,9) (77,6) (62,1)

[101,3] [54,3] [73,3] [67,9] [77,6] [61,8]

E. coli 01С (228) •

-2,3)-a-L-Rha-(l- 102,2 78,3 80,0 72,5 70,3 18,0

(102,7) (78,2) (80,3) (72,1) (69,9) (18,1)

-2;-<x-L-Rha-(l- 101,7 78,7 71,4 73,7 70,7 18,0

(102,1) (78,8) (71,3) (73,5) (70,0) (18,0)

-3)-a-D-Gal-(l- 100,6 69,4 77,7 70,1 - 72,2 61,9

(101,0) (68,9) (78,5) (70,2) (72,2) (62,4)

-3)-ß-D-GlcNAc-( 1 - 103,0 55,7 81,5 72,2 76,7 61,8

(103,9) (55,8) (81,9) (71,9) (77,2) (61,8)

ß-D-ManNAc-(l- 101,0 54,3 73,4 68,3 77,5 62,1

(101,3) (54,3) (73,3) (67,9) (77,6) (62,1)

*В квадратных скобках приведены химические сдвиги, рассчитанные с учетом отклонений от аддитивности, найденных при анализе спектра трисахарида 241.

Подобные отклонения от аддитивности наблюдались ранее для целого ря-

да трисахаридных фрагментов, например 240, входящего в состав О-специФи-ческого полисахарида Salmonella arizonae 045 и ряд других природных олиго- и полисахаридов. Для выяснения причин спектральных аномалий в спектре полисахарида Salmonella arizonae. 045 нами проводилось исследование метил-глико-зида трисахарида 240 и составляющих его дисахаридов. Было показано, что, как и в случае вицинально разветвленных олигосахаридов, отклонения от аддитивности в спектрах 13С-ЯМР трисахаридов с (1-2)-связью (центральное звено 1,2-дизамещено) являются следствием их конформационных различий с образующими дисахаридами.

Для преодоления трудностей, связанных с присутствием в полисахаридах (1-2)-связи, необходима модификация компьютерной программы и дополнение баз спектральных данных, используемых в расчетах, величинами отклонений от аддитивности, вызванных (1-2)-связью. С этой целью нами сделаны необходимые изменения в компьютерной программе и включены в нее данные по отклонениям от аддитивности, найденные при анализе линейных трисахаридов с (1-2)-связью. В частности, использованы отклонения от аддитивности в спектре трисахарида 241 (для C1 Rha +3,4 м.д., Для С1 и С2 Gal-2,7 и -3,3 м.д., для СЗ и С4 GlcNAc -2,7 и 1,8-м.д.), моделирующего фрагмент 239 полисахарида 01В.

a-L-Rha-(1-2)-a-D-Gal-(1-3)-D-GlcNAc 239

a-L-Fuc-(i-2)-ß-D-Gal-(1 -3)-D-GlcNAc 240

a-L-Rha-(1 -2)-a-D-Gal-(1 -3)-a-D-©lcN Ac-OMe 241

Проведенный анализ спектра 13С-ЯМР полисахарида Ol В с помощью модифицированной программы был успешным и выявил правильное повторяющее звено 227 как наиболее вероятное (S=l,l); вероятность последовательности 238 была на втором месте, однако S-фактор (2,0) был заметно больше. Таким образом, модификация компьютерной программы по рассмотренному пути и дополнение ее необходимыми спектральными данными делает возможным компьютерный структурный анализ и "псевдоразветвленных" полисахаридов, содержащих (1-2)-связь.

3.4. Компьютерный структурный анализ О-специфинеского полисахарида из Pseudomonas solanacearum штамм ICMP 7944* [32]. При исследовании спектра ^С-ЯМР О-специфического полисахарида из Pseudomonas solanacearum штамм ICMP 7944 было выяснено, что данный штамм продуцирует либо два полисахарида с тетра- и пентасахаридными повторяющи-

"ИсслеДование проведено совместно с д.х.н. Ю.А.Книрелем и к.х.н. Н.А.Кочаровой.

мися звеньями в соотношении 3:2, либо один полисахарид, содержащий два типа повторяющихся звеньев.

Структура преобладающего компонента, линейного полисахарида 242, была установлена с учетом результатов метилирования и сравнительного анализа спектральных характеристик и таковых для изучавшегося ранее в ИОХ РАН полисахарида с повторяющимся звеном 242. Данные спектра минорного разветвленного полисахарида подвергались компьютерному анализу, позволившему определить аномерные конфигурации моносахаридных остатков, положения гли-козидных связей и последовательность моносахаридных звеньев в цепи и, в результате, установить повторяющее звено 243, характеризующееся минимальным S-фактором 1,0. Следующая альтернативная структура имела заметно больший S-фактор - 1,5.

-2)-a-L-Rha-(1-2)-a-L-Rha-(1-3)-a-L-Rha-(1-3)-a-D-GicNAc-(1- 242

-2)-a-L-Rha-(1-2)-a-L-Rha-(1-3)-a-L-Rha-(1-3)-a-D-GlcNAc-(1- 243

a-L-Rha-(1-3)/

В заключение отметим, что определение структуры О-специфического полисахарида из Pseudomonas solanacearum штамма ICMP 7944 с привлечением современных деструктивных методов представляется очень трудоемким. Поэтому результат успешного использования компьютерного анализа в этом случае особенно наглядно демонстрирует его преимущества и практическое значение, состоящие в возможности непосредственно определять строение повторяющегося звена, предсказывать небольшой список наиболее вероятных структурных вариантов, а также оперативно проверять гипотетические структуры. Применение метода будет расширяться по мере накопления данных по отклонениям от аддитивности для разветвленных структур разного типа, синтез и исследование которых интенсивно проводятся в целом ряде лабораторий.

ВЫВОДЫ:

1. Осуществлен стерео- и регионаправленный синтез широких серий ви-цинально ди-О-гликозилированных производных метил-а-L-рамно-, -а-D-ман-но-, -а- и -ß-D-глюко- и -ß-D-галакшо-пиранозида, содержащих 2-аксиально,3-экваториальный, а также 2,3- и 3,4-диэкваториальный узлы разветвления, а в качестве заместителей - моносахаридные остатки с a-D-, ß-D-, a-L- и ß-L-кон-фигурациями; синтезированы дисахариды, фрагменты трисахарицов.

2. Пр1дложены новые и модифицированы известные методики проведения реакций гликозилирования, повышающие их эффективность:

а. Разработан новый подход к синтезу a-L-фукопиранозидов, основанный на использовании в качестве гликозил-донора бензобромфукозы - одного из

наиболее доступных производных Ь-фукопиранозы.

б. Исследовано гликозилирование алкил-1-тиогликопиранозидами О-три-тиловых эфиров моносахаридов в присутствии перхлората трифенилметилия, показано различие активности гликозил-доноров данного типа в зависимости от их строения и природы защитных групп, что позволяет на разных этапах синтезов использовать тиогликозидную группировку как защиту аномерного центра либо как гликозилирующую функцию.

в. Изучено гликозилирование гликозил-ацетатами в присутствии триме-тилсилилтрифлата. Определены перспективы и ограничения данного метода гликозилирования и выявлены требования к строению гликозил-акцептора, способствующие наиболее эффективному гликозилированию.

г. На многочисленных примерах продемонстрированы преимущества бен-зобромальдоз как гликозилирующих агентов по сравнению с традиционно используемыми ацетобромсахарами.

3. В спектрах 13С-ЯМР синтезированных разветвленных олигобахаридов и линейных трисахаридов с центральным 1,2-дизамещенным звеном определены величины отклонений химических сдвигов от аддитивности, а в спектрах дисахаридов - спектральные эффекты гликозилирования, являющиеся необходимыми параметрами для компьютерного анализа спектров '^С-ЯМР регулярных полисахаридов.

4. Проведен конформационный анализ разветвленных олигосахаридов с привлечением теоретических расчетов методами молекулярной механики и экспериментов по ядерным эффектам Оверхаузера. Показано, что возникновение отклонений от аддитивности в спектрах 13С-ЯМР рассмотренных олигосахаридов связанно с различием конформаций и внутримолекулярных протон-протонных взаимодействий в дисахарвдных фрагментах разветвленных олигосахаридов и в соответствующих дисахаридах.

5. В спектрах 13С-ЯМР синтезированных линейных трисахаридов с центральным 1,2-дизамещенным звеном определены величины отклонений химических сдвигов от аддитивности и показано,' что возникновение этих спектральных эффектов, как и в случае вицинально разветвленных олигосахаридов, определяется конформационными различиями, наблюдаемыми при переходе от трисахаридов к составляющим дисахаридам.

6. Проведен анализ величин отклонений химических сдвигов '^С от аддитивности для стереохимически подобных олигосахаридов, а также содержащих одинаковый тип разветвления, но в разных положениях. Основываясь на полученных данных о взаимосвязи спектральных и конформационных свойств для исследованных соединений, выявлены группы разветвленных олигосахаридов,

между которыми возможно перенесение величин отклонений химических сдвигов 13С от аддитивности.

7. Составлены программы для компьютерного структурного анализа вици-нально разветвленных полисахаридов, основанные на расчете спектров 13С-ЯМР полисахаридов с учетом величин отклонений химических "сдвигов 13с от аддитивности, найденных в спектрах разветвленных олигосахаридов. Компьютерный метод использован при установлении строения вицинально разветвленных антигенных полисахаридов бактерий Escherichia coii и Pseudomonas solanacearum.

Содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Нифантьев Н.Э., Бакиновский JI.B., Липкинд Г.М., Шашков А.С., Кочетков Н.К. Синтез и исследование спектров ЯМР и конформаций разветвленных олигосахаридов. 1. Синтез разветвленных олигосахаридов, содержащих одинаковые моносахаридные заместители при 0-2 и 0-3 в остатке a-L-рамнопиранозы // Биоорган, химия.-Т.\1 (199 X). С.517-530

2. Lipkind G.M., Nifant'ev N.E., Shashkov A.S., Kochetkov N.K. Synthesis, NMR, and conformational studies of branched oligosaccharides. 2. NMR and conformational studies of branched oligosaccharides containing 2,3-disubstituted residue of ct-L-rhamnose //.Can. J. Chem.- V.68(1990). P.1238-1250

3. Нифантьев Н.Э., Липкинд Г.М., Шашков A.C., Кочетков Н.К. Синтез ... 3. Синтез 2,3-ди-О-гликозилированных производных метил a-L-рамнопира-нозида// Биоорган. хшншг.-Т. 17(1991). С. 1229-1250

4. Nifant'ev N.E., Lipkind G.M., Shashkov AS.,'Kochetkov N.K. Synthesis, ...

4. Synthesis of 2,3-di-O-glycosyl derivatives of methyl a-L-rhamnopyranoside // Car-bohydr. Res.-V.223(1992). P.109-128

5: Kochetkov N.K., Lipkind G.M., Shashkov A.S., Nifant'ev N.E. Synthesis, ...

5. NMR and conformational analysis of 2,3-disubstituted methyl a-L-rhamnopy-ranosides //Carbohydr.Res.- V.221 (1991). P.145-168

6. Нифантьев Н.Э., Амочаева В.Ю., Шашков AC., Кочетков Н.К. Синтез ... 6. Синтез 2,3-ди-О-гликозилированных производных метил-р-О-глюкопира-нозида // Биоорган. хгшшг.-Т.18(1992). С.699-716

7. Nifant'ev N.E., Shashkov AS., Lipkind G.M., Kochetkov N.K. Synthesis, ... 7. Synthesis and l3C-NMR spectra of 2,3-di-O-glycosyl derivatives of methyl a-L-rhaninopyranoside and methyl a-D-mannopyranoside // Carbohydr. Res.-V.237(1992). P.95-113

8. Нифантьев Н.Э., Шашков AC., Липкинд Г.М., Кочетков Н.К. Синтез ... 8. 2,3-Ди-О-гликозилированные производные метил a-L-рамнопиранозида и a-D-маннопиранозида // Биоорган, химия.-Т. 18(1992). С.843-861

9. Nifant'ev N.E., Amochaeva Y.Y., Shashkov AS., Kochetkov N.K. Synthesis, ... 9. a-Fucosylation by 2,3,4-tri-O-benzoyl-a-L-fucopyranosyl bromide under Helferich conditions // Carbohydr. Res.-V.242 (1993). P.77-91

10. Нифантьев Н.Э., Амочаева В.Ю., Шашков AC., Кочетков Н.К. Синтез ... 10. Синтез 2-, З-О- и 2,3-ди-О-гликозилированных производных метил-a-D-глюкопиранозида // Биоорган, химия.-Т.18(,1992). С.1249-1254

11. Nifant'ev N.E., Ainochaeva V.Y., Shashkov A.S., Lipkind G.M., Koclietkov N.K. Synthesis, ... 11. Synthesis of 2,3-di-O-glycosyl derivatives of methyl a- and ß-D-glucopyranoside // Carbohydr. Res. -V.250 (1993). P.211-230

12. Shashkov A.S., Nifant'ev N.E., Amochaeva V.Y., Kochetkov N.K. Synthesis, ... 12. 13C-NMR data for 2-0-, 3-0-, and 2,3-di-O-glycosylated methyl a- and ß-D-glucopyrano-sides and ß-D-galactopyranosides // Magn. Res. C/iem.-VJ 1(1993). P.599-605

13. Шашков A.C., Нифантьев Н.Э., Амочаева В.Ю., Кочетков H.K. Синтез ... IS. Отклонения от аддитивности в спектрах ^С-ЯМР 2,3-ди-О-гликозилиро-ванных производных метил-а- и ß-D-глюкопиранозида и метил^-О-галактопи-ранозида // Биоорган. т««я.-Т. 19(1993). С.633-643

14. Шашков A.C., Нифантьев Н.Э., Кочетков Н.К. Синтез ... 14. Сравнение величин отклонения от аддитивности в спектрах ^С-ЯМР 3,4-ди-О-гли-козилированных метил-а-О-галактопиранозидов и 2,3-ди-О-гликозилирован-ных метил-а-L-рамнопиранозидов // Биоорган, химия.-Т.19(1993). С.756-759

15. Нифантьев Н.Э., Шашков A.C., Хатунцева Е.А., Цветков Ю.Е., Шер-ман A.A., Кочетков Н.К. Синтез ... 15. 2,3-Ди-О-гликозилированные метил-a-L-рамнопиранозиды, содержащие 2-ацетамидо-2-дезокси-р-0-глюкопиранозиль-ный заместитель // Биоорган, химия.- Т.20(1994). С.1101-1110

16. Бакиновский Л.В., Нифантьев Н.Э., Кочетков Н.К. Нарушение стере-оспецифичности при гликозилировании метил-2,3-ди-0-ацетил-р-0-ксилопира-нозида 1,2-О-цианоалкилиденовыми производными моносахаридов // Биоорган. химия.-Т.9(1983). С.1089-1096

17. Мамян С.С., Липкинд Г.М., Шашков A.C., Нифантьев Н.Э., Кочетков Н.К. Конформационный анализ метил-4-0-(а- и ß-D-rai0K0nHpaH03Wi)-ß-D-ксилопиранозидов в водных растворах //Биоорган.химия,-Т.12(1986). С.1101-1110

18. Нифантьев Н.Э., Бакиновский Л.В., Кочетков Н.К. Синтез капсуляр-ного полисахарида Streptococcus pneumoniae тип 14; синтез производного тетра-сахаридного повторяющегося звена // Биоорган. хшшя.-Т. 13(1987). С.967-976

19. Нифантьев Н.Э., Бакиновский Л.В., Кочетков Н.К. Синтез капсуляр-ного полисахарида Streptococcus pneumoniae тип 14; получение метил-6-О-ацетил-3-0-бензоил-4-0-(2,3,4,6-тетра-0-бензоил-р-0-галактопиранозил)-2-дезокси-2-фталимидo-ß-D-глюкoпиpанoзида // Биоорган. хгшия.-Т. 13(1987). С.977-991

20. Нифантьев Н.Э., Бакиновский Л.В., Кочетков Н.К. Синтез капсуляр-ного полисахарида Streptococcus pneumoniae тип 14; поликонденсация мономера, характеристика полисахарида // Биоорган. химия.-ТЛЗ(1987). С.1101-1109

21. Kochetkov N.K., Nifant'ev N.E., Backinowsky L.V. Synthesis of the capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae type 14 // Tetrahedron.-^A3 (1987). P.3109-3121

22. Nifant'ev N.E., Backinowsky L.V., Kochetkov N.K. Synthesis of the derivatives of 2-amino-2-deoxy-4-0-(a- and ß-E)-galactopyranosyl)-D-glucose // Carbohydr. Res.-V. 174 (1988). P.61-72

23. Нифантьев Н.Э., Шашков A.C., Кочетков Н.К. Синтез и спектры ЯМР метил-3-0-(0-маннопиранозил- и Ь-рамнопиранозил)-р-Б-талопиранози-

.дов // Биоорган, химия.-Т. 14(1988). С.187-197

24. Nifant'ev N.E., Backinowsky L.V., Kochetkov N.K. The effect of replacing a 3-O-acetyl group by 3-O-benzyI group in a methyl 4-O-trityl-ß-D-xylopyranoside derivative on the efficiency of. 1,2-frans-glycosylation with D-xylose l,2-0-(l-cyanoethylidene) derivative // Carbohydr.Res.-V,\9\(1989). P.13-91

25. Нифантьев Н.Э., Бакиновский JI.B., Кочетков Н.К. Гликозилирование метил-З-О-бензил-4-О-тритил-р-О-ксилопиранозидов 3,4-ди-О-ацетил-1,2-0-11 -(эвдо-циано)этилиден]-а-0-ксилопиранозой // Биоорг.хим («г. -Т. 14(198 8). С. 1545-1550

26. Нифантьев Н.Э., Бакиновский Л.В., Кочетков Н.К. Гликозилирование тритиловых эфиров Сахаров метил-4-0-ацетил-2,3-0-изопропилиден-1-тио-а-Ь-рамнопиранозидом при катализе перхлоратом трифенилметилия // Биоорган, химия. -Т.16(1990). .С. 1402-1406

27. Nifant'ev N.E., Shashkov A.S., Kochetkov N.K. Synthesis of methyl 0-(a-L-fucopyranosyl)-(l-»2)-0-(p-D-galactopyranosyl)-(l->3)-2-acetamido-2-deoxy-p-D-glucopyranoside using benzobromofucose as the a-L-fucosylating agent // Carbohydr. Res.-V. 226 (1992). P.331-336

28. Нифантьев Н.Э., Амочаева В.Ю., Шашков AC. Гликозилирование 1,2,3,4,6-пента-О-ацетил-р-О-галактопиранозой и 1,3,4,6-тетра-0-аретил-2-де-зокси-2-фталими-до-р-О-глюкопиранозой. Реакции аномеризации и транс-гликозилирования - возможные побочные процессы при гликозилировании гликозилацетатами // Биоорган, химия.-Т.18(1992). С.562-569

29. Lipkind G.M., Shashkov A.S., Nifant'ev N.E., Kochetkov N.K. Computerassisted analysis of the structure of regular branched polysaccharides containing 2,3-disubstituted rhamnose and mannose residues on the basis of l^C-NMR data // Carbohydr. Res.-V.237 (1992). P. 11-22

30. Shashkov A.S., Vinogradov E.V., Knirel Y.A., Nifant'ev N.E., Kochetkov N.K., Dabrowski J., Kholodkova E.V., Stanislavsky E.S. Structure of the O-specific polysaccharide of Salmonella arizonae 045 polysaccharide // Carbohydr. /tes.-V.241 (1993). P.177-188,

31. Нифантьев Н.Э., Шашков A.C., Липкинд Г.М., Кочетков Н.К., Янн Б., Янн К. Компьютерный структурный анализ О-рпецифических полисахаридов Escherichia сой OlA, OIB и 01С // Биоорган. ;ашшг.-Т.19(1993). С.981-988

32. Kocharova N.A., Knirel Y.A., Shashkov AS., Nifant'ev N.E., Kochetkov N.K, Varbanets L.D., Moskalenko N.V., Brovarskaja O.S., Muras V.A., Young J.M. Studies of O-specific polysaccharide chains of Pseudomonas solanacearum lipripo-lysaccharides consisting of structurally different repeating units // Carbohydr. Res.-V.250(1993). P.275-289

33. Nifant'ev N.E., Amochaeva V.Y., Kochetkov N.K. a-Fucosylation by 2,3,4-tri-O-benzoyl-a-L-fucopyranosylbromide under Helferich conditions // Abstrs. of papers of XVI International Carbohydrate Symposium.- Paris. 1992. P. 47

34. Lipkind G.M., Shashkov A.S., Nifant'ev N.E., Kochetkov N.K. Computerassisted structural analysis of regular branched polysaccharides containing 2,3-disubsti-tuted rhamnopyranose and mannopyranose residues on the basis of C-NMR data // Abstrs. of papers of XVI International Carbohydrate Symposium.- Paris. 1992. P. 475

35. Nifant'ev N.E., Amochaeva V.Y., ShasWcov A.S., Kochetkov N.K. Conformational origin of deviation from additivity in C-NMR spectra of 2,3-di-O-gly-cosylated methyl p-D-glucopyranosides // Abstrs. of papers of II International Symposium on the Conformational Analysis of Carbohydrates and Protein/Carbohydrate Interactions,- Le Croisic. 1992. P. IV-17

36. Ejchart A, Kozar Т., Nifant'ev N.E., Grosskurth H., Dabrowski J. Internal mobility in oligosaccharide chains as probed by С spin-lattice relaxation times measured at various frequencies//Abstrs. of papers of VII European Carbohydrate Simposium.Cracow. 1993. P.B51

37. Nifant'ev N.E., Shashkov A.S., Lipkind G.M., Kochetkov N.K., Jann B., Jann K. Computer-assisted structural analysis of the E. coli OlA, OIB, and OIC specific polysaccharides // Abstrs. of papers of VII European Carbohydrate Simposium.- Cracow. 1993. P.B74

38.'Nifant'ev N.E., Shashkov A.S., Lipkind G.M., Kochetkov N.K., Jann B., Jann K. Computer-assisted method of .the structural analysis of the regular branched polysaccharides // Abstrs. of papers of XII International Symposium on Glycocon-jugates.- Cracow. 1993. P. 335

39. Dabrowski J., Grosskurth H., Kozar T., Nifant'ev N.E., Kochetkov N.K. NOE and modeling study of the conformation of the vicinally bifurcated trisaccharide DMana(l-2)[LRhaa(l-3)]DGlcpi-OMe and its disaccharide components // Abstrs. of papers of 26 Congress Ampere on Magnetic Resonance.- Athens. 1992. P. 468

40. Nifant'ev N.E. Computer access to structural analysis of branched polysaccharides // Abstrs. of papers of Second International Conference on Glycotech-nology.- San Diego. 1994. P.39

41. Khatuntseva E.A., Shashkov A.S., Nifant'ev N.E. Synthesis and 13C-NMR studies of 3,4-di-O-glycosyl methyl a-L-rhamnopyranosides // Abstrs. of papers of XVII International Carbohydrate Symposium.- Ottawa. 1994. P.

42. Dabrowski J., Kozar T., Grosskurth H., Nifant'ev N.E. Cdnformational mobility of oligosaccharides: unequivocal evidence of the -existence of an "anti" conformer of the Gaipi-3Glcpl-OMe disaccharide // Abstrs. of papers of III International Symposium on the Conformational Analysis of Carbohydrates and Protein/Carbohydrate Interactions.- Val Monn. 1994. P.62

Отпечатано в ИГиРГИ Зак.Ю., тирЛОО.