Спектральное (ЯМР) и конформационное исследование олигосахаридов, отвечающих фрагментам фукоиданов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМЕНИ Н. Д. ЗЕЛИНСКОГО

На правах рукописи

ГРАЧЕВ Алексей Александрович

СПЕКТРАЛЬНОЕ (ЯМР) И КОНФОРМАЦИОННОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ОЛИГОСАХАРИДОВ, ОТВЕЧАЮЩИХ ФРАГМЕНТАМ ФУКОИДАНОВ

02.00.03 — органическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в лаборатории химии гликоконъюгатов Института органической химии им. Н. Д. Зелинского РАН

Научный руководитель:

профессор, доктор химических наук Нифантьев Николай Эдуардович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Анаников Валентин Павлович доктор химических наук Полыпаков Владимир Иванович

Ведущая организация: Химический факультет Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится « 29 » сентября 2006 г. в // часов па заседании диссертационного совета К 002.222.01 по присуждению ученой степени кандидата химических наук в Институте органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН по адресу: 119991 Москва, Ленинский проспект, 47, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института органической химии им. II. Д. Зелинского РАН

Автореферат разослан « 28 » августа 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета К 002.222.01

доктор химических наук

Л.А. Родиновская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Настоящая работа посвящена изучению конформационных свойств олигосахаридных фрагментов фукоиданов - природных полисахаридов, обладающих широким спектром физиологической активности. Известно, что эти биополимеры ингибируют воспаления, оказывают антикоагулянтное и антиангиогенное действие, блокируют бактериальную и вирусную адгезии. Фукоиданы построены преимущественно из а-Ь-фукопиранозных остатков, связанных в полимерные цепи. При этом для фукоидановых цепей характерно наличие разветвленных фрагментов, большая степень сульфатирования, а также присутствие других углеводных остатков (глюкозы, галактозы, ксилозы, глюкуроновой кислоты).

Наличие физиологической активности у фукоиданов связывают с тем, что отдельные участки их полисахаридных цепей имитируют природные углеводные лиганды белковых рецепторов. Это свойство фукоиданов определяется наличием в их структуре сульфатных групп, которые имеют определенную пространственную ориентацию. Таким образом, для понимания механизма физиологической активности необходимо знать пространственную структуру фукоиданов.

Структурная характеристика природных фукоиданов осложнена из-за их нерегулярности, гетерогенности, а также отсутствия методов их направленного и контролируемого расщепления. Изучение конформационных свойств олигофукозидов является перспективным подходом к установлению взаимосвязи между структурой и свойствами природных фукоиданов.

Целью работы является спектральное (ЯМР) и молекулярно-механическое исследование конформационных свойств олигосахаридных фрагментов фукоиданов, построенных из остатков а-Ь-фукопиранозны и различающихся длиной цепи (от да- до гексасахаридов), типом гликозидных связей, количеством и положением сульфатных групп. Выбранный круг олигофукозидов позволяет определить основные структурные и стереохимические факторы, от которых зависит пространственная организация фукоиданов.

Научная новизна и практическая ценность работы. На основании экспериментальных величин трансгликозидных констант спин-спинового взаимодействия г1с,н и данных молекулярно-механических расчетов впервые проведен конформацнонный анализ представительного ряда синтетических олигофукозидов, отвечающих основным структурным элементам природных физиологически активных полисахаридов фукоиданов.

В ходе работы исследована область применения величин трансгликозидных констант спин-спинового взаимодействия 31с,н при проведении систематического конформационного

анализа олигофухозидов. Для определения величин констант была использована новейшая методика двумерной ЯМР-спектроскопии J-HMBC.

В ходе работы показаны существенные различия в конформационных свойствах (1-+3)- и (1-*4)-связанных дифукозидных фрагментов, являющихся основными структурными элементами фукоидановых цепей. Исследованы конформационные изменения цепей фукоолигосахаридов, вызванных удлинением цепи, введением сульфатных групп и боковых заместителей (создание разветвленных фрагментов). На основании данных конформационного анализа синтетических олигофукозидов предложены пространственные структуры полисахаридных цепей природных фукоиданов.

Для исследуемых олигофукозидов определены специфические характеристики спектров ЯМР, включая химические сдвиги 'Н и 13С ЯМР и эффекты сульфатирования, привлечение которых упростит установление структур новых фукоидановых полисахаридов.

Публикация и апробация работы. По результатам диссертации опубликовано 6 статей. Отдельные части работы были представлены на конкурсе молодых ученых ИОХ РАН (Москва, 2003), Международной конференции "Carbohydrate Workshop" (Борстель, Германия, 2004), III-ей Всероссийской школе-конференции "Химия и биохимия углеводов" (Саратов, 2004) и Международной конференции "NMR in Condensed Matter" (Санкт-Петербург, 2005). Результаты настоящей диссертации являются частью работы "Стереонаправленный синтез, спектроскопический (ЯМР) и конформационный анализ фрагментов фукоиданов", удостоенной медали Российской академии наук (2004) (совместно с Устюжаниной Надеждой Евгеньевной и Гербстом Алексеем Генриховичем).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах и состоит из введения, литературного обзора, посвященного методам конформационного анализа углеводов в растворе, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка цитированной литературы и двух приложений.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Целевые соединения и методы их исследования.

Различают два основных типа цепей фукоиданов. К первому типу относятся полисахариды, построенные из а-Ь-фукопиранозных остатков, связанных между собой преимущественно (1-*3)-гликозидными связями. Для фукоиданов второго типа характерно чередование (1—>3)- и (1-»4)-гликозидных связей между а-Ь-фукопиранозными остатками. В данной работе проведен конформационный анализ представительного ряда синтетических

олигофукозидов1 (Рисунки 1 и 2), отвечающих фрагментам фукоидановых цепей обоих типов. При этом были рассмотрены олигофукозиды, различающиеся межфукозными связями (1->3, 1—>4), числом звеньев в цепи (от 2 до б), положением сульфатных групп, а также олигофукозиды, содержащие в своей структуре 2,3- и 3,4-разветвленные фрагменты.

Рисунок 1. Исследованные олигофукозиды, родственные фрагментам гомо-(1-»3)-связанных фукоидановых цепей.

Изучение пространственной организации олигофукозидов заключается, в основном, в определении конформационных свойств гликозидных связей, так как фукопиранозньте моносахаридные остатки в исследуемых соединениях являются конформационно жесткими и их геометрия хорошо известна. Для установления строения гликозидных связей традиционно используют величины ЯЭО между протонами, принадлежащими соседним моносахаридным остаткам. Однако, в случае тетра- и гексафукозидов, рассматриваемых в данной работе, этот

' Синтез исследуемых соединений проведен к.х.н. Устюжаниной Н.Е. (лаборатория химии глюкоконъюгатов ИОХ РАН).

1в № » Н, № - вО,N8

26 Я1 - БО^а , IV • Н 2в Я' = Н,т- вОзЫа

Зв № = Н, рг ■ 50]Ыа

подход оказался неприменимым из-за перекрывания сигналов в спектрах Ш и 2Т) ЯЭО, а также из-за близости к нулю абсолютных величин ЯЭО для большинства крупных олигосахаридов.

9а п< с н

96 И' • 80,Ма

10а

Рисунок 2. Исследованные олигофукозиды, родственные фрагментам фукоидановых цепей с чередующимися (1 ->3)- и (1 ->4)-связями.

В данной работе была исследована возможность использования величин трансгликозидных констант спин-спинового взаимодействия (КССВ) для

трансгликозидного фрагмента С-О-С-Н углеводов (Рисунок 3) зависят от величин торсионных углов ф и у и могут быть рассчитаны по уравнению Карплуса (1) (Рисунок 4).

Рисунок 3. Торсионные углы ф и ц/ при гликоэидной связи и соответствующие им КССВ J, и J„.

Экспериментальные величины ^ и были измерены при помощи двумерных ЯМР-экспериментов 1-НМВС (1-версия гетероядерной корреляционной спектроскопии через несколько связей) и 1-гезо1уе<1 (селективная Смодулированная гетероядерная спектроскопия). Методика 2D 1-НМВС является одной из наиболее информативных для детектирования

дальних протон-углеродных КССВ "1с,н (где п>2). \ 9 /

Л = 5.5соз29 - 0.7со58 + 0.6 (1)

Рисунок 4. Уравнение (1) и график функции Карплуса для определения величин КССВ во фрагменте 13С-0-С-'н углеводов.

Из спектров J-HMBC нам удалось определить величины констант J^ для всех гликозидных связей в исследуемых олигофукозидах (Рисунок 5). Однако определение величин констант J9 с помощью эксперимента J-HMBC не всегда было возможно из-за перекрывания корреляционных пиков, отвечающих внутри- и межостаточным взаимодействиям. Для определения недостающих величин констант 1ф был использован селективный 2D J-resolved эксперимент, применение которого проиллюстрировано на рисунке 6.

Нами была проведена оценка ошибки измерения экспериментальных величин 3Jc,h констант. С этой целью проводился анализ величин Jhi,cs. Двухгранный угол вокруг связи (С-1)—О во фрагменте (Н-1)-(С-1)—0-(С-5) фукопиранозных колец в олигосахаридах близок к 180°. Согласно уравнению Карплуса (1), это отвечает характеристичным большим величинам констант Jhi,c5, равным ~6.5 Гц. Их корреляционные пики хорошо разрешены как

.)(С1В, Н36)

'"ДЭДн

| он но В

(2а)

4.04 4.02 4.00 3.96 3.96 3.94 3 92 ррш Рисунок 5. Фрагмент J-HMBC спектра трисахарида 2а, показывающий взаимодействия между атомами углерода С-1 и протонами Н-3. На спектре видно два корреляционных пика, соответствующих двум О-гликозидным связям молекулы. Вдоль вертикальной 1гС-оси корреляционные пики расщеплены в дублеты на величины, пропорциональные константам Jч,. Коэффициент пропорциональности в данном случае был равен 37.

Рисунок 6. Фрагмент 20 .Ьгево^ес! спектра тетрафукозида За (слева), содержащий корреляционные пики гликозилированных атомов углеродов С-3. Расщепление сигналов С-3 возникает за счет спин-спиновых взаимодействий с протонами Н-1в и Н-1В, облучаемыми в ходе эксперимента 20 ,)-ге8оК/е<1.

в ^НМВС, так и в ,Г-гезоК'ес1 спектрах. Для каждого соединения нами была сделана выборка величин констант Дн1,с5 из 2Г> 1-гезоК-её и 1-НМВС спектров. Анализ этих величин показывал, что ошибка измерения величин 31с,н не превышала 0.5 Гц для обоих методов. С другой стороны, расчет констант в соответствии с уравнением (1) может быть проведен с точностью 1 Гц.

Экспериментальные величины констант были сопоставлены с рассчитанными. Расчет констант проводился исходя из данных молекулярно-механических расчетов2 (силовое поле ММЗ). При этом для каждой гликозидной связи исследуемых соединений была построена конформационная карта, дающая информацию об относительных энергиях конформеров вращения.

Конформационный анализ О-сульфатированных дифукозидов проводился в предположении, что обе сульфатные группы находятся в ионизированном (депротонированном) состоянии. Однако в случае О-сульфатированных три-, тетра- и гексафукозидов рассчитанные величины ,10 и I.,, расходились с экспериментальными, если все сульфатные группы рассматривались ионизированными. Было найдено, что для этих соединений лучшие результаты получаются, когда сульфатная группа фукопиранозного остатка на восстанавливающем конце молекулы рассматривается в протонированной форме.

Стоит также отметить, что конформационные расчеты проводились без учета молекул растворителя в явном виде (без учета молекулярной структуры раствора). Однако мы предполагали, что молекулы растворителя изменяют диэлектрическую проницаемость среды (б). В расчетах использовалось значение 6=81, соответствующее диэлектрической проницаемости воды.

Эмпирическое уравнение Карплуса (1) позволяет рассчитать величины трансгликозидных КССВ 1Р и для каждой точки (ср, конформационного пространства молекулы. Экспериментально получаемые величины .1,, и являются усредненными по всем конформерам, существующим в растворе. Такие же усредненные величины могут быть получены из данных конформационного анализа, с помощью распределения Больцмана. Показателем правильности молекулярного моделирования можно считать совпадение полученных из расчета величин трансгликозидных КССВ I, и I, с экспериментально определенными.

Данные, полученные в ходе конформационного анализа синтетических олигофукозидов, использовались нами для моделирования пространственных структур природных фукоиданов.

2 Мсшекулярно-механические расчеты проведены А.Г. Гербстом (лаборатория химии гликоконъюгатов ИОХ РАН).

2. Конформацнонный анализ олигосахаридов, родственных фрагментам гомо-а-(1—>3)-связанных фукоидановых цепей.

2.1. Молекулярное моделирование соединений 1а-4в. На конформационных картах соединений 1а-4в присутствовало два ярко выраженных минимума А и Б (Рисунки 7, 8). В конформере А (ф=40°, у=40°) протон Н-1 гликозилирующего остатка равноудален от протонов Н-3 и Н-4 гликозилируемого остатка, в конформере Б (ф=30°, у =-40°) протон Н-1 гликозилирующего остатка сближен с протоном Н-3 гликозилируемого остатка.

В случае несульфатированного дифукозида 1а статистические веса конформеров А и Б составляли 60% и 40%, соответственно (Таблица 1). Переход от дифукозида 1а к тетрафукозиду За сопровождался увеличением доли конформера А до 100%. Дальнейшее удлинение цепи при переходе от тетрафукозида За к гексафукозиду 5а не сопровождалось каким-либо значимым изменением конформаций (1->3)-связей. Все связи в гексафукозиде существуют в конформации А. Введение (1—>2)-связанного фукозного остатка в (1—>3)-связанную трифукозидпую цепь в случае 2,3-разветвленного тетрасахарида 4а также приводило к увеличению доли конформера А (до 100%, Таблица 1) по сравнению с линейным трисахаридом 2а.

Рисунок 7. Конформеры А (<р=40°, \у=40°) и Б (ф=30°, у=-40°) для О-гликозидных связей в а-(1-+3)-связанных олигофукозидах.

В случае 2-О-сульфатированного дифукозида 16 статистический вес конформера А в конформационном распределении молекулы составлял 55% (Таблица 1). Для а-(1-»3)-связей трисахарида 26, тетрасахарида 36, а также 2,3-разветвленного тетрасахарида 46 теоретические расчеты предсказывали увеличение доли конформера А по сравнению с дисахаридом 16. Эти результаты аналогичны полученным ранее для несульфатированных соединений 1а-5а, что свидетельствует о том, что увеличение доли конформера А в большей степени есть следствие удлинения и разветвления цепей олигофукозидов, чем введения в них сульфатных групп.

Введение 4-О-сульфатной группы в сс-Ь-фукопиранозные остатки уменьшает долю конформера А в конформационном равновесии а-(1->3)-гликозидных связей. Так, для 4-О-

Ме

А

Б

сульфатированного дифукозида 1в доля конформера А составляла 39% (Таблица 1). В случае 4-О-сульфатированных трифукозида 2в и тетрафукозида Зв доля конформера А была еще меньше и составляла порядка 20%. Исключением являлась только (1—>3)-связь из 2,3-разветвленного фрагмента тетрафукозида 4в, существующая преимущественно в конформации А (Таблица 1). В последнем случае конформер Б является невыгодным из-за стерических взаимодействий (1—>3)- и (1-»^-связанных фукопиранозных остатков в 2,3-разветвленном фрагменте молекулы.

-180 -90

-180 40

во 1во

в г

Рисунок 8. Конформационные карты а-(1->3)-связей в дифукозидах 1а (а) и 1в (б), а также линейных тетрафукозидах За (в) и Зв (г).

2.2. Анализ величин констант Лф и для соединений 1а,в-5а. В случае линейных дифукозида 1а, трифукозида 2а и тетрафукозида За экспериментальные величины констант 1Ф близки друг другу и равны 3,6±0,3 Гц для всех (1->3)-связей. В то же время, величины I,, констант в олигофукозидах 1а-3а оказываются зависимыми от длины (1—>3)-связанной цепи и позиции соответствующей связи в цепи. Величины уменьшаются для межостаточных

связей в направлении от невосстанавливающего к восстанавливающему концу молекул (Таблица 2).

Изучение линейного (1-»3)-связанного гексафукозида 5а было осложнено из-за наложения сигналов в 2Т) ЯМР спектрах 1-НМВС и Т-гезо1уеё. Однако было достоверно установлено, что величины констант Дф и различались для внешних и внутренних дисахаридных фрагментов гексафукозида 5а (Таблица 2). В случае внутренних фрагментов значения Д» и были одинаковы для всех трех гликозидных связей.

Экспериментальные величины констант для (1 ->3)-гликозидных связей в 2-0-сульфатированных линейных дифукозиде 16 и трифукозиде 26 близки друг другу и равны 4,1±0,1 Гц (Таблица 2). В случае линейного тетрафукозида 36 экспериментальная величина константы 3^ для дисахаридного фрагмента на восстанавливающем конце молекулы имеет близкую величину и равна 4,3 Гц. Для двух других дисахаридных фрагментов тетрафукозида 36 величины ^ были больше (5,2±0,1 Гц). В то же время величины констант .Ту для олигофукозидов 16-36 увеличиваются для межостаточных связей в направлении от невосстанавливающего к восстанавливающему концу молекул (Таблица 2). Это противоположно тенденции, наблюдаемой в случае несулъфатированных олигофукозидов 1а-3а.

В случае 4-0-сульфатированных линейных олигофукозидов 1в-3в экспериментальные величины констант и ^ имели близкие значения для всех (1—>3)-связей (Таблица 2) и не зависели от расположения последних в молекулах.

Сопоставление экспериментальных и рассчитанных величин констант и для линейных олигофукозидов показывало их хорошее соответствие (расхождение не превышало 1 Гц) для всех внутренних дисахаридных фрагментов тетрафукозидов За-Зв и гексафукозида 5а, а также для некоторых терминальных звеньев ди-, три- и тетрафукозидов. В то же время в случае сульфатированных олигофукозидов хорошее соответствие наблюдалось для большего числа дисахаридных фрагментов. Однако молекулярно-механические расчеты не показали различия в конформациях дисахаридных фрагментов в несулъфатированных и 2-0-сульфатированпых олигофукозидах (Таблица 1 и 2). По-нашему мнению, такое несоответствие между экспериментальными и рассчитанными данными связано с тем, что молекулярно-механические расчеты воспроизводят конформации терминальных дисахаридных фрагментов в олигофукозидах менее точно, потому что они более конформационно подвижны, чем внутренние фрагменты.

Введение (1-»2)-связанного фукозного остатка в (1-»3)-связанную трифукозидную цепь в случае 2,3-разветвленных тетрасахаридов 4а-4в изменяло экспериментальные

Таблица 1. Рассчитанные статистические веса конформеров А и Б для а-(1-»-3)-связей олигофукозидов 1а-4в.

Связь А Б А Б А Б

а-Ь-Рис-(1->3)-а-Ь-Рис-ОРг 1а 60% 40% . 16 55% 45% 1в 39% 61%

->3)-а-1Лч1с-(1 ->3)-а-Ь-Рис-ОРг 2а 80% 20% 26 72% 28% 2в 20% 80%

а-Ыч1С-( 1 -»3)-а-Ь-Рис-(1-> 80% 20% 69% 31% 19% 81%

->3)-а-1^Рис-(1-»3)-а-Ь-Рис-ОРг За 100% 0% 36 74% ,26% Зв 21% 79%

->3)-а-Ь-Рис-(1->3)-а-Ь-Рис-(1-> 100% 0% 72% 28% 23% 77%

а-Ь-Рис-(1-»3)-а-Ь-Рис-(1-> 100% 0% 72% 28% 23% 77%

->3)-а-Ь-Рис-(1 ->3)-а-Ыч1с-ОРг 4а 100% 0% 46 80% 20% 4в 80% 20%

сс-Ыч1с-(1 ->3)-а-Ь-Рис-(1 -» 100% 0% 75% 25% 40% 60%

Таблица 2. Сопоставление экспериментальных и рассчитанных (в скобках) величин констант I, и для олигофукозидов 1а,в-5а

Связь

^ Гц

а-ЬРис-(1->3)-а-Ь-Рис-ОРг

Гц

^Гц

1я 3,5 <3,6) 3,6{ЗД),. 16 4,1(3,8) 4,7(3,4)

^ Гц

1ц,, Гц

1в 4,0 (3,8) 5,1 (4,0)

->3)-а-Ь-Рис-(1->3)-а-Ь-Рис-ОРг а-ЬРис-( 1->3)-а-Ь-Рис-(1->

2а 3,6 (3,8) 2,2 (3,5) 3,7(3,3) 4,3(3,1)

26 4,1 (3,8) 4,9 (3,1) ,4,0(3,6) 2,0(2,9)

2в V'!" И 4,8(4.9) а 414.(1) <>,2 ('¡.О)

->3)-а-Ь-Рис-(1->3)-а-1^Рис-ОРт За 3,4(3,6) 1,7(3,4) 36 ' 4,2 (3,9) 4,8 (4,3) Зв 4,1(3,8) 5,2(4,0) -+3)^-Ы>ис-(1->ЗЬх-Ь-РисЧ1-+ 3,9(3,6) 2,7(3,]) 5,2(4,5) ' 2,8(3,0} 4.5 (-13)

а-ЬГис-(1->3)-а-Ь-Рис-(1-> 3,8(3,3) 4,3(3,1) ' 5,1(4,5) 1,8(3,0) 4,1(4 3) 4,9(4.7)

-^3)-а-Ь-Рис-(1->3)-<х-Ь-Рис-ОРг 4а (3,0) 3 1(2 8) а-Ь-Рис-( 1 ->3)-а-1^Рис-( 1 -> 3,2(3.2) 4 0(3.4)

а-Ь-Рис-(1-»2)-а-Ь-Рис-ОРг 2,7 (3,2) 2,1(2,8)

->3)-а-Ь-Рис-(1->3)-а-Ы7ис-ОРг 5а

->3)-а-ЬРис-(1->3)-а-Ь-Рис-(1"->

а-Ь-Рис-(1->3)-а-ЬРис-(1->

5,0 (3,5) 2,0 (3,4) 4,56 (3,5) 3,66 (3,3) 4,0(3,5)' 2,1(3,4).

46 -1,415) 2,8(3,0) 4в 2 7(5,1/

3,7 (3,4) 4,2(3,7) , : 2,3 (%7) , 3,7(3,3) г

Т 911.7) 3.7(5,7) 4.0 ОД,

" Сигналы всех интернальных фукозных остатков. 6 Ошибка измерения для этих величин была больше из-за перекрывания сигналов в 20 ЯМР спектрах. Полем серого цвета ( ) выделены дисахаридные фрагменты, для которых расхождение между экспериментальными и рассчитанными величинами 1ф и констант не превышает 1 Гц.

величины обеих и .Ту констант для (1—>3)-связей молекул. В то же время, наличие 2,3-разветвления делает (1->3)-связанные дисахаридные фрагменты жестче. Поэтому хорошее соответствие между экспериментальными и рассчитанными величинами и наблюдалось для всех фрагментов (Таблица 2).

3. Конформационный анализ олигосахаридов, родственных фрагментам фукоидановых цепей с чередующимися (1—>3)- и (1—М)-связямн.

3.1. Молекулярное моделирование соединений 1а,б и 6а,б-10а. Конформационный анализ (1 —>3)-связанного дифукозида 1а был рассмотрен в разделе 2. Для этого соединения характерны два конформера А и Б (Рисунок 7) со статистическими весами 60% и 40%, соответственно. Для (1—>3)-связанных дисахаридных фрагментов линейных три- (7а), тетра-(8а) и гексафукозида 9а, согласно расчетам, характерным оказывается только конформер А, с углами ф>0 и у>0 (Рисунок 9). Эта ситуация аналогична наблюдаемой ранее в случае несульфатированных (1—>3)-связанных олигофукозидов 1а-5а (см. раздел 2.1.), для которых удлинение цепи молекулы также приводило к увеличению доли конформера А в конформационном равновесии (1—>3)-связей.

Конформационные карты, отвечающие (1 —>4)-связанным дисахаридным фрагментам соединений 6а-10а (Рисунок 9), содержали по два ярко выраженных конформационных минимума В и Г (Рисунок 10), для которых средние величины углов равны <р=35° и у=20°, а также ср=20° и у—35°, соответственно. В конформере В протон Н-1 гликозилирующего остатка оказывается равноудаленным от протона Н-4 и протонов метальной группы гликозилируемого остатка, а в конформере Г протоп Н-1 пространственно сближен с протоном Н-4. Для (1 —>4)-связанного дифукозида 6а статистический вес конформера В составлял 70%, однако в случае три- (7а), тетра- (8а) и гексасахарида 9а его доля была около 45%.

Конформационный анализ 3,4-разветвленного олигофукозида 10а показывал, что для его (1 —>3)-гликозидной связи преобладающим является конформер Б (80%), а для (1—И)-связи - конформер Г (93%). Таким образом, переход от линейных олигофукозидов к 3,4-разветвленному трифукозиду 10а приводил к увеличению долей конформеров Б и Г для (1—>3)- и (1—>4)-связей, соответственно. Этот эффект вызван стерическими взаимодействиями гликозилирующих остатков в 3,4-разветвленном фрагменте трифукозида 10а.

•180 I ■-■ — I' , | -180 I ■ ц. I . | | I

•180 -90 0 90 180 -180 -90 О 90 180

'с

а 6

Рисунок 9. Конформационные карты а-(1-+3)-связи (а) и а-(1->4)-связи (б) тетрафукозида 8а.

Конформационные карты 2-О-сульфатированных олигофукозидов 16 и 66-96 были похожи на конформационные карты несульфатированных олигофукозидов 1а и 6а-9а. В случае (1-»3)-связанных дисахаридных фрагментов доля конформера А составляла 55% для дифукозида 16 и 100% для три- (76), тетра- (86) и гексафукозида 96. В случае (1—>4)-связанных фрагментов ди- (66), три- (76) и тетрафукозида 86 доля конформера В составляла около 75%, однако в случае гексафукозида 96 она была около 55%.

Ме

Рисунок 10. Конформеры В (ф=35°, ц/=20°) и Г (<р=20°, ч/=-35°), характерные для а-(1-»4)-свяэанных дифукозидных фрагментов.

3.2. Анализ величин констант ^ и для соединений 1а,6 и ба,б-10а. Для всех (1->4)-связей линейных несульфатированных олигофукозидов 1а и 6а-9а экспериментальные величины констант и равны 3,9±0,1 и 5,8±0,2 Гц (Таблица 3), соответственно. В случае (1—>3)-связей соединений 6а-9а экспериментальные величины констант 1Ф также близки между собой и равны 3,5±0,4 Гц, однако величины констант зависели от положения связи в молекуле. Так, в дифукозиде 1а и трифукозиде 7а (1—>3)-связи являются терминальными,

для них величины Нравны 2,4+0,2 Гц. В случае тетрафукозида 8я и гексафукозида 9а (1->3)-связи являются внутренними, для них величины равны 3,8 Гц. Эта ситуация аналогична наблюдаемой ранее при изучении (1->3)-связанных олигофукозидов (см. раздел 2.2.), для которых величина также зависела от положения связи в молекуле. Различие в величинах констант для (1-»3)-связей говорит о различии конформаций соответствующих связей.

В случае 2-О-сульфатированных олигофукозидов 66-96 экспериментальные величины констант ^ и ^ близки для всех (1—>4)-связей. Их значения равны 4,6+0,3 и 5,4±0,1 Гц для и соответственно (Таблица 3). В случае (1-»3)-связей в соединениях 16 и 66-96 экспериментальные величины констант 39 зависели от положения связи в молекуле. В дифукозиде 16 и трифукозиде 76 (1->3)-связи являются терминальными, для них величины составляют 4,1 Гц. В случае тетрафукозида 86 и гексафукозида 96 (1->3)-связи являются внутренними, для них величины 3^ были меньше и равны 3,3±0,1 Гц. В то же время, экспериментальные величины констант .Ту близки между собой для всех (1—>3)-связей молекул и лежат в диапазоне 4,7±0,2 Гц. Эта ситуация обратна наблюдаемой в случае несульфатированных олигофукозидов 1а и 7а-9а, для которых величина .1ц, зависела от положения (1-»3)-связи в молекуле.

Сопоставление экспериментальных и рассчитанных величин трансгликозидных 31сл констант для олигофукозидов 1а,6 и 6а,б-10а в случае (1—>3)-связей показьшало хорошее соответствие для всех констант (расхождение менее 1 Гц), кроме констант Зч для внешних дисахаридных фрагментов трифукозида 7а и дифукозида 16 (Таблица 3). Как было показано в разделе 2.2, внешние (1—>3)-связанные дисахаридные фрагменты более конформационно подвижны, чем внутренние, а потому молекулярная механика предсказывает их поведение менее точно. ,

В случае (1->4)-связей соединений ба,б-10а различие между экспериментальными и рассчитанными величинами ^ не превышало 1 Гц, однако в случае констант ^ расхождение в большинстве случаев было больше. Мы связываем это с тем, что молекулярная механика недооценивает вклад конформеров с величинами углов у близкими 0° в конформационное равновесие (1—>4)-связанных дифукозидных фрагментов. Действительно, для этих фрагментов экспериментальные величины 1^=5,4+6,0 Гц и отвечают максимумам функции Карплуса (Рисунок 4), которые достигаются при величинах углов у близких 0" и 160°. Конформеры с углами у близкими 160° энергетически невыгодны из-за расталкивания атомов, принадлежащих соседним фукопиранозным остаткам. Таким образом, согласно

Таблица 3. Сопоставление экспериментальных и рассчитанных (в скобках) величин констант Хр и ^ для линейных олигофукозидов 1а,б и ба,б-9а,б, родственных фрагментам фукоидановых цепей с чередующимися (1—>3)- и (1—>4)-связями.

Связь ■1ф, Гц Гц Гц V Гц

а-Ь-Рис-( 1 ->3)-а-Ь-Рис-ОРг 1а 5 1 ( ЧЧ ¡¡||1|| 16 4,1 (3,8) 4,7 (3,4)

а-Ь-Рис-( 1 -И)-сс-Ь-Рис-ОРг 6а 3,9 (3,7) 5,9 (4,6) 66 4Л13 0) '(4.7)

-И)-а-1^Рис-(1-»3)-а-ЬРис-ОРг 7а ЗД (3,5) 2,3 (3,7) 76 4 I П/м

а-Ь-Рис-( 1 —>4)-а-Ь-Р'ис-( 1 -> 3,8 (3,5) 5,9 (4,0) 1.4(1,8) 5,4(4,8)

->3)-а-1^Рис-( 1 ->4) -а-Ь-Рис-ОРг 8а 3,9 (3,8) 5,6 (4,5) 86 4,9(3,9) 5,4(3,9)

->4)-а-Ь-Рис-( 1 —>3)-а-Ь-Рис-(1 —> 3,8 (3,3)

а-Ь-Рис-( 1 —>4)-а-Ь-рис-( 1 3 0 (3 ¡>) 5,6 (4,4) 4,6(3,8) "\4 (4

—>3)-а-Ь-Рис-( 1 -*4)-а-Ь-Рис-ОРг 9а -"(3,9) 6,0 (4,5) 96 4,7 (4,3) 5,5 (4,2)

->4)-а-Ь-Рис-(1 ->3)-сс-Ь-Рис-( 1 -> - (3,5) 3,8 (3,4) 3,4 Л 6) 4,7(3,8)

->3)-сс-Ь-Рис-( 1 ->4)-а-Ь-Рис-( 1 - (3,8) 6,0 (4,0) 4,5 (4,3) 5,5 (4,5)

-»4)-а-Ь-Рис-( 1 -»3)-а-Ь-Рис-( 1 -» - (3,6) 3> (1,5) Ч, • 1 1 М : 4,7 (3*1

а-Ь-Рис-( 1 ->4)-а-Ь-Рис-(1—► - (4,0) 6,0(4,2) 4,4 (4,0) 5,5 (4 2,

а-Ь-Рис-(1->4)-а-Ь-Рис-ОРг 10а 3,9 (3,8) 5,6 (4,5)

а-Ь-Рис-( 1 —>3)-а-Ь-Гис-ОРг З'ММ) 3,8 (3.3)

* Определение величин констант в случае гексасахарида 9а было невозможно из-за перекрывания сигналов и большого уровня шума в соответствующих областях .Г-НМВС и .Г-гезо1уес1 спектров. Полем серого цвета ( Ц ) выделены дисахаридаые фрагменты, для которых расхождение между экспериментальными и рассчитанными величинами констант 1Ф и .Ту не превышает 1 Гц.

экспериментальным данным, для (1-»4)-связанных дифукозидных фрагментов характерными оказываются конформеры с углами \|/ близкими 0° (Рисунок 11). В этих конформерах протон Н-1 гликозилируклцего остатка оказывается между протоном Н-4 и протонами метальной группы гликозилируемого остатка, однако пространственно протон Н-1 более сближен с

протоном Н-4. Присутствие в растворе значимого количества конформеров с углами |у|>00 приводило бы к уменьшению экспериментальной величины константы. Мы предполагаем, что конформеры с углами близкими 0° стабилизированы за счет сольватационных эффектов.

Стоит также отметить, что введение 2-О-сульфатных групп в олигофукозиды с чередующимися (1—>3)- и (1—>4)-связями изменяет величины трансгликозидных 3.1с.н констант, что говорит об изменении конформаций молекул. При этом в случае сульфатированных олигофукозидов хорошее соответствие между рассчитанными и экспериментальными величинами констант наблюдается для большего числа дисахаридных фрагментов, что связано с увеличением жесткости молекул.

Рисунок 11. Конформер (ф=35°, у=0°) для (1-+4)-связанного дисахаридного фрагмента, согласующийся с экспериментальными данными по величинам констант и

Хотелось бы еще раз отметить, что согласно данным конформационного анализа внутренние дисахаридные фрагменты тетра- и гексафукозидов являются менее конформационно подвижными, чем внешние фрагменты. Мы предполагаем, что конформации внутренних фрагментов в этих молекулах близки конформациям дисахаридных фрагментов природных фукоиданов. Нами было проведено моделирование пространственных структур фрагментов фукоидановых цепей с (1—>3)- и чередующимися (1—>3)- и (1—>4)-гликозидными связями (как в несульфатированной, так и в сульфатированной формах) с использованием конформационных характеристик внутренних дисахаридных фрагментов тетра- и гексафукозидов (Рисунок 12) (о правомочности такого моделирования см. раздел 5). Полученные модели фукоидановых цепей будут способствовать пониманию механизма связывания этих молекул с белковыми рецепторами.

4. Анализ эффектов сульфатирования для соединений 1б,в-9б. Эффект сульфатирования (Д5С) есть разница между химическими сдвигами ЯМР аналогичных атомов углерода "С в сульфатированном и несульфатированном олигофукозидах. Ранее в лаборатории химии гликоконъюгатов были проанализированы данные по эффектам сульфатирования в да- и

а-(1-»3)-связашая фукоидановая цепь

7 остатков

НА \

4-

фукоидановая цепь с чередующимися а-(1-»3)- и а-(1->4)-связями

1бА

ч-►

Рисунок 12. Фрагменты несульфатированных фукоидановых цепей с (1-+3)- и чередующимися (1->3)- и (1->4)-связями, смоделированные исходя из данных конформационного анализа тетрафукозидов За и 8а, соответственно. Обе цепи имеют форму спиралей, однако эти спирали достаточно сильно различаются по геометрическим параметрам (показаны шаги и диаметры спиралей).

трифукозидах. В данной работе показано, что эффекты сульфатирования в тетра- и гексафукозидах качественно совпадают с эффектами, найдеными для ди- и трифукозидов.

2-О-сульфатирпванные олигофукозиды 16-96. а-Эффекты сульфатирования на атомах С-2 были равны +7±0.5 м.д. ß-Эффекты сульфатирования на атомах С-1 и С-3 были также существенны, однако имели отрицательные величины (до -3.4 м.д.). Значимые у-эффекты сульфатирования (~+2,5 м.д.) наблюдались только на С-4 атомах 4-О-гликозилированных остатков олигофукозидов 66-96. Такие большие у-эффекты не характерны для сульфатных групп. Ранее в работах A.C. Шашкова (ИОХ РАН) было показано, что химические сдвиги ,3С ЯМР атомов углерода вблизи гликозидной связи зависят от конформации последней. Согласно данным конформационного анализа, введение 2-О-сульфатных групп в исследуемые олигофукозиды изменяло характеристики основных конформеров молекул. Последнее обстоятельство, как мы предполагаем, и вызывало появление больших у-эффектов на С-4 атомах 4-О-гликозилированных фукопиранозных остатков.

4-О-сульфатированные олигофукозиды 1в-4в. а-Эффекты сульфатирования на атомах С-4 были положительны и равны ~11 м.д. для всех фукопиранозных остатков, кроме терминальных на невосстанавливающих концах молекул, где они были на ~2 м.д. меньше, ß-Эффекты сульфатирования на атомах С-5 большинства фукопиранозных остатков и на атомах С-3 терминальных остатков на невосстанавливающих концах молекул имели отрицательные величины, как и в случае 2-О-сульфатированных олигофукозидов. Однако ß-эффекты на атомах С-3, вовлеченных в образование гликозидных связей, в случае 4-О-сульфатированных линейных олигофукозидов имели существенные положительные

величины. Также существенные эффекты сульфатирования (положительной величины) »

наблюдались на атомах С-1, вовлеченных в образование гликозидных связей.

Как было показано выше, введение 4-О-сульфатных групп в (1->3)-связанные олигофукозиды приводит к изменению конформаций молекул и сопровождается увеличением доли конформера Б для (1-»3)-гликозидных связей (см. раздел 2), что в свою очередь приводит к слабопольному сдвигу сигналов С-1 и С-3, вовлеченных в образование гликозидных связей. Этот эффект подобен обнаруженному нами для сигналов С-4 атомов в 4-О-гликозилированных фукопиранозных остатках олигофукозидов с чередующимися (1->3)- и (1->4)-гликозидными связями, как следствие введения в них 2-О-сульфатных групп.

5. Анализ спектров 13С-ЯМР природных фукоиданов с применением данных по синтетическим олигофукозндам.

Как было сказано в разделе 4, химические сдвиги атомов углерода, находящихся вблизи гликозидной связи, зависят от ее конформации. Следовательно, если конформации дисахаридных фрагментов олигофукозидов близки конформациям дисахаридных фрагментов фукоидановых полисахаридов, то и химические сдвиги атомов углерода иС должны быть близки для этих молекул.

Согласно методу аддитивных схем, химический сдвиг 8С< любого атома углерода i моносахаридного остатка в полисахаридной или олигосахаридной цепи можно представить в виде уравнения:

где 5С,-° - химический сдвиг 13С этого углерода в изолированном моносахаридном остатке; А (к, 0 и В (к', 0 - эффекты, обусловленные тем, что данный моносахаридный остаток с одной стороны гликозилирован (образование связи к), а с другой стороны сам является гликозилирующим (образование связи к) (Рисунок 13). Уравнение 2 позволяет рассчитать химические сдвиги |3С ЯМР фукоиданов, исходя из данных по эффектам гликозилирования [А(А, г) и В {к', г')] Для синтетических олигофукозидов. Нами проводился расчет химических сдвигов 13С ЯМР фукоидановых цепей с (1—>3)- и чередующимися (1->3)- и (1-»4)-связями, как в несульфатированной, так и в сульфатированной формах. Расчет проводился исходя из ди-, три-, тетра- и гексасахаридных моделей (Таблица 4).

Рисунок 13. Фрагмент фукоидановой цепи и обозначение связей кик'.

Для каждой олигосахаридной модели впоследствии был проведен расчет среднеквадратичного отклонения Б по уравнению (3). Величины в позволяют судить о степени соответствия экспериментальных и рассчитанных химических сдвигов и позволяют сопоставить олигосахаридные модели между собой.

6С, = 5С,° + А {к, г) + Ш', О

(2)

к

к'

->3)-Риср-ос-( 1 —>4УГиср-а-П->3)-Риср-аЧ 1

(3)

где п - число атомов углерода, приходящихся на повторяющееся звено фукоидановой цепи.

Анализ величин среднеквадратичных отклонений (в) показывал, что они уменьшаются при использовании для расчета олигосахаридов с большей длинной цепи (Таблица 4, последняя колонка). Это утверждение правомочно как в случае фукоидановой цепи, построенной через (1-»3)-связи, так и в случае цепи с чередующимися (1—>3)- и (1->4)-связями. При этом для обоих типов цепей величины Э тетра- и гексасахаридных моделей были близки друг другу и находились в пределах допустимого диапазона изменения химических сдвигов полисахарида (0,20 м.д., см. таблицу 4). Это говорит о том, что конформации дисахаридных фрагментов тетрафукозидов и гексафукозидов близки конформациям дисахаридных фрагментов природных полисахаридов. Этот факт доказывает правомочность моделирования дисахаридных фрагментов природных фукоиданов, исходя из данных конформационного анализа для фрагментов тетра- и гексафукозидов (см. раздел З.2.).

Таблица 4. Химические сдвига 13С ЯМР несульфатированных полисахаридных цепей фукоиданов и отклонения от аддитивности" (А813С), наблюдаемые для олигосахаридных моделей, и соответствующие им среднеквадратичные отклонения (Э).

Объект Фрагмент C-l С-2 с-з С-4 С-5 С-6 S

фукоидан из водоросли Chorda filun? дисахаридная модель la -*3)-Fuc/>-a-(l-> —>3)-Fuc/>-a-(l—> химические сдвиги 13C ЯМР (м.д.) 96,9 67,7 76,3 69,8 67,8 16,5 отклонения от аддитивности Д813С (м.д.) 0,5 0,1 0,5 0,5 0,3 0 0,20е 0,38

трисахаридная модель 2а (А)8 -»3)-Fuc/i-a-(l-» 0,4 0 0,4 0,2 0,2 -0,2 0,27

трисахаридная модель 2а (Б)' -»3)-Fucp-a-(l-» -0,2 -0,1 -0,1 -0,1 -0,2 -0,2 0,16

тетрасахаридная модель За —>-3)-Fuc/>-a-(l-» 0 0,1 0,3 0,1 0 0,1 0,14

гексасахаридная модель 5а ->3)-Fucp-a-(l-> 0,1 0,1 0,3 0 0 0 0,14

3 A O. Chizhov, A. Dell, H.R. Morris, S.M. Haslam, R.A. McDowell, A.S. Shashkov, N.E. Nifantiev, E.A. Khatuntseva, A.I. Usov. A study of fucoidan from the brown seaweed Chorda filum. // Carbohydr, Res., 1999, V. 320, P. 108-119.

Таблица 4. (продолжение)

Объект

Фрагмент

С-1 С-2 С-3 С-4 С-5 С-6

фукоидан из водоросли Fucus evanescens4

дисахаридная модель 1 а+ба

—>3)-Fucp-a-(l--»4)-Fucp-a-(l-

->3)-Fucp-a-(l-->4)-Fucp-a-(l-

химические сдвиги С ЯМР (м.д.)

101,6 68,3 77,2 70,2 67,7 16,4 97,8 69,2 70,0 81,2 68,8 16,4 отклонения от аддитивности Д513С (м.д.)

0

1,4

0,7 -ОД

1,4 -0,4

0,9 -0,1

0,2 0,5

-0,1 -0,1

0,20

0,69

трисахаридная модель 7а '

->3)-Fucp-a-(l-->4)-Fucp-a-(l-

1,2

0,7

1,2 0,8 0,3 -0,1

-0,1 -0,2 -0,1 0,1 -0,1

0,59

тетрасахаридная модель 8а

—>3)-Fucp-a-(l-—>4)-Fucp-a-(l-

-0,1 -0,1

0,1 -0,3

-0,1 -0,3

-0,1 -0,1

0,14

гексасахаридная модель 9а

->3)-Fucp-a-(l-->4)-Fuc/)-a-(l-

-0,1 0

-0,1 0

0

0,3

-0,1 0

-0,1 -0,1

0,11

" Отклонение от аддитивности (Д513С() для 1-ого атома углерода есть разница между экспериментальным химическим сдвигом этого атома в полисахариде (C¡9Kcn) и химическим сдвигом, рассчитанным по формуле 2 (С(расч), исходя из данных по олигофукозидам (Д813С,- = ôC,,Kcn - 8С,расч). 6 Доп устимая величина среднеквадратичного отклонения экспериментальных химических сдвигов 13С ЯМР полисахарида, обусловленная зависимостью последних от концентрации и вязкости раствора полисахарида. " Трисахаридная модель 2а: А — расчет исходя из данных по дисахаридному фрагменту на восстанавливающем конце молекулы, Б - расчет исходя из данных по дисахаридному фрагменту на невосстанавливающем конце молекулы.

Следует также отметить, что в случае полисахаридной цепи фукоидана из водоросли Fucus evanescens с чередующимися (1—>3)- и (1 —>4)-связями различие между экспериментальными и рассчитанными химическими сдвигами 13С ЯМР на атомах, находящихся в непосредственной близости к (1 —»4)-гликозидной связи (атомы С-1 - гликозилирующего остатка и атомы С-3, С-4 и С-5 - гликозилируемого остатка, Таблица 4) претерпевают меньшие изменения при удлинении цепи олигосахарида, по-сравнению с аналогичными эффектами на атомах 13С при (1->3)-гликозидной связи. Этот факт еще раз свидетельствует об ограниченности конформационной подвижности (1 ->4)-связанных фрагментов, которые, как мы предполагаем, стабилизированы за счет сольватации (см. раздел 3).

* MX Bilan, A.A. Grachev, N.E. Ustuzhanina, A.S. Shashkov, N.E. Nifantiev, A.I. Usov. Structure of a fiicoidan from the brown seaweed Fucus evanescens C.Ag. // Carbohydr. Res., 2002, V. 337, P. 719-730.

Выводы

1. На основании экспериментальных величин трансгликозидных констант спин-спинового

з.

взаимодеиствия JCH и данных молекулярно-механических расчетов исследованы конформационные свойства олигофукозидов, построенных только из а-(1—>3)- или чередующихся а-(1—»3)- и а-(1—>4)-связанных дисахаридных звеньев и отвечающих основным структурным фрагментам природных полисахаридов фукоиданов.

2. Показано, что конформации а-( 1 —>3)-связанньгх дисахаридных фрагментов в изучаемых олигофукозидах зависят от их положения в олигосахаридной цепи, наличия сульфатных групп и разветвлений, в то время как конформации а-(1->4)-связанных фрагментов заметно изменяются только при введении в молекулы сульфатных групп.

3. Показано, что конформации внутренних дисахаридных фрагментов в исследованных олигосахаридах с числом фукозных звеньев от четырех и выше совпадают с конформациями соответствующих дисахаридных фрагментов фукоиданов.

4. Построены вторичные структуры фукоидановых цепей с гомо а-(1->3)- или чередующимися а-(1—>3)- и а-(1—>4)-связями; выявлены особенности пространственной организации этих двух типов цепей.

5. Для исследуемых олигофукозидов определены экспериментальные эффекты сульфатирования и гликозилирования' в спектрах |3С ЯМР и изучена их взаимосвязь с конформационными характеристиками молекул.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. A.G. Gerbst, N.E. Ustuzhanina, A.A. Grachev, Е.А. Khatuntseva, D.E. Tsvetkov, D.M. Whitfield, A. Berces, N.E. Nifantiev. Synthesis, NMR and conformational studies of fucoidan fragments 3: effect of benzoyl group at О-З on stereoselectivity of glycosylation by 3-0- and 3,4-di-O-benzoylated 2-O-benzylated fucosyl bromides // J. Carbohydr. Chem., 2001, V. 20, P. 821-831.

2. A.G. Gerbst, N.E. Ustuzhanina, A.A. Grachev, N.S. Zlotina, E.A. Khatuntseva, D.E. Tsvetkov, A.S. Shashkov, A.I. Usov, N.E. Nifantiev. Synthesis, NMR and conformational studies of fucoidan fragments 4: 4-mono- and 4,4'-disulfated (l-3)-a-L-fucobioside and 4-sulfated fucoside fragments l/J. Carbohydr. Chem., 2002, V. 21, P. 313-324.

3. A.G. Gerbst, N.E. Ustuzhanina, A.A. Grachev, E.A. Khatuntseva, D.E. Tsvetkov, A.S. Shashkov, A.I. Usov, M.E.Preobrazhenskaya, N.A.Ushakova, N.E. Nifantiev. Synthesis, NMR and conformational studies of fucoidan fragments 5: Linear 4,4',4"-tri-0-sulfated and

parent non-sulfated (l-3)-fucotrioside fragments H J. Carbohydr. Chem., 2003, V. 22, P. 3750.

4. А.Г. Гербст, A.A. Грачев, H.E. Устюжанина, Б.А. Хатунцева, Д.Е. Цветков, А.И. Усов, A.C. Шашков, М.Е. Преображенская, H.A. Ушакова, Н.Э. Нифантьев. Синтез, ЯМР и конформационные исследования фрагментов фукоиданов. VI. Фрагменты, содержащие а-(1~>2)-связанное фукобиозидное звено // Биоорган, химия, 2004, Т. 30, С. 156-167.

5. A.A. Grachev, A.G. Gerbst, N.E. Ustyuzhanina, E.A. Khatuntseva, A.S. Shasbkov, A.I. Usov, N.E. Nifantiev. Synthesis, NMR and conformational studies of fucoidan fragments 7: influence of length and branching on the conformational flexibility of linear (1—>3)-Iinked oligosaccharide chains // J. Carbohydr. Chem., 2005, V. 24, P. 85-99.

6. A.A. Grachev, A.G. Gerbst, N.E. Ustyuzhanina, A.S. Shashkov, A.I. Usov, N.E. Nifantiev. NMR investigation of the influence of sulfate groups at C-2 and C-4 on the conformational behaviour of the fucoidan fragments with homo-(l—>3)-Hnked backbone // J. Carbohydr. Chem., 2006, V. 25, P. 315-330.

7. A.A. Grachev, A.G. Gerbst, N.E. Ustyuzhanina, A.S. Shashkov, N.E. Nifantiev. The conformational study of oligosaccharides which are related to the fragments of natural fucoidans // Международная конференция "Carbohydrate Workshop" (Борстель, Германия), 2004, Тезисы докладов, С. 22.

8. A.A. Грачев, А.Г. Гербст, A.C. Шашков, Н.Э. Нифантьев. Применение трансглико-зидных вицинальных С-Н констант спин-спинового взаимодействия в конформационном анализе олигосахаридных фрагментов фукоиданов // III Всероссийская школа-конференция "Химия и биохимия углеводов" (Саратов), 2004, Тезисы докладов, С. 28.

9. A.A. Grachev, A.G. Gerbst, A.S. Shashkov, N.E. Nifantiev. The conformational study of oligosaccharides related to the fragments of natural fucoidans // Международная конференция "NMR in Condensed Matter" (Санкт-Петербург), 2005, Тезисы докладов, С. 76.

к исполнению 23/08/2006 Исполнено 24/08/2006

Заказ № 563 Тираж: 150 зкз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 (495) 747-64-70 www.autoreferat.ru

Список условных обозначений

Часть 1. Введение.

Часть 2. Литературный обзор "Конформационный анализ углеводов в 7 растворе".

2.1. Экспериментальный конформационный анализ углеводов.

2.1.1. Теория и методы регистрации ядерного эффекта 9 Оверхаузера.

2.1.2. Теория и методы регистрации вицинальных констант 27 спин-спинового взаимодействия.

2.2. Теоретический конформационный анализ углеводов. 44 Часть 3. Обсуждение результатов.

3.1. Целевые соединения и стратегия их исследования.

3.2. Олигосахариды, относящиеся к фрагментам (1->3)- 58 связанной фукоидановой цепи.

3.2.1. Несульфатированные олигофукозиды 1а-5а.

3.2.2.2-0-сульфатированные олигофукозиды 16-46.

3.2.3.4-0-сульфатированные олигофукозиды 1в-4в.

3.2.4. Применение данных спектрального и конформационного 91 анализа синтетических олигофукозидов в структурном исследовании природных фукоиданов.

3.3. Олигосахариды, относящиеся к фрагментам фукоидановой 99 цепи с чередующимися (1-»3) и (1->4)-связями.

3.3.1. Несульфатированные олигофукозиды 1а-5а.

3.3.2.2-О-сульфатированные олигофукозиды 16-46.

3.3.3. Применение данных спектрального и конформационного 116 анализа синтетических олигофукозидов в структурном исследовании природных фукоиданов.

Часть 4 Выводы.

Часть 5 Экспериментальная часть.

Исследование взаимосвязи между структурой и свойствами углеводов является важнейшей задачей современной химии природных соединений. К широко изучаемым в последнее время биологически активным углеводам относятся полисахариды фукоиданы, про которые известно, что они проявляют противоопухолевую [1, 2], антикоагулянтную [3, 4], противовоспалительную [5-7] и антивирусную [8-10] активности.

Фукоиданы построены преимущественно из a-L-фукопиранозных остатков, связанных в полимерные цепи. При этом для их цепей характерно наличие разветвлений, а также высокая степень сульфатирования, одна-две сульфатные группы на одно фукопиранозное звено. Фукоиданы содержатся в бурых водорослях и морских беспозвоночных, относящихся к типу иглокожих. Несмотря на то, что эти биополимеры известны уже несколько десятков лет, имеются лишь фрагментарные сведения об их строении. Это обусловлено сложностью структурной характеристики фукоиданов из-за их нерегулярности, гетерогенности, а также отсутствия методов их направленного и контролируемого расщепления.

Изученные на данный момент фукоиданы можно разделить на два класса по типу соединения a-L-фукопиранозных остатков в полимерные цепи (Рисунок 1). К первому классу относятся фукоиданы с основной цепыо из a-L-фукопиранозных остатков, соединенных (1->3)-гликозидными связями. Фукоиданы с таким типом цепи были выделены из водорослей Laminaria saccharina [11], Chorda filum [12], Cladosiphon okamurantis [13], морского огурца Ludwigoíhurea grísea [14] и морского ежа Sírongylocentroíus franciscanus [15]. Другой класс фукоиданов содержит основную цепь из a-L-фукопиранозных остатков с чередующимися (1-»3)- и (1->4)-связями. К этому классу относятся фукоиданы из водорослей Fucus evanescense [16], Fucus distihus [17], Fucus serratus [18], Ascophyllum nodosum [19]. Для обоих типов цепей характерно наличие разветвленных фрагментов, при этом имеются сведения о 2,3- и 3,4-замещенных a-L-фукопиранозных остатках [12, 13, 18].

Рисунок 1. Два типа основной цепи фукоиданов. Цепь I состоит из а-Ь-фукопиранозных остатков, соединенных только (1->3)-гликозидными связями. Цепь II построена из а-\.-фукопиранозных остатков, сочлененных чередующимися (1->3)- и (1-И)-связями. = Н, а-Ь-Риср, ЭОз", Ас

Наличие биологической активности фукоиданов связывают с их способностью имитировать углеводные лиганды природных рецепторов, например, белков лектинов. При этом способность фукоиданов к имитации определяется наличием в их структуре сульфатных групп, которые имеют определенную пространственную ориентацию. Таким образом, для понимания механизма имитации необходимо знать пространственную структуру фукоиданов. Это позволит разрабатывать эффективные фармацевтические препараты.

В данной работе проведено систематическое изучение вторичной (пространственной) структуры синтетических олигофукозидов (Рисунок 2 и 3), отвечающих фрагментам фукоидановых цепей обоих типов (I и II). При этом были рассмотрены олигофукозиды, различающиеся межфукозными связями (1-»3, 1—>4), числом звеньев в цепи (от 2 до 6), положением сульфатных групп (несульфатированные, 2-0-сульфатированные и 4-0-сульфатированные), а также олигофукозиды, содержащие в своей структуре разветвленные фрагменты (2,3 и 3,4).

ОРг

1*20? Дон

1а IV = Я» = Н

16 IV - вО^а , IV = Н

1вР1 = Н,Р2 = 303№

Ме

ОРг

1*20?

ОРг оК1

А0Н

2а IV = Я» = Н

26 IV = ЭО^а , IV = Н

2в IV = Н, IV = Э03№

Ме

ЕЮ?

0? он зб = Э03№ , IV = Н

Зв IV = Н, IV = Э03№

ОРг

Рисунок 2. Исследованные олигофукозиды, родственные гомо-(1-»3)-связанным фукоидановым цепям.

Изучение проводилось методами спектроскопии ЯМР и теоретического молекулярного моделирования. На основании полученных данных выявлены ключевые моменты, определяющие пространственное строение фукоидановых цепей. Другой целью работы являлась систематизация спектральных 13С ЯМР эффектов сульфатирования и гликозилирования для фукозидов и их объяснение в свете результатов теоретического конформационного анализа. В дальнейшем эти эффекты могут быть использованы при установлении структуры природных фукоиданов по данным 13С ЯМР [20].

ОРг ОРг ОРГ

Ме'

Ме НО но? 00н тЫ

I он но ¿он

6а IV = Н 7а IV = Н \Ы\ 8а = Н

66 IV = 80}№ 76 IV = ЭОзМа НО 86 IV = в03№

ОРг

10а ^ = Н

Рисунок 3. Исследованные олигофукозиды, родственные фукоидановым цепям с чередующимися (1-»3)- и (1-»4)-связями.

Часть 2.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Конформационный анализ углеводов в растворе"

Биологически важные полисахариды участвуют в самых различных комплиментарных взаимодействиях, например с антителами, ферментами, различными рецепторами. Активность полисахаридов в этих процессах напрямую связана с конформациями их полимерных цепей. Это определяет интерес к изучению строения и в частности пространственной организации полисахаридов и их фрагментов.

В настоящем литературном обзоре рассмотрены существующие способы определения конформаций углеводов в растворе с применением методов ЯМР-спектроскопии (раздел 2.1) и теоретического конформационного анализа (раздел 2.2).

ВЫВОДЫ

1. На основании экспериментальных величин трансгликозидных констант зт спин-спинового взаимодеиствия 1СН и данных молекулярно-механических расчетов исследованы конформационные свойства олигофукозидов, построенных только из а-(1-»3)- или чередующихся а-(1->3)- и а-(1-»4)-связанных дисахаридных звеньев и отвечающих основным структурным фрагментам природных полисахаридов фукоиданов.

2. Показано, что конформации а-(1->3)-связанных дисахаридных фрагментов в изучаемых олигофукозидах зависят от их положения в олигосахаридной цепи, наличия сульфатных групп и разветвлений, в то время как конформации а-(1->4)-связанных фрагментов заметно изменяются только при введении в молекулы сульфатных групп.

3. Показано, что конформации внутренних дисахаридных фрагментов в исследованных олигосахаридах с числом фукозных звеньев от четырех и выше совпадают с конформациями соответствующих дисахаридных фрагментов фукоиданов.

4. Построены вторичные структуры фукоидановых цепей с гомо а-(1-»3)- или чередующимися а-(1-»3)- и а-(1-»4)-связями; выявлены особенности пространственной организации этих двух типов цепей.

5. Для исследуемых олигофукозидов определены экспериментальные эффекты

I 3 сульфатирования и гликозилирования в спектрах С ЯМР и изучена их взаимосвязь с конформационными характеристиками молекул.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ЯМР спектры олигофукозидов 1а-10б (10-15 мг) были зарегистрированы на приборе Bruker DRX-500, оснащенного програмным обеспечением XWINNMR 3,6 , также фирмы Bruker. Образцы для регистрации ЯМР-спектров были растворены в D20 (99.98% D, Merck, 0.5 мл) с использованием ацетона

1 1Ч

0.05%) в качестве внутреннего стандарта ( Н 2.225 м.д., С 31.45 м.д.). Температура экспериментов выбиралась так, чтобы сигнал остаточных протонов HOD в *Н ЯМР спектрах не перекрывался с сигналами протонов олигофукозидов. Спектры несульфатированных олигофукозидов (1а-10а) были зарегистрированы при ЗОЗК, спектры 2-0-сульфатированных олигофукозидов (16-96) - при температуре 298К, а спектры 4-0-сульфатированных олигофукозидов (1в-4в) - при температуре 307К. Для некоторых образцов были использованы специальные ампулы (Microtube Shigemi, Inc.), позволяющие уменьшить объем раствора образца и тем самым повысить чувствительность ЯМР экспериментов.

Отнесение сигналов в одномерных спектрах 'Н-ЯМР олигосахаридов проводили с использованием комбинации 2D gCOSY, gNOESY и TOCSY экспериментов, в то время как сигналы в спектрах 13С ЯМР были отнесены с применением 2D gHSQC и gJ-HMBC экспериментов.

Данные спектров !Н ЯМР целевых олигосахаридов 1а,в-10а приведены в Приложении 1. Данные спектров 13С ЯМР целевых олигосахаридов 1а,в-10а приведены в Приложении 2.

Экспериментальные величины неравновесных ЯЭО были измерены с применением градиентной методики 2D gNOESY. Для (1->3)-связанных олигофукозидов 1а-4в ширина спектрального окна составляла 1000 (±50) Гц на частоте резонанса ядер !Н (500 МГц) и не включала область резонанса ядер протонов метальных групп остатков фукозы. В случае олигофукозидов с чередующимися (1->3)- и (1->4)-связями 6а,б-10а ширина спектрального окна составляла 2500 (±50) Гц и включала область резонанса ядер протонов метальных групп. Время насыщения тт составляло 500 мс, релаксационная задержка tj - 3 с. В ходе экспериментов был использован градиент магнитного поля синусоидальной формы длительностью 1 мс и временем востановления 1 мс. Фурье-преобразование спектров проводилось с использованием в обоих измерениях 2D gNOESY спектра взвешивающей функции - квадратичного синуса, сдвинутого на л/2.

Экспериментальные величины Jc,h КССВ были измерены с помощью градиентной методики gJ-HMBC [48, 49] и методики J-resolved [45, 46]. 2D gJ-НМВС эксперимент регистрировался в режиме эхо/антиэхо. Эхо составляющая получалась за счет приложения двух синусоидальных градиентов поля с соотношением интенсивностей 5:-3, в то время как для антиэхо составляющей - соотношение было -3:5. Градиенты поля прикладывались в течение 1 мс, задержка для восстановления поля составляла 1 мс. Ширины спектральных окон составляли 1000 (±50) Гц для 'Н-региона и 4700 Гц для.13С региона и не включали область резонанса углеродов метальных групп остатков фукозы. Спектры были зарегистрированы с 60-80 tj инкрементами, при этом на каждый инкримент tj приходилось 500-700 прохождений. В течение времени регистрации собиралось 512 точек. Для получения достоверных величин КССВ предварительная задержка Ai в НМВС эксперименте должна составлять как минимум 60% инвертированной величины наименьшей КССВ, которую мы хотим измерить (Ai=0.6/Jc,hmiw) [49]. Коэффициент пропорциональности к, определяющий величину расщепления пиков, был равен 40-60. Релаксационная задержка составляла 1 с. Таким образом, полное время экспериментов составляло 10-15 ч. Для подавления расщеплений, обусловленных прямыми КССВ 'jc н, в J-HMBC эксперименте использовался трехступенчатый низкочастотный фильтр LPJF [49]. Диапазон подавляемых КССВ составлял 125-180 Гц. При этом в низкочастотный фильтр LPJF была встроена последовательность градиентов поля синусоидальной формы с соотношением интенсивностей +7:-4:-2:-1. Математическая обработка экспериментов включала линейное предсказание ССИ до 1024 точек в Fi измерении, что соответствует разрешению 5-6 Гц, и дополнение нулями до 1024 точек в F2 измерении, что соответствует разрешению 1 Гц. В качестве взвешивающих функций по обеим осям (Fj и F2) использовался квадратичный синус, сдвинутый на л/2.

J-resolved эксперименты проводились в режиме детектирования ядер С, для повышения чувствительности которых использовалась импульсная последовательность PENDANTE. Ширины спектральных окон составляли 4800 1 ^

Гц для С-измерения и 14 Гц для J-измерения. Спектры были оцифрованы с 44 ti-инкрементами, при этом на каждый инкремент приходилось 500-740 циклов накопления. 2048 точек регистрировалось в течение времени накопления Î2, что соответствовало разрешению 2.3 Гц в 13С-измерении. Релаксационная задержка между двумя циклами составляла 1 с. Таким образом, полное время экспериментов составляло 12-15 ч. Для селективной инверсии сигналов протонов использовался импульс гауссовой формы, его длительность составляла 20-50 мс, что соответствует диапазону облучения 50-20 Гц и отвечает требуемой селективности. Математическая обработка включала дополнение масива данных нулями до 128 точек в J-измерении, что соответствует разрешению 0,3 Гц. В качестве взвешивающих функций по обеим осям (Fj и F2) использовался квадратичный синус, сдвинутый на я/2.

Молекулярное моделирование было проведено с использованием программы TINKER со встроенным силовым полем ММЗ. Диэлектрическая константа 8 принималась равной 81. При этом влияние растворителя в расчетах в явном виде не учитывалось. Начальные структуры молекул, используемые для построения конформационных карт, получали геометрической оптимизацией с использованием силового поля ММЗ. Для построения каждой точки коиформационного пространства молекулы использовали одну и ту же начальную структуру, изменяя только значения торсионных углов ф и у при гликозидных связях. Подвижность торсионных связей задавалась силовой постоянной 10 ккал/градус . Конформационные карты были визуализованы с помощью программы SigmaPlot 4.0.

1. М. Ellouali, С. Boisson-Vidal, Р. Durand, J. Jozefonvicz, Anticancer Res., 1993,13, 2011.

2. H. Itoh, Н. Nöda, Н. Amano, С. Zhuang, Т. Mizuno, Н. Ito, Anticancer Res., 1993,13, 2045.

3. M.S. Pereira, В. Mulloy and P.A. Mourao, J. Biol. Chem., 1999,274, 7656.

4. T. Nagumo, T. Nishino, In: Polysaccharides in Medicinal Applications, S. Dumitriu Ed., Marcel Dekker: New York, 1996, 545.

5. M.E. Preobrazhenskaya, A.E. Berman, V.l. Mikhailov, N.A. Ushakova, A.V. Mazurov, A.V. Semenov, A.I. Usov, N.E. Nifant'ev, N.V. Bovin, Biochem. Molecul. Biol. Int., 1997, 43, 443.

6. C. Granert, J. Raud, A. Waage, L. Lindquist, Infect. Immun., 1999, 67, 2071.

7. L.A. Lasky, Science, 1992,258, 964.

8. M.O. McClure, J.P. Moore, D.F. Blanc, P. Scotting, G.M.W. Cook, R.J. Keynes, J.N. Weber, D. Davies, R.A. Weiss, AIDS Res. Hum. Retrovir., 1992, 8, 19.

9. M. D. Baba, D. Schols, R. Pauwels, H. Nakashima, E. De Clercq, J. AIDS, 1990,3,493.

10. G. F. Clark, S. Oehninger, L.K. Moen, FASEB J., 1992, 6,233.

11. A.I. Usov, G.P. Smirnova, M.I. Bilan, A.S. Shashkov, Bioorgan. Khim.,1998, 24,431.

12. A.O. Chizhov, A. Dell, H.R. Morris, S.M. Haslam, R.A. McDowell, A.S. Shashkov, N.E. Nifant'ev, E.A. Khatuntseva, A.I. Usov, Carbohydr. Res.,1999, 320, 108.

13. M. Nagaoka, H. Shibata, I. Kimura-Takagi, S. Hashimoto, K. Kimura, R. Aiyama, S. Ueyama, T. Yokokura, Glycoconjugate J., 1999,16, 19.

14. A.-C.Ribeiro, R.P.Vieira, P.A.S. Mourao, B. Mulloy, Carbohydr. Res., 1994, 255, 225.

15. A.-C. Vilela-Silva, A.-P. Alves, A.-P. Valente, V.D. Vacquier, P.A.S. Mourao ,Glycobiology, 1999, 9,927.

16. M.I. Bilan, A.A. Grachev, N.E. Ustuzhanina, A.S. Shashkov, N.E. Nifantiev, A.I. Usov, Carbohydr. Res., 2002, 337, 719.

17. M.I. Bilan, A.A. Grachev, N.E. Ustuzhanina, A.S. Shashkov, N.E. Nifantiev, A.I. Usov, Carbohydr. Res., 2004, 339, 511.

18. M.I. Bilan, A.A. Grachev, N.E. Ustuzhanina, A.S. Shashkov, N.E. Nifantiev, A.I. Usov, Carbohydr. Res., 2006, 341, 238.

19. L. Chevolot, A. Foucault, F. Chaubet, N. Kervarec, C. Sinquin, A.-M. Fisher, C. Boisson-Vidal, Carbohydr. Res. 1999, 319, 154.

20. A.C. Шашков, 13C ЯМР -спектроскопия углеводов, Диссертация. д-ра хим.наук, Москва, ИОХ АН СССР, 1983.

21. Г.М. Липкипд, Конформационный анализ углеводных цепей, Диссертация. д-ра хим.наук, Москва, ИОХ АН СССР, 1991.

22. R.U. Lemieux, К. Bock, L.T.J. Delbaere, S. Koto, V.S. Rao, Can. J. Chem., 1980, 58, 631.

23. H. Thogersen, R.U. Lemieux, К. Bock, B. Meyer, Can. J. Chem., 1982, 60, 44.

24. A.G. Gerbst, A.A. Grachev, N.E. Ustyuzhanina, E.A. Khatuntseva, D.E. Tsvetkov, A.I. Usov, A.S. Shashkov, M.E. Preobrazhenskaya, N.A. Ushakova, N.E. Nifantiev, Russ. J. Bioorg. Chem., 2004, 30(2), 137.

25. J.A. Schwarcs, A.S.Perlin, Can. J. Chem., 1972, 50, 3661.

26. F. Heatley, L. Akhter, R.T. Brown, J. Chem. Soc. Perkin II, 1980,919.

27. A.S. Shashkov, G.M. Lipkind, Y.A. Knirel, N.K. Kochetkov, Magn. Reson. Chem., 1988,26, 735.

28. D.M. Grant, B.V. Cheney, J. Am. Chem. Soc., 1967, 89(21), 5315.

29. J. Noggle, R.E. Schirmer, The nuclear Overhauser effect, New York, 1971.

30. Э. Дероум, Современные методы ЯМР для химических исследований, Москва, Мир, 1992.

31. Н.М. Сергеев, Спектроскопия ЯМР, Москва, Московский университет, 1981.

32. С. Bauer, R. Freeman, Т. Frenkiel, J. Keeler, A.J. Shaka, J. Magn. Res., 1984, 58, 442.

33. T.D.W. Claridge, High Resolution NMR Techniques in Organic Chemistry, Pergamon, 1999.

34. J.-R. Brisson, J.P. Carver, Biochemistry, 1984, 22, 1362.

35. S.R. Haseley, S.G. Wilkinson, Carbohydr. Res., 1998, 306, 257.

36. J. Jeener, B.H. Meier, P. Bachmann, R.R. Ernst, J. Chem. Phys., 1979, 71, 4546.

37. A.A. Bothner-By, R.L. Stephens, J. Lee, C.D. Warren, R.W. Jeanloz, J. Am. Chem. Soc., 1984,106, 811.

38. A. Bax, D.G. Davis, J. Magn. Res., 1985, 63, 207.

39. A. Bax, D.G. Davis, J. Magn. Reson., 1985, 65, 355.

40. M. Karplus, J. Chem. Phys., 1959, 30, 11.

41. M. Karplus, J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, 2870.

42. J.A. Schwarcz, A.S. Perlin, Can. J. Chem., 1972, 50, 3667.43