Синтез сполна сульфатированных олигосахаридов, родственных природным полисахаридам фукоиданам тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ
|
Крылов, Вадим Борисович
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2010
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.03
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. Н.Д. ЗЕЛИНСКОГО РАН
На правах рукописи 004614515 Цм^У^
КРЫЛОВ ВАДИМ БОРИСОВИЧ
СИНТЕЗ СПОЛНА СУЛЬФАТИРОВАННЫХ ОЛИГОСАХАРИДОВ, РОДСТВЕННЫХ ПРИРОДНЫМ ПОЛИСАХАРИДАМ ФУКОИДАНАМ
02.00.03 - органическая химия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва 2010
-2 дек 2010
004614515
Работа выполнена в лаборатории химии гликоконъюгатов (№52) Института органической химии имени Н.Д. Зелинского Российской академии наук
Научный руководитель: кандидат химических наук Устюжанина Надежда Евгеньевна
Официальные оппоненты: доктор химических наук Яков Васильевич Возный доктор химических наук Евгения Николаевна Олсуфьева
Ведущая организация: Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова
Защита состоится 30 ноября 2010 года в 11 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 002.222.01 при Институте органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН по адресу 119991, Москва, Ленинский проспект, 47.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОХ РАН
Ученый секретарь диссертационного
совета Д 002.222.01
доктор химических наук
Родиновская Л. А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Сульфатированные полисахариды играют важную роль в организме млекопитающих благодаря их способности образовывать прочные ионные контакты с различными белковыми рецепторами. Например, полианионные гликозаминогликаны (ГАГ) участвуют в таких физиологических процессах, как свертывание крови, развитие воспаления, ангиогенез, адгезия клеток, распознавание вирусами клеток хозяина и других.
Среди практически доступных природных полисахаридов значительный интерес вызывают фукоиданы из бурых водорослей благодаря их способности воздействовать на широкий ряд физиологических процессов в организме млекопитающих. По-видимому, отдельные участки полисульфатированных цепей фукоиданов способны выступать в качестве миметиков природных лигандов белковых рецепторов (в том числе лигандов относящихся к ГАГ), обуславливая тем самым, например, противовоспалительную активность, оказывая антикоагулянтное и антиангиогенное действие, блокируя бактериальную и вирусную адгезию.
Цепи фукоиданов построены преимущественно из остатков а^-фукопиранозы и могут содержать сульфатные и ацетильные группы, а также различные углеводные заместители (остатки глюкуроновой кислоты, ксилозы, маннозы). Важнейшей характеристикой фукоиданов, определяющей спектр проявляемой биологической активности, является степень сульфатирования, среднее значение которой чаще всего лежит в пределах от 0,5 до 1,5 сульфатных групп на фукозный остаток. Показано, что фукоиданы с высокой степенью сульфатирования проявляют антикоагулянтную активность, по величине сравнимую с действием гепарина. В связи с этим разработка эффективных схем синтеза олигосахаридов, отвечающих крупным высокосулъфатированным фрагментам фукоиданов, представляется актуальной задачей. Синтетические олигосахариди являются ценными модельными соединениями для выявления взаимосвязи структуры и свойств этих полисахаридов. Кроме того, их спектральные (ЯМР) данные необходимы для информационного анализа углеводных цепей фукоиданов, а биохимические исследования позволят определить структурные мотивы, ответственные за физиологическую активность. Химический синтез крупных высокосульфатированных фрагментов фукоиданов является нетривиальной задачей. Так, исчерпывающее сульфатирование олигофукозидов, содержащих более двух углеводных остатков, весьма затруднительно, что связано с недостаточной полнотой прохождения реакции при использовании стандартных методов сульфатирования.
Целью работы является разработка эффективного метода исчерпывающего сульфатирования полигидроксильных соединений и его применение для синтеза серии крупных сполна сульфатированных олигофукозидов, включающих основные структурные типы природных цепей фукоиданов.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые проведен синтез 10 сполна сульфатированных олигосахаридов, соответствующих основным структурным типам природных цепей фукоиданов. Данные соединения являются ценными моделями дня структурных, конформационных и биохимических исследований. Для их получения разработана эффективная схема блочного синтеза с использованием тиоэтильных гликозил-доноров, позволившая впервые синтезировать такие крупные фрагменты фукоиданов, как додека- и гексадекасахариды.
Разработан метод исчерпывающего сульфатирования полиолов в присутствии сильных протонных кислот и продемонстрирована его эффективность на примере превращения широкого ряда олигофукозидов (от ди- до гексадекасахаридов). Изучено влияние природы промотирующей кислоты, а также исследована неизвестная ранее реакция изомеризации пиранозидов в фуранозиды.
Публикация и апробация работы. По результатам диссертации опубликованы 3 стати, 1 обзор. Отдельные части работы были представлены на 4-ой Балтийской конференции по бактериальным углеводам «4-th ВММС» (Финляндия, Хиитиэле), всероссийской конференции по органической химии, посвященной 75-летию со дня основания Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН (Москва, 2009), 15-ом Европейском углеводном симпозиуме «EuroCarb2009» (Австрия, Вена, 2009), VII-om Всероссийской научной конференции «Химия и медицина, 0рхимед-2009» (Уфа, 2009), VI Международном конгрессе молодых ученых «YoungChem 2009» (Польша, Краков, 2008).
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, посвященного синтезу низкомолекулярных углеводных миметиков гепарина, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитированной литературы. Общий объем диссертации страниц, библиография ссылок.
Автор выражает глубокую благодарность заведующему лабораторией химии гликоконъюгатов ИОХ РАН доктору химических наук, профессору Николаю Эдуардовичу Нифантьеву за внимание и помощь, оказанные при выполнении работы.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Целевые соединения. В данной диссертационной работе выбор целевых соединений основывался на литературных данных о структуре фукоиданов. Различают несколько типов главных цепей этих полисахаридов. Так, например, в фукоиданах из водорослей Laminaria saccharina, Chorda filum, Cladosiphon okamuranus главная цепь построена из (1-^-связанных a-L-фукопиранозных остатков (Рис. I, тип I). Для фукоиданов из водорослей Fucus vesiculosus, F. evanescens, F. distichus, Ascophyllum nodosum характерна цепь, состоящая из чередующихся (1-»3)- и (1-»4)-связанных a-L-фукопиранозных остатков (тип II). Углеводная цепь, построенная из гомо-( 1-»4)-связанных a-L-фукопиранозных остатков (тип 111), была установлена для фукансульфата из морского ежа Arbacia lauta. Также сообщалось об обнаружении такого структурного мотива в фукоидане из L. cichorioides.
Рисунок 1. Основные типы главных цепей фукоиданов из бурых водорослей. R = Н, S03", Ас; Fue, GlcA, Man, Xyl, Gal.
Наличие заместителей у атомов кислорода главной цепи существенно увеличивает разнообразие структурных мотивов фукоиданов, маскируя при этом ее регулярность. Заместители могут быть как неуглеводные (в основном, сульфат и ацетат), так и углеводные. Это, например, (1—>2)-связанные остатки фукозы, как в фукоидане из L. saccharina (Рис. 2 А), (1-»2)-связанные остатки глкжуроновой кислоты, как в фукоидане из С. okamuranus (Рис. 2 Б), а также остатки маннозы, ксилозы, галактозы и другие.
Целевые олигосахариды 1-6, построенные из 2,4, 6, 8, 12 и 16-ти (1-»3)-связанных a-L-фукопиранозных остатков, соответствуют типу 1 главных цепей фукоиданов (Рис. 3). Известно, что биологические свойства полианионных олигосахаридов существенно зависят от длины цепи. Например, способность синтетических фрагментов гепарина
-да?;
RO ? RO ? Г OR
ТИП I
ТИП II
ТИП III
„0 °
fr-1
MOro ?
u-u.
Me
RÓ 9
У
fes?
<j>
Me
RO 9
СОО" ■OR
Рисунок 2. Примеры (1->2)-разветвленных цепей: фукоиданов: А, фукоидан из Ь. ¡ассИагта; Б, фукоидан из С. окатигапиз. К = Н, БОзИа и др.
ингибировагь действие фактора свертывания крови На начинает проявляться только с 14-сахарида, благодаря образованию тройного комплекса антитромбин III - фактор II -фрагмент гепарина В то же время, для ингибирования действия фактора свертывания крови Ха требуется только пентасахаридный фрагмент, который специфично связывается с ангитромбином П1. Именно поэтому в рамках данной диссертационной работы была синтезирована серия олигофукозидов с широким диапазоном размеров и строения цепей.
Ме7~-о-j
f-r^1
RO О
[r¿° Mtri—о'у
..i no
ррг
•OR
Ol
I no
OPr OR
Ol
br-J-'
1 no
OPr OR
„0 o
L na
Me' RO 9
R = H
n = 0 13-
n =2 14-
n -4 15-
П = 6 « —
n = 10 17 —
n = 14 16 —
R ■ S03Na
«7*--0-7
ГГ^'
i ПВ
i na
-I ПР
Me"
RÓ °R
n = 0 19-n = 1 20 -n = 2 21 .
R-H 22 -
R = SOjNa -10
OPr
Me'
no OR I™ 0R Rr OR L ^
О-Тч ROA-^f^-OR
M=¿R OR
R s H R = S03Na R = H R = S03Na
23 -»11 24 -.-12
Рисунок 3. Целевые соединения 1-12 и их несульфатированные предшественники 13-24.
Целевые соединения 7-9 соответствуют типу II главных цепей фукоиданов, а трисахарид 10 - типу III. Дисахариды 11 и 12, содержащие (1—»2)-а-связанные боковые остатки фукозы и глкжуроновой кислоты соответственно, отвечают разветвлениям
главной цепи, встречающимся в фукоиданах из водорослей I. тсскагта и С. окатигапт (Рис. 2 А,Б).
2. Синтез несульфатированных предшественников 13-22. Ранее в нашей лаборатории был проведен синтез серии олигофукозидов, построенных из (1-»3)-связанных а-Ь-фукоииранозных остатков, с использованием в качестве гликозил-доноров трихлорацетоимидатных производных, которые получали из соответствующих аллил-гликозидов. В настоящей работе предложена новая стратегия синтеза, заключающаяся в использовании блоков, содержащих в аномерном положении тиоэтильную группу, которая в зависимости от условий гликозилирования может выступать либо в качестве защитной группы в гликозил-акцепторных блоках, либо легко уходящей группы в гликозил-донорах. Применение такой ортогональной стратегии синтеза при удлинении цепи позволяет избежать стадий, связанных с переводом аномерной защитной группы (например, аллильной) в легко уходящую при гликозилировании.
Тиофукозид 25, являющийся основным моносахаридным исходным соединением, был получен по разработанной ранее методике. Далее в этом соединении монохлорацетилировали свободную гидроксильную группу при С-3, а затем тиоэтильную группу при С-1 заменяли либо на трихлорацетоимидатную (смесь а- и р-изомеров 27), либо на атом брома (а-бромид 28 использовался далее без дополнительной очистки) (Схема 1).
ме-7—а-~т-&а вяз он
¿-р^У-о!
1 г>лпли Г*I
¿^Г^Х-ОВп В20 "
слл т
В26 ОСОСНгС1 Вг "1в2^22-овп
26 ~Х И Ю] ОСОСН2С|
Схема 1. С1СН2СОС1, Ру, СН2С12, 95%; и: 1) ШБ, ацетон-вода, 2) ССЬСЫ, ДБУ, СН2С12, 76%; ш: Вь, СН2С12; ¡у: ТМБСПТ, СН2С12, -90 "С, 1 ч, 66%; V. Ь^(СМ)2,1^Вг2, СН2С12,20 °С, 3 ч, 46%.
Сочетание доноров 27 и 28 с акцептором 25 было изучено в различных условиях (Таблица 1). Практически во всех случаях гликозилирование было осложнено побочной реакцией переноса тиозтильного заместителя на гликозил-донор. Гликозилирование трихлорацетоимидатом 27 при промотировании ТЫБОТГ при -40 "С приводило к необходимому продукту 29 лишь с выходом 38%, однако снижение температуры до -90 °С, позволило увеличить его выход до 66%. Промотирование бромида 28 солями ртути при
комнатной температуре позволило получить дисахарид 29 с выходом 46%. Аналогичный результат был получен и при использовании Л§0'П при -30 °С (выход 44%). Гликозилирование бромидом 28 в присутствии ВщЫВг при комнатной температуре проходило очень медленно, за 7 дней конверсия не превышала 20%. Таким образом, условия опыта 2 оказались наиболее успешными, реакция протекала сгереоспецифично с образованием а-изомера 29. а-Конфигурация вновь созданной гликозидной связи в этом соединении подтверждалась характеристической величиной КССВ 3\,г, составляющей 3,5 Гц.
Таблица 1. Результаты гликозилирования донорами 27 и 28 акцептора 25.
Опыт Донор Уходящая группа Условия гликозилирования Выход 29,%
1 27 ОС(КН)ССЬ ТМЗОЦ СН2С12, -40 "С, 1 ч. 38
2 27 ОС(Ш)СС13 ТМБСЩ СН2С12, -90 °С, 1 ч. 66
3 28 Вт НкОЗГЬ, HgBr2, СН2С12,11,3 ч. 46
4 28 Вг АеОТГ, СН2С12) -30 "С, 1 ч. 44
5 28 Вг ВщЫВг, СН2С12, ДМФА, 20 °С, 7 д. -20 (ТСХ)
Для синтеза крупных олигосахаридов помимо дисахаридного тиоэтильного предшественника 29 потребовался и тетрасахаридный тиогликозид 32. Для его получения в дисахариде 29 хлорацетильную группу удаляли с образованием акцептора 30 при обработке тиомочевиной и 2,4,6-коллидином с выходом 94% (Схема 2). Гликозилированием этого соединения дисахаридным трихлорацетоимидатом 31, описанным ранее, в условиях, разработанных для получения дисахарида 29, был ситезировантетрасахарид 32 с выходом 57%.
НИ
О___СС!3
Т
ОВп
ОВп N4 ВгО 9
Че^—о~7
ОВп
ВгО 0Ас
32
Схема 2. ¡: КН2С5КН2, 2,4,6-коллидин, МеОН, 60°С, 24 ч, 94%, и: ТМЗОТГ, СН2С12, -90 °С, 1 ч, 57%.
В качестве исходного соединения для синтеза крупных олигосахаридов был использован дисахарид 35, полученный гликозилированием аллил-фукозида 33 тиогликозидом 26 в присутствии N18 и ТГОН. Реакция проходила стереоизбирательно и приводила к образованию только а-изомера 34 (КССВ Дг = 3,5 Гц) (Схема 3). Избирательное удаление хлорацетильной группы приводило к акцептору 35 практически с количественным выходом. Каталитическим гидрогенолизом дисахарида 34 и последующим дезацетилированием был также получен незащищенный дисахарид 13.
о,
___ \
В^ ососн2а гТГ^'
ОА11 ОВп
Ма-ВгО
гГ—О "7
о
I г>гг»ги.<
ОА11 ОВп
ОВп
бсосн,а
: 7^0-7 ■гТ-а-7
гг^-1
ом ОВп
ВгО ОН 35
Схема 3. ¡: N15, ТЮН, СН2С12, - 30 °С, 1 ч, 82%, и: NH2CSNH2, 2,4,6-коллидин, МеОН, 60°С, 24 ч, 95%, Ш: 1) Н2, РЛ'С, МеОН-ЕЮАс, 20°С, 5 ч, 2) ЫаОН, Ме0Н-Н,0, 20°С, 24 ч, 81%.
Для синтеза крупных линейных олигофукозидов 14-18, построенных из (1->3)-связанных а-Ь-фукопиранозных остатков, нами далее проводилось гликозилирование дисахаридного акцептора 35 дисахаридным донором 29. В результате стереоспецифично с выходом 84% образовывался тетрасахарид 36 (КССВ 71.2 = 3,5 Гц) (Схема 4). В этом
о.
0-71
ОА11 ОВп
ВгО Ме7—0"7
ОВп
ВгО ОН
35
Ме-Г^-о-Т-вЕ!
ОВп
ВгО п
«и 9
Ме-Т-^О-У ¿•^г^и-овп
вд!, ососнга
29
вги 9
ОВп
ВгО
у
ОА» ОВп
ВгО
„О °
ргй
1_пО о
>7^0-7
I пи
ОРГ ОН
Ма-; но о Сон
Ме'
но он
Схема 4. г. N15, ТЮН, СНгС12> - 30 °С, 1 ч, 79-84%, и: КН2С5КН2,2,4,6-коллидин, МеОН, 60°С, 24 ч, 93-95%, ш: 1) Н2, РИС, МеОН-ЕЮАс, 20°С, 5 ч, 2) КаОН, Ме0Н-Н20, 20 "С, 24 ч, 65-81%.
соединении избирательно удаляли хлорацетильную группу при 0-3 концевого остатка, что приводило к тетрасахаридному акцептору 37. Полученный тетрасахарид 37 далее гликозилировали дисахаридом 29 с образованием гексасахарида 38 (выход 80%) и переводили в моногидроксильное производное 39. Его последующее гликозилирование донором 29 позволило получить октасахарид 40 с выходом 79% (КССВ J^2 = 3,5 Гц). Каталитический гидрогенолиз и дезацилирование соединений 36, 38 и 40 приводили к незащищенным олигосахаридам 14-16.
Додека- и гексадекасахариды 17 и 18 были получены по схемам [4+8] и [4+12] соответственно с использованием тетрасахаридного донора 32 (Схема 5). Удаление хлорацетильной группы в октасахариде 40 и последующее гликозшшрование соединения 41 донором 32 приводило к додекасахариду 42 с выходом 69% (КССВ ^ г = 3,5 Гц). Удаление ацетильной группы в 42 и последующее гликозилирование донором 32 позволили получить гексадекасахарид 44 с выходом 52% на 2 стадии.
Схема 5. i: NH2CSNH2, 2,4,6-коллидин, МеОН, 60°С, 24 ч, 95%, ii: NIS, ТГОН, СН2С12, - 30 "С, 1 ч, 69% для 42,74% для 44, iv: HCl, МеОН, 20°С, 6 ч, 72%, iii: 1) Н2, Pd/C, ТГФ-ЕЮН-CHjCOOH, 20 °С, 5 ч, 2) NaOH, СН2С12-ЕЮН-Н20, 40 °С, 12 ч, 3) Н2, Pd/C, МеОН-АсОН, 20 °С, 5 ч, 61% для 17, 54% для 18.
Следует отметить, что в случае таких крупных олигосахаридов, как додека- и гексадекасахариды, удалить все защитные группы при однократном гидрогенолизе и омылении по стандартным методикам не удалось из-за низкой растворимости частично
защищенных интермедиатов реакции. В этих случаях полное удаление защитных групп было достигнуто после повторного гидрогенолиза.
Синтез олигосахаридов 19-21, построенных из чередующихся (1—>3)- и (1—>4)-связанных а-ь-фукопиранозных остатков, был осуществлен аналогично рассмотренным выше схемам. В качестве основного предшественника был использован дисахарид 45 (Схема 6). Удаление всех защитных групп и восстановление аллильной группы до пропильной в этом соединении приводили к незащищенному дифукозиду 19, а избирательное удаление ацетильной защиты с помощью мягкого кислотного метанолиза позволило получить акцептор 46, содержащий свободную гидроксильную группу при С-3 невосстанавливающего остатка. Для синтеза трихлорацетоимидата 47 в дисахариде 45 первоначально удаляли аллильную защиту действием Р<1С12 в метаноле, а затем полученную смесь полуацеталей переводили в трихлорацетоимидаты в присутствии ССЬСК и ДБУ. Сочетание дисахаридных блоков 46 и 47 осуществлялось в присутствии ТМвСШ1 и приводило к образованию тетрасахарида 48 с выходом 81%. Удаление всех защитных групп в 48, сопровождающееся восстановлением аллильной группы в пропильную, приводило к незащищенному тетрасахариду 20.
Схема 6. i: 2% HCl в МеОН, 70-75%; ii: 1) PdCl2, МеОН, 2 ч; 2) CC13CN, ДБУ, 64-70% на 2 стадии; iii: 0,1М TMSOTf в СН2С12, -30 °С, 81% для 48, 82% для 50; iv: 1) Н2, Pd/C, МеОН-ЕЮАс; 2) 0,5М NaOH, 20 °С, Н20-Ме0Н, 70-73% на две стадии.
Для синтеза гексасахарида 21 в соединении 48 первоначально удаляли ацетильную защиту, а потом полученный тетрасахаридный акцептор 49 гликозилировали трихлорацетоимидатом 47 с образованием гексасахарида 50. Выход соединения 50 составил 81%. Деблокирование 50 приводило к гексасахариду 21 с выходом 70%.
ОАП
О АЛ
Синтез трисахарида 22, незащищенного предшественника гептасульфата 10, был
трихлорацетоимидатом 47 в присутствии ТМБОТ£ Эта реакция приводила к образованию трисахарида 52 с выходом 77% (Схема 7), который далее с помощью гидрогенолиза и дезацетилирования переводили в требуемый трифукозид 22.
Схема 7. i: TMSOTf; -40 °С, 3 ч, 77%; ii: 1) Н2, Pd/C, МеОН-ЕЮАс, 20°С, 5 ч, 2) NaOH, MeOH-HiO, 20°С, 24 ч, 75%.
3. Исследование исчерпывающего сульфатирования свободных олигофукозидов комплексом SO3 в присутствии трифторметансульфоновой кислоты (ТГОН). Наиболее широко используемый в настоящее время метод сульфатирования олигосахаридов заключается в обработке полиола комплексом PySCh в апротонном растворителе при комнатной или повышенной температуре. Этот метод был нами успешно использован для синтеза сполна сульфатированных дисахаридов 1 и 11. Однако для получения более крупных соединений этот метод оказался неэффективным. Так, сульфатирование тетрасахарида 14 указанным выше способом приводило лишь к смеси частично сульфатированных производных (Таблица 2, опыт 1). Достичь исчерпывающего сульфатирования также не удалось и при проведении реакции при повышенной температуре в течение 3 суток (опыты 2-5) с использованием различных сульфатирующих реагентов и растворителей. При обработке тетрасахарида 14 хлорсульфоновой кислотой (5,0 экв. на ОН-группу, пиридин, 20 °С, 24 ч.), которая используется в качестве сульфатирующего агента, также наблюдалось неполное сульфатирование (опыт 6), прежде всего, пространственно затрудненных гидроксильных групп при С-4.
Мы предположили, что добавление сильной кислоты в реакционную смесь при сульфатировании комплексом SO3 приведет к высвобождению свободной частицы SO3 из комплекса с амином, что увеличит эффективность сульфатирования. Нами было
осуществлен гликозилированием аллил-фукозида 51 дисахаридным
BzO илс
47
исследовано действие комплекса Е^ЫБОз (5,0 экв. на ОН-группу) в ДМФА на тетрасахарид 14 в присутствии трифторметансульфоновой кислоты (ТЮН) (0,3-1,0 экв. на ОН-группу) при 0 "С. Так, при использовании ТЮН в количестве 1,0 экв. на ОН-группу нам удалось получить сполна сульфатированное производное 2 (опыт 7), с выходом 77%.
Таблица 2. Результаты сульфатирования тетрасахарида 14 в различных условиях.
ОРг ОРг
Ме-/
мо 9 мао3зо 9
Ме-Т~- 0-7 Ме~7~~-о-7 он
НО 9 1) сульфатирование МаО^О О 2) ионный обмен (N3*) Ме"7 0^7
НО 9 ЫаОзБО ?
1 ПИ .. _ _ 1 пспль
ЫаОзвб О^э^а
Опыт ТСС) Время (ч) Сульфаггирующий реагент Результат реакции
1 20 1 РуБОз, ДМФА частичное сульфатирование
2 55 72 Ру50з, пиридин частичное сульфатирование
3 55 72 Ру50з, ДМФА-пиридин (3:1) частичное сульфатирование
4 55 72 Ру-БОз, ДМФА деструкция гликозидных связей
5 55 72 Е13№503, ДМФА частичное сульфатирование
6 20 24 ОБОзН, пиридин частичное сульфатирование
7 0 24 ЕКМ-БОз, ДМФА, +ТЮН продукт 2
Все целевые соединения были получены в виде натриевых солей, для этого реакционную смесь обрабатывали водным раствором ЫаОН при рН 11. Выделение высокосульфагтированных углеводов осуществлялось методом гель-проникающей хроматографии на геле 0-15 в воде.
Строение соединения 2 подтверждалось данными ЯМР и масс-спектрометрии. Так, спектр 'Н ЯМР соединения 2 содержал только один набор сигналов, причем все сигналы Н-2 и Н-4 располагались в более слабом поле, чем в исходном тетрасахариде 14 (Н-2: 3,793,95 м.д. для 14, 4,51-4,61 м.д. для 2; Н-4: 3,82-4,06 м.д. для 14, 4,89-4,97 м.д. дм 2). Сильный слабопольный сдвиг, связанный с введением сульфогруппы, наблюдался и для Н-3 концевого остатка фукозы (3,93 м.д. для 14, 4,82 м.д. для 2), в то время как сдвиги Н-3, находящихся при межзвеньевых связях, оказались незначительными (3,934,10 м.д. для 14, 4,28-4,37 м.д. для 2). Максимальный сигнал в масс-спектре соединения 2, при регистрации отрицательно заряженных частиц, соответствовал двухзарядному
молекулярному иону ([М-2Ыа]2': найдено - 757,8814, вычислено - 757,8792), соответствующему ожидаемой структуре нонасульфата 2.
4. Изомеризация терминального фукопиранозного остатка в фуранозный -побочная реакция сульфатирования. Условия, использованные для синтеза сульфатированного тетрасахарида 2, оказались непригодными для получения более крупных полисульфатированных олигофукозидов. Это было показано на примере гексасахарида 3 и окгасахарида 4. Так, при сульфатировании соответствующих предшественников 15 и 16 в присутствии ТГОН образовывалась сложная смесь продуктов, а увеличение количества кислоты лишь способствовало изменению соотношения продуктов реакции. Это потребовало более детального изучения процесса исчерпывающего сульфатирования олигофукозидов, которое было выполнено на примере дисахарида 13 (Таблица 3).
Сульфатирование соединения 13 комплексом Е1з5\'-50з (5,0 экв. на ОН-группу) в присутствии ТЮН (1,0 экв. на ОН-группу) в безводном ДМФА при 0 °С протекало гладко с образованием только одного пентасульфата 1 с выходом 77% (опьгг 1). Однако увеличение количества кислоты (2,0 экв. на ОН-группу) приводило к образованию смеси соединений 1 и 53 в соотношении 3,1 : 1 (опыт 2), которое устанавливалось интегрированием соответствующих сигналов пропильной группы в спектре !Н ЯМР. Увеличение времени реакции до 7 дней способствовало увеличению образования неожиданного продукта 53, соотношение 1:53 составляло 1 :2,3. В этом случае
Таблица 3. Результат сульфатирования дисахарида 13 в присутствии различных количеств ТЮН.
Ме
у ' 1 1~0Е03На
НГ ¿ 1) Е13Ы-503 (5.0 зга, на ОН^рулпу) О
Т(ОН. ДМ«А,0»С Ме-Г~~о-7 _ J
_ ОБОзМа
О'
Мб'
но °н .....* МаОзЭО ОЗОзНа
п
ОвОзМа
Опыт Количество ТЮН (экв. на ОН-группу) Время (ч) Продукты Выход 1+53 (%)
1 1.0 24 1 77
2 2.0 24 1:53 = 3,1 : 1 82
3 2.0 186 1:53=1:2,3 + распад
наблюдалось также образование продуктов частичной деградации дисахаридов (опыт 3). Сульфатирование при комнатной температуре сопровождалось разрушением гликозидных связей и удалением пропильной группы.
Сигналы 'Н и 13С ЯМР, относящиеся к терминальному остатку дисахарида 53, имели характерные для 2,5-дисульфатированного фукофуранозного звена химические сдвиги и КССВ. Подробное обсуждение спектральных данных и структуры терминального остатка приведено ниже для гомологичного тетрасахарида 54.
Образование побочного продукта 54 протекало более легко в случае сульфатирования тетрасахарида 14 (Схема 8). Так, при обработке олигофукозида 14 с Е1зЫ 50з (5,0 экв. на ОН-группу) и ТГОН (2,0 экв. на ОН-группу) в течение 48 часов образовывался только 54 (выход 71%).
Соединение 54 было детально изучено методами ЯМР и масс-спектрометрии. Было установлено, что терминальное звено олигосахаридной цепи представляет собой 2,5-дисульфатированный а-Ь-фукофуранозный остаток. Это подтверждалось характерными для фукофуранозы сигналами Н-4 (4,02 м.д., т) и С-4 (83,9 м.д.) в спектрах *Н и 13С ЯМР (см. Таблгщу 4). Кроме того, наличие 5-членного цикла подтверждалось корреляцией между сигналами Н-1 и С-4, а также С-1 и Н-4 в эксперименте НМВС ЯМР. Пространственная сближенность Н-4 и Н-2 подтверждалась в экспериментах по ЯЭО. Сигнал молекулярного иона в Н51-М8 так же соответствовал формуле 54.
о
и
мо о
0-7
1 пн
НО О
1) В3№503 (5.0 эи. та ОН-группу)
ТГОН (2.0 эк. на ОН-группу) ДМФА, О °С, 48 ч
2) МаОН, НгО
-СьО.Ыи
А 0РГ
¿ОЭОзЫа
МаОзЭО О
'■"7 ° / „
>7 0-7
14 п=2
15 п=4
16 п—6
54 п - 2 71*
55 п =4 74%
56 п = 6 63%
Схема 8. Продукты 54-56, образующиеся при сульфатировании 14-16 в присутствии ТЮН.
Гексасахарид 15 и октасахарид 16 были полностью переведены в соответствующие сполна сульфатированные производные 55 и 56, содержащие фуранозный остаток, под действием Е1зМ-50з (5,0 экв. на ОН-группу) и ТЮН (2,0 экв. на ОН-группу) в течение 48 часов. Их спектры были аналогичны спектру тетрасахарида 54 и содержали сигналы,
характерные для терминального 2,5-дисульфатированного а-Ъ-фукофуранозного остатка (см. Таблицу 4), а также сигналы невосстанавливающих фукопиранозных остатков.
Таблица 4. Избранные данные ЯМР-спектров для тетрасахаридов 2 и 54. Структура Избранные данные ЯМР-спектров
Ио-Т—О-У'
N»0^0 ^ !
6Ме
5(-0303Ыа
,ОРг
Усзо^кв
Н-1 Н-2 н-з Н-4 Н-5 Н-6 0-СЯ2-Е1
5,21 4,52 4,28 4,90 4,22 1,30 3,55; 3,63
С-1 С-2 С-3 С-3 С-5 С-6 0-СН2-Е1
97,4 76,2 76,1 81,3 68,3 17,0 71,9
■Лы.Н-2 •/Н-4.Н-5 Л-4.Н-1 •/с-1,н-4 •Л^ды Л:-1,н-5
3,4 Нг ~ 1Нг - - 6,9 Нг -
Н-1 Н-2 н-з Н-4 Н-5 Н-6 0-СЯ2-Е1
5,23 4,77 4,43 4,02 4,61 1,45 3,47; 3,82
С-1 С-2 С-3 С-3 С-5 С-6 0-СН2-Е1
101,2 81,6 81,2 83,9 78,6 18,0 71,8
•Лы.Н-2 л|ч. Н-5 ■Лм. н-1 </с-1, Н-4 /с-5. Н-1 ^С-1. Н-5
4,4 Нг 6,0 Нг 7,0 Нг 3,2 Нг
Наблюдаемая необычная перегруппировка фукопиранозного остатка в фукофуранозный с сохранением конфигурации пропильного агликона относится к тем немногочисленным реакциям в химии углеводов, где эндо-циклическая связь С(1)-0(5) разрывается, а последующая рециклизация приводит к образованию новой 0(4)-С(1) связи. Обычно кислотно-катализируемые трансформации пиранозного цикла протекают неселектвно и сопровождаются как разрывом эжЭо-циклической связи С(1)-0(5), так и экзо-циклической С(1)-0(1), что приводит к образованию сложной смеси продуктов. В настоящее время данная реакция исследуется нами более детально на примере других углеводных соединений.
5. Промотирование реакции сульфатирования различными кислотами.
Получение сполна сульфатированного гексасахарида 3 с неизмененным терминальным остатком при промотируемом ТГОН сульфатаровании олигофукозида 15 было невозможно из-за образования побочного продукта 55. Мы предположили, что варьирование природы промотирующей кислоты и ее количества позволит увеличить выход необходимого продукта 3. Использование хлорсульфоновой кислоты (1,0 экв. на ОН-группу) также приводило к практически чистому соединению 55 с выходом 83% (Таблица 5, опыт 1). Использование серной кислоты и эфирата трехфтористого бора
(ПРз^О) в количестве 1,0 зкв. на ОН-группу было неэффективным и приводило к образованию смесей частично сульфатированных гексасахаридов (опыты 2 и 3). Требуемый продукт 3 удалось получить с использованием более слабой трифторуксусной кислоты (ТТА). Так, при добавлении в реакционную смесь ТБА в количестве 1,0 экв. на ОН-группу образовывалась смесь 3 и 55 в соотношении 5 : 1 (опыт 4). Однако при снижении количества промотирующей кислоты до 0,5 экв. на ОН-группу был получен чистый гексасахарид 3 (опыт 5).
Таблица 5. Исследование сульфатирования гексасахарида 15 комплексом Е1зМБ0з (5,0 экв. на ОН-группу) в ДМФА при промотировании различными кислотами.
Опыт Кислота Количество кислоты (экв. на ОН-группу) Продукты Выход (%)
1 C1S03H 1,0 55 83
2 H2SO4 1,0 Смесь частично сульфатированных продуктов
3 BF3Et20 1,0 Смесь частично сульфатированных продуктов
4 TFA 1,0 3:55-5:1 73
5 TFA 0,5 3 76
Условия реакции из опыта 5, разработанные для получения гексасахарида 3, были успешно использованы и дня получения и более крупных сульфатированных производных - окгасахарида 4 (выход 78%), додекасахарида 5 (выход 72%) и гексадекасахарида 6 (выход 78%) (Схема 9).
ОРг ОРг
нп О .. _ Г '
н0 ? 1 , to03SÖ О
\ 1)Et3NSOj(5.0aK.naOmpynny) I
ТРА(0,5эьнаОН-фугпу) "piS/c
но О п ДМФА. О "С. 24 ч [to03S0 О
О он ____I
OSOjMa
OS03Na
Na03SÖ ÖS03Na
15 n=4 3 n=4 76%
16 n=6 4 n - 6 78%
17 n=10 5 n = 10 72%
18 n=14 б n = 14 78%
Схема 9. Исчерпывающее сульфатирование олигосахаридов 15-18 в присутствии трифторуксусной кислоты.
б. Сульфатирование олигофукмидов с а-(1-»4)- и а-(1-»2)-связашшми остатками. На следующем этапе работы было изучено исчерпывающее сульфатирование олигофукозидов, построенных из чередующихся а-(1—>4)- и а-(1—>3)-связшшых фукозных
остатков (Таблица 6). Обе описанные выше методики, как с использованием ТЮН, так и ТРЛ, приводили к одинаковым результатам. В обоих случаях при сульфатировании тетрасахарида 19 наблюдалось образование единственного пентасульфата 7 с выходами 80% и 83%, соответственно (опыты 1 и 2). В ходе экспериментов не наблюдалось перегруппировок пиранозных остатков из-за наличия заместителя при 0-4 восстанавливающего остатка. Таким образом, для сульфатирования тетрасахарида 20 и гексасахарида 21 были выбраны условия из опыта 2 с ТГОН. Обработка незащищенных олигосахаридов 5-кратным избытком комплекса Н^К БОз и ТЮН (1,0 экв. на ОН-грулпу) приводила к сульфатированным производным 8 и 9 с выходами 84% и 83%, соответственно.
Таблица 6. Исчерпывающее сульфатирование олигосахаридов 19-21 комплексом Е1зМ БОз (5,0 экв. наОН-группу) в ДМФА при промотировании кислотами.
о
I ПН
М
1 пи
Ме-НО О
Ме-
НО он
О ОН ОН
ОРг ОН
1) Е13И-503 (5.0 э«. на ОН-фуппу) ТЮН (1.0 эк. на ОНчруппу) ДМФА, О °С, 24 ч
2) ЫаОН, НгО
игг \e-p~0-j
I ПСП.М»
Ме'
I п Ыа03$0 9
Ме"7~-0'7
7^0-7 „
и
19 п=0
20 п=1
21 п=2
7 п=0 а п—1
» п=2
Опыт Исходный олигосахарид Кислота Количество кислоты (5 экв. на ОН-группу) Продукт Выход (%)
1 19 ТИА 0,5 7 83
2 19 ТГОН 1,0 7 80
3 20 ТГОН 1,0 8 84
4 21 ТЮН 1,0 9 83
Затем было изучено исчерпывающее сульфатирование трисахарида 22, построенного только из (1->4)-а-связанных фукопиранозных остатков (Схема 10). В этом случае (Е[зМ-50з, 5,0 экв. на ОН-группу и ТЮН, 1,0 экв. на ОН-группу) происходило успешное образование требуемого продукта 10 без побочных реакций. (1->2)-Связанные дисахариды 23 и 24 были также переведены в сполна сульфатированные производные 11 и 12 обработкой комплексом Е13М-80з (5,0 экв. на ОН-группу) и ТГОН (1,0 экв. на ОН-группу) с выходами 72% и 85% соответственно.
OPr
О OR
Мв-7~- <} °РГ
¿-r-^Z-OR Ме-7—0-7
У^ лгъ»
/22 R = Н . / 23 R = H
MO R = S03Na 75% Ml R = S03Na 72%
Схема 10. Исчерпывающее сульфатирование олигосахаридов 22-24 в присутствии TfOH. i: 1) Et3N-S03 (5,0 экв. на ОН-гр.), ТЮН (1,0 экв. на ОН-гр.), ДМФА, 0 °С, 24 ч 2) NaOH, Н20.
7. Исследование антикоагулянтной активности синтезированных соединений.
Как было отмечено выше, фукоиданы проявляют антикоагулянтную активность, то есть обладают способностью влиять на систему гемостаза. Это открывает перспективы создания высокоэффективных антикоагулянтных препаратов, в том числе и на основе синтетических олигосахаридов, родственных фукоиданам. Кроме того, учитывая высокую сложность системы свертывания крови, разработка препаратов с другими типами активностей (например, противовоспалительная или антиадгезивная) также требует обязательного определения профиля антикоагулянтных свойств.
Способность высокосульфатированных олигосахаридов проявлять антикоагулянтную активность связана с возможностью ингибирования ими ключевых факторов каскада свертывания крови, таких как На (тромбин) и Ха. Ингибиторное действие сульфатированных олигосахаридов на эти факторы опосредовано серпинами (например, антитромбином III, гепарин-кофактором II), которые в комплексе с углеводами связываются с факторами коагуляции, замедляя тем самым процесс образования фибринового сгустка
Для выявления профиля антикоагулянтных свойств синтезированных олигосахаридов было изучено их действие на каскад коагуляции, а также специфичное ингибирование факторов На и Ха в плазме и в «чистых» системах. На первом этапе влияние синтетических олигосахаридов 2-6, 8-9, 54-56 на процесс свертывания крови изучали с использованием общепринятого in vitro теста активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) (Таблица 7). Этот тест позволяет оценить совокупное влияние антикоагулянта на активность факторов свертывания крови «внутреннего» пути. Реализация этого пути свертывания происходит при контактной активации фактора XII соединениями с отрицательно заряженной поверхностью (в
ОРг
Ме-т—-0-V
гТм
RO OR U-o-^T-COONa OR
,24R = H
M2 R = S03Na 85%
тестовых системах используют каолин, целлит, эллаговую кислоту и т.д.). Целевые соединения, содержащие менее чем четыре углеводных остатка, не проявляли значительной актикоагулянтной активности в данном тесте, поэтому далее не рассматривались. Иигибирующая активность веществ была выражена величиной 2АЧТВ -эффективной концентрацией соединения, необходимой для увеличения времени образования сгустка в два раза относительно контроля.
Таблица 7. Значения 2АЧТВ (мкг/мл) серии синтетических олигосахаридов 2-6,8-9,54-56.*
Тип цепи 4-сахариды 6-сахариды 8-сахариды 12-сахарид 16-сахарид
[-а-Ь-Рис-(1—>3)-] 2 30,5±3,5 3 6,3+1,1 4 2,86±0,10 5 3,00+0,47 6 2,77±0,32
[-а-Ь-Рис-( 1 -»3)-]* * 54 22,9±4,7 55 5,9±1,1 56 2,95+0,25
[-а-Ь-Рис-(1—>3)- 8 9
-а-Ь-Рис-(1—>4)-] 14,9+2,1 4,8±1,4
* Значение 2АЧТВ для фукоидана из Ь. ¡ассИагта составляет 2,31±0,43 мкг/мл. ** Содержит а-Ь-фукофуранозный восстанавливающий остаток
Полученные данные позволяют сделать вывод, что среди рассматриваемых структур антикоагулянтная активность в тесте АЧТВ в первую очередь зависит от длины цепи, в то время как тип цепи и структура терминального остатка влияют несущественно. Это подтверждается близкими величинами 2АЧТВ для изомерных тетрасахаридов 2, 54 и 8, гексасахаридов 3, 55 и 9, октасахаридов 4 и 56. Среди тетрасахаридов наибольшую активность проявлял фукозид 8, построенный из чередующихся (1—»4)- и (1—>3)-связанных фукозных остатков (14,9±2,1 мкг/мл). Немного менее активным оказался тетрасахарид 54, содержащий терминальный а-Ь-фукофуранозный остаток (22,9±4,7 мкг/мл). Еще слабее ингибировал коагуляцию крови тетрасахарид 2 (30,5±3,5 мкг/мл). Изомерные гексасахариды 3, 55, 9 были в 3-5 раз более активны (4,8 - 6,3 мкг/мл), чем соответствующие тетрасахаридные производные. Следует отметить, что различие в активности среди гексасахаридов 3, 55 и 9 не выходило за пределы статистической достоверности результатов.
Переход от гекса- к окгасахаридам также приводил к увеличению активности более чем в 2 раза: для изомерных соединений 4 и 56 величины 2АЧТВ были близки и составляли 2,86+0,10 и 2,95±0,25 мкг/мл соответственно. Интересно отметить, что дальнейшее удлинение углеводной цепи не приводило к увеличению активности:
величины 2АЧТВ для октасахаридов 4 и 56, додекасахарида 5 (3,00±0,47 мкг/мл) и гексадекасахарида 6 (2,77±0,32 мкг/мл) были близки, а различие не выходило за пределы доверительного интервала. Отметим, что антикоагулянгная активность, достигнутая для олигосахаридов, содержащих более 8 моносахаридных звеньев, приближалась к активности фукоидана из водоросли L. saccharina (2АЧТВ = 2,31±0,43 мкг/мл).
Специфическую анти-Ха антикоагулянтную активность образцов определяли in vitro по ингибированию фибриногенсвертывающей активности этого фактора в плазме крови человека с использованием стандартного набора реактивов РеаКлот. В качестве стандарта использовался низкомолекулярный гепарин (НМГ, активность - 168 Ед. аХа/мг). Активность синтетических олигосахаридов 2-6, 8-9, 54-56, выраженная в гепариновых единицах, приведена в Таблице 8.
Изучаемые соединения проявляли невысокую анти-Ха активность, которая монотонно возрастала при увеличении молекулярной массы, причем, в отличие от активности в тесте АЧТВ, рост ингибирующей способности не останавливался на октасахариде. Так, изомерные тетрасахариды 2, 54 и 8 проявляли практически одинаковую невысокую активность (0,26-0,34 аХа Ед./мг), в то время как гексасахариды 3, 55 и 9 были примерно в 5 раз более активны (1,42-1,79 аХа Ед./мг). Дальнейший рост активности был примерно пропорционален молекулярной массе и достигал 5,ЗОЮ,61 аХа Ед./мг для гексадекасахарида 6, который был в 2 раза менее активен, чем фукоидан из водоросли L. saccharina (9,98+1,11 аХа Ед/мг) и в 32 раза менее активнее стандарта низкомолекулярного гепарина (НМГ, 168 Ед. аХа/мг).
Таблица 8. Значения анти-Ха (аХа Ед./мг) серии синтетических олигосахаридов 2-6, 8-9,54-56, определенные методом РеаКлот.*
Тип цепи 4-сахариды 6-сахариды 8-сахариды 12-сахарид 16-сахарид
t-a-L-Fuc-(l—3)-] 2 0,25+0,06 3 1,63±0,37 4 2,81+0,60 5 4,15+0,20 6 5,30+0,61
[-a-L-Fuc-(l—»3)-]** 54 0,34+0,05 55 1,42±0,35 56 2,30±0,31
[-a-L-Fuc-(l—>3)- 8 9
-a-L-Fuc-(l—>4)-] 0,26±0,03 1,79±0,11
* Значение анти-Ха активности фукоидана из L saccharina составляет 9,98±1,11 Ед./мг.
** Содержит cc-L-фукофуранозный восстанавливающий остаток.
Анти-Па антикоагулянтную активность образцов определяли in vitro по ингибированию фибриногенсвертывающей активности тромбина (На) в плазме крови
человека. При этом использовалась стандартная методика определения тромбинового времени в присутствии различных количеств исследуемых антикоагулянтов. Предварительные эксперименты выявили схожую активность для изомерных олигосахаридов, поэтому в дальнейшем подробно была изучена только серия (1->3)-связанных олигосахаридов 1-6. В качестве стандарта использовался низкомолекулярный гепарин (НМГ, активность - 174 Ед. alla/мг). Активность синтетических олигосахаридов 2-6, выраженная в гепариновых единицах, приведена в Таблице 9.
Таблица 9. Значения анти-Па (alla Ед./мг) серии синтетических олигосахаридов 2-6 и определенная по влиянию ингибиторов натромбиновое время (ТВ).*
Тип цепи 4-сахарид 6-сахарид 8-сахарид 12-сахарид 16-сахарид
2 3 4 S 6
[-a-L-Fucp-( 1 —>3 )-]
<1,0 <1,0 2,68+0,37 8,64+1,23 12,27+1,71
* Значение анти-Иа активности фукоидана из L. saccharina составляет 25,43±3,56 Ед./мг.
Анти-Иа активность изученных образцов резко возрастала при увеличении длины углеводной цепи. Так тетра- и гексасахариды 2 и 3 практически не оказывали влияния на тромбиновое время, их активность в пересчете на гепариновые единицы составляла менее 1 Ед. alla. Существенно лучше замедлял сгусткообразование плазмы под действием тромбина октасахарид 4, его активность составила 2,68±0,37 Ед. alla. В три раза более эффективными ингибиторами оказались додекасахарид 5 (активность анти-На - 8,64±1,23 Ед. alla) и гексадекасахарид 6 (активность анти-На - 12,27±1,71 Ед. alla). Фукоидан из бурой водоросли L. saccharina был приблизительно в два раза более активен, чем гексадекасахарид, и его активность в этом тесте составила 25,43±3,56 Ед. alla/мг.
Помимо вышеописанных коагулометрических методов, основанных на изменении времени образования фибринового сгустка в плазме крови человека, антикоагулянтная активность синтезированных соединений была изучена в амидолитических тестах без использования такой сложной многокомпонентной смеси, как плазма. Эти методы основаны на способности факторов коагуляции расщеплять синтетический хромогснный субстрат, представляющий собой специфичную олигопептидную последовательность, содержащую на С-конце л-нитроанилин. Протеазная активность факторов определяется по скорости высвобождения свободного л-нигроанилина, которая фиксируется фотометрически. Определение ферментативной активности факторов Па и Ха осуществлялось в присутствии сериина - антитромбина III. В качестве стандарта использовался низкомолекулярный гепарин (НМГ) с анти-На активностью 174 Ед. alla/мг и с анти-Ха активностью 248 Ед. аХа/мг.
Все синтезированные соединения практически не оказывали влияния на активность фактора На (<0,1 Ед. а11а/мг), а способность ингибировать фактор Ха была на 1-2 порядка ниже, чем соответствующая величина, измеренная коагулометрическим методом, и не превышала 0,3 Ед. аХа/мг. В случае олигосахаридов 8 и 9, построенных из чередующихся (1—>4)- и (1—^-связанных а-Ь-фукопиранозных остатков, корректное определение активности было затруднено опалесценцией пробы при высоких концентрациях ингибитора. Существенное отличие амидолитической активности по сравнению с коагулометрическими определениями свидетельствует о том, что изучаемые олигофукозиды осуществляют свою активность посредством не антитромбина III, а с помощью других серпинов, содержащихся в плазме.
Выводы
1. Впервые осуществлен синтез сполна сульфатированных олигосахаридов 2-10 и 12, родственных фрагментам фукоиданов, различающихся типом гликозидных связей и длиной цепи.
2. Разработана эффективная блочная схема синтеза олигофукозидов, построенных из (1-»3)-связанных фукопиранозных остатков с использованием ди- и тетрасахаридных тиогликозидных доноров 29 и 32.
3. Разработан эффективный метод исчерпывающего сульфатирования крупных олигосахаридов комплексом Е1зК БОз в ДМФА в присутствии протонных кислот (ТГОН, ТРА).
4. При изучении промотируемого кислотой сульфатирования (1-»3)-связанных олигофукозидов обнаружена необычная перегруппировка восстанавливающего фукопиранозного остатка в фукофуранозный с сохранением пропильного агликона.
5. Проведено определение базовых антикоагулянтных характеристик синтезированных сполна сульфатированных олигофукозидов 2-6, 8-9, 54-56, и показано, что способность синтетических олигосахаридов ингибировать внутренний путь свертывания крови, а также блокировать действие факторов коагуляции На и Ха существенно возрастает при увеличении длины цепи.
Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях*:
1. N.E. Ustyuzhanina, V.B. Krylov, A.A. Grachev, A.G. Gerbst, N.E. Nifantiev. Synthesis, NMR and conformational studies of fucoidan fragments 8: convergent synthesis of branched and linear oligosaccharides II Synthesis 2006,23,4017-4031.
2 V.B. Krylov, N.E. Ustyuzhanina, A.A. Grachev, N.E. Nifantiev. Efficient acid-promoted per-O-sulfation of organic polyols II Tetrahedron Lett., 2008, 49, 5877-5879.
3. N.E. Ustyuzhanina, V.B. Krylov, A.I. Usov, N.E. Nifantiev. Synthesis of fucoidan fragments in Progress in the synthesis of complex carbohydrate chains of plant and microbial polysaccharides, N.E. Nifantiev Ed„ Research Singpost and TRN, ISBN 978-81-7895-424-0, 2009, 131-154.
4. В.Б. Крылов, H.A. Ушакова, H.E. Устюжанина, М.Е. Преображенская, Д.В. Яшунский, Д.Е. Цветков, В.М. Меньшов, Г.В.М. Шарма, П. Радха Кришна, Н.Э. Нифантьев. Исследование сульфатированных производных полигидроксильных соединений в качестве ингибиторов свертывания крови II Язе РАН сер. хим., 2010, 1, 228-231.
5. V.B. Krylov, N.E. Ustyuzhanina, A.A. Grachev, N.E. Nifantiev. Acid promoted method for per-O-sulfation of organic polyols // 6-th International Congress of Young Students «YoungChem 2008», Краков, Польша, 15 - 19 октября, 2008. Сборник тезисов докладов, с. 119.
6. В.Б. Крылов, Н.Е. Устюжанина, Н А. Ушакова, Н.Н. Дрозд, В.А. Макаров, М.Е. Преображенская, Н.Э. Нифантьев. Синтез и антикоагулянтная активность сполна сульфатированных производных олигофукозидов и природных полифенолов // VII всероссийская конференция с молодежной научной школой «Химия и медицина, Орхимед-2009», Уфа, 1 - 5 июля, 2009. Сборник тезисов докладов, Уфа, 2009, с. 52-53.
7. V.B. Krylov, N.E. Ustyuzhanina, A.A. Grachev, N.E. Nifantiev. Unusual rearrangement of a pyranoside residue into furanoside one under acid-promoted sulfation of large oligofucosides II 15-th European carbohydrate symposium, «EuroCarb», Вена, Австрия, 19-26 июля, 2009. Сборник тезисов докладов, с. 338.
8. В.Б. Крылов, Н.Е. Устюжанина, Н.Н. Дрозд, Н.А. Ушакова, М.Е. Преображенская, В.А. Макаров, Н.Э. Нифантьев. Синтез и антикоагулянтная активность полисульфатированных линейных олигосахаридов, родственных фукоидану из водоросли Laminaria saccharina II Всероссийская конференции по органической химии, посвященной 75-летию со дня основания Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, Москва, 25-30 октября, 2009. Сборник тезисов докладов. М., 2009, с. 239.
9. V.B. Krylov, N.E. Ustyuzhanina, A.A. Grachev, N.E. Nifantiev. Synthesis of large fucoidan fragments - potential inhibitors of microbial adhesion // 4-th Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates, Хиитиэле, Финляндия, 19 - 22 сентября, 2010. Сборник тезисов докладов, с. 50.
* V.B. Krylov, Z.M. Kaskova, D.Z. Vinnitskiy, N.E. Ustyuzhanina, A.A. Grachev, A O. Chizhov, N.E. Nifantiev. Acid-promoted total sulfation of fucoidan fragments // рекомендована для печати в Carbohydr. Res.
Подписано в печать:
27.10.2010
Заказ № 4382 Тираж -150 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru
Часть 1. Введение 5 Часть 2. Литературный обзор
Синтез низкомолекулярных углеводных миметиков гепарина»
2.1. Введение: строение и функции гепариноидов '
2.2. Синтез фрагментов гепарина
2.2.1. Синтез АТШ-связывающейся пентасахаридной последовательности
2.2.2. Блочный синтез фрагментов гепариноидов
2.3. Синтез метилированных миметиков гепариноидов
2.3.1. Общая характеристика метилированных миметиков
2.3.2. Синтез метилированных аналогов ключевого пентасахарида
2.3.3. Синтез крупных метилированных миметиков гепарина
2.4. Высокосульфатированные олигосахариды, как миметики гепариноидов
2.4.1. Сульфатированный фосфоманнан PI-88 - ингибитор гепараназы
2.4.2. Синтез сульфатированных олигосахаридов с противовирусной активностью
2.4.3. Синтез сульфатированных олигосахаридов обладающих анти-пролиферативной активностью
2.4.4. Спейсерные олигосахариды
2.4.5. Фукоиданы, как миметики гепаринов 45 Часть 3. Обсуждение результатов
3.1. Целевые соединения
3.2. Синтез несульфатированных предшественников 13
3.3. Исследование исчерпывающего сульфатирования полиолов комплексом S03 в присутствии трифторметансульфоновой кислоты
3.4. Изомеризация терминального фукопиранозного остатка в фуранозный - побочная реакция сульфатирования
3.5. Промотирование реакции сульфатирования различными кислотами
3.6. Сульфатирование олигофукозидов с а-(1—И) и а-(1—>2)-связанными остатками
3.7. Исследование антикоагулянтной активности 67 Часть 4. Выводы 74 Часть 5. Экспериментальная часть 75 Часть 6. Приложение 97 Часть 7. Список литературы '
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
Ас - ацетил АН - аллил Вп - бензил Bu - бутил
CAN - аммоний-церий (1У)-нитрат CSA - (±)-камфор-10-сульфоновая кислота DMAP - 4-диметиламинопиридин DS - декстран сульфат
ESI-MS - масс-спектр, ионизации в электроспрее Et - этил
FGF-1,2 - факторы роста фибробластов 1,
FGFR-1,2 - рецепторы факторов роста фибробластов 1,
Fue - фукоза
Glc — глюкоза
GlcA — глюкуроновая кислота GlcNAc — N-ацетилглюкозамин Ido - идоза
IdoA - идуроновая кислота
Lev - левулиноил (СН3С(0)СН2СН2С(0)-)
Me - метил
MS - молекулярные сита NBS — N-бромсукцинимид NIS - N-иодсукцинимид PF4 - тромбоцитарный фактор 4 Ph - фенил
МВп — иора-метоксибензил Рг - пропил Ру - пиридин
TBAF — тетрабутиламмоний фторид ТВ S — mpem-бутилдиметил силил
TES - триэтилсилан
Tf - трифторметилсульфонил
TFA - трифторуксусная кислота
TMS - триметилсилил
Toi -толил
Ts - л-толуолсульфонил - Z - карбоксибензил ATIII - антитромбин Ш
АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время
ГАГ - гликозаминогликаны
ДБУ - 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен
ДМСО - диметилсульфоксид
ДМФА - NjN-диметилформамид
КССВ — константа спин-спинового взаимодействия
НМГ - низкомолекулярный гепарин
ТГФ - тетрагидрофуран
ЭА - этилацетат
ПЭ - петролейный эфир
Часть 1.
Сульфатированные полисахариды играют важную роль в организме млекопитающих благодаря их способности образовывать прочные ионные контакты с различными белковыми рецепторами [1,2]. Например, полианионные гликозаминогликаны (ГАГ) участвуют в таких физиологических процессах, как свертывание крови, развитие воспаления, ангиогенез, адгезия клеток, распознавание вирусами клеток хозяина и других [3,4].
Среди практически доступных природных полисахаридов значительный интерес вызывают фукоиданы из бурых водорослей благодаря их способности воздействовать на широкий ряд физиологических процессов в организме млекопитающих. По-видимому, отдельные участки полисульфатированных цепей фукоиданов способны выступать в качестве миметиков природных лигандов белковых рецепторов (в том числе лигандов относящихся к ГАГ), обуславливая тем самым, например, противовоспалительную активность, оказывая антикоагулянтное и антиангиогенное действие, блокируя бактериальную и вирусную адгезию [5-8].
Цепи фукоиданов построены преимущественно из остатков а-Ь-фукопиранозы и могут содержать сульфатные и ацетильные группы, а также различные углеводные заместители (остатки глюкуроновой кислоты, ксилозы, маннозы) [9]. Важнейшей характеристикой фукоиданов, определяющей спектр проявляемой биологической активности, является степень сульфатирования, среднее значение которой чаще всего лежит в пределах от 0,5 до 1,5 сульфатных групп на фукозный остаток. Показано, что фукоиданы с высокой степенью сульфатирования проявляют антикоагулянтную активность, по величине сравнимую с действием гепарина. В связи с этим разработка эффективных схем синтеза олигосахаридов, отвечающих крупным высокосульфатированным фрагментам фукоиданов, представляется актуальной задачей. Синтетические олигосахариды [10] являются ценными модельными соединениями для выявления взаимосвязи структуры и свойств этих полисахаридов. Кроме того, их спектральные (ЯМР) данные необходимы для конформационного анализа углеводных цепей фукоиданов, а биохимические исследования позволят определить структурные мотивы, ответственные за физиологическую активность. Несмотря на проявляемый интерес к крупным высокосульфатированным фрагментам фукоиданов, их химический синтез представляет собой нетривиальную задачу. Так, исчерпывающее сульфатирование олигофукозидов, содержащих более двух углеводных остатков, весьма затруднительно, что связано с недостаточной полнотой прохождения реакции при использовании стандартных методов сульфатирования [11].
Целью настоящей диссертации является разработка эффективного метода исчерпывающего сульфатирования полигидроксильных соединений и его применение для синтеза серии крупных сполна сульфатированных олигофукозидов, включающих основные структурные типы природных цепей фукоиданов, а также изучение базовых антикоагулянтных характеристик синтезированных образцов в тестах in vitro.
Работа выполнена в лаборатории химии гликоконъюгатов (№52) Института органической химии имени Н.Д. Зелинского РАН. Диссертация состоит из 7 частей: введения, литературного обзора, посвященного синтезу низкомолекулярных углеводных миметиков гепарина, в том числе и основанных на структуре фукоиданов, обсуждения результатов, выводов, экспериментальной части, приложения и списка цитированной литературы.
Нумерация соединений дается арабскими цифрами жирным шрифтом, причем соединения, схемы и таблицы в части 2 "Литературный обзор" и в части 3 "Обсуждение результатов" нумеруются независимо.
Часть 2.
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Синтез низкомолекулярных углеводных миметиков гепарина» 2.1. Введение строение и функции гепариноидов
Сульфатированные полисахариды, относящиеся к гликозаминогликанам (ГАГ), широко распространены в тканях млекопитающих. Гепарин и структурно родственный гепарансульфат, относящиеся к высокосульфатированным ГАГ, представляют собой линейные цепи, построенные из чередующихся остатков гексуроновой кислоты и a-D-глюкозамина, которые связаны между собой (1—>4)-гликозидными связями (Рисунок 1) [12]. Высокая гетерогенность этих полисахаридов обусловлена наличием двух изомерных гексуроновых кислот: ß-D-глюкуроновой и a-L-идуроновой, а также из-за частичного О-, N-сульфатирования и N-ацетилирования полисахаридной цепи.
Гепарин, в отличие от гепарансульфата, характеризуется большим содержанием остатков a-L-идуроновой кислоты и N- и О-сульфатов, кроме того, гепарин содержится только внутри клеток, в то время как гепарансульфат в составе протеогликана экспрессирован в межклеточное пространство. Учитывая структурное подобие гепарина и гепарансульфата, их принято объединять термином «гепариноиды».
За счет структурного разнообразия и высокого отрицательного заряда эти биополимеры способны связываться со многими белками, в том числе и с рецепторами, проявляя тем самым разнообразную биологическую активность [1,4]. Наиболее хорошо изученным примером взаимодействия гепариноидов с белком является специфическое связывание ключевого пентасахаридного фрагмента 2 [13] с антитромбином III (ATIII), белком крови, выполняющим важную регуляторную функцию в процессе гемостаза. Комплекс гепарина с антитромбином Ш (ATIII) способен блокировать ряд ключевых факторов коагуляции крови, обуславливающих образование фибринового сгустка [14]. За счет этого гепарин
1 Гипотетический фрагмент молекулы гепарина
ЛОЛ
ЫНАс
2 Ключевой пентасахаридный фрагмент связывающийся с АТШ
ОБОз"
ГЧНЗОз"
3 Трисахаридный фрагмент связывающийся с РСР-1
ОН 1МН803- ОН
4 Трисахаридный фрагмент связывающийся с Р6Р-2
Рисунок 1. Гепарин и его фрагменты. уже более 70-ти лет применяется в качестве антикоагулянтного препарата для предотвращения тромботических состояний.
Кроме того, в 1991 году было обнаружено, что гепариноиды необходимы для связывания факторов роста фибробластов (РОР-1, РвР-2 и др.) со своими высоко аффинными рецепторами (РОР11-1, БОРЯ-2 и др.) [15]. Это взаимодействие играет важную роль в процессах пролиферации, дифференциации и миграции клеток, а также ангиогенезе при развитии раковой опухоли. Рентгеноструктурный анализ тройного комплекса РОГ-ГОРЯ-гепарин выявил сайты связывания полисахарида, как с фактором роста, так и с его рецептором [16]. Анализ библиотеки различных фрагментов гепариноидов позволил выявить минимальные необходимые трисахаридные фрагменты, ответственные за связывание с РОР-1 3 и РОР-2 4 [17].
Помимо специфичного взаимодействия выделяют и неспецифичные связывания крупных отрицательно заряженных гепариноидов с широким рядом белков. Эти взаимодействия обуславливают роль гепариноидов в развитии воспалительного процесса, метастазировании раковых клеток, заражении вирусами и др. [1, 3].
Такой разнообразный спектр физиологической активности накладывает существенные ограничения на использование природного гепарина и гепарансульфата в качестве терапевтических средств. При использовании гепарина в качестве антитромботического средства часто наблюдается развитие побочных процессов, таких как геморрагия и тромбоцитопения [18, 19]. Кроме того сильный антикоагулянтный эффект нативных гепариноидов не позволяет использовать их в качестве противовоспалительных, противоопухолевых, противовирусных препаратов. Создание низкомолекулярных миметиков гепарина со строго определенной структурой позволяет получить высокоэффективные препараты более узкого биологического действия, снизив тем самым риски побочных процессов [4].
Поиск таких миметиков среди синтетических сульфатированных олигосахаридов является интенсивно развивающимся направлением биохимии углеводов. Рассмотрению основных типов структур и подходов к их синтезу посвящен настоящий обзор.
1. D. R. Coombe and W. С. Kett / Heparan1 sulfate-protein interactions: therapeutic potential through structure-function insights. // Cell. Mol. Life Sci. 62 (2005), p. 410-424, review.
2. J.M. Whitelock, R.V. Lozzo / Heparan sulfate: a complex polymer charged with biological activity. // Chem. Rev., 105 (2005), p 2745-2764, review.
3. R. Lever, C.P. Page / Novel drug development opportunities for heparin. // Nature Reviews Drug Discovery, 1 (2002), p. 140-148, review.
4. V. Pomin / An overview about the structure-function relationship of marine sulfated homopolysaccharides with regular chemical structures. // Biopolymers, 91 (2009), 8, p. 601-609, reveiw.
5. O. Berteau, B. Mulloy / Sulfated fucans, fresh perspectives: structures, functions, and biological properties of sulfated fucans and an overview of enzymes active toward this class of polysaccharide. // Glycobiology, 13 (2003), 6, 29R-40R.
6. P.A.S. Mourau / Use of sulfated fucans as anticoagulant and antithrombotic agents: future perspectives. // Curr. Pharm. Des., 10 (2004) 9, p. 964-981.
7. A I Usov, MI Bilan / Fucoidans sulfated polysaccharides of brown algae. // Russ. Chem. Rev., 78 (2009) 8, p. 785-799.А.И. Усов,- М.И. Билан / Фукоиданы сульфатированные полисахариды бурых водорослей // Yen. Хим., 78 (2009) 8, 846-862.
8. N. Ustyuzhanina, V. Krylov, A.Grachev, A.Gerbst, N.Nifantiev / Synthesis, NMR and conformational studies of fucoidan fragments. Part 8. Convergent synthesis of branched and linear oligosaccharides. // Synthesis, 23 (2006), p. 4017-4031.
9. V. Krylov, N. Ustyuzhanina, A.Grachev, N. Nifantiev / Efficient acid-promoted per-O-sulfation of organic polyols. // Tetrahedron Lett., 49 (2008), 5877-5879.
10. B. Casu / Structure and biological activity of heparin. I I Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 43 (1985), p. 51-134.
11. C.A.A. Boeckel, M. Petitou / The unique antithrombin III binding domain of heparin: a lead to new synthetic antithrombotics. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32 (1993) 12, p. 1671 1690, review.
12. A. Yayona, M. Klagsbrunb, J.D. Eskoc, P. Lederd, D.M. Ornitz / Cell'-surface, heparin-like molecules are required-for binding of basic fibroblast growth, factor, to its high affinity receptor. // Cell 64 (1991), p. 841-848!
13. J. Tatai, P. Fugedi / Synthesis of the putative minimal FGF binding motif heparan, sulfate trisaccharides by an orthogonal protecting group strategy. // Tetrahedron 64 (2008), p. 9865-9873.
14. V.V. Kakkar, S. Kakkar, R.M. Sanderson, C.E. Peers / Efficacy and safety of two regimens, of low molecular weight heparin fragment (fragmin) in preventing postoperative venous thrombolism. И Haemostasis 16 (1986), p. 19-24.
15. J. Fareed, D.A: Hoppensteadt, R.L. Bick / An update on heparins at the beginning of the new millennium. // Semin. Thromb. Hemost. 26 (2000) 1, p. 5-22.
16. P. Sinay, J.-C. Jacquinet, M. Petitou, P.Duchaussoy, I.Lederman, J.Choay, G.Torri / Total synthesis of a heparin pentasaccharide fragment having high affinity for antithrombinin. // Carbohydr. Res., 132 (1984) 2, p. C5-C9.
17. M. Petitou, P. Duchaussoya, I. Ledermana, J. Choaya, J.-C. Jacquinetb, P. Sinay, G. Torric / Synthesis of heparin fragments: a methyl a-pentaoside with high affinity for antithrombin III. // Carbohydr. Res., 167 (1987), p. 67-75.
18. M. Petitou, G. Jaurand, M. Derrien, P. Duchaussoy and J. Choay / A new, highly potent, heparin-like pentasaccharide fragment containing a glucose residue instead of a glucosamine. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1 (1991) 95-98.
19. T. Polat, Chi-Huey Wong / Anomeric reactivity-based one-pot synthesis of heparin-like oligosaccharides. II J. Am. Chem. Soc. 129 (2007), 12795-12800.
20. H.A. Orgueira, A. Bartolozzi, P. Schell, R.E.J.N. Litjens, E.R. Palmacci, P.H. Seeberger / Modular synthesis of heparin oligosaccharides. // Chem. Eur. J. 9 (2003), 1, p 140-169.
21. M. Petitou, C.A.A. Boeckel / A synthetic antithrombin III binding pentasaccharide is now a drug! What comes next? // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43 (2004), 3118 — 3133, review.
22. M. Maccarana, B.Casu, U. Lindahl / Minimal sequence in heparin/heparan sulfate required for binding of basic fibroblast growth factor. // J. Biol. Chem. 268 (1993), p.23898-23905
23. D.J.D. Johnson, J. Langdown, Wei Li, S.A. Luis, T.P. Baglin, J.A. Huntington / Crystal structure of monomeric native antithrombin reveals a novel reactive center loop conformation. II J. Biol. Chem., 281 (2006), 35478-35486.
24. M. Petitou, P. Duchaussoy, P.-A. Driguez, G. Jaurand, J.-P. Hérault, J.-C. Lormeau,C.A.A. Boeckel, J.-M. Herbert / First synthetic carbohydrates with the fullanticoagulant properties of heparin. // Angew. Chem. Int. Ed. Ъ1 (1998) 21, p. 3009 -3014.
25. J.G. Kelton, J.W. Smith, Т.Е. Warkentin, C.P. Hayward, G.A. Dénommé P. Horsewood / Immunoglobulin G from patients with heparin-induced thrombocytopenia binds to a complex of heparin and platelet factor 4. // Blood 83 (1994), 3232-3239.
26. D. Wall, S. Douglas, V. Ferro, W. Cowden C. Parish / Characterisation of the anticoagulant properties of a range of structurally diverse sulfated oligosaccharides. // Thrombosis Res., 103 (2001) 4, p. 325-335.
27. V. Ferro, K. Fewings, M.C. Palermo, C.Li / Large-scale preparation of the oligosaccharide phosphate fraction of Pichia holstii NRRL Y-2448 phosphomannan for use in the manufacture of PI-88. // Carbohyd. Res. 332 (2001), p. 183-189.
28. J.K. Fairweather, E. Hammond, K.D. Johnstone, V. Ferro / Synthesis and heparanase inhibitory activity of sulfated mannooligosaccharides related to the antiangiogenic agent PI-88. // Bioorg. & Med. Chem. 16 (2008), p. 699-709.
29. E.A. McKenzie / Heparanase: a target for drug discovery in cancer and inflammation. // Br J Pharmacol. 151 (2007) 1: 1-14.
30. S. Cochran, C. Li, J.K. Fairweather, W.C. Kett, D.R. Coombe, V. Ferro / Probing the interactions of phosphosulfomannans with angiogenic growth factors by surface plasmon resonance. II J. Med. Chem., 46 (2003), p. 4601-4608.
31. Guofeng Gu, Guohua Wei, Yuguo Du / Synthesis of a 6V-sulfated mannopentasaccharide analogue related to PI-88. // Carbohydr. Res. 339 (2004), p. 1155-1162.
32. T. Endress, M. Lampe, J.A.G. Briggs, H.-G. Krausslich, C. Brauchle, B. Miiller D.C. Lamb / HTV-l-cellular interactions analyzed by single virus tracing. // Eur. Biophys. J., 37 (2008) 8, p. 1291-1301.
33. M. Ito, M. Baba, A. Sato, R. Pauwels, E. Clercq, Sh. Shigeta / Inhibitory effect of dextran sulfate and heparin on the replication of human immunodeficiency virus (HIV) in vitro. II Antiviral Res., 7 (1987) 6, p. 361-367.
34. T. Moriya, H. Kurita, K. Matsumoto, T. Otake, H. Mori, M. Morimoto, N. Ueba, N. Kunita / Potent inhibitoiy effect of a series of modified cyclodextrin sulfates on the replication of HIV-1 in vitro. II J. Med. Chem., 34 (1991), p. 2301-2304.
35. T. Moriya, K. Saito, H. Kurita, K. Matsumoto, T. Otake, H. Mori, M. Morimoto, N. Ueba, N. Kunita / A new candidate for an anti-HIV-1 agent: modified cyclodextrin sulfate (mCDS71). II J. Med. Chem 36 (1993) 11, p. 1674-1677.
36. K. Takeo, H. Mitoha, K. Uemura / Selective chemical modification of cyclomalto-oligosaccharides via tert-butyldimethylsilylation. // Carbohydr. Res., 187 (1989) 2, p. 203-221.
37. K. Katsurayaa, H. Nakashimab, N. Yamamotoc T. Uryu / Synthesis of sulfated oligosaccharide glycosides having high anti-HTV activity and the relationship between activity and chemical structure. // Carbohydr. Res. 315 (1999) 3-4, p. 234242.
38. J.R. Guyton, R.D. Rosenberg, A.W. Clowes, M.J. Karnovsky / Inhibition of rat arterial smooth muscle cell proliferation by heparin. In vivo studies with anticoagulant and nonanticoagulant heparin. // Circ. Res. 46 (1980), p 625-634.
39. H.P. Wessel, R. Minder, G. Englert / Synthetic a,p-(l—>4)-glucan oligosaccharides as models for heparan sulfate. // J. Carbohydr. Chem., 14 (1995) 8, p.l 101 1115.
40. H.P. Wessel, J. Niggemann / Synthesis of p-D-(l—>4)-substituted trehalose oligosaccharides. II J. Carbohydr. Chem., 14 (1995) 8, p.1089- 1100.
41. H.P. Wessel, G. Englert, P. Stangier / a-D-glycosyl-substituted a,a-D-trehaloses with (1—>4)-linkage: syntheses and NMR investigations. // Helv. Chim. acta 74 (1991)4, p. 682-696.
42. H.P. Wessel, B. Mayer, G. Englert / All-a-linked tetra- and penta-saccharide substructures of Trestatin A by block syntheses with triflic anhydride as promoter. // Carbohydr. Res. 242 (1993) 7, p.141-151.
43. H.P. Wessel / Heparinoid mimetics. // Topics in Current Chemistry, 187 (1997), 215-238.
44. A. Sugidachia, F. Asaia H. Koikea / In vivo pharmacology of aprosulate, a new synthetic polyanion with anticoagulant activity. // Thrombosis Res. 69 (1993), p. 7180.
45. F.A. Ofosu, J. Fareed, L.M. Smith, N. Anvari, D. Hoppensteadt, M.A. Blajchman./ Inhibition of factor X, factor V and prothrombin activation by the bis(lactobionic acid amide) LW10082.11 Eur JBiochem. 203(1992), 1-2, p.121-125.
46. U.E. Papoulias, PJ. Wyld, S. Haas, A. Stemberger, W. Jeske, D. Hoppensteadt, A. Kammereit / Phase I study with aprosulate, a new synthetic anticoagulant. // Thromb Res. 72 (1993) 2, p. 99-108.
47. А.О. Chizhov, A. Dell, H.R. Morris, S.M. Haslam, R.A. McDowell, A.S. Shashkov, N.E. Nifantev, E.A. Khatuntseva A.I. Usov / A study of fucoidan from the brown seaweed Chorda filum. II Carbohydr. Res., 320 (1999), p. 108-119.
48. M. Nagaoka, H. Shibata, I. Kimura-Takagi, S. Hashimoto, K. Kimura, R. Aiyama, S. Ueyama, T. Yokokura / Structural study of fucoidan from Cladosiphon okamuranus tokida. // Glycoconjugate J. 16 (1999), p. 19-26.
49. L. Chevolot, B. Mulloy, J. Ratiskol, A. Foucault S. Colliec-Jouault / A disaccharide repeat unit is the major structure in fucoidans from two species of brown algae // Carbohydr. Res., 330 (2001), p. 529-535.
50. M.I. Bilan, A.A. Grachev, N.E., Ustuzhanina, A.S. Shashkov, N.E. Nifantiev, A. I. Usov, / Structure of a fucoidan from the brown seaweed Fucus evanescens C.Ag. // Carbohydr. Res., 337 (2002), p. 719-730.
51. M.I. Bilan, A.A. Grachev, N.E. Ustuzhanina, A.S. Shashkov, N.E.; Nifantiev, A.I. Usov / A highly regular fraction of a fucoidan from the brown seaweed Fucus distichus L. // Carbohydr. Res., 339 (2004), p. 511-517.
52. L. Chevolot, A. Foucault, F. Chaubet, N. Kervarec, C. Sinquin, A.-M. Fisher, C. Boisson-Vidal / Further data on the structure of brown seaweed fucans: relationships with anticoagulant activity C. // Carbohydr. Res., 319 (1999), 154-165.
53. A.-P. Alves, B. Mulloy, J.A. Diniz, P.A.S. Mourao / Sulfated polysaccharides from the egg jelly layer are species-specific inducers of acrosomal reaction in sperms of sea urchins/ J. Biol. Chem., 272 (1997), 6965-6971
54. S.-J. Yoon, Y.-R. Pyun, J.-K. Hwang, P.A.S. Mourao / A sulfated fucan from the brown alga Laminaria cichorioides has mainly heparin cofactor П-dependent anticoagulant activity. // Carbohydr. Res., 342 (2007), p. 2326-2330.
55. J.D.C. Codee, R.E.J.N. Litjens, L.J. Bos, H.S. Overkleeft, G.A. Marel / Thioglycosides in sequential glycosylation strategies // Chem. Soc. Rev., 34 (2005), p. 769-782
56. R.U. Lemieux, K.B. Hendriks, R.V. Sick, K.J. James / Halide ion catalyzed glycosidation reactions. Syntheses of a-linked disaccharides // Am. Chem Soc., 97 (1975), p. 4056-4062.
57. J. Kuszmann, G. Medgyes, S. Boros / Synthesis of 2,5-anhydro-(P-D-glucopyranosyluronate)- and (a-L-idopyranosyluronate)-D-mannitol hexa-O-sulfonate hepta sodium salt. I/Carbohydr. Res. 339 (2004), 1569-1579.
58. A. Raghuraman, M. Riaz, M. Hindle, U.R. Desai /Rapid and efficient microwave-assisted synthesis of highly sulfated organic scaffolds. // Tetrahedron Lett. 48 (2007), p. 6754-6758.
59. М. Е. Sousa, М. Correia da Silva, M. M. М. Pinto //в Natural Products: Chemistry, Biochemistry and Pharmacology, Ред. G. Brahmachari, Narosa Publishing House PVT. Ltd., New Delhi, India ISBN: 978-81-7319-886-1, 2009.
60. M. Gelin, V. Ferrieres, M. Lefeuvre, D. Plusquellec / First intramolecular aglycon delivery onto a D-fucofuranosyl entity for the synthesis of a-D-fucofuranose-containing disaccharides. // Eur. J. Org. Chem. 2003, p. 1285-1293.
61. Breitmaier, E.; Voelter, W. Carbon-13 NMR Spectroscopy 1989, p. 384, 3-rd edition, VCH, Weinheim.
62. D. McPhail, J. Lee, B. Fraser-Reid. / Exo and endo activation in glycoside cleavage: acetolysis of methyl a- and P-glucopyranosides // J. Am. Chem. Soc. 1992, 114 (5), 1905-1906.
63. J. Liras, E. Anslyn /Exocyclic and endocyclic cleavage of pyranosides in both methanol and water detected by a novel probe. IIJ. Am. Chem. Soc. 116 (1994), p. 2645-2646.
64. F.W. Lichtenthaler, J. Breunig, W. Fischer / Boron trifluoride-catalyzed acetolysis of glycosides // Tetrahedron Lett. 12 (1971) 30, p. 2825-2828.
65. R.D. Langdell, R.H. Wagner, К.М. Brinkhous / Effect of antihemophilic factor on one-stage clotting tests; a presumptive test for hemophilia and a simple one-stage antihemophilic factor assy procedure. // J. Lab. Clin. Med. 41 (1953) 4, p. 637-647.
66. R. Stuart, A. Michel / Monitoring heparin therapy with the activated partial thromboplastin time // Can Med Assotiation J, 104 (1971) 5, p. 385-388.
67. E. Yin, S. Wessler, J. Butler / Plasma heparin: a unique, practical, submicrogram-sensitive assay // J Lab Clin Med, 81 (1973) 2, p. 298-310
68. A. Teien, M. Lie / Heparin assay in plasma a comparison of five clotting methods // Thromb Res, 7 (1975) 5, p. 777 788
69. A. Teien, М. Lie / Evaluation of an amidolytic heparin assay method: increased sensitivity by adding purified antithrombin III // Thromb Res., 10 (1977) 3, p. 399410.
70. A. Rezaie / Determinants of specificity of factor Xa interaction with its physiological inhibitors // Mini Rev Med Chem,6 (2006) 8, p. 859-865.
71. А. Гордон, P. Форд, Спутник химика, Москва, из-во "Мир" (1976).
72. W. L. F. Armarego, Christina Li Lin Chai. Purification of laboratory chemicals, 5th edition, Elsevier, Cornwall (2003).
