Масс-спектрометрическое профилирование кожных секретов ранидных и хилидных лягушек тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

московским государственный университет

имени М.В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

горшков владимир александрович

масс-спектрометрическое профилирование кожных секретов ранидных и хилидных лягушек

(02.00.03 - органическая химия)

3 о сен 2010

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2010

004609520

Работа выполнена на кафедре органической химии в лаборатории органического анализа Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Лебедев Альберт Тарасович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Заикин Владимир Георгиевич (Институт нефтехимического синтеза им. A.B. Топчиева РАН, г. Москва)

доктор химических наук, в.н.с. Егоров Цезий Алексеевич (Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, г. Москва)

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт белка РАН, г. Пущино

Защита состоитсяоктября 2010 г. в II00 на заседании Диссертационного совета Д 501.001.69 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, дом 1, строение 3, МГУ, химический факультет, аудитория 446.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 20 сентября 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор химических наук, профессор

Магдесиева Т.В.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Бесхвостые амфибии представляют собой группу некрупных, достаточно медленно передвигающихся животных. Их тела лишены защитных панцирей, клыков, когтей, покрыты легко проницаемой кожей, что делает их уязвимыми для хищников и паразитов. В процессе длительной эволюции для защиты от них амфибии выработали высокосложный химический арсенал. Секрет, выделяемый спинными кожными железами в стрессовых ситуациях, помогает эффективно противостоять внешней агрессии. В его составе присутствуют соединения с высокой биологической активностью, большая их часть относится к классу пептидов. Изученные к настоящему моменту пептиды амфибий проявляют антимикробные, противовирусные, противоопухолевые свойства, могут противодействовать паразитическим грибам и простейшим. Некоторые из них обладают нейроактавностью и выполняют регуляторные функции в организме продуцирующих их амфибий. Высокая степень схожести многих пептидов земноводных с пептидами млекопитающих и человека делает изучение их структур и механизма действия актуальным для понимания физиологии самого человека.

Постоянная эволюция патогенных микроорганизмов способствует появлению резистентных к существующим антибиотикам штаммов и, тем самым, вынуждает расширять поиск новых веществ, позволяющих эффективно противостоять бактериям. Преимуществом антимикробных пептидов, в том числе кожных пептидов амфибий, в сравнении с традиционными антибиотиками является то, что их механизм действия исключает привыкание к ним со стороны патогенных микроорганизмов.

Классические биохимические методы определения структур белков и пептидов в настоящее время практически полностью вытеснены масс-спектрометрическим секвенированием. Оно оказалось более быстрым, простым и чувствительным методом, что резко уменьшило необходимое для анализа количество образца без ущерба надежности его результатов. Основной и наиболее трудоемкой задачей масс-спектрометрического секвенирования является так называемое de novo секвенирование, т.е. установление структуры абсолютно неизвестного пептида. Повышение эффективности этой процедуры тем или иным способом крайне важно для развития самого метода, поскольку расширяет границы его применения.

Таким образом, изучение состава кожных секретов амфибий, содержащих поистине уникальные биоактивные вещества, разработка и развитие новых подходов к анализу многокомпонентых смесей природных пептидов неизвестной структуры, а также повышение эффективности их de novo секвенирования являются актуальными задачами современной науки.

Цель работы. Целью данной работы являлось определение пептидных профилей кожных секретов пяти видов ранидных лягушек (R. ridibunda, R. lessonae, R. esculenta, R. temporaria и R. arvalis) и одного вида квакш (Hyla arbórea) комплексом масс-спектрометрических методов с

применением простых химических модификаций неразделенного кожного секрета, а также изучение возможности проведения видовой идентификации ранидных лягушек на основе состава их кожных субстратов.

Научная новизна и практическая значимость. Установлены составы кожных секретов шести видов лягушек. Сведения о пептидомах трех видов лягушек (R. lessonae, R. esculenta и Hyla arbórea) публикуются впервые. Уточнены составы кожных выделений трех других видов: R. ridibunda, R. arvalis и R. temporaria (обитающей на территории России). В ходе выполнения работы установлены структуры 153 пептидов, из них ранее не описанных-39.

Предложен и практически применен новый подход к de novo секвенированию неизвестных компонентов в составе природных пептидных смесей (кожных секретов ранидных и хилидных лягушек). Он включает совокупный анализ исходных и модифицированных кожных субстратов при суммарном использовании двух методов активации диссоциации пегггидных связей: соударениями (ДАС) и захватом электронов (ДЭЗ). Для изучения секрета ранидных лягушек предложено параллельное использование двух способов модифицирования внутримолекулярных дисульфидных связей: восстановление с последующим карбоксамидометилированием и окисление надмуравьиной кислотой. При определении пептидного профиля квакши Hyla arbórea применена процедура ацетилирования. Такое совместное использование двух способов фрагментации с простыми химическими модификациями позволяет повысить надежность и эффективность масс-спектрометрического de novo секвенирования компонентов кожных пептидомов ранидных и хилидных лягушек.

Изучены три способа модифицирования N-концевой аминогруппы коротких пептидов для предотвращения газофазной циклизации их 6- и a-ионов. Оказавшаяся в результате наиболее эффективной процедура ацетилирования N-аминогруппы пептидов была применена при масс-спектрометрическом изучении состава кожного секрета Hyla arbórea.

Продемонстрирована возможность использования составов кожных пептидомов для межвидовой идентификации ранидных лягушек. Показано, что она может проводиться как путем детального масс-спектрометрического профилирования кожных секретов с применением масс-спектрометрии высокого разрешения, так и экспресс-профилированием методами ВЭЖХ и МАЛДИ-МС.

Первичные структуры пяти новых пептидов были подтверждены методом деградации по Эдману. Один из пептидов, выделенный из секрета Hyla arbórea, был протестирован на антимикробную активность и способность ингибировать NO-синтазу: оба теста показали отрицательный результат.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано В статей в ведущих отечественных и зарубежных научных журналах. Результаты работы представлены на

сяти российских и международных конференциях: XIV международной конференции студентов, гарантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2007); 2-ой и 3-ей Всероссийских нференциях с международным участием "Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы" [осква, 2007; Москва, 2009); 55-ой, 57-ой и 58-ой конференциях Американского масс-ектрометрического общества (Индианаполис, 2007; Филадельфия, 2009; Солт Лейк Сити, 2010); Всероссийском симпозиуме "Белки и пептиды" (Казань, 2009); 22-ой масс-спектрометрической нференции в Австралии и Новой Зеландии (Сидней, 2009); 6-ом Международном симпозиуме эндокринологии и нейробиологии амфибий (Берлин, 2009) и 9-ом Европейском семинаре по ЗФП (Лозанна, 2010).

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 167 страницах, состоит из гдения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части и выводов, шюстративный материал содержит 16 таблиц, 61 рисунок. Список процитированной литературы стоит из 451 наименования.

Основное содержание работы

Получение и подготовка кожных секретов

Для выполнения настоящей работы в Звенигородском районе Московской области были товлены особи пяти видов ранидных лягушек: R. ridibunda, R. Iessonae, R. escalenta, R. arvalis и temporaria. Древесные квакши Hyla arbórea были доставлены из Грузии. Кожные секреты лучали электростимуляцией спинных желез, смывая выделения деионизованой водой в емкость метанолом. Полученный раствор фильтровали при помощи тефлонового фильтра (0.45 мкм), офильно высушивали и хранили при -24 °С.

Отнесение особей внутри комплекса зеленых лягушек (R. escalenta complex), в который одят R. ridibunda, R. Iessonae, R. esculenta, было сделано на основе промеров отдельных частей и, выполненных по существующей для этого зоологической методике.

Масс-спектрометрическое секвенированне

Общий подход

Общая схема эксперимента приведена на рис. 1. Изучение пептидных компонентов кожных кретов всех лягушек в данной работе проводилось двумя способами: 1) детальным офилированием с помощью тандемной масс-спектрометрии на приборе ионного циклотронного зонанса с преобразованием Фурье (наноВЭЖХ-ИЦРФП) и 2) экспресс-профилированием с пользованием масс-спектрометрии МАЛДИ (матрично-активированная лазерная сорбция/ионизация) и ВЭЖХ-УФ. В процессе детального профилирования применяли исходные химически модифицированные субстраты, тогда как экспресс-профилирование проводилось ль ко на исходных кожных секретах.

Для повышения эффективности de novo секвенирования пептидов использовали возможное! масс-спектрометра - одновременное применение двух способов инициирования фрагментам пептидной цепи: диссоциации, активированной соударениями (ДАС), и диссоциации п{ электронном захвате (ДЭЗ), а также проводили химические модификации кожных субстратов, добиваясь, таким образом, получения большей структурной информации. Для кожных секретов ранидных лягушек были использованы две параллельные модификации S-S связей пептидне смеси: восстановление-карбоксамидометилирование и окисление надмуравьиной кислотой. Г1р изучении кожных секретов хилидных лягушек применяли ацетшшрование субстрата.

Точные массы пептидов исходного, немодифицированного секрета были положены в ochoi построения двумерных карт, визуализирущих данные детального профилирования.

Детальное профилирование | | Экспресс-профилирование

Рис. 1. Общая схема эксперимента.

Комплементарность ДАС и ДЭЗ

Известно, что суммарное использование режимов ДАС и ДЭЗ повышает эффективное масс-спектрометрического секвенирования коротких триптических пептидов (10-! аминокислотных звеньев). Отличия в физической сути этих методов активации позволяв инициировать разрывы разных пептидных связей, что обеспечивает получение болыш структурной информации.

Особенностью данной работы явилось то, что основными объектами изучения служи.] длинные нетриптические пептиды ранидных лягушек (до 46 аминокислотных звеньи осложненные внутримолекулярной С-концевой дисульфидной связью.

Табл. 1 иллюстрирует комплементарность двух методов активации фрагментации (ДАС ДЭЗ) на примере пяти длинных (17-37 аминокислот) дисульфидсодержащих пептиде выделенных из кожного секрета Я. г1сИЬипс!а. Присутствующий С-терминальный дисульфиднь

цикл разрушен с помощью восстановления и алкилирования йодацетамидом. Неустановленные аминокислоты даны в скобках, в колонке «Покрытие» приводится количество идентифицированных аминокислот из общего их числа в пептиде.

Таблица 1. Комплементарность ДАС и ДЭЗ на примере пептидов из R. ridibunda.

м Заряд Метод Последовательность пептида Покрытие

2674.5 3+ ДАС FLPLLAGLAANFL(PK)IFCK.(ITR)KC 19-24; 79.2%

3+ ДЭЗ F(LPLLAGL)(AA)N(FLP)K(IFCKITR)KC 5-24; 20.8%

Сумма FLPLLAGLAANFL(PK)IFCK(ITR)KC 19-24; 79.2%

3516.9 3+ ДАС (GI)(LL)DKLKNF(AK)TAGKGVLQSLLNTASCKLSGQC 28-34; 82.4%

5+ ДЭЗ GI(LLD)(KL)KNFAKTAGKGVLQSLLNTASCKLSGQC 29-34; 85.3%

Сумма G1(LL)DKLKNFAKTAGKGVLQSLLNTASCKLSGQC 32-34; 94.1%

3823.1 5+ ДАС ;GI)(LSLV)K(GV)AKLA(GK)(TF)AKEG(GK)FGLEFIACKVTNQC 23-37; 62.2%

5+ ДЭЗ :GILS)LVKGVAKLAGKTFAKEGGKFGLEFIACKVTNQC 33-37; 89.2%

Сумма ;GI)(LS)LVKGVAKLAGKTFAKEGGKFGLEFIACKVTNQC 33-37; 89.2%

1891.0 4+ ДАС AAKLLLN(PKFRC)(KAA)FC 9-17; 52.9%

4+ ДЭЗ :AA)KIXLNPKFR(CKA)(AF)C 10-17; 58.8%

Сумма AAKLLLNPKFRC(KA)AFC 15-17; 88.2%

1939.0 4+ ДАС AVNIPFK(VK)(FRCKAAF)C 8-17; 47.1%

4+ ДЭЗ ;av)nipfkvkfrckaafc 15-17; 88.2%

Сумма AVNIPFKVKFRCKAAFC 17-17; 100.0%

Иногда суммарное покрытие целиком обеспечивается за счет одного способа активации фрагментации: либо ДАС (2674.5 Да), либо ДЭЗ (3823.1 Да). В других случаях оба метода удачно дополняют друг друга, увеличивая суммарное покрытие последовательностей пептидов (3516.9, 1891.0 и 1939.0 Да).

Таким образом, совокупное использование двух методов активации распада (ДАС и ДЭЗ) повышает эффективность de novo секвенирования длинных нетриптических пептидов ранидных лягушек, хотя и не способно исчерпывающе решить задачу определения их полных последовательностей.

Комплементарность процедур карбоксамидометилирования и окисления дисульфидных связей ранидных пептидов

Традиционной в протеомике процедурой, предшествующей трипсинолизу, является разрушение дисульфидных связей восстановлением с последующим апкилированием йодацетамидом (карбоксамидометилирование, KAM). В настоящей работе впервые в дополнение к ней было использовано окисление S-S связей надмуравьиной кислотой (Оксл), примененное ко всему исходному кожному субстрату (рис. 2).

Карбоксамидометилирование Окисление

nh2

.NH О

l.DTT, pH8,37°C, 1ч

„NH

HCOOOH

.„, 2.1СН,С(ЖН„ 25°С, 1ч

о _

1>7Т - дитиотреитол

Рис. 2. Использованные в работе химические модификации дисульфидной связи.

Результатом процедур служит появление в пептидах различающихся по свойствам функциональных групп: -СН2-СОЫН2 и -ЭОзН. Предполагалось, что дополнительные протоны двух сульфокислотных групп изменят характер фрагментации дисульфидсодержащих пептидов ранидных лягушек. Таким образом, комбинируя результаты, полученные в каждом эксперименте, мы вправе были ожидать увеличения структурной информации, что должно было сказаться на эффективности определения последовательностей. Ниже в табл. 2 приведены данные спектров ДАС пяти дисульфидсодержащих пептидов (тех же, что в табл. 1), модифицированных двумя способами.

Таблица 2. Комплементарность двух процедур модификации дисульфидной связи.

м Заряд Метод Последовательность пептида Покрытие

2674.5 3+ KAM FLPIXAGLAANFL(PK)IFCK(ITR)KC 19-24 79.2%

3+ Оксл FL(PL)LAGLAANFLP(KIF)CKITRKC 19-24 79.2%

Сумма FLPLLAGLAANFLPKIFCKITRKC 24-24 100.0%

3516.9 3+ KAM ;GI)(LL)DKLKNF(AK)TAGKGVLQSLLNTASCKLSGQC 28-34 82.4%

зн- Оксл (GI)(LL)DKLKNFAKTAGK(GV)LQSL(LN)TASCKLSGQC 26-34 76.5%

Сумма (GI)(LL)DKLKNFAKTAGKGVLQSLLNTASCKLSGQC 30-34 88.2%

3823.1 5+ KAM ;GI)(LSLV)K(GV)AKLA(GK)(TF)AKEG(GK)FGLEFIACKVTNQC 23-37 62.2%

4+ Оксл ;GILS)(LV)KGV(AK)LA(GK)(TFA)KEGGKFGLEFIACKVTNQC 24-37 64.9%

Сумма ;GI)(LS)(LV)KGVAKLA(GK)(TF)AKEGGKFGLEFIACKVTNQC 27-37 73.0%

1891.0 4+ KAM AAKLLLN(PKFRC)(KAA)FC 9-17; 52.9%

3+ Оксл (AAK)LLLN(PK)FR(CK)AAFC 10-17; 58.8%

Сумма AAKLLLN(PK)FRCKAAFC 15-17; 88.2%

1939.0 4+ KAM AVNIPFK(VK)(FRCKAAF)C 8-17; 47.1%

2+ Оксл (AVN)IPFKVKFRCKAAFC 14-17; 82.4%

Сумма AVNIPFKVKFRCKAAFC 17-17; 100.0%

Во всех пяти примерах примененный подход (сумма двух модификаций S-S связей) обеспечил более высокое суммарное покрытие последовательностей, чем при традиционном карбоксамидометилировании. В некоторых случаях удается установить полную первичную структуру пептидов (2674.5 и 1939.0 Да).

Наибольший вклад процедура окисления внесла в секвенирование аргининсодержащих пептидов (2674.5, 1939.0 и 1891.0 Да): в них появились разрывы на N-конце и, часто, на С-конце Arg, обычно отсутствующие при карбоксамидометилировании. Это связано с появлением

8

подвижных протонов двух сульфоксильных групп, способных к внутримолекулярному протонированию пептидных связей, что инициирует их разрыв.

Таблица 3. Сравнение различных алгоритмов МС-секвенирования.

Процедура de novo секвенирования Покрытие последовательности пептидов, %

2674.5 3516.9 3823.1 1939.0 1891.0

КАМ/ДАС 79.2 82.4 62.2 47.1 53.0

Оксл/ДАС 91.8 82.4 73.0 82.4 70.6

КАМ/ДАС+ДЭЗ 79.2 94.1 89.2 88.2 88.2

Оксл/ДАС+ДЭЗ 91.7 82.4 89.2 100.0 100.0

КАМ+Оксл/ДАС 100.0 88.2 73.0 100.0 88.2

КАМ+Оксл/ДАС+ДЭЗ 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0

В табл. 3 приведены полученные величины покрытий последовательностей ранидных пептидов в зависимости от использованной процедуры de novo секвенирования: т.е. способа активации фрагментации и модификации дисульфидных связей.

Сумма двух модификаций дисульфидных связей при совместном использовании двух методов активации фрагментации (строка «КАМ+Оксл/ДАС+ДЭЗ») превосходит данные традиционного карбоксамидометилирования («КАМ/ДАС+ДЭЗ») и позволяет полностью определить последовательность всех пяти нетриптических (до 37 аминокислот) пептидов ранидных лягушек. Использование суммы процедур дериватизации S-S связей эффективно и для приборов, лишенных возможности получать спектры фрагментации при захвате электронов (ДЭЗ): значения покрытий в этом случае («КАМ+Оксл/ДАС») превосходят показатели каждой из процедур по отдельности («КАМ/ДАС» и «Оксл/ДАС»).

Разработанный эффективный подход к de novo секвенированию, объединяющий два способа активации фрагментации пептидных связей (ДАС+ДЭЗ) и два метода модификации дисульфидных связей (КАМ+Оксл), был применен для детального масс-спектрометрического профилирования кожных пептидомов всех пяти видов ранидных лягушек, изученных в данной работе.

Побочные реакции, протекающие при карбоксамидометапировании и окислении дисульфидных связей

Карбоксамидометилирование не является строго селективной реакцией в отношении цистеинов: сообщалось, что при рН выше 5 и 7 возможно побочное алкилирование гистидина и лизина соответственно. Однако в своих экспериментах мы не зафиксировали таких реакций, несмотря на использование буферного раствора с рН 8. Вопреки литературным данным, нами также не выявлено взаимодействия йодацетамида с боковыми цепями тирозина и метионина. В большинстве случаев реакция с йодацетамидом протекает практически количественно по тиольным группам двух цистеинов: в спектрах МАЛДИ реакционных смесей лишь иногда фиксируются незначительные количества исходного и мономодифицированного пептида.

9

Реакция окисления дисульфидных связей надмуравьиной кислотой проходит количественно: исходные пептиды в спектрах МАЛДИ реакционных смесей присутствуют в следовых количествах.

Из множества известных побочных реакций окисления аминокислот в наших условиях устойчиво протекают лишь реакции с боковыми цепями цистеинов и метионинов (рис. 3).

? ,он

Б

Цистеин

н>4

Метионин

Триптофан

Цистеинсульфоновая к-та

Метионинсульфоксид (+16 Да)

Метионинсульфон (+32 Да)

Гидрокситриптофан (+16 ДО

З-пщроксикинуренин

(+20 Д а)

Кинурснин (+4 Да)

О

Ы-формилкикурсннн (+32 Да)

Рис. 3. Окисление боковых цепей цистеина, метионина и триптофана.

При окислении неразделенных кожных секретов мы не наблюдали ни одного из множества потенциальных продуктов окисления триптофана (рис. 3). Однако в некоторых исходных образцах эта аминокислота присутствовала уже в окисленном состоянии. На рис. 4 приведены спектры обнаруженного нами в немодифицированном секрете Д. /тоиае пептида [А5пЗ,ТЬг6,РЬе13]3-14 бомбезина, который вместо триптофана содержал М-формилкинуренин (+32 Да), кинуренин (+4 Да) и гидрокситриптофан (+16 Да).

к

Я

uUL

? s

I í"

■

ivk

700 600 900 1000 1100 1200 1300 1400

I = I

JUL

«00 SOO 600 700

JyJL

900 1000 1100 1200 1300 1400

I 5СЧ 5 4CH

S És

JiL

ХЛ

IODO 1100

Рис. 4. Спектры ионов-продуктов [Asn3,Thr6,Phel3]3-14 бомбезина, содержащего Metox и Тгр в различных формах окисления (ионизация элекгрораспылением, ДАС).

Вместо ожидаемого по литературным данным окисления тирозина при взаимодействии с надмуравьиной кислотой зарегистрировано его хлорирование (+ 33.97 Да) (рис. 5). Продукт хлорирования тирозина присутствует в реакционной смеси в незначительном количестве. В качестве механизма его образования можно предположить атаку активированного гидроксидной группой ароматического ядра тирозина ионом С1+, образующимся из хлорид-иона под действием перекиси водорода при получении надмуравьиной кислоты.

SF 70 í

гп

Ь,1 у

У,

V ^ V

я й |а ;; f S" I I 3 "s, в? is Й5 s

3 s я

?

§

Sou.

Am t

800 1000 1200 1400

1800 2000 2200 2400 2600

Рис. 5. MC -спектр бревининэ-lRa (ДАС), присутствующего в окисленном секрете R. ridibunda.

В процессе окисления неразделенного кожного секрета наблюдается частичная деградация пептидной смеси, которую мы связываем с неспецифическим расщеплением крупных пептидов. Дальнейший масс-спектрометрический анализ кожных секретов подтвердил наше предположение.

N-концевые модификации коротких хилидных пептидов

Основной проблемой de novo секвенирования коротких пептидов является газофазная циклизация их Ь- и а- ионов, не позволяющая получить надежную информацию о реальной структуре. На рис. 6 показано образование циклической формы &б-иона пептида FLPFFP-NH2 (Hyla arbórea) и возникновение при раскрытии цикла шести линейных оксазолоновых ионов, каждый из которых в процессе фрагментации продуцирует свои ионы-продукты («непрямая фрагментация»).

flpffp„'u (i) lpffpf^, (2) pffpf14, (3) ' ffpflp;u (4) fpflpf^ (5) pflpff* (6)

FLPFFP-NIIt-

>cyclo(FLPFFPf

Рис. 6. «Непрямая фрагментация» циклического Ь6-иона пептида FLPFFP-NH2 (Hyla arbórea).

В тандемном спектре FLPFFP-NIb при электрораспылении (рис. 7) присутствуют фрагментные ионы всех шести линейных оксазолоновых 6-ионов.

ь,ь;

- х4 -

£ .л

sS h

b,b¡ а',

СО о i

с? "

_х4-У,

ьХ а< \

а „а,

,|,„1

2мн'

100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750

Рис.7. Спектр МС2 FLPFFP-NH2 (Ионизация электрораспылением, QTOF).

Поскольку именно короткие пептиды составляют основную часть кожного секрета квакши Hyla arbórea, для предотвращения их циклизации и получения надежных результатов de novo секвенирования нами были протестированы три способа модификации N-концевой аминогруппы: 1) ацилирование с помощью уксусного ангидрида, 2) сульфобензоилирование циклическим ангидридом 2-сульфобензойной кислоты и 3) образование 2,4,6-триметилпиридиния под действием тетрафторбората 2,4,6-триметилпириллия (рис. 8).

12

«-NH, + ^ X -- X

U /NslH

R—NH2 + o

цд? su

HN

R-nh2 + Í\BF; ---Py

Рис. 8. Три способа модификации N-концевой аминогруппы, протестированных в работе.

Спектры ионов-продуктов модифицированного тремя способами пептида FLPFFP-NH2 (М 765.4 Да), выделенного из Hyla arbórea, представлены на рис. 9.

S».

а

i».

[FFP-NHJ У" Я 1 I s J МП

§ ,1 Т

h

f 1.0

U I IJ

200 300 400 500 600 700 В00 900

suf[í|p[f[f]p-nh,

PyfflPFlFP-NH,

АсРИЙ^Р-ЫН,

Рис. 9. Спектры ионов-продуктов модифицированного триптофштин-подобного пептида (РЬРРРР-ЫНг): (а) ацетилирование, (б) сульфобензоилирование, (в) модификация тетрафторборатом 2,4,6-триметилпириллия.

Ацетилирование концевой Ш^-группы в спектре на рис. 9а эффективно подавляет циклизацию Ь-ионов. Все наблюдаемые фрагменты объясняются прямой фрагментацией и позволяют полностью установить последовательность пептида.

Сульфобензоилирование приводит к появлению сильной кислотной группы на Ы-конце пептида, что может снижать стабильность его молекулярного иона. В результате спектр фрагментации модифицированного пептида при электрораспылении зафиксировать не удалось. Однако в спектрах МАЛДИ-МС2 на рис. 96 наблюдается увеличение интенсивностей ионов у-серии при полном отсутствии циклических ионов. Это позволило установить полную последовательность пептида. Тем не менее стабильность введенной метки невысока: доминирующим в спектре является ион [МН-Эи-МНз]', образующийся при элиминировании метки из протонированного молекулярного иона пептида РЬРРРР-ГШг.

Фиксированный положительный заряд, введенный на Ы-конец пептида с помощью тетрафторбората 2,4,6-триметилпириллия, подавляет «непрямую» фрагментацию, но не усиливает

«прямую»: из пяти амидных связей две остались незатронутыми, что не дает возможности установить полную последовательность (рис. 9в). Основным достоинством этой модификации является появление в спектре высокоинтенсивной комплементарной пары ионов b\ - y}j которая позволяет надежно определить первую аминокислоту, тем самым решая одну из существующих проблем масс-спектрометрического de novo секвенирования.

Таким образом, наиболее эффективной оказалась процедура ацетилирования, поскольку она надежно подавляет циклизацию коротких пептидов, протекает быстро, необходимые реагенты доступны и дешевы, а их избыток легко удаляется лиофилизацией (исключаются потери при очистке). Совместный анализ исходного и ацетилированного кожного секрета с применением наноВЭЖХ-МС2 и регистрацией суммы спектров ДА С и ДЭЗ был положен в основу масс-спектрометрического секвенирования пептидов из кожи квакши Hyla arbórea.

Сравнение ручного и автоматического секвенирования

Все аминокислотные последовательности в настоящей работе были установлены ручным секвенированием. Для сравнения была взята одна из наиболее совершенных программ автоматического de novo секвенирования, учитывающая данные спектров ДАС и ДЭЗ, разработанная в лаборатории профессора Р. Зубарева М. Савицким (Университет Уппсалы, Швеция). В табл. 4 приведены результаты автоматического и ручного секвенирования одинакового набора данных (немодифицированный секрет R. escalenta). Совпадающие участки последовательностей показаны затемнением.

Верхняя строка содержит результат автоматического секвенирования, нижняя - ручного. Число в скобках означает массу неопределенного секвенатором фрагмента пептида. В случае коротких пептидов секвенатор дает полное совпадение результатов (12,14-16). Для ряда длинных пептидов (1, 4, 6 и 9) в автоматическом режиме установлены практически полные последовательности, за исключением С-терминальных фрагментов, которые при ручном секвенировании были определены по спектрам модифицированных пептидов. В целом, результаты ручного секвенирования для всех длинных пептидов с S-S связью более точны. Ручным секвенированием удалось идентифицировать последовательности 33 пептидов (см. профиль R. lessonae в диссертации) против 20, определенных в автоматическом режиме. Серьезным преимуществом ручного секвенирования является возможность учитывать существующие аналогии в структурах пептидов, относящихся к одному семейству. Данные автоматического секвенирования нуждаются в дополнительной ручной обработке, подразумевающей конкретные знания по особенностям фрагментации пептидов в зависимости от их структуры и условий масс-спектрометрического эксперимента Таким образом, даже самые совершенные из существующих на сегодня программ автоматического de novo секвенирования могут взять на себя лишь рутинную часть работы исследователя, но не способны заменить его полностью.

мп' Последовательность Название

1 2608.49 FFPAFLKVAAKWPSIL{-399.15-)(AKY)-OH FFPAFLKVAAKVVPSILCSITKKC-OH Бревинин-1Ес*

2 2425.14 PFVASVAA(Pm)(-396.18-)(NS)(-410.09-)(A)(V)(II)-OH VIPFVASVAAEMMQHVYCAASRRC-OH Бревинин-lRa

3 2996.53 GlLDSLKNMA(-861,28-)(AFP)(RR)(KSS)K-OH GILDSLKNFAKDAAQTMLNKASCKITGGC-OH EpeBHHHH-2Re*

4 2990.64 GIIOSLKNFAKDAAGILLlCK(CHS)(AV)(RSS)-OH GILDSLKNFAKDAAGIIXKKASCKLSGOC-OH EpeB»mm-2Ra

5 2920.56 (-602.33-)QQGAATNAAVTFAA(NT)(-429.26-)(RQ)-NH2 GLMSTLKGAATNAAVTLLNKLQCKLTGTC-OH EpeBHHHH-2Rb

6 3012.63 GILUSLKNLAKNAAQlLLNKAS(AC)S(-408.24-)-OH G1LDSLKNLAKNAAQILLNKASCKLSGOC-OH EpeBHHHH-2Rd

7 3243.77 (NK)K(IT)KN(-399.25-)AG(WE)GALKSLLNAAS(AC)(AAP) (QQ)-NH, gilstiknvaktagkgalksllnaascklsgoc-oh Бревинин-2Е1*

8 3244.75 (-l)24.6S-)TAGKGALQSLiDAAS(-717.30-)-OH GILSTLKNLGKTAGKGALOSLLDAASCKISGOC-OH Бревинин-2Ет*

9 3387.83 GL\V'NTLKATGK.SAASNVAVTLLDK.I(AN)('631.31-)-OH GLV.'NTI.KATGKSAASNVAVTLI.DKAKCKIVDGEC-OH Бревинин-2Еп*

10 3620.03 H-461.2S-)GVAKLAGKTLAKE(-431.34-)(GHm)IA(-477.16-) (DPV)-NH, FSLVKGVAKLAGKTLAKEGGKFGI.DL1ACKISKOC-OH Эскулентин-2с* 3-37

11 1940.03 AVNlPFKVKF(-423.13-)(RPT)-OH ANVIPFKVJCFRCKAAFC-OH PaHaTyepiiH-2R 10-26

12 1223.57 VEFTEDAGbO-D-OH VEFTEDAGKLD-OH Про-бомбезин

13 2025.07 (NNl)(afp)RG(kp)S(an)S(KV)(aap)S-nhj pEKTYNRRPPGWSPLRVS-OH Лессонакинин*

14 1060.56 RPPGFSPFR-OH RPPGFSPFR-OH Брадикинин

15 1159.63 RPPGFSPFRV-OH RPPGFSPFRV-OH RV-10

16 1173.65 RPGPFSPFR1-OH RPPGFSPFRl-OH RI-10

17 1244.69 RPPG(ST)(AA)(-417.24-) A-QH RPPGFSPFRIA-OH RA-11

18 1230.67 RPP(MV)(AT)VA-OH RPPGFSPFRVA-OH RA-U-2

19 1076.56 (-423.22-)FSPFR-OH RPHypGFSl'FR-OH [НурЗ]брадикинин

20 1187.67 RPPGFTPFR1-OH RPPGFTPFR1-OH [Thr6]RI-U

Детальное МС профилирование кожных секретов раниднмх и хилидиых лягушек В табл. 5 суммированы данные по количеству пептидов, идентифицированных в каждом из изученных видов лягушек, в том числе, ранее не описанных в литературе.

Отнесение всех изобарных аминокислот (Lys/Gin, Phe/Metox, Hyp/Leu, Туг/МеЬ0х) было сделано с помощью масс-спектрометрии высокого разрешения. Часть изомерных Leu/Ile были идентифицированы по наблюдаемым при захвате электрона характеристическим потерям радикалов "С3Н7 и 'С2Н5, а при их отсутствии - по аналогии с известными родственными пептидами.

Таблица 5. Количество установленных пептидов.

Вид амфибии Общее количество пептидов Новые пептиды Длина пептидов (кол-во аминокислот)

R.ridibunda 29 3 9-46

R. lessonae 43 13 6-29

R. esculenta 33 9 6-46

R. arvalis 17 2 7-28

R. temporaria 21 3 9-33

Hyla arbórea 10 9 3-14

Пептидный профиль зеленых лягушек (Л. ridibunda, R. lessonae, R. esculenta) оказался богаче в сравнении с бурыми (R. arvalis, R. temporaria). В секретах четырех амфибий, за исключением R. temporaria, впервые обнаружены ранатуерины-2, имеющие характерный шестизвенный С-концевой дисульфидный цикл. Пептиды этого семейства ранее не обнаруживались у евразийских земноводных: их присутствие считалось отличительной особенностью североамериканских лягушек.

Вторым классом пептидов, также впервые обнаруженных нами у евразийских амфибий, являются бомбезины. В структуре всех известных бомбезинов присутствует общий мотив WAVGHFM, который ответственен за связь с рецепторами, обусловливающими их биологическую активность. Два новых пептида этого семейства были названы нами [Asn3,Lys6,Phel3]3-14-бомбезин и [Asn3,Thr6,Phel3]3-14-6oM6e3HH (выделены из секретов R. ridibunda и R. lessonae соответственно).

Наличие нехарактерного для бомбезинов лизина в структуре [Asn3,Lys6,Phel3]3-14-бомбезина было подтверждено дополнительным экспериментом с помощью ацетилирования (рис. 10).

ACN®ACK1Q[W|Á¡Í|G]H|^M . ж,

Рис. 10. МАЛДИ-МС2 спектр [Asn3,Lys6,Phel3]3-14-6oM6e3HHa до (а) и после (б) ацетилирования.

Реакция ацетилирования затрагивает N-концевую аминогруппу н е-аминогруппы лизинов. Общий прирост массы пептида после ацетилирования составил 84 Да, что подтверждает присутствие двух NHj-групп в пептиде: N-концевая и Е-аминогруппа Lys. Разница масс - Ьх соответствующая ацетил-лизину, говорит о наличии Lys в четвертом положении последовательности [Asn3,Lys6,Phel3]3-14-6oM6e3HHa (рис. 10).

16

Три вида зеленых лягушек R. ridibunda, R. ¡essonae и R. esculenta образуют так называемый R. esculenta complex. Виды R. ridibunda и R. Iessonae являются родительскими по отношению к их естественному гибриду R. esculenta. Идентификация видов внутри комплекса зеленых лягушек затруднена вследствие пересечения их биометрических параметров и ареалов обитания. Полученные в работе результаты показали, что детальное масс-спекгрометрическое профилирование кожных секретов позволяет провести надежную идентификацию особей внутри этого комплекса

Сравнение секретов двух родительских видов выявило их коренное отличие по количеству дисульфидсодержащих пептидов: 22 в R. ridibunda против 4 в R. lessonae (полный перечень установленных пептидов приводится в диссертации). Мажорными пептидами в R. ridibunda являются бревинин-2Ес и бревинин-1Е, а в R. lessonae - брадикинин и родственные ему пептиды. Последние включают: тирозинсодержащие [Туг8]брадикинин и [Туг5,ТЬг6]брадикинин, а также [SerO,Prol ]брадикинин (SPPPGFSPFR) и [5егО,Рго1,Т11г6]брадикинин (SPPPGFTPFR), для которых не удалось провести каких-либо аналогий с известными пептидами. Перечисленные пептиды уникальны, т.е. встречаются только у одного вида из комплекса и, следовательно, могут являться таксономическими маркерами R. ridibunda и R. lessonae.

В табл. 6 приведен состав кожного пептидома гибридного вида R. esculenta, соотнесение обнаруженных пептидов с родительскими видами R. ridibunda и R. lessonae отмечено в таблице буквами R и L соответственно.

Девять из четырнадцати дисульфидсодержащих пептидов R. esculenta имеются в родительском виде R. ridibunda. Пять новых дисульфидсодержащих пептидов характерны только для съедобной лягушки (Е) - это бревинины-1Ес, -2Е1, -2Em, -2En (1, 7-9) и эскулектон-2с (13). Большая часть пептидов из семейства брадикинина и его аналогов (17-24) прослеживаются также в секрете R. lessonae (L). Интереснейшим фактом является обнаружение в секрете R. esculenta [ArgO,Trp5,Leu8]6paflHMiHHHa (28), агониста брадикининового рецептора типа В2, второго из известных рецепторов кининов немлекопитающих (найден в геноме полосатого данио Ifianio rerio)). Известно, что [А^0,Тгр5,1хи8]брадикинин, выделенный впервые из плазмы форели, трески и угря, вызывает сокращение гладкой мускулатуры желудочно-кишечного тракта рыб. В секрете прудовой лягушки R. lessonae этот пептид не был зафиксирован, хотя там присутствуют четыре родственных пептида, названных нами лессонакининами, которые в своей структуре содержат [ArgO,Trp5,Leu8]6paAwoiHHH.

Характерные только для R. esculenta пептиды (помечены «Е» в табл. 6) могут служить маркерами этого вида

Таблица 6. Пептиды, обнаруженные в кожном секрете гибридного вида/?. ехси/еШа.

м Название Последовательность пептида

1 2607.5 Бревинин-Шс* FFPAFLK.VAAKVVPSILCS1TKKC-OH E

2 2636.2 Бреиинин-lRa V1PFVASVAAEMMQHVYCAASRRC-OH R

3 2995.5 Бревинин-21?е* G1LDSLKNFAKDAAQTMLNKASCKITGGC-OH R,L

4 2989.6 EpeeHHHH-2Ra G1LDSLKNFAKDAAGILLKKASCKLSGQC-OH R,L

5 2918.5 Бревинин-2ЯЬ GLMSTLKGAATNAAVTLLNKLOCKLTGTC-OH R

6 3011.6 Бревинин-2Я(1 GILDSLKNLAKNAAQILLNKASCKLSGQC-OH R

7 3242.8 Бре&инин-2Е1* GILSTIKNVAKTAGKGALKSLLNAASCKLSGOC-OH E

8 3243.7 Бревинин-2Ет* G&STLKNLGKTAGKGALQSLLDAASCKISGOC-OH E

9 3386.8 Бревинин-2Еп* GLWNTLKATGKSAASNVAVTLLDKAKCK(VnGEC-OH E

10 4882.7 Эскулентин-1 GIFSKLGRKKIKNLLISGLKNVGKEVGMDVVRTGIDIAG CKIKGEC-OH R

11 4770.7 Эскулентин-IR GIFSKLAGKKXKNLL1SGLKSVGKEVGMDVVRTGIDIA GCKIKGEC-OH R

12 3805.1 Эскулентин-2КЬ GIFSLVKGVAKLAGKTLAKEGGKFGLELAM CK1AKOC-OH R

13 3619.0 Эскулентин-2с* 3-37 FSLVKGVAKLAGKTLAKEGGKFGLDLIACKISKOC-OH E

14 1939.0 Ранатуерин-2К ANV1PFK.VKFRCKAAFC-OH R.L.

15 1059.6 Брадикинин RPPGFSPFR-OH R,L

16 659.3 1-6-брадикинин RPPGFS-OH E

17 806.4 3-9-брадикинин PGFSPFR-OH L

18 903.5 [des-Arg916paflmcHHHH RPPGFSPF-OH R,L

19 1172.6 RI-10 RPPGFSPFRI-OH R,L

20 1243.7 RA-11 RPPGFSPFR1A-OH R,L

21 1158.6 RV-10 RPPGFSPFRV-OH L

22 1229.7 RA-11-2 RPPGFSPFRVA-OH L

23 1484.8 RS-14 RPPGFSPFRVAPAS-OH L

24 1684.9 RL-16 RPPGFSPFRVAPASSL-OH t

25 1075.6 [НурЗ ¡брадикинин RPHypGFSPFR-OH E

26 1041.5 [01и5]брадикинин RPPGESPFR-OH E

27 1186.7 [Thr6]RI-l 1 RPPGFTPFRI-OH R,L

28 1220.7 [Arg0,Trp5,Leu8] брадикинин* RRPPGWSPLR-OH E

29 2024.1 Лессонакинин pEKTYNRRPPGWSPLRVS-OH L

30 1222.6 Про-бомбезин VEFTEDAGKLD-OH L

31 1517.8 Про-максимакинин DYTIRTRLHSGLS-OH L

32 1919.0 Эскулин-1* PSSPWNEGTYVtNKLKS-OH E

33 1517.7 Эскулин-2* DVGYNINRWEPVG-OH E

Примечание: * - новые пептиды.

Таким образом, детальное профилирование, выполненное с применением ВЭЖХ-МС2 высокого разрешения, выявило принципиальное различие в составе кожных секретов трех видов членов комплекса зеленых лягушек (Л. rídíbunda, R. tessonae и R. escalenta), т.е. оно позволяет проводить видовую идентификацию особей внутри этого комплекса.

Составы кожных секретов R. temporaria и R. arvalis, принадлежащих к отряду бурых лягушек, коренным образом отличаются от рассмотренных выше зеленых лягушек. Их общей особенностью является присутствие коротких (17 аминокислот) дисульфидсодержащих пептидов, доминирование в секрете брадикинина, его аналогов и родственных им пептидов, а также высокое

содержание пептидов из семейства мелиттина. Дисульфидсодержащие пептиды в секретах обоих видов представлены, в основном, бревининами-1.

Полная последовательность неописанного в литературе бревинина-1ТЬ из секрета R. temporaria, включая дисульфидный цикл, была установлена нами по совокупности спектров фрагментации (ДАС+ДЭЗ) ^модифицированного пептида (МН+ 1964.15 Да, рис. 11). Сумма спектров дает информацию о полной последовательности бревинина-1ТЬ, за исключением С-концевой пары аминокислот Lys-Cys. Аналогия с другими пептидами этого семейства позволяет уверенно заключить, что цистеин - последняя аминокислота в последовательности бревинина-1Tb. Leu4 и Leu9 идентифицированы по характеристическим выбросам изопропильного радикала, наблюдаемым в спектре ДЭЗ (рис. 11а).

fs 4 II

ХиЗЫ!

íu

л -i* i!

г<

гг-

20-

S»

в

1 12:

1

2

s б

800 1000 1200 1400 1600

LVPLFLSKLI(CFITKKC)-OH

L(VP)LF(LS)K(LI)CFITK(KC)-OH

Рис. 11. МС2-спектр бревинина-1ТЬ: ДЭЗ (а) и ДАС (б).

Процесс разрыва S-S связи при захвате электрона происходит по следующей схеме.

Ri-S-S-^H* + е~ = Ri-S" + HS-R: Такая прямая фрагментация внутри С-концевых дисульфндных циклов длинных ^модифицированных пептидов ранидных лягушек отмечена впервые. Она не носит универсального характера: в общем случае для получения полной последовательности требуется предварительное разрушение внутримолекулярных S-S связей.

В кожном секрете R. arvalis нами обнаружен новый пептид из семейства мелиттина. Мелитгин - основной компонент яда пчел Apis mellifera и Apis florae. Структурно близкие пептиды были обнаружены в секретах некоторых бурых лягушек: европейской R. temporaria и японских R. tagoi и R. sakuraii. Обнаруженный нами мелигтин-подобный пептид (МПП) - пятый из известных на сегодня пептидов этого семейства.

705 TIO MS гго 725 730 7Э5 740 745 750 75S 760 765 770 пЛ

VI.

3 С

IlclO, -29.04 Да

Я S

3

б

Рис. 12. Отнесение Lys21 и Gln22 (а) и Не20 (б) в мелитгин-подобном пептиде, выделенном из

Его последовательность FVGAALKVLANVLPPVISWIKQ-NHz определена по сумме двух спектров (ДАС и ДЭЗ) (рис. 12). Изобарные Lys21 и GIn22 отнесены по спектру ДАС (рис. 12а), изомерные Leu9, Leul3 и Пе20 - по спектрам электронного захвата. Отнесение Lcu6 и 11е17 было проведено по аналогии со структурой известных на сегодня мелитгинов. Характеристичными пептидами для R. arvalis являются ранатуерины -2AVa и -2AVb (М 2825.6 и 2912.5 Да), а для R. temporaria это многочисленные темпорины (самые короткие из известных антимикробных пептидов амфибий). Среди них - обнаруженный нами новый пептид этого семейства FLPILGKVLSRVL-NHj (11е4 отнесен по выбросу 'С1Н5 в спектре ДЭЗ), названный темпорином-М.

Самым интересным из группы брадикининов, обнаруженных в секрете R. temporaria, является [ТЬгб,1ли8]брадикинин, впервые идентифицированный нами в секрете амфибии. Он относится к орнигокининам - агонистам орнитокининового рецептора, одного из двух известных на сегодня кининовых рецепторов немлекопитающих, который впервые был выделен и охарактеризован Шрёдером с соавторами в 1997 году.

Кожный секрет Hyla arbórea, как и секреты других квакш, состоит, в основном, из коротких пептидов. Применение процедуры ацетилирования исключило их циклизацию в газовой фазе и позволило провести однозначное масс-спектрометрическое de novo секвенирование. Поскольку данные пептиды не содержат лизина, эта модификация проходит количественно по N-аминогруппе.

В секрете квакши Hyla arbórea идентифицировано 10 пептидов, из которых все, за исключением брадикинина, являются новыми. Большинство из них относятся к триптофиллинам или триптофиллин-подобным пептидам, оставшиеся три не имеют полных аналогий с известными пептидами. Последние были названы арбореинами; структура их близка к ауреинам, пептидам, выделенным из кожи австралийских квакш. Один из них, арбореин-1 (М 1392.8 Да), структурно

Rana arvalis (М 2361.4 Да).

близок к ауреину 5.1 (ОЬЬОГУТСЬЬС^ШЗУЬКРКТРАЗ-ОН, 66% сходства) австралийских квакш Ыгопа аигеа и ЫЮг'ш гат^гт'ч.

Процедура ацетилирования позволила дифференцировать два изомерных пятичленных пептида: РЬР\УЬ-ЫН2 и 11РР\У-МН2 (М 673.4 Да), которые из-за близких хроматографических характеристик первоначально воспринимались как один пептид.

| 50 | 40 I 30

У.

561.32

586.30

4,

Ь,

269.19

•Д

ь4

513.31 482.31/ |

1

5 40

62657 696.73|1

[У,-СО}

100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 т/г

Ас10РР|\У-МН2

у4

610.30,-559.31

671.37 Ь; I 699.37

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 тЬ

АсрДруЭД-ШЬ Рис. 13. Спектры изомерных пептидов после ацетилирования: (а) Ас11РР\¥-Ш2 (б) АсРЬР\УЬ-Ш2.

Тщательная оптимизация хроматографических условий позволила выделить эти пептиды в чистом виде и подтвердить их структуры деградацией по Эдману.

Таким образом, масс-спектрометрическое детальное профилирование показало строгую характеристичность составов кожных секретов всех шести видов амфибий, что позволяет предложить этот метод для проведения их видовой идентификации.

Экспресс-прскЬилироваине

При экспресс-профилировании используются данные ВЭЖХ-УФ и МАЛДИ-МС анализа исходных кожных секретов. В процессе работы была показана характеристичность вида хроматограммы для каждого из пяти видов ранидных лягушек. Специальному изучению были подвергнуты вопросы дискриминации сигналов компонентов пептидных смесей в спектрах МАЛДИ неразделенных кожных секретов. На рис. 14 показано сравнение экспресс-профилирования (хроматограмма и масс-спектр МАЛДИ) с данными детального профилирования на примере кожного секрета Л. атаШ (таблица справа).

ММ Название

1 1810.0 2 1873.1 Бревинин-lAVa Бревинигт-lAVb

3 2825.6 Ранатуерин-2АУа *

4 2912.5 Ранатуерин-2АУЬ *

5 2361.4 6 1059.6 Мслипнн-подобный пептид* Брадиктшн

7 806.4 3-9-брадикинин

8 903.5 [des-Arg'l6paAHKHmiH

9 1187.6 10 1243.7 AR-U RA-1I

11 1285.7 RI-11

12 1340.7 RP-12

13 1498.8 RS-14

14 1712.9 RL-16

15 2356.2 RD-21

16 1728.9 [Hyp5)RL-16

17 1225.7 [Qlus]RA-ll

Рис. 14. Сравнение детального и экспресс-профилирования (R. arvalis).

Практически все пептиды, указанные в таблице на рис. 14, нашли свое отражение в спектре МАЛДИ и на хроматограмме: 13 из 17-ти пептидов, обнаруженных детальным профилированием, присутствуют в спектре МАЛДИ. Характеристические для R.arvalis пептиды дают интенсивные сигналы в спектре МАЛДИ: ранатуерин-2АУа (2825.6 Да), мелитгин-подобный пептид (2361.4 Да) и [Hyp3]RL-16 (1728.9 Да). Аналогичные данные получены и для других видов ранидных лягушек. Следовательно, спектры МАЛДИ неразделенных кожных секретов адекватно отражают результаты детального профилирования: наблюдающаяся незначительная дискриминация сигналов минорных компонентов не сказывается на интенсивности молекулярных ионов характеристических для каждого из видов пептидов. Таким образом, экспресс-профилирование, объединяющее ВЭЖХ-УФ хроматограмму со спектром МАЛДИ кожных секретов ранидных лягушек, может быть использовано для проведения их быстрой видовой идентификации.

Двумерные капты

Результаты детального профилирования могут быть визуализированы в виде двумерных карт. Каждый пептид на ней представлен пятном, положение которого определяется значениями нормализованного дефекта масс (NMD) (ось абсцисс) и нормализованного изотопного сдвига (NIS) (ось ординат), а размер - количеством пептида. Необходимые для построения

характеристики могут быть получены из набора изотопных пиков протонированной молекулы

пептида по формулам, приведенным ниже.

MM-MN МА-ММ

NMD = 1 ОООх 111 ;NIS = 1000x^1^, MM MM

где MM - моноизотопная, MA - средняя, MN - номинальная молекулярная масса.

Для расчета номинальной массы может быть использована следующая оценочная формула.

1999

MN =

0.5+ММх-

2000

Положение точки на двумерной карте связано с элементным составом пептида. Наличие тех или иных аминокислот или их модификация сдвигает точку на диаграмме. При таком методе отображения данных пептиды, принадлежащие к одному семейству, образуют плотную «туманность», которая может быть четко отделена от остальных. В нашей работе диаграммы такого рода были использованы для визуализации данных детального профилирования с целью проведения межвидовой идентификации лягушек.

На рис. 15 приведены двумерные карты трех видов зеленых лягушек, образующих R. esculenta complex: R. ridibunda, R. lessonae и R. esculenta.

« Rana esculenta • ••

1

■ 0 • ° CP • О

Семейства пептидов

ОБрадикинины О Кинин-подобные ОБомбезины • Бревинины-1 ® Бревинины-2 О Эскулентины-1 О Эскулентины-2 О Темпорин О Ранатуерины О Прочие О Спейсеры

Рис. 15. Двумерные карты лягушек из комплекса R. esculenta.

Двумерная карта на качественном уровне хорошо отображает разницу между кожными секретами трех видов амфибий. На диаграмме, построенной для R. lessonae, область, соответствующая различным семействам дисульфидсодержащих пептидов (бревининам-1 и -2, эскулентинам-i и -2), практически пуста, что соответствует данным детального профилирования:

в секрете присутствуют всего 4 таких пептида против 22 у R. ridibunda и 14 - R. esculenta. Мажорные пептиды хорошо заметны на диаграммах: для R. ridibunda - это брадикинин, бревинин-1Е, бревинин-2Ес и ранатуерин-2Я; для R. esculenta - брадикинин, бревинины -IRa и -2Ет; для R. lessonae - брадикинин и [Asn3,Thr6,Phel3]3-14 бомбезин. Реперной точкой на всех диаграммах можно считать брадикинин (NMD 0.53 N1S 0.61), присутствующий во всех трех кожных секретах. Карты для R. esculenta и R. ridibunda имеют похожую область в центре (NMD 0.5-0.6, NIS 0.60.65), однако сильно различаются в области более высоких NIS. Брадикинины, кинин-подобные пептиды и бомбезины наряду с кислотными спейсерами образуют плотные обособленные группы. В отличие от них разреженное облако бревининов-2 сильно пересекается с пептидами остальных семейств.

Диаграммы на рис. 15 строго индивидуальны и позволяют различить три близкородственных вида зеленых лягушек, входящих в комплекс R.escu!enta. Однако построение их трудоемко, а результаты не превосходят по информативности данные экспресс-профилирования. Таким образом, наиболее простым, удобным и одновременно информативным способом проведения быстрой видовой идентификации ранидных лягушек является экспресс-профилирование (ВЭЖХ-УФ хроматограмма и масс-спектр МАЛДИ исходного кожного секрета).

Биологическое тестирование

Триптофиллин-подобный пептид FLPFFP-Níb из Hyla arbórea был протестирован на антимикробную активность в отношении пятнадцати видов грам-положительных и грам-отрицательных бактерий, а также способность ингибировать NO-синтазу. Оба типа тестов показали отрицательный результат.

Выводы

1. Разработан и практически применен новый подход к de novo секвенированию неизвестных пептидов в составе природных смесей (кожных секретов ранидных и хилидных лягушек). Он сочетает в себе использование двух методов активации фрагментации пептидных связей: соударениями (ДАС) и захватом электронов (ДЭЗ) с простыми химическими модификациями кожного субстрата.

2. Изучены три способа модификации N-концевой аминогруппы коротких пептидов для предотвращения газофазной циклизации их Ь- и а-ионов.

3. Впервые установлены составы кожных секретов трех видов лягушек: R. lessonae, R. esculenta и Hyla arbórea. Уточнены составы кожных пептидомов трех других видов: R. ridibunda, R. arvalis и R. temporaria (обитающей на территории России). Установлены структуры 153 пептидов, из них ранее не описанных - 39. Первичные структуры пяти новых пептидов дополнительно подтверждены методом деградации по Эдману.

4. Показана возможность проведения межвидовой идентификации ранидных лягушек детальным МС2-профилированием неразделенных кожных секретов с применением ВЭЖХ-МС высокого разрешения, а также экспресс-профилированием с использованием ВЭЖХ-УФ и МАЛДИ-МС.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях

1. В.А. Горшков, К.А. Артеменко, Т.Ю. Сайгона, А.Т. Лебедев Влияние органических добавок на увеличение интенсивностей сигнала протонированных пептидов в масс-спектрах МАЛДИ. Масс-спектрометрия, 2007, 4(1), 5-11.

2. T.Yu. Samgina, К.А. Artemenko, V.A. Gorshkov, A.T. Lebedev, M.L. Nielsen, M.L. Savistski, R.A. Zubarev. Electrospray ionization tandem mass spectrometry sequencing of novel skin peptides from ranid frogs containing disulfide bridges. Eur. J. Mass Spectrom., 2007, 13(2), 155— 163.

3. Т.Ю. Самгина, K.A. Артеменко, B.A. Горшков, A.T. Лебедев. Биоактивные пептиды из кожных секретов ранидных лягушек: современные подходы к масс-спектрометрическому de novo секвенированию. Изв. Акад. Наук Серия Химическая, 2008, 57(5), 1061-1072.

4. T.Yu. Samgina, К.А. Artemenko, V.A. Gorshkov, N.B. Poljakov, A.T. Lebedev. Oxidation versus carboxamidomethylation of S-S bond in ranid frog peptides: pro and contra for de novo MALDI-MS sequencing. J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2008, 19(4), 479-487.

5. T.Yu. Samgina, K.A. Artemenko, V.A. Gorshkov, S.V. Ogourtsov, R.A. Zubarev, A.T. Lebedev. De novo sequencing of peptides secreted by the skin glands of the Caucasian Green Frog Rana ridibunda. Rapid Commun. Mass Spectrom., 2008, 22(22), 3517-3S25.

6. T.Yu. Samgina, K.A. Artemenko, V.A. Gorshkov, S.V. Ogourtsov, R.A. Zubarev, A.T. Lebedev. Mass spectromctric study of peptides secretcd by the skin glands of the brown frog Rana arvalis from the Moscow region. Rapid Commun. Mass Spectrom., 2009, 23(9), 1241-1248.

7. T.Yu. Samgina, S.V. Kovalev, V.A. Gorshkov, K.A. Artemenko, N.B. Poljakov, A.T. Lebedev. N-Terminal Tagging Strategy for de novo Sequencing of Short Peptides by ESI-MS/MS and MALDI-MS/MS. J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2010, 21(1), 104-111.

8. T.Yu. Samgina, V.A. Gorshkov, K.A. Artemenko, S.V. Kovalev, S.V. Ogourtsov, R.A .Zubarev, A.T. Lebedev. Novel natural peptides from Hyla arborea schelkownikowi skin secretion. Rapid Commun. Mass Spectrom., 2010, 24(12), 1749-1754.

9. B.A. Горшков. Масс-спектрометрическое секвенирование пептидов, выделенных ю кожных желез лягушки Rana arvalis. Материалы докладов XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых <Ломоносов», Секция «Химия», Москва, 2007, с. 321.

10. В.А. Горшков. Масс-спектрометрическое секвенирование пептидов, выделенных из кожных желез лягушки Rana arvalis. Материалы 2-ой Всероссийской конференции с международным участием "Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы", Москва, 2007, МБС-14.

11. T.Yu. Samgina, K.A. Artemenko, V.A. Gorshkov, A.T. Lebedev. Oxidation vs carboxy-methylation of S-S bond in frog peptides: pro and contra for de novo MALDI-MS sequencing. Proc. of the 55,b ASMS conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Indianapolis, IN, 2007, ThP-080.

12. A.T. Lebedev, S.V. Kovalev, V.A. Gorshkov, T.Yu. Samgina. Sequencing of the skin peptides secreted by Caucasian Common Tree Frog Hyla arbórea. Proc. 22nd Biennial Mass Spectrometry Conference in Australia and New Zealand, Sydney, Australia, 2009, p. 128.

13. C.B. Ковалев, B.A. Горшков, K.A. Артеменко. Масс-спектрометрическое de novo секвенирвоание коротких пептидов: N-коицевая модификация как способ получения надежных спектров. Материалы 3-ей Всероссийской конференции с международным участием "Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы", Москва, 2009, МБУ-2.

14. Т.Ю. Самгина, В.А. Горшков, Е.А. Воронцов, А.Т. Лебедев. Практические аспекты масс-спектрометрического de novo секвенирования биоактивных пептидов ранидных и хилидных лягушек. Материалы IV Всероссийского симпозиума "Белки и пептиды ", Казань, 2009, с. 135.

15. T.Yu. Samgina, S.V. Kovalev, Y.A. Vorontsov, V.A. Gorshkov., A.T. Lebedev. Bioactive peptides in the skin secretion of ranid and hylyd frogs: complex approach for the mass-spectrometric de novo sequencing. Proc. of 57th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Philadelphia, PA, 2009, ThP-186.

16. T.Yu. Samgina, V.A. Gorshkov, K.A. Artemenko, S.V. Kovalev, Ye.A. Vorontsov, S.V. Ogurtsov, A.T. Lebedev. Mass spectrometric sequencing of the skin peptides of amphibian inhabiting the territory of Russian Federation. Proc. 6th International Symposium on Amphibian and Reptilian Endocrinology and Neurobiology, Berlin, Germany, 2009, p. 22,

17. T.Yu. Samgina, V.A. Gorshkov, R.A. Zubarev, K.A. Artemenko, A.T. Lebedev. FT-ICR MS study of the skin peptidome of ranid and hylid frogs. Proc. 9th European FTMS Workshop, Lausanne, Switzerland, 2010, p. 41.

18. T.Yu. Samgina, V.A. Gorshkov, K.A. Artemenko, S.V. Kovalev, Ye.A. Vorontsov, R.A. Zubarev, A.T. Lebedev. Amphibian skin peptidome: efficiency of mass spectrometric elucidation. Proc. of 58th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Salt Lake City, UT, 2010, TP-11.

Благодарности.

Автор выражает благодарность к.х.н. Самгиной Т.Ю. (Химический факультет МГУ), к.б.н. Огурцову С.В. (Биологический факультет МГУ), проф. Артеменко K.A. (Uppsala University, Sweden) за ценные консультации в процессе данного исследования, а также Полякову Н.Б. (ИБХ РАН), проф. Зубареву Р.А. (Karolinska Institutet, Sweden) и проф. P. Schmitt-Kopplin (HemholtzZentrum Munich, Germany) за предоставленные приборные возможности.

Подписано в печать:

10.09.2010

Заказ № 4092 Тираж -120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Роль пептидов в живых организмах.

1.1.1. Коммуникативные пептиды.

1.1.2. Мембраноактивные пептиды.

1.1.2.1. Строение мембраноактивных пептидов.

1.1.2.2. Механизм действия мембраноактивных пептидов.

1.1.2.3. Ингибиторы синтеза N0.

1.2. Пептиды из кожных секретов амфибий семейства Anura.

1.2.1. Синтез пептидов в организме амфибий.

1.2.2. Амфибии рода Rana и Hyla.

1.2.3. Кожные пептиды ранидных лягушек.

1.2.3.1. Мембраноактивные пептиды.

1.2.3.1.1. Активность дисульфидсодержащих пептидов.

1.2.3.1.2. Пептиды, несодержащие дисульфидной связи.2Р

1.2.3.2. Нейропептиды ранидных лягушек.

1.2.3.2.1. Тахикинины.

1.2.3.2.2. Ранатензины ибомбезины.

1.2.3.2.3. Брадикинины.

1.2.4. Пептиды хилидных лягушек.

1.2.4.1. Мембраноактивные пептиды.

1.2.4.1.1. Семейство дермасептина.

1.2.4.1.2. Пептиды-антибиотики австралийских квакш.

1.2.4.2. Нейропептиды.

1.2.4.2.1. Каерулины.

1.2.4.2.2. Опиоидные пептиды.

1.2.4.2.3. Триптофиллины.

1.3. Секвенирование пептидов.

1.3.1. Химические методы.

1.3.1.1. Метод Эдмана.

1.3.1.2. Леддерное секвенирование.

1.3.2. Методы генной инженерии.

1.3.3. Масс-спектрометрическое секвенирование пептидов и белков.

1.3.3.1. Применяемые для секвенирования пептидов методы ионизации.

1.3.3.1.1. Ионизация электрораспылением (ЭР).

1.3.3.1.2. Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (МАЛДИ).

1.3.3.2. Тандемная масс-спектрометрия.

1.3.3.2.1. Диссоциация, активированная соударениями (ДАС).

1.3.3.2.2. Диссоциация при захвате (ДЭЗ) или переносе электрона (ДПЭ).

1.3.3.2.3. Фрагментация в МАЛДИ.

1.3.3.3. Комплементарность различных способов активации фрагментации полипептидных цепей.

1.3.3.4. Сложности масс-спектрометрического секвенирования.

1.3.3.4.1. Изомерные и изобарные аминокислоты.

1.3.3.4.2. Внутримолекулярная днсульфидная связь.

1.3.3.4.3. Масс-спектрометрические методы разрушения S-S связей.

1.3.3.4.4. Газофазная циклизация Ъ- и я-ионов коротких пептидов.

1.3.3.5. Модификация N-концевой аминогруппы.

1.3.3.5.1. Введение незаряженной группы на N-конец пептида.

1.3.3.5.2. Введение отрицательно заряженной группы на N-конец пептида.

1.3.3.5.3. Введение положительно заряженной группы на N-конец пептида.

2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

2.1. Оптимизация процедуры получения кожных секретов.

2.2. Оптимизация ВЭЖХ разделения кожных секретов.

2.3. Детальное масс-спектрометрическое профилирование кожных секретов ранидных и хилидных лягушек.

2.3.1. Комплементарность результатов de novo секвенирования полученных в режимах ДАС и ДЭЗ.

2.3.2. Ранидные лягушки.

2.3.2.1. Комплементарность процедур карбоксамидометилирования и окисления дисульфидных связей ранидных пептидов.

2.3.2.2. Побочные реакции, зафиксированные при карбоксамидометилировании и окислении дисульфидных связей.

2.3.2.3. Кожный пептидом озерной лягушки, Rana ridibunda.

2.3.2.4. Кожный пептидом прудовой лягушки, Rana lessonae.

2.3.2.5. Кожный пептидом съедобной лягушки, Rana esculenta.

2.3.2.6. Кожный пептидом травяной лягушки, Rana temporaria.

2.3.2.7. Кожный пептидом остромордой лягушки, Rana arvalis.

2.3.3. Хилидные лягушки.

2.3.3.1. Газофазная циклизация Ъ- и а-ионов коротких пептидов.

2.3.3.2. Изучение трех способов предотвращения циклизации ионов коротких пептидов.

2.3.3.3. Кожный пептидом квакши обыкновенной, Hyla arborea.

2.4. Экспресс-профилирование кожных секретов ранидных лягушек.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ВЫВОДЫ.

В процессе длительной эволюции для защиты от хищников и паразитов амфибии выработали высокосложный химический арсенал. Секрет, выделяемый их кожными железами в стрессовых ситуациях, помогает им эффективно противостоять внешней агрессии. В его составе присутствуют соединения с высокой биологической активностью, большая их часть относится к классу пептидов. Изученные к настоящему моменту пептиды амфибий проявляют антимикробные, противовирусные, противоопухолевые свойства, могут противодействовать паразитическим грибам и простейшим. Некоторые из них обладают нейроактивностыо и выполняют регуляторные функции в организмах продуцирующих их амфибий. Высокая степень сходства многих пептидов земноводных с пептидами млекопитающих делает их изучение актуальным для понимания физиологии в том числе и человека.

Постоянная эволюция патогенных микроорганизмов способствует появлению резистентных к существующим антибиотикам штаммов и, тем самым, вынуждает расширять поиск новых веществ, эффективных в борьбе с бактериями. Преимуществом антимикробных пептидов, в том числе кожных пептидов амфибий, в сравнении с традиционными антибиотиками является то, что их механизм действия исключает привыкание к ним со стороны патогенных микроорганизмов.

Классические биохимические методы определения структур белков и пептидов в настоящее время практически полностью вытеснены масс-спектрометрическим секвенированием. Оно оказалось более быстрым, простым и чувствительным методом,, что резко уменьшило необходимое для анализа количество образца без ущерба надежности получаемых результатов. Основной и наиболее трудоемкой задачей масс-спектрометрического секвенирования является так называемое de novo секвенирование, т.е. установление структуры абсолютно неизвестного пептида.

В силу неоднородности состава кожные выделений амфибий чрезвычайно сложны даже для масс-спектрометрического исследования. Они содержат пептиды разной длины от 5 до 46 аминокислот) и природы (гидрофильность, зарядное состояние и т. д.); часто осложненные С-терминальным дисульфидным кольцом; Ь- и а-ионы коротких пептидов самопроизвольно циклизуются в газовой фазе масс-спектрометра. Концентрации отдельных компонентов пептидной смеси различаются на порядки, что может приводить к потере информации как о минорных, так и о мажорных ее составляющих в процессе массспектрометрического эксперимента. Таким образом, изучение состава кожных секретов амфибий, содержащих поистине уникальные биоактивные вещества, разработка и развитие новых подходов к анализу многокомпонентных смесей природных пептидов 6 неизвестной структуры, а также повышение эффективности их de novo секвенирования являются актуальными задачами современной науки.

Целью данной работы является апробация нового масс-спектрометрического подхода к de novo секвенированию пептидных компонентов кожных секретов лягушек, объединяющего два способа активации фрагментации пептидных цепей (соударениями и захватом электрона) с простыми химическими модификациями компонентов кожных секретов.

В работе решались следующие задачи:

1. Установление состава кожных выделений пяти видов ранидных лягушек (R. ridibunda, R. lessonae, R. esculenta, R. temporaria и R. arvalis), используя сумму параллельных процедур модифицирования внутримолекулярной дисульфидной связи: восстановление с последующим карбоксамидометилированием и окисление их надмуравьиной кислотой.

2. Сравнительное изучение трех способов модификации N-концевой КНг-труппы коротких пептидов с дальнейшим применением наиболее эффективного из них для анализа кожного секрета квакши обыкновенной Hyla arborea.

3. Изучение возможности проведения межвидовой идентификации ранидных. лягушек детальным МС2-профилированием неразделенных кожных секретов с применением ВЭЖХ-МС высокого разрешения, а также экспресс-профилированием с использованием ВЭЖХ и МАЛДИ-МС.

1. Обзор литературы

Выводы

1. Разработан и практически применен новый подход к de novo секвенированию неизвестных пептидов в составе природных смесей (кожных секретов ранидных и хилидных лягушек). Он сочетает в себе использование двух методов активации фрагментации пептидных связей: соударениями (ДАС) и захватом электронов (ДЭЗ) с простыми химическими модификациями кожного субстрата.

2. Изучены три способа модификации N-концевой аминогруппы коротких пептидов для предотвращения газофазной циклизации их Ъ- и а-ионов.

3. Впервые установлены составы кожных секретов трех видов лягушек: R. lessonae, R. esculenta и Ну la arbor еа. Уточнены составы кожных пептид омов трех других видов: R. ridibunda, R. arvalis и R. temporaria (обитающей на территории России). Установлены структуры 153 пептидов, из них ранее не описанных — 39. Первичные структуры пяти новых пептидов дополнительно подтверждены методом деградации по Эдману.

4. Показана возможность проведения межвидовой идентификации ранидных лягушек детальным МС2-профилированием неразделенных кожных секретов с применением ВЭЖХ-МС высокого разрешения, а также экспресс-профилированием с использованием ВЭЖХ-УФ и МАЛДИ-МС.

1. Jablonka Е., Lachmann М., Lamb MJ. Evidence, mechanisms and models for the inheritance of acquired characters. // J. Theor. Biol. 1992. V. 158. № 2. P. 245-268.

2. Egger G., Liang G., Aparicio A., Jones P.A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. // Nature. 2004. V. 429. № 6990. P. 457-463.

3. File S.E., Fluck E., Fernandes C. Beneficial effects of glycine (bioglycin) on memory and attention in young and middle-aged adults. // J. Clin. Psychopharmacol. 1999. V. 19. № 6. P. 506-512.

4. Viu E., Zapata A., Capdevila J., Skolnick P., Trullas R. Glycine(B) receptor antagonists and partial agonists prevent memory deficits in inhibitory avoidance learning. // Neurobiol. Learn. Mem. 2000. V. 74. № 2. P. 146-160.

5. McEntee W.J., Crook Т.Н. Glutamate: its role in learning, memory, and the aging brain. // Psychopharmacology (Berl). 1993. V. 111. № 4. P. 391-401.

6. Hooi D.S., Bycroft B.W., Chhabra S.R., Williams P., Pritchard D.I. Differential immune modulatory activity of Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing signal molecules. // Infect. Immun. 2004. V. 72. № 11. P. 6463-6470.

7. Jurgens M., Schrader M. Peptidomic approaches in proteomic research. // Curr. Opin. Mol. Ther. 2002. V. 4. № 3. P. 236-241.

8. Schulz-Knappe P., Zucht H.D., Heine G., Jurgens M., Hess R., Schrader M. Peptidomics: the comprehensive analysis of peptides in complex biological mixtures. // Comb. Chem. High Throughput Screen. 2001. V. 4. № 2. P. 207-217.

9. Strand F.L. Neuropeptides: general characteristics and neuropharmaceutical potential in treating CNS disorders. // Prog. Drug Res. 2003. V. 61. № 1-37.

10. Soloviev M., Shaw C., Andren P. Peptidomics: Methods and Applications. Hoboken, NJ, USA: John Wiley & Sons, Inc., 2008. 409 p.

11. Hummon A.B., Amare A., Sweedier J.V. Discovering new invertebrate neuropeptides using mass spectrometry. // Mass Spectrom. Rev. 2006. V. 25. № 1. P. 77-98.

12. Robas N.M., Fidock M.D. Identification of orphan G protein-coupled receptor ligands using FLIPR assays. // Methods Mol. Biol. 2005. V. 306. № 17-26.

13. Kimbrell D.A., Beutler B. The evolution and genetics of innate immunity. // Nat. Rev. Genet. 2001. V. 2. № 4. P. 256-267.

14. Steiner H., Hultmark D., Engstrom A., Bennich H., Boman H.G. Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity. // Nature. 1981. V. 292. № 5820. P. 246-248.

15. Zasloff M. Magainins, a class of antimicrobial peptides from Xenopus skin: isolation, characterization of two active forms, and partial cDNA sequence of a precursor. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. № 15. P. 5449-5453.

16. Bechinger В., Zasloff M., Opella S.J. Structure and orientation of the antibiotic peptide magainin in membranes by solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy. // Protein Sci. 1993. V. 2. № 12. P. 2077-2084.

17. Romeo D., Skerlavaj В., Bolognesi M., Gennaro R. Structure and bactericidal activity of an antibiotic dodecapeptide purified from bovine neutrophils. // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. № 20. P. 9573-9575.

18. Selsted M.E., Harwig S.S., Ganz Т., SchillingJ.W., Lehrer R.I. Primary structures of three human neutrophil defensins. // J. Clin. Invest. 1985. V. 76. № 4. P. 1436-1439.

19. Selsted M.E., Novotny M.J., Morris W.L., Tang Y.Q., Smith W., Cullor J.S. Indolicidin, a novel bactericidal tridecapeptide amide from neutrophils. // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. № 7. P. 4292-4295.

20. Matsuzaki K. Why and how are peptide-lipid interactions utilized for self-defense? Magainins and tachyplesins as archetypes. // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1462. № 1-2. P. 1-10.

21. Yang L., Weiss T.M., Lehrer R.I., Huang H.W. Crystallization of antimicrobial pores in membranes: magainin and protegrin. // Biophys. J. 2000. V. 79. № 4. P. 2002-2009.

22. Shai Y. Mechanism of the binding, insertion and destabilization of phospholipid bilayer membranes by alpha-helical antimicrobial and cell non-selective membrane-lytic peptides. // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1462. № 1-2. P. 55-70.

23. Zasloff M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. // Nature. 2002. V. 415. № 6870. P. 389-395.27.28,2930,31,32,33,34,35,36.37,38.