Получение и применение изотопомеров белков для количественного масс-спектрометрического определения белков в биологических объектах

Манойлов, Александр Владимирович

Получение и применение изотопомеров белков для количественного масс-спектрометрического определения белков в биологических объектах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Манойлов, Александр Владимирович АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Санкт-Петербург МЕСТО ЗАЩИТЫ

2013 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.02 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Получение и применение изотопомеров белков для количественного масс-спектрометрического определения белков в биологических объектах»

Автореферат диссертации на тему "Получение и применение изотопомеров белков для количественного масс-спектрометрического определения белков в биологических объектах"

На правах рукописи

МАНОЙЛОВ АЛЕКСАНДР ВЛАДИМИРОВИЧ

ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ ИЗОТОПОМЕРОВ БЕЛКОВ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ

Специальность 02.00.02 — Аналитическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 7 ЯНВ 2013

Санкт-Петербург 2012

005048454

Работа выполнена в лаборатории биомедицинской масс-спектрометрии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института аналитического приборостроения Российской академии наук (ИАП РАН)

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор Курочкин Владимир Ефимович, директор ИАП РАН

Официальные оппоненты:

Доктор физико-математических наук, профессор

Галль Николай Ростиславович (Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Физико-Технический Институт им. А.Ф. Иоффе Российской академии наук)

Доктор химических наук, профессор

Поваров Владимир Глебович (Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет», химический факультет)

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный политехнический университет», факультет медицинской физики и биоинженерии

Защита состоится 21 марта 2013 г в 15:00 на заседании диссертационного совета Д.212.232.37 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Средний проспект В.О., д. 41/43, БХА.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан «2е» декабря 2012 г. Ученый секретарь диссертационного совета, к.ф-м.н.

В.В. Панчук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Определение концентрации пептидов и белков - целевых продуктов при производстве лекарственных препаратов, диагностических наборов, реагентов для биохимических исследований - является актуальной задачей. В последние годы для определения концентрации белков, помимо традиционных методов анализа, успешно используются масс-спектрометрия. Это произошло после внедрения в практику мягких методов ионизации электроспрей (ESI-MS) и матричной лазерной десорбционной ионизации (МЛДИ, MALDI). Сегодня по достоверности идентификации и точности определения масс масс-спектрометрии нет равных. Тем не менее, при проведении количественных измерений белков в биопробах имеются трудности. Они связаны с тем, что интенсивности сигналов могут не соответствовать даже относительным концентрациям соединений, а абсолютные интенсивности - не воспроизводиться. В то же время, интенсивности изотопных распределений воспроизводятся хорошо и, более того, соответствуют теоретически рассчитанным соотношениям.

Именно этот факт используют в количественной масс-спектрометрии. Обычно для каждого анализируемого соединения применяют его изотопно-меченый аналог, называемый изотопомером. Он идентичен анализируемому соединению по химической структуре, но отличается изотопным составом.

Существуют три группы традиционных способов получения изотопомеров: метаболический, химический и ферментативный. Первый способ подразумевает добавление в питательную среду аминокислот, меченных стабильными изотопами D, |3С, 1SN и |80. Химический способ подразумевает использование модифицированного аналога анализируемого соединения в двух формах: первую - с природным изотопным составом (аналит), вторую -химически идентичную первой, но содержащую различные изотопы, такие как дейтерий, углерод |3С, l5N или кислород 180. Третьим способ подразумевает проведение ферментативного гидролиза в присутствии воды Н2'80. Таким образом получают пептидные фрагменты белка с изотопно-меченной карбоксильной группой. Их смешивают с аналогичным набором пептидных фрагментов белка с природным изотопным составом. Все перечисленные способы введения метки успешно применяют в практике, но они не свободны от различных недостатков.

А именно, метаболический способ нельзя применять для анализа биологических жидкостей (он подходит только для исследований in vivó).

Химический и ферментативный способы сопровождаются изменением структуры белка, что может существенно повлиять на его свойства. Кроме того, существующие коммерческие наборы, которые обеспечивают количественный масс-спектрометрический анализ, - достаточно дороги, не являются универсальными и рассчитаны лишь на ограниченный список конкретных соединений.

Таким образом, поиск способа получения изотопомеров белков без нарушения их химической структуры является актуальной задачей.

Цель и задачи работы

Целью диссертационной работы была разработка способа масс-спектрометрического определения концентрации индивидуальных белков без нарушения их химической структуры.

Для достижения цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Разработать способ получения стабильных изотопомеров белков и пептидов без нарушения их химической структуры.

2. Изучить процесс дезамидирования остатков аспарагина и глутамина в условиях изотопного обмена.

3. Разработать подходы для масс-спектрометрического определения концентрации индивидуальных белков с использованием предложенного нового способа получения изотопомеров путем проведения модельных экспериментов.

4. Разработать схемы масс-спектрометрического определения концентрации индивидуальных белков сыворотки крови: альбумина, агантитрипсина, а2-макроглобулина, а также — активности стрептокиназы в коммерческих лекарственных препаратах для апробации предложенного нового способа получения изотопомеров.

Научная новизна

1. Предложен способ масс-спектрометрического определения концентрации индивидуальных белков с использованием стабильных изотопомеров.

2. Разработан новый способ получения стабильных изотопомеров пептидов и белков без разрушения пептидных связей, основанный на обмене кислорода 160 на о в карбоксильных группах этих соединений в воде н218о в присутствии трифторуксусной кислоты (TFA).

3. Показано, что изотопную метку можно вводить на любой стадии пробоподготовки - как до триптического гидролиза, так и после.

Практическая значимость работы

1. Предложенный способ получения изотопомеров является универсальным решением для любых пептидов, белков, а также их смесей. Аминокислотные остатки, которые подвергаются обмену (Asp и Glu), присутствуют практически во всех белках, к тому же в любых неамидированнх пептидах есть С-концевая карбоксильная группа.

2. Разработаны схемы количественного определения белков сыворотки крови, а также ряда белков, содержащихся в лекарственных препаратах.

Положения, выносимые на защиту

1. Новый способ получения стабильных изотопомеров пептидов и белков, заключающийся в обработке образца водой н2'8о в присутствии трифторуксусной кислоты при нагревании.

2. Скорости дезамидирования остатков аспарагина и глутамина в условиях изотопного обмена.

3. Схема проведения масс-спектрометрического определения концентрации белков с помощью нового способа получения изотопомеров.

4. Схемы масс-спектрометрического определения концентрации белков альбумина, ai-антитрипсина, сь-макроглобулина в сыворотке крови, а также — активности стрептокиназы в лекарственных препаратах, содержащих стрептокиназу.

Степень достоверности результатов проведенных исследований

Представленные в диссертационной работе результаты прямых и косвенных измерений получены с использованием независимых физико-химических методов исследования, таких как количественная высокоэффективная жидкостная хроматография, количественная масс-спектрометрия, УФ-спектроскопия. Каждое измерение повторяли от 3-х до 7-ми раз. При определении концентрации белков по триптическим пептидам получалось до 20-ти триптических пептидов смеси аналита и его изотопомера. На основании определения соотношения анализируемого образца и стандарта некоторого количества триптических пептидов (не менее 3-х) получался результат с достоверностью 95%.

Личный вклад автора Изначально идея введения изотопной метки с использованием трифторуксусной кислоты была высказана и опробована доктором химических наук O.A. Миргородской. Но до начала работы автора публикаций, описывающих способ введения метки, изложенный в положении 1, не было. Все эксперименты, проведенные в Лаборатории биомедицинской масс-спектрометрии Учреждения Российской академии наук Института аналитического приборостроения Российской академии наук (ИАП РАН), выполнены автором лично. Полученные масс-спектрометрические данные обрабатывались автором лично. Помимо этого, проделанные эксперименты на приборе с ионизацией «электроспрей» повторены O.A. Миргородской на приборе Bruker Ultraflex с ионизацией MALDI (Институт биомедицинской химии РАМН, Москва). Также в рамках данной работы предложены и апробированы алгоритмы для расчета соотношения аналита и внутреннего стандарта на основе масс-спектра смеси. Автор алгоритмов - к.ф.-м.н. Козьмин Ю.П. Постановка задач и обсуждение результатов проводилась автором совместно с O.A. Миргородской.

Апробацпя работы

Работа апробирована на четырех конференциях, в том числе на 18-той международной масс-спектрометрической конференции 2009 года в Г. Бремен и V-м международном научном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», в 2009-м году в Москве. Работа поддержана грантом

4/04.05/035 для студентов, аспирантов вузов и академических институтов, расположенных на территории Санкт-Петербурга.

Публикации

Разработанный новый способ получения изотопомеров защищен патентом РФ с приоритетом от 13.02.2008. Основные результаты работы опубликованы в четырех научных статьях, в журналах, входящих в перечень ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, 3-х глав, раздела «Материалы и методы», заключения и списка литературы, состоящего из 89 источников. Материал содержит 116 страниц, 38 рисунков и 13 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обосновывается актуальность темы диссертационной работы, формулируется научная новизна и практическая значимость полученных результатов, а также приводятся основные положения, выносимые на защиту. В конце раздела формулируются цель и задачи диссертации.

Глава 1. Обзор литературы по теме исследования

Обзор литературы состоит из 5-ти разделов. В первом разделе приведено описание методов ионизации в масс-спектрометрии ESI и MALDI, второй раздел посвящен обзору существующих к настоящему времени способов введения изотопной метки для масс-спектрометрического определения концентрации белков. Третий раздел посвящен описанию процесса дезамидирования остатков аспарагина и глутамина: приведены схема дезамидирования и скорости его протекания в различных средах. В четвертом разделе описано строение и свойства белков сыворотки крови, определение концентраций которых проделано в настоящей работе. В пятом разделе главы 1 сформулированы цель и перечислены задачи работы.

Материалы и методы

В данном разделе охарактеризованы реактивы, использованные в работе; характеристики пептидов и белков приведены в виде таблицы. В ней отображены названия, моноизотопные молекулярные массы, первичная структура и количество карбоксильных групп. Далее приведено описание приборов, на которых проводили анализ. Описаны стандартные методики, использованные в работе.

Глава 2. Получение изотопно-модифицированных пептидов и белков для масс-спектрометрического определения их концентрации.

До начала настоящей работы в публикации [1] была продемонстрирована возможность получения подходящих 180-меченых внутренних стандартов для

ряда аминокислот, путем обмена с водой Н2'80 в кислой среде. На примере аминокислот Lys, Arg, His, Phe и Туг было показано, что при их инкубации в воде Н2,80 в присутствии 20% TFA при 20°С в течение 5-7 дней (или 8 часов при 100°С) в карбоксильных группах обменивалось более 75% |60 на ,80. Однако использованные в [1] процедуры оказались разрушительными для пептидов и белков. При выдерживании их в указанных выше условиях происходил разрыв пептидных связей. В то же время, получение изотопомеров белков и пептидов расширяет набор белков, концентрацию которых можно определить с помощью масс-спектрометрии.

Для экспериментальной оценки возможности введения |80 в карбоксильные группы был использован пептид 0-А1а:,Ьеи5,Л^''-энкефалин (даларгин) со структурой YAGFLR. На Рисунке 1 приведен масс-спектр этого пептида до и после обмена.

Рисунок 1. ESI-масс-спектр пептида даларгина до обмена (А) и после обмена в течение 180 мин при температуре 50°С в 8.2% TFA (Б).

Обмен природного изотопа кислорода на кислород 180 происходит в трех типах карбоксильных групп - С-концевой, а также - в карбоксильных группах боковой цепи аспарагиновой (Asp) и глутаминовой (Glu) кислот. В случае если модифицируется одна карбоксильная группа, как на Рисунке 1, происходит увеличение массы соединения до 4-х Дальтон. Прежде всего, следует ввести понятие степени включения метки (п|80 или п(18)0). Понятие п(18)0 является суммой содержания форм с одним, двумя, тремя и так далее атомами |80. Значение п(18)0 может быть вычислено по формуле:

где I — интенсивность сигнала, a i — номер сигнала.

В настоящей работе оценена скорость обмена в зависимости от концентрации ТФУ и температуры. Контроль за изотопным обменом осуществляли с использованием ESI-MS. В качестве модельного пептида

использовали также даларгин. Кроме этого, с помощью масс-спектрометрии контролировали наличие возможных продуктов гидролиза.

Для получения зависимости скорости изотопного обмена, как от температуры, так и от кислотности среды, величины п(18)0 были рассчитаны для каждого образца, см. Рисунки 2 и 3.

0.75

« 0.5

0,25

40 т.-с

Рисунок 2. Зависимость степени включения ,80 в даларгин за 30 мин в 8.2% ТФУ от температуры

На основании полученных данных для пептидов с С-концевыми карбоксильными группами можно выбрать подходящие условия получения стандартов с достаточной степенью обмена для проведения эксперимента. Анализируя полученные графики, можно сказать, что оптимальными условиями введения изотопа 180 является температура 50°С и рН 0.5 (трифторуксусная кислота с концентрацией 8.2% или 0.74 М). При повышении температуры и концентрации кислоты скорость обмена возрастает незначительно, но при этом может происходить разрыв пептидных связей.

Рисунок. 3. Зависимость степени включения 180 в даларгин от рН раствора при температуре 50°С за 30 мин.

В специальных экспериментах оценена стабильность полученных изотопомеров в средах, наиболее часто используемых при работе с образцами в биохимических и других экспериментах, например при ВЭЖХ. Проведен эксперимент, в рамках которого исследовали зависимость величины п(18)0 изотопомера пептида ангиотензина II в различных средах от времени при комнатной температуре. Результаты, а также описание сред, представлены на Рисунке 4 в виде диаграмм. Погрешность составила 5-8%, как видно из доверительных интервалов.

Из полученных данных следует, что полученные изотопомеры — достаточно стабильны в широком диапазоне рН, в том числе при типичных условиях высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), используемой для разделения пептидов и для Е81-М5 при обессоливании образцов.

Для получения практически всех необходимых изотопомеров пептидов в работе использовали ТФУ с концентрацией 8.2% (0.74 М) и Т = 50°С, время для разных образцов выбирали экспериментально по результатам масс-спектрометрического анализа. В связи с тем, что в этих условиях хотя и сохранялись пептидные связи, можно было ожидать частичное дезамидирование.

И РА 10%

аТРА0,1%

вТРА1%

КПТА10 %

Рисунок 4. Зависимость степени включения метки |80 в различных средах от времени. И А - муравьиная кислота, ТРА - трифторуксусная кислота, Т = 25°С.

В работе проведено измерение скорости дезамидирования остатков аспарагина и глутамина в условиях изотопного обмена. В результате эксперимента получены константы скорости первого порядка дезамидирования

остатков аспарагина и глутамина. Константа скорости дезамидирования остатка аспарагина составила 0.031±0.005 ч' , остатка глутамина - 0.108±0.017 ч"'. Эти константы скорости позволят определить степень превращения амида в кислоту во время получения изотопомера. В образующихся кислотах Asp и Glu может также проходить изотопный обмен.

Совокупность полученных данных позволяют предложить следующий механизм обмена (Рисунок 5):

он ОН] ----Л

н+

он

:-/ ^-► R--

он

+ОН

R-

он

H2,sO

он

н218о

-С—180Н2

-н+

он

-с—18он=

-н,0

180

// Н2,8О,Н+ с7 ■ \

он

он он

Рисунок 5. Предполагаемый механизм изотопного обмена.

180 <

18он

Сначала происходит протонирование карбоксильной группы, после чего образуется ковалентная связь С-|80 и уход группы ОН. Присоединение второго атома кислорода |80 происходит аналогичным образом. Следует также сказать, что все процессы, протекающие при обмене, являются обратимыми.

При повышении кислотности среды скорость изотопного обмена, как прямого, так и обратного, возрастает. Отсюда следует, что лимитирующей стадией изотопного обмена является протонирование карбоксильной группы.

Таким образом, разработан новый способ введения стабильной изотопной метки в белки и пептиды для определения их концентрации в биологических объектах. Это является решением задачи № 1. Главными достоинствами предлагаемого способа являются:

а) метод прост в осуществлении и требует 0.5-4 часа времени. Степень введения метки можно легко контролировать масс-спектрометрическим анализом (отобрать аликвоту из реакционной среды и провести масс-спектрометрический анализ). При необходимости процесс может быть остановлен разбавлением с последующим испарением летучих компонентов;

б) этот метод не требует химической модификации анализируемого образца и не загрязняет пробу посторонними примесями (тяжелая вода и TFA легко удаляются испарением). Это позволяет получать количественные данные, не нарушая протекания процессов, характерных для немодифицированного образца, в том числе не изменяется их хроматографическая и электрофоретическая подвижность;

в) метка стабильна в водных растворах при широком диапазоне рН и достаточно устойчива в биологических тканях, этот способ введения метки может быть использован для изучения кинетики метаболизма и ферментативной активности in vivo',

г) карбоксильные группы, по которым идет обмен, достаточно часто встречаются в природных белках. По этой причине этот метод определения

концентрации белков применим к любым карбоксилсодержащим соединениям.

Для определения концентрации белка аналит (биопробу) смешивают с его изотопомером (стандартом). Возникает вопрос, при каком их соотношении целесообразно проводить анализ. Для этого провели специальный эксперимент. Пептид ангиотензин II (ОЯУУШРР) смешивали с его изотопомером в разных соотношениях. Содержание стандарта составляло от 0 до 100% с шагом 10% (помимо этого добавлены точки с содержанием стандарта 5 и 95%). После чего с помощью масс-спектрометрии определяли реальное содержание стандарта в полученных смесях. Далее строили зависимость содержания стандарта, вычисленного в результате эксперимента, от заданного. Получилась прямая вида у = ах + Ь с определенным разбросом. Отклонение коэффициента а от единицы, а Ь от нуля свидетельствует о погрешности результатов проведенного эксперимента. В результате обработки экспериментальных данных получены коэффициенты а и Ь.

Коэффициенты а и Ь определяли на основании формул 2—4: г = иЪс,2 - (1_г,)2, (2) а = (1>',Ьс,2 - 1.у,х,Ъс,)/ г, (3) Ъ = (пЪу^, - (4)

В результате расчетов определены коэффициенты а и Ь: а = 1.02±0.02, Ь = 0.06±1.70.

Полученную прямую (Рисунок 6) разделили на 3 участка по содержанию стандарта: 1. от 0 до 20%; 2. от 30 до 70%; 3. от 80 до 100%. Среднеквадратичное отклонение на каждом участке (СКО) вычисляли по формуле (5):

где у, - вычисленное значение константы скорости, у, - среднее значение константы скорости, п — количество экспериментов.

В результате расчета СКО на каждом из участков графика оказалось, что при соотношении аналита и стандарта 1:1 ошибка составляет 1.8%, при содержании аналита 30% относительная ошибка определения составляет 3.0%, а при содержании аналита 10% относительная ошибка определения равна 16.2%; 5% - 32.4%. Таким образом, при содержании аналита в смеси со стандартом от 30 до 70% относительная ошибка определения не превышает 5%, что допустимо при проведении биохимических экспериментов.

содержаниэ стандарта, % (задано)

Рисунок 6. Зависимость содержания изотопомера, вычисленного в результате эксперимента, от заданного в смеси природного пептида ангиотензина II (DRVYIHPF) и его изотопомера при разных соотношениях.

Глава 3. Практическое использование изотопомеров 3.1. Схемы масс-спектрометрического определения концентрации белков

Помимо простых пептидов, изотопная метка может быть успешно введена и в высокомолекулярные соединения, такие как полипептиды и белки. Введение изотопа 180 в полипептиды и белки не имеет принципиальных отличий от введения их в пептиды. Однако в связи с высокими значениями молекулярных масс полипептидов и белков и их широким изотопным распределением, вводится дополнительная стадия ферментативного гидролиза (обычно, трипсинолиза). Это обеспечивает достаточное разрешение и точность измерения m/z для сигналов, относящихся к анализируемому соединению и внутреннему стандарту. Кроме того, знание значений m/z продуктов трипсинолиза обеспечивают дополнительный контроль при идентификации, необходимый для анализа интересующего объекта в смесях. Разнообразие продуктов трипсинолиза позволяет также выбирать среди них продукты с большим числом карбоксильных групп, которые более удобны для высокоточного определения концентрации цельных белков в биологических образцах.

В работе рассмотрены два альтернативных пути введения изотопной метки при определении концентрации белков, отличающиеся порядком проведения стадий обмена и гидролиза.

В первом случае обмену с водой Н2,80 подвергают продукты триптического гидролиза, в то время как сам гидролиз проводят раздельно для анализируемой пробы и внутреннего стандарта образца. При этом введение

метки происходит во все пептиды гидролизата - не только по карбоксилсодержащим аминокислотам, но и по С-концевым карбоксильным группам.

Во втором случае обмену с Н2'80 подвергают индивидуальные белки или их природную смесь, а затем полученное изотопно-меченое соединение смешивают с анализируемой пробой. Все последующие стадии обработки, включая трисинолиз, проба и внутренний стандарт проводят совместно в виде одной смеси. При этом мечеными окажутся не все пептиды гидролизата, а только те из них, которые содержат в своем составе остатки карбоксилсодержащих аминокислот (Asp и Glu). Однако это ограничение не принципиально, поскольку почти всегда среди продуктов гидролиза удается найти пептид, подходящий для определения концентрации цельного белка.

Каждый из этих путей имеет свои достоинства и недостатки, что порождает проблему выбора в зависимости от конкретной задачи. Введение метки непосредственно в анализируемые белки обладает тем преимуществом, что обеспечивает полную идентичность протекания трипсинолиза для каждого компонента пары. При определении концентрации белков в биопробах, в случае, когда необходимо проходить стадии разделения и очистки (например, электрофореза или хроматографии), сопровождающихся неминуемыми количественными потерями, этот путь становится фактически безальтернативным.

Схема определения концентрации белков и полипептидов, базирующаяся на прямом введении в них изотопной метки, сводится к осуществлению следующих стадий:

1. получение внутреннего стандарта с помощью обмена с Н2180 в кислой среде;

2. предобработка анализируемой пробы в аналогичных условиях, но в присутствии обычной воды;

3. объединение внутреннего стандарта и обработанного таким же образом образца для обеспечения идентичности протекания всех последующих стадий обработки. Для повышения точности определения концентрации белков желательно приготовить такие смеси в разных соотношениях, чтобы в анализируемой пробе интенсивности сигналов вещества и внутреннего стандарта были соизмеримыми;

4. трипсинолиз смеси;

5. фракционирование смеси пептидов с помощью ВЭЖХ (при использовании масс-спектрометра с ионизацией «электроспрей»;

6. масс-спектрометрический анализ гидролизатов;

7. обработка результатов с помощью специальной компьютерной программы, разработанной в рамках данной работы.

На Рисунке 7 приведен пример количественного масс-спектрометрического анализа белков по их триптическим пептидам с использованием приведенной выше схемы на примере альбумина в сыворотке крови человека.

Среди ряда методов, применяемых для анализа, масс-спектрометрия с использованием изотопомеров обладает важным преимуществом, поскольку не требует предварительного фракционирования и при этом обеспечивает определение концентрации именно этого белка, т.к. анализ осуществляется по триптическим пептидам, исключительно относящихся к альбумину. Кроме того, каждое измерение концентрации белка с использованием его изотопомера повышает точность измерения по мере увеличения количества повторов эксперимента.

С использованием предложенного способа получения изотопомеров проведено определение концентрации альбумина человека в сыворотке крови для десяти образцов сыворотки крови. В результате оказалось, что образцы сыворотки крови с диагностированной патологией рака яичника имеют пониженную концентрацию альбумина по сравнению с нормой. Это соответствует выводам работы [2]. Действительно при некоторых видах рака концентрация альбумина понижена по сравнению с нормой.

621, 67 677^77 а^! 2£ т. ЙГЛЛЛА 380.395 1 ¡«Г2 Т4 . Ш.1.....».1 (ДА. 6138 01 А) Ю.Л л Л » Л

677.297 426,221 [¿76,299 674.266 1 | 1 з'т^гй | .НИШ» 822^479 К^.979 "ПТ 821,979 886 496 ЕЕ^Я. П 1 864.496 387.493 82Л2 Л Б) Ли

621,22. 677401 1 6?6.Э9й 678.400 | ( 820-, В1 а ц, ш [1 '.23 ¿ШчШ 680,606 |1 889.596 В | аша Т| ла, 1ЛА В)

Рисунок 7. Масс-спектры триптических пептидов альбумина. А) Исходный образец. Б) Полученный изотопомер, В) Их эквимолярная смесь. Слева направо: ТРУБОЯ (МН+ = 673.2), КУРдУБТРТЬУЕУБЯ (МН+ = 1639.9), АЕРАЕУБК (МН+ = 880.4), РКЮЬСЕЕ^К (МН+= 1226.6).

В данном примере практического применения изотопомеров следует отметить продемонстрированные две новые возможности. Во-первых, возможность осуществлять анализ без фракционирования в такой многокомпонентной среде как сыворотка крови. Во-вторых, большие перспективы использования изотопомеров для анализа функциональных белков, регулирующих протеолиз. Для стрептокиназы это - способность

активировать плазмииоген, которую определяли внесением изотопомера в качестве продукта, образующегося при определении эстеразной активности комплекса. Этот же подход успешно использован и для определения концентрации других функциональных белков в сыворотке крови человека-ai-антитрипсина (агАИ) и а2-макроглобулина (а2М). С использованием изотопомера М-(тозил)-аргинина (ТА) из определения эстеразной активности этих белков, являющиеся маркерами при диагностике ряда патологий, были измерены концентрации этих двух белков в 20 образцах сыворотки крови. В качестве субстрата использовали метиловый эфир ТЧ-(тозил)-аргинина (TAME). Все указанные возможности обеспечиваются тем, что полученные изотопомеры — достаточно устойчивы в биологических средах.

3.2. Определение активности стрептокиназы

В работе продемонстрированы возможности использования масс-спектрометрии для сравнительного анализа лекарственных препаратов содержащих белковый активатор плазминогена - стрептокиназу от разных производителей: Стрептокиназа "Белмедпрепараты", Беларусь (Стр-Бел); Стрептокиназа "KabiVitrum", Швеция (Стр-К) и Стрептокиназа "Behring Werke", Германия (Стр-BW). Для всех препаратов определена их функциональная активность. Она определена на основе их способности активировать плазмииоген при воздействии на сыворотку крови человека и появлению способности активированного стрептокиназой в эквимолярных соотношениях плазминогена гидролизовать субстрат TAME. Начальная скорость гидролиза этого субстрата также оценивалась масс-спектрометрически по образованию продукта реакции ТА, изотопомер которого был получен также путем изотопного обмена в Н2'80 в присутствии TFA. Результаты анализа представлены в таблице 1.

Из полученных данных следует, что наименьшей активностью обладает препарат Стр-Бел, хотя по данным, указанным на флаконе, она - максимальная из трех. Этот результат соответствует выводам работы [3], в которой отмечались значительные различия активности препаратов стрептокиназы от декларируемой, что может быть связано с ее лабильностью, как в процессе получения, так и хранения, и необходимостью контроля ее активности перед использованием.

Таблица 1

Удельная активность препаратов стрептокиназы

№ Препарат D280*, О. Е. Активность стрептокиназы, у.е.**, п=4

измерен. вычисл.

1 Стр-Бел Э.27±0.04 0.27±0.04 O.OlOiO.OOl

2 Стр BW Э.14±0.02 0.14±0.02 0.11 ±0.01

3 Стр-К 0.22±0.03 0.22±0.03 0.15±0.02

*В растворе концентрацией 1 мг/мл

** 1 у.е. = 1 мкмоль ТАМЕ/(1 мг препарата* 1 мин)

В разделе заключение приведено резюме всей работы, выявлены аспекты по практической значимости работы.

Основные результаты и выводы

1. Предложен способ введения изотопной метки, позволяющий в лабораторных условиях получать изотопомеры любых белков и пептидов без нарушения их химической структуры. Он заключается в обработке образца водой H2lsO в присутствии трифторуксусной кислоты при нагревании.

2. Определены скорости дезамидирования остатков аспарагина и глутамина. Константа скорости дезамидирования остатка аспарагина составила 0.031±0.005 ч", остатка глутамина — 0.108±0.017 ч"1. Эти константы скорости позволят определить степень превращения амида в кислоту во время получения изотопомера. В образующихся кислотах Asp и Glu может также проходить изотопный обмен.

3. Разработаны методические подходы для масс-спектрометрического определения концентрации белков в биологических объектах. Таким образом, расширен класс анализируемых белков. Показано, что изотопную метку можно вводить на любой стадии пробоподготовки — как до триптического гидролиза, так и после.

4. Разработаны новые схемы масс-спектрометрического определения концентрации белков сыворотки крови: альбумина, ai-антитрипсина, а2-макроглобулина, а также — активности стрептокиназы в лекарственных препаратах, содержащих стрептокиназу.

Список публикаций по теме диссертации

1 Бубляев P.A., Козьмин Ю.П., Краснов Н.В., Манойлов A.B., Миргородская O.A., Новиков A.B. Способ получения изотопно-модифицированных пептидов и белков // Патент РФ. RU № 2399627, с приоритетом от 13.02.2008.

2 Манойлов A.B., Новиков A.B., Бубляев P.A., Серебрякова М.В., Козьмин Ю.П., Краснов Н.В., Миргородская O.A.. Особенности включения стабильного изотопа |80 в сильнокислой среде в карбоксильные группы пептидов // Научное приборостроение, 2008, Т. 18, № 4, С. 61-72.

3 Манойлов A.B., Торопыгин И.Ю., Козьмин Ю.П., Краснов Н.В., Самус Н.Л., Новиков A.B., Бубляев P.A., Миргородская O.A.. Клиническая протеомика: новые диагностические возможности масс-спектрометрии // Научное приборостроение, 2008, Т. 18, №4, С. 16-23.

4 Манойлов A.B., Серебрякова М.В., Козьмин Ю.П., Миргородская O.A. Новая технология введения изотопной метки ,80 в карбоксилсодержащие соединения, включая пептиды и белки // V международный научный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва. 2009, Сборник тезисов, часть 1, С. 49-50.

5 Манойлов A.B., Миргородская O.A. Количественный масс-спектрометрический анализ функциональных белков плазмы крови без фракционирования // V международный научный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2009, Сборник тезисов, часть 1, С. 173.

6 Манойлов A.B., Серебрякова М.В., Козьмин Ю.П., Миргородская O.A. Прямое введение изотопа |80 в пептиды и белки для получения изотопомеров // Политехнический Симпозиум «Молодые ученые промышленности СевероЗападного региона». 2009, Сборник тезисов, С. 174—175.

7 Manoylov A.V., Serebryakova M.V., Kozmin Yu. P, Mirgorodskaya O.A. Direct Incorporation of the 180 Isotope into Peptides and Proteins for Quantitative Analysis // 18th International Mass Spectrometry Conference, Bremen. 2009, Abstract LS/SIT -03.

8 Манойлов A.B., Торопыгин И.Ю., Козьмин Ю.П., Новиков A.B., Бубляев P.A., Миргородская O.A. Комплексный анализ лекарственных препаратов содержащих стрептокиназу с использованием масс-спектрометрии // Научное приборостроение, 2010, Т. 20, №4, С. 120-128.

9 Козьмин Ю.П., Манойлов A.B., Серебрякова М.В., Миргородская O.A. Прямое введение изотопов |80 в пептиды и белки для количественного анализа // Биоорганическая химия, 2011, Т. 37, № 6, С. 793-806.

Список цитируемой литературы:

[1] Новиков A.B., Савельева Н.В., Краснов Н.В. [и др]. Использование ESI-MS и изотопно-меченых аминокислотных стандартов для определения концентрации белков // Научное приборостроение. Т. 12, № 4. 2002. С. 70-80.

[2] Rasouli М., Okhovatian А., Enderami А. Serum proteins profile as an indicator of malignancy: multivariate logistic regression and ROC analyses // Clin. Chem. Lab. Med. Vol. 43. N. 9. 2005. P. 913-918.

[3] Hermentin Р., Cuesta-Linker Т., Weisse J. [et al.]. Comparative analysis of the activity and content of different Streptokinase preparations // Eur. Heart J. Vol. 26. N. 9. 2005. P. 933-940.

Подписано в печать 19.12.12 Формат 60x84/16 печать цифровая Тираж 75 экземпляров ООО «КОПИСЕРВИС» 190103, г. Санкт-Петербург, 12-я Красноармейская, д. 32, лит. А, пом.

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Манойлов, Александр Владимирович, Санкт-Петербург

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

НАУКИ

ИНСТИТУТ АНАЛИТИЧЕСКОГО ПРИБОРОСТРОЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

МАНОИЛОВ Александр Владимирович

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени О кандидата химических наук

ю „

-г- Специальность:

(V) ^ 02.00.02 - Аналитическая химия

5з

СЧ| ^ Научный руководитель:

^^ Д.т.н., проф. Курочкин В.Е.

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Перечень используемых сокращений..............................................................................................5

Введение....................................................................................................................................................................7

Глава 1. Обзор литературы по теме исследования..............................................................14

1.1. Принципы работы масс-спектрометров и их источников ионизации

для анализа белков..............................................................................................................................................14

1.1.1. Масс-спектрометрия с ионизацией типа электроспрей....................................16

1.1.2. Масс-спектрометрия с матричной лазерной десорбционной ионизацией (МЛДИ, МА1ЛЭ1)..................................................................................................................19

1.1.3. Качественное и количественное определение белков с помощью технологии 8Е1Х)1............................................................................................................................................23

1.2. Масс-спектрометрическое определение концентрации белков..................25

1.2.1. Стадии пробоподготовки при проведении масс-

спектрометрического определения концентрации белков....................................25

1.2.2. Теория изотопного разбавления..........................................................................................26

1.2.3. Способы введения метки............................................................................................................27

1.2.3.1. Метаболический способ введения метки................................................................28

1.2.3.2. Химические способы введения метки....................................................................................29

1.2.3.3. Использование меченых синтетических аминокислот и

пептидов....................................................................................................................................................................40

1.2.3.4. Протеолитические способы введения метки..........................................................43

1.2.4. Масс-спектрометрическое определение концентрации белков без использования изотопов..................................................................................................................................................................45

1.2.5. Применение технологий получения изотопомеров для решения реальных задач в последние годы....................................................................................................47

1.2.6. Преимущества и недостатки существующих на данный момент способов получения изотопомеров белков..............................................................................48

1.3. Дезамидирование остатков аспарагина и глутамина............................................51

1 А. Свойства белков, использованных в работе..................................................................54

1.4.1. Свойства альбумина........................................................................................................................54

1.4.2. Альфа-1-антитрипсин....................................................................................................................60

1.4.2.1. Биохимические свойства..........................................................................................................................................61

1.4.2.2. Методы анализа а!-антитрипсина............................................................................................................62

1.4.3. Альфа-2-макроглобулин..................................................................................................................................................62

1.4.4. Стрептокиназа как активатор плазминогена................................................................................63

1.5. Цель и задачи работы................................................................................................................................................................64

Материалы и методы..........................................................................................................................66

Глава 2. Получение изотопно-модифицированных пептидов и белков

для масс-спектрометрического определения их концентрации......................................69

2.1 .Предпосылки для разработки нового способа получения

изотопомеров..........................................................................................................................................................................................................69

2.2. Новый способ получения изотопомеров..................................................................................................70

2.3. Оптимизация условий проведения изотопного обмена..................................................71

2.4. Дезамидирование в условиях изотопного обмена....................................................................76

2.5. Точность определения концентрации белков..................................................................................84

2.6. Выводы по главе 2..........................................................................................................................................................................88

Глава 3. Практическое использование изотопомеров....................................................89

3.1. Схемы масс-спектрометрического определения концентрации

белков............................................................................................................................................................................89

3.1.1. Схема масс-спектрометрического определения концентрации альбумина в сыворотке крови..............................................................................................................93

3.1.2. Схема масс-спектрометрического определения концентрации аг антитрипсина и а2-макроглобулина..........................................................................................95

3.2. Определение активности стрептокиназы........................................................................100

3.3. Выводы по главе 3..........................................................................................................................................................................103

Заключение................................................................................................................................................................103

Основные результаты и выводы.............................. ................................................................................104

Список публикаций по теме диссертации..................................................................................106

Список цитируемой литературы

Перечень использованных сокращений

2-D PAGE - двумерный полиакриламидный гель-электрофорез

агАТ, арАИ - аi-антитрипсин

а2М - а2-макроглобулин

Ang I (Анг. I) - ангиотензин I

Ang II (Анг. II) - ангиотензин II

БА - болезнь Альцгеймера

Da, Да — Дальтон

DiART - deiterium isobaric amino-reactive tags («дейтерированные изотопные метки, селективные к аминогруппе») DHB - 2,5-дигидроксибензойная кислота DMSO - диметилсульфоксид

ELISA - enzyme-linked immunosorbent analysis (иммуноферментный анализ, основанный на связывании ферментов)

ESI - electrospray ionization (ионизанция с электрораспылением) ETD - electron-transfer dissosiation (способ фрагментации ионов) FA - formic acid (муравьиная кислота)

HPLC (ВЭЖХ) - высокоэффективная жидкостная хроматография НССА — а-циано-4-гидроксикоричная кислота

ICAT - isotope-coded affinity tag («изотопно-модифицированная селективная метка»)

ICPL - isotope-coded protein labeling («изотопное мечение белков») IMAC - immobilized-metal affinity chromatography («иммобилизованная металл-специфичная хроматография»)

iTRAQ - isobaric tag for relative and absolute quantification («мечение заместителями с разным изотопным составом для абсолютного и относительного количественного анализа») IU - единица активности фермента

LDI - laser desorption ionization (лазерная десорбционная ионизация)

LC - liquid chromatography (жидкостная хроматография)

MALDI (МЛДИ) - matrix-assisted laser desorption/ionization (матричная

лазерная десорбционная ионизация)

MRM - multi-reaction monitoring (одновременный мониторинг нескольких реакций)

MS - mass spectrometry (масс-спектрометрия)

MS/MS - тандемный масс-спектрометрический анализ

NIT - N-isotope tagging (технология мечения с N-конца)

SELDI - surface enhanced laser desorption/ionization (лазерная десорбционная

ионизация на модифицированной поверхности)

SILAC - stable isotope-labeled amino acid culture («использование

аминокислот, меченных стабильными изотопами, для культуры клеток»)

TFA - trifluoroacetic acid (трифторуксусная кислота)

ТМТ - tandem mass tagging

TOF-time of flight

CKO - среднеквадратичное отклонение SK, Стр - стрептокиназа

SRM - selected reaction monitoring (мониторинг одной выбранной реакции) ТА - N-тозил-аргинин

TAME - метиловый эфир N-тозил-аргинина

Введение

Актуальность работы

Определение концентрации пептидов и белков - целевых продуктов при производстве лекарственных препаратов, диагностических наборов, реагентов для биохимических исследований - является актуальной задачей. В последние годы для определения концентрации белков, помимо традиционных методов анализа, успешно используются масс-спектрометрия. Это произошло после внедрения в практику мягких методов ионизации электроспрей (Е81-М8) и матричной лазерной десорбционной ионизации (МЛДИ, МАЫ)1). Сегодня по достоверности идентификации и точности определения масс масс-спектрометрии нет равных. Тем не менее, при проведении количественных измерений белков в биопробах имеются трудности. Они связаны с тем, что интенсивности сигналов могут не соответствовать даже относительным концентрациям соединений, а абсолютные интенсивности - не воспроизводиться. В то же время, интенсивности изотопных распределений воспроизводятся хорошо и, более того, соответствуют теоретически рассчитанным соотношениям.

1 3 1 ^

как дейтерий, углерод С или азот N. Третий способ подразумевает

проведение ферментативного гидролиза в присутствии воды Н2180. Таким путем получают пептидные фрагменты белка с изотопно-меченной карбоксильной группой. Их смешивают с аналогичным набором пептидных фрагментов белка с природным изотопным составом. Все перечисленные способы введения метки успешно применяют в практике, но они не свободны от различных недостатков.

А именно, метаболический способ нельзя применять для анализа биологических жидкостей (он подходит только для исследований ш vivo).

Химический и ферментативный способы сопровождаются изменением структуры белка, что может существенно повлиять на его свойства. Кроме того, существующие коммерческие наборы для получения изотопомеров -достаточно дороги, не являются универсальными и рассчитаны лишь на ограниченный список конкретных соединений.

Цель и задачи работы

Для достижения цели было необходимо решить следующие задачи:

2. Изучить процесс дезамидирования остатков аспарагина и глутамина в условиях изотопного обмена.

3. Разработать подходы для масс-спектрометрического определения концентрации белков с использованием предложенного нового способа получения изотопомеров путем проведения модельных экспериментов.

4. Разработать схемы определения концентрации белков сыворотки крови: альбумина, агантитрипсина, а2-макроглобулина, а также - активности стрептокиназы в коммерческих лекарственных препаратах для апробации предложенного нового способа получения изотопомеров.

Научная новизна

2. Разработан новый способ получения стабильных изотопомеров пептидов и

белков без разрушения пептидных связей, основанный на обмене кислорода

16 18 18 О на О в карбоксильных группах этих соединений в воде Н2 О в

присутствии трифторуксусной кислоты (TFA).

3.Показано, что изотопную метку можно вводить на любой стадии пробоподготовки - как до триптического гидролиза, так и после.

Практическая значимость работы

1. Предложенный способ получения изотопомеров является универсальным решением для любых пептидов, белков, а также их смесей. Аминокислотные остатки, которые подвергаются обмену (Asp и Glu), присутствуют практически во всех белках, к тому же в любых неамидированных пептидах есть С-концевая карбоксильная группа.

Положения, выносимые на защиту

1. Новый способ получения стабильных изотопомеров пептидов и белков,

заключающийся в обработке образца водой Н21О0 в присутствии трифторуксусной кислоты при нагревании.

2. Скорости дезамидирования остатков аспарагина и глутамина в условиях изотопного обмена.

4. Схемы масс-спектрометрического определения концентрации белков альбумина, аi-антитрипсина, а2-макроглобулина в сыворотке крови, а также - активности стрептокиназы в лекарственных препаратах, содержащих стрептокиназу.

Степень достоверности результатов проведенных исследований

Представленные в диссертационной работе результаты прямых и косвенных измерений получены с использованием независимых физико-химических методов исследования, таких как количественная высокоэффективная жидкостная хроматография, количественная масс-спектрометрия, УФ-спектроскопия. Каждое измерение повторяли от 3-х до 7-ми раз. При определении концентрации белков на основе их триптических пептидов получалось до 20-ти триптических пептидов смеси аналита и его изотопомера. На основании определения соотношения анализируемого образца и стандарта некоторого количества триптических пептидов (не менее 3-х) получали результат с достоверностью 95%.

Личный вклад автора

Изначально идея введения изотопной метки с использованием трифторуксусной кислоты была высказана и опробована доктором химических наук O.A. Миргородской. Но до начала работы автора публикаций, описывающих способ введения метки, изложенный в положении 1, не было. Все эксперименты, проведенные в Лаборатории биомедицинской масс-спектрометрии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института аналитического приборостроения

Российской академии наук (ИАП РАН), выполнены автором лично. Полученные масс-спектрометрические данные обрабатывались автором лично. Помимо этого, проделанные эксперименты на приборе с ионизацией «электроспрей» повторены O.A. Миргородской на приборе Bruker Ultraflex с ионизацией MALDI (Институт биомедицинской химии РАМН, Москва). Также в рамках данной работы предложены и апробированы алгоритмы для расчета соотношения аналита и внутреннего стандарта на основе масс-спектра смеси. Автор алгоритмов - к.ф.-м.н. Козьмин Ю.П. Постановка задач и обсуждение результатов проводилась автором совместно с О. А. Миргородской.

Апробация работы

Публикации

Структура и объем диссертации

Глава 1. Обзор литературы по теме исследования

Обзор литературы состоит из 5-ти разделов. В первом разделе приведено описание методов ионизации в масс-спектрометрии ESI и MALDI, второй раздел посвящен обзору существующих к настоящему времени способов введения изотопной метки для масс-спектрометрического определения концентрации белков. В третьем разделе: приведены возможные схемы дезамидирования остатков аспарагина и глутамина и указаны скорости его протекания в различных средах. В четвертом разделе описано строение и свойства белков сыворотки крови, определение концентраций которых проделано в настоящей работе. В пятом разделе главы 1 сформулированы цель и перечислены задачи работы.

Материалы и методы

Глава 2. Получение изо