Создание и применение методов количественной протеомики с использованием и без использования изотопного мечения тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.17 ВАК РФ
|
Агрон, Илья Александрович
АВТОР
|
||||
|
кандидата физико-математических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2011
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
01.04.17
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
Российская академия наук Институт энергетических проблем химической физики
На правах рукописи
АГРОН ИЛЬЯ АЛЕКСАНДРОВИЧ
Создание и применение методов количественной протеомики с использованием и без использования изотопного мечения
01.04.17 - химическая физика, горение и взрыв, физика экстремальных состояний вещества
4855342
автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук
Москва, 2011г.
4855342
Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте энергетических проблем химической физики РАН
Научный руководитель:
доктор физико-математических наук, профессор Николаев Евгений Николаевич
Официальные оппоненты:
Доктор физико-математических наук, профессор
Барашев Петр Петрович
Доктор химических наук Трофимов Алексей Владиславович
Ведущая организация:
Московский физико-технический институт (Государственный университет)
Защита состоится «-^i» СкХ. 2011г. в [[_ час. 00 мин. на заседании диссертационного совета Д 002.112.01 при Институте энергетических проблем химической физики Российской академии наук по адресу: 119334, г. Москва, Ленинский проспект, д. 38, корп.2, ИНЭП ХФ РАН.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики им. H.H. Семенова Российской академии наук.
Автореферат разослан ^/»¿Wf- 2011г.
Ученый секретарь
диссертационного совета Д.002.112.01 кандидат физико-математических наук
W-
Ларичев М.Н.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
Введение и актуальность проблемы
При помощи современных методов, основанных на масс-спектрометрическом анализе, можно исследовать биологические объекты самого разного происхождения и сложности. Это стало возможным благодаря открытию новых методов ионизации вещества: метода электроспрей и метода лазерной десорбции/ионизации из матрицы (МАЛДИ) - которые позволили переводить в газовую фазу и одновременно ионизировать большие биологические молекулы, такие как пептиды, белки и полинуклеотиды. Среди методов масс-спектрометрии, используемых в протеомных исследованиях, масс-спектрометрия ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (ИЦР ПФ) занимает особое место. Главными достоинствами этого метода являются: сверхвысокая разрешающая способность и рекордная точность измерения масс. С помощью современного масс-спаарометра ИЦР ПФ можно однозначно как идентифицировать индивидуальные биомолекулы, так и определять состав их смесей.
В настоящее время полностью расшифрованы геномы различных организмов, в том числе и человека. В связи с исследованиями многообразия белков, содержащихся в различных биологических объектах, возникла новая фундаментальная концепция, названная «протеом» (ПРОТЕиновое дополнение к генОМу). Создана новая дисциплина - протеомика, которая призвана дополнить и аннотировать информацию, содержащуюся в геномах. Современная масс-спекгрометрия (в том числе, и ИЦР ПФ) занимает передовые позиции в решении основной задачи протеомики идентификация белков. В настоящее время также ведется активная разработка масс-спекгрометрических методов количественного анализа протеомов.
Масс-спектрометр ИЦР ПФ обладает ограниченным динамическим диапозоном, в то же время, протеомы различных организмов содержат белки
в широком диапазоне относительных концентраций. И поэтому необходимо использовать масс-спекгрометрии ИЦР ПФ в комбинации с существующими методами разделения (жидкостная хроматография, электрофорез). Время удерживания пептида (продукта гидролиза белка энзимом трипсин) на хроматографе может являться дополнительным параметром при идентификации пептида.
В работе разрабатывались и оптимизировались методы, использующие масс-спектрометрию ИЦР ПФ для исследования протеомного состава одной из физиологических жидкостей человека - мочи. В работе были разработаны и использованы новые подходы для обработки и интерпретации полученных данных, в том числе, для сравнительного количественного анализа протеома. Также проводилась разработка подхода для совмещения методов атомно-силового микроскопа и масс-спектрометрии, где масс-спектрометрические методы использовались для идентификации молекул, обнаруживаемых АСМ.
Цели и задачи
1. разработать хромато-масс-спектрометрические методики анализа протеомного состава мочи человека;
2. разработать и применить в реальных исследованиях метод точной массово-временной метки для анализа протеома мочи;
3. создать новую базу данных, состоящую из точных массово-временных меток, для быстрого поиска и идентификации белков содержащихся в моче человека;
4. разработать методику сравнительного количественного анализа протеома, реального биологического объекта;
5. разработать подход масс-спектрометрической идентификации белков детектируемых методами атомно-силовой микроскопии.
Научная новизна работы
1. Создана база данных точных массово-временных меток триптических пептидов протеома мочи человека.
2. Создана новая процедура нормирования времен удерживания на колонке жидкофазного хроматографа триптических пептидов белков, содержащихся в моче человека, которая может быть использована для идентификации белков методом точных массово-временных меток.
3. Разработан новый метод для сравнительного количественного анализа на основе использования методов точной массово-временной метки и изотопного мечения с применением концепции гипотетической аминокислоты «аверашн» для коррекции значений интенсивности пиков пептидов в спектрах.
4. Исследован протеомный состав мочи здорового человека, при помощи новой хромато-масс-спектрометрической методики, основанной на методе точной массово-временной метки. Обнаружено 39 новых генных продуктов.
5. Предложен подход совместного использования методов атомно-силовой микроскопии и масс-спекгрометрии для идентификации и количественного определения содержания белков при сверхмалых концентрациях.
Практическая значимость работы
Разработанные хромато-масс-спектрометрические подходы для качественного и количественного анализа биологических жидкостей человека могут быть использованы при разработке методов диагностики различных патологий, вызванных, в том числе, заболеваниями.
Новая база данных точных массово-временных меток может использоваться для высокопроизводительного анализа протеома мочи человека при поиске биомаркеров различных заболеваний.
Подход, разработанный для идентификации белков, детектируемых методами атомно-силовой микроскопии может применяться для исследования других объектов, содержащихся в сверхнизких концентрациях в реальных биологических жидкостях.
Личный вклад автора
Материал, представленный в диссертации, получен при непосредственном участии автора как в постановке задачи, так и при проведении исследований. База данных точных массово-временных меток создавалась автором совместно с Д.М. Автономовым (ИНЭП ХФ РАН), И.А. Поповым (ИБХФ РАН) и A.C. Кононихиным (ИНЭПХФ РАН). Метод количественного анализа был разработан автором совместно с Д.М. Автономовым (ИНЭП ХФ РАН). Подход к совместному использованию методов атомно-силовой микроскопии и масс-спектрометрии был разработан совместно с A.C. Батуриным, Е.В. Дедковой (МФТИ (ГУ)). Диссертационная работа выполнена в Институте энергетических проблем химической физики Российской академии наук, в Лаборатории ионной и молекулярной физики, часть работ выполнялась автором параллельно в Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук в период с 2005 по 2011 год.
Защищаемые положения
1. новая база данных точных массово-временных меток триптических пептидов протеома мочи;
2. новый метод количественного анализа протеома физиологических жидкости человека, основанный на использовании методик точной массово-временной метки и изотопного мечения триптических пептидов изотопом 180;
3. новая процедура нормирования времен удерживания на хроматографической колонке и идентификации пептидов;
4. метод идентификации белков при сверхмалых концентрациях с использованием масс-спектрометрии и атомно-силовой микроскопии.
Апробация работы
Результаты работы докладывались на следующих российских и международных конференциях: 58-ая Ежегодная конференция американского масс-спектрометрического общества «Масс-спектрометрия и смежные темы», Солт Лейк Сити, США, 23-27 мая 2010; 4-я Всероссийская конференция «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и ее аналитические применения», Звенигород, Россия, 10 -14 октября 2010; 8-ая Международная конференция организации "Протеом Человека" (HUPO), Торонто, Канада, 26-30 сентября 2009; 57-ая Ежегодная конференция американского масс-спекгрометрического общества «Масс-спекгрометрия и смежные темы», Филадельфия, США, июнь 2009.
Публикации
Основное содержание диссертации опубликовано в работах, список которых приводится в конце автореферата. Работы, результаты которых изложены в диссертации выполнены при поддержке грантов РФФИ, 1NTAS, Миннауки.
Структура и объем диссертации
Работа изложена на^Рт^страницах, содержит /^рисунков и таблиц. Диссертация состоит из четырех глав, заключения и списка цитируемой литературы.
Список сокращений, используемых в тексте автореферата
ИЦР ПФ - ионный циклотронный резонанс с преобразованием Фурье; AMT - подход точной массово-временной метки (accurate mass and time tags database);
LC - высокоэффективная жидкофазная хроматография (liquid chromatography);
MS - масс-спектрометрия (mass-spectrometry); MS/MS - тандемная масс-спектрометрия;
CID - столкновительно-индуцированная фрагментация (collision induced dissociation);
ECD - фрагментация при захвате медленнего электрона (electron capture dissociation);
IRMPD - инфракрасная мультифотонная диссоциация (infrared multi photon dissociation);
ACM - атомно-силовая микроскопия.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Первая глава является литературным обзором, в котором дается краткое описание объекта исследования (моча человека), обсуждаются трудности и ограничения стандартных методов исследования протеома мочи (нисходящий и восходящий подходы протеомного анализа, подход точной массово-временной метки), обсуждаются возможности и преимущества применения масс-спектрометрии ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (ИЦР ПФ) в комбинации с различными методами фрагментации и ионизации биомакромолекул, с высокоэффективной жидкостной хроматографией и новыми методами обработки масс-спектров ИЦР.
Однозназначная идентификация, как индивидуальных биомакромолекул, так и их смесей напрямую связана с точностью измерения масс, поэтому в обзоре особое внимание уделено обсуждению этой характеристики.
Точность измерения масс и разрешение в масс-спектрометрии ИЦР ПФ Измеряемой величиной в масс-спектрометрии ИЦР ПФ является частота, по значению которой можно рассчитать массу иона используя общепринятое калибровочное выражение:
г ~ V, VI'
где т и г - масса и заряд иона, соответственно, - измеряемая частота. Коэфиценты А и В являются постоянными величинами и расчитываются при калибровке масс-спектрометра по двум или более известным массам. Выражение (1) получается в приближении одного иона и не учитывает влияние объемного заряда и кулон-кулоновского взаимодействия между ионами. На практике для более точных измерений используется внутренняя калибровка масс-спектрометра, когда в образце содержатся одновременно исследуемое вещество и калибрант, поскольку, ионы калибранта вместе с ионами исследуемого вещества, подвержены одинаковым эффектам,
искажающим точность измерения масс. Также проводят точные измерения с использованием внешней калибровки, при этом калибрант вводят отдельно от исследуемого вещества, если для каждого измерения в ИЦР ячейку захватывается примерно одинаковое число ионов.
В работе все измерения производились на гибридном масс-спектрометре Finnigan LTQ FT (Thermo Electron, Бремен, Германия; Рис. 1), который состоит из масс-спектрометра ИЦР ПФ со сверхпроводящим соленоидом (7 Тесла) и высокочувствительной линейной квадрупольной ионной ловушки.
Рис. 1. Схема гибридного масс-спектрометра Ршш§ап СГС? БТ.
Изображенный на Рис. 1 гибридныи масс-спектрометр является одним из самых современных приборов в своем классе и позволяет проводить измерения в режиме ИЦР ПФ с максимальным разрешением 11=500000 для т!г-400 и точностью измерения масс 2ррт (при использовании внешней калибровки). Главными достоинствами прибора являются автоматический контроль числа ионов в масс-анализаторе и возможность использовать современные методы ионизации (электроспрей, атмосферный МАЛДИ) и фрагментацию биомакромолекул (в линейной квадрупольной ионной ловушке реализована столкновительно индуцированная фрагментация (СЮ),
в ячейке ИЦР - инфракрасная мультифотонная диссоциация (IRMPD) и диссоциация, происходящая при захвате медленных электронов (ECD)). Последний из перечисленных методов фрагментации в отличии от двух первых позволяет получить осколки пептидов, образованные не по пептидной связи, а по связи 1Ч-С(альфа), так называемые с-, z-фрагменты.
Масс-спектрометрия ионного циклотронного резонанса была выбрана по причине максимальной точности измерения масс (в сравнении с другими масс-спектрометрическими методами- времяпролетная масс-спектрометрия, ионная ловушка, Орбитрэп), и достаточно высокой скорости измерения спектров для совмещения с хроматографическим методом разделения триптических пептидов, что необходимо для работы с использованием метода точной массово-временной метки, который в свою очередь, позволяет добиться минимального времени проведения эксперимента, количества образца и понижения порога чувствительности (из-за отказа от MS/MS).
Количественные методы в протеомике глобально подразделяются на два типа: с применением и без применения изотопных меток.
Изотопные метки для попарного сравнения образцов (для задач нротеомики) начали разрабатываться с самого начала применения в этой области тандемной хромато-масс-спектрометрии (LC-MS/MS). Метод основан на том, что в результате мечения пептиды в опытном и контрольном образцах дают пики в масс-спектрах, отстоящие друг от друга на несколько единиц массы. Метки конструируют таким образом, чтобы они не влияли на эффективность ионизации и времена хроматографического удерживания. По отношению интенсивностей пиков соответствующих пептидов определяют их относительное содержание в образцах.
Разработано несколько коммерчески доступных решений для проведения сравнительного количественного анализа протеомов. Примерами могут служить технологии ICAT (Isotope-Coded Affinity Tag) и ICROS (Isotope Coded Reduction Off of Chromatographic Support), в которых мечение производится по цистеиновому остатку. Более сложной является технология
iTRAQ (Isobaric Tagging Reagents Amino-reactive Quantification), которая позволяет проводить количественный анализ сразу 4 образцов - но с использованием MS/MS. Изобарные (имеющие одинаковые массы) метки в iTRAQ связываются с N-концевым остатком пептидной цепи. Одним из методов модификации для количественного анализа является гуанидирование лизинового остатка пептидов.
Для сравнительного количественного анализа протеомов нами было использовано более простое и экономичное С-концевое ферментативное мечение изотопом кислорода 180. Использование 180-атома в качестве метки известно еще с работ Спирсона (Spirson) и Ритгенберга (Rittenberg) 1951-го года, которые исследовали механизм ингибирования продуктов реакции гидролиза амидной связи химотрипсином. При применении 180/160 изотопного мечения получаются химотриптические пептиды, меченые по С-концу независимо от их аминокислотной последовательности. Благодаря ряду преимуществ, таких как относительно несложная химия и сдвиг массы на строго определенную величину, 180/1б0 изотопное мечение стало популярным методом в количественной протеомике. Однако из-за слишком малой разницы масс между изотопами (всего 2 или 4 Да) этот подход применяется только в сочетании с масс-спектрометрами сверхвысокого разрешения (R порядка 500000).
Также в первой главе приводится обзор литературы, посвященной методу атомно-силовой микроскопии и методикам совмещения АСМ и масс-спекгрометрии для идентификации биомолекул. Описаны концентрационные критерии для возможности совмещения этих методов.
Во второй главе описывается хромато-масс-спектрометрическая методика, разработанная для анализа протеома мочи человека, процедура создания базы данных метода точных массово-временных меток, структура базы и методы поиска и идентификации белков, содержащихся в моче человека, с ее использованием.
Процедура анализа протеома мочи человека строилась на стандартном подходе, который используется в протеомике биологических жидкостей и состоящем из следующих этапов: (1) отбор пробы содержащей белки; (2) очистка, концентрирование и предварительное разделение смеси белков; (3) энзиматическое расщепление белков - получение смеси пептидов; (4) хромато-масс-спектрометрический анализ смеси пептидов; (5) поиск и идентификация белков.
Хромато-масс-спектрометрическая методика анализа смеси пептидов была разработана на базе нанопоточного высокоэффективного жидкостного хроматографа (нано-ВЭЖХ) Agilent 1100 (Agilent, США) и масс-спектрометра Finnigan LTQ FT (Thermo Electron, Бремен, Германия). Для соединения нано-ВЭЖХ с масс-спектрометром использовался наноспрейный ионный источник, который был разработан и собран в лаборатории.
Разделение смеси пептидов при помощи нано-ВЭЖХ проводилось методом градиентного элюирования - подвижная фаза В (80% ацетонитрил + 20% вода + 0,1% муравьиной кислоты) изменялась от 3% до 35% в течение 120 минут, скорость потока подвижной фазы была 0,3мкл/мин.
Масс-спектрометрический анализ фракций пептидов осуществлялся при помощи программы Xcalibur (Thermo Electron, Бремен, Германия) в двухстадийном режиме автоматического измерения спектров. На первой стадии в масс-спектрометре ИЦР ПФ измерялись точные массы пептидов в диапазоне m/z 300-1600, с разрешением R=25000 для m/z 400 (число ионов в ячейке ИЦР: 5*106). На второй стадии из ИЦР масс-спектра выбирались три максимальных пика, для которых производилась либо столкновителыю индуцированная фрагментация (CID), либо фрагментация, при захвате медленных электронов (ECD). Фрагментация CID и измерение спектров CID фрагментов происходили в линейной квадрупольной ионной ловушке (число ионов: 3*104). Фрагментация ECD и измерение спектров ECD фрагментов осуществлялись в ИЦР-ячейке (число ионов: 5*105). В режиме автоматического двухстадийного анализа пептиды, для которых
фрагментация уже была проведена, динамически исключались из исследования на 30 секунд.
Данные хромато-масс-спектрометрического анализа (Рис. 2) обрабатывались с использованием программного обеспечения, разработанного автором. В результате обработки формируется список масс и времен удерживания. Этот список используется для поиска и идентификации белков по базе данных SwissProt при помощи программы Mascot (Matrix Science, London, UK; version 2.0.04).
g/ia<?QO> 10 3} 77 с
ВРЕМЯ ВЫХОДА ПЕПТИДА В ХРОМАТОГРАММЕ
АШ1
'Gl
tili
J4
Ii« <o»< ift« j
20 30
Рис. 2. Масс-хроматограмма полученная для пробы мочи (вверху). СТАДИЯ
1: измерение ИЦР масс-спекгра в момент времени, выделенный на
хроматограмме (в центре). СТАДИЯ 2: фрагментация (ECD или CID) ионов,
дающих самый интенсивный пик, выделенный в ИЦР масс-спектре, и
измерение спектра фрагментов (внизу).
14
Всего в результате анализа всех исследованых проб мочи было идентифицировано около 820 белков. В одном хромато-масс-спектрометрическом прогоне удается идентифицировать около 120 белков.
Метод точных массово-временных меток (Рис. 3) подразумевает создание базы данных точных массово-временных меток и использование этой базы для поиска и идентификации белков в хромато-масс-спектрометрических экспериментах - без применения методов фрагментации. Эта идеология была использована для анализа проб мочи человека. На первой стадии производился хромато-масс-спезсгрометрический анализ для предварительной идентификации пептидов, содержащихся в пробе.
Наполнение V базы данных
Рис. 3. Блок-схема алгоритма формирования и использования базы данных точных массово-временных меток.
Из списка идентифицированных пептидов формировалась база данных (Рис. 4), содержащая массы (рассчитанные по идентифицированной
аминокислотной последовательности) и соответствующие (измеренные) времена удерживания пептидов в хроматографической колонке.
' ¿j experiments_bas_mns ▼
; f experiments^exp_name VARCHAR(SO) 'r-^ j i ruft$_run_idINT(10)
' 3 experiments
1 " e*>jiane VARCH/«(SO) j ; description TEXT
■ 3 runs
1
' j pepöde_sequences V .
t pep.id INT(IO) ■>pep_seq VWCHAR(255) j mass calc DOUBLE
■ ^ protein_sec»Jences T
! prot Jd INT(10) „prot_s«J LONGTEXT V accession VAR<X«(45) vmass DOUBLE vdescnptian TEXT 4>gi INT(IO)
ipi VARCHifi(20) ->ipi_version VARCHAR(?) jtax.id INT CIO) j gene_s>mbol vAftCHAR(^S)
/ runjd INT(IO) ✓ runjjate DATET1ME -.»description TEXT j file.nam e TEXT ',(lle_patMEXT v i»Jiam e VARCHAR(25S) . db.se arched VARCHAR(255) J searth.date INT(U) j fixedjn ods TEXT j upload.date DATET1ME_
3 queries
3 peptide s ..observed T '
I runjd INT(IO) t protjd INI (10) r pep.id IMT(IO) < query.num ]NT(10) jstaLINT(lO) J end INT( 10) j mascot .score DOUBLE vmass.deLtaOCUBLE J-mortfiCabons VARCHAR(2S5)
jj mods
r mod.id INT(IO) •>name VARCHAR(255)
I runjd INT(IO)
> query.num 1NT( 10) j mass.e>p DOUBLE
, mass .decon DOUBLE JchargeTlNVINT(4)
> elution .start DCUBLE
> elution.end DOUBLE , «annum INT (10)
amt_resiJt
! run_idINT(10) f prot.id INT(IO) r pepjd 1NT(10) f query.num INT(IO) :>stjt INT(IO) J end INT( 10) у mascot.score DOUBLE > modifications VARCHAft(255)
[j| mascot_res(Jt ▼
r runjd INT(IO) ' prot .id INT (10) i pepjd INT(IO) r query num INT(IO) v start INT( 10) v end 1NT(10) .^mascot.score DOUBLE ■j modifications VARCHAR(2S5)
Рис. 4. Структура базы данных точных массово-временных меток.
В результате формировалась база данных точных массово-временных меток, которая может использоваться для поиска и идентификации белков из мочи
человека по точной массе пептидов (Рис. 5), входящих в состав белка, и временам удерживания пептидов в хроматографической колонке.
Рис. 5. Последовательность действий по наполнению и использованию базы точных массово-временных меток.
Эта база данных точных массово-временных меток позволяет быстро идентифицировать большое количество белков во всех последующих хромато-масс-спектрометрических экспериментах.
В третьей главе описаны метод и результаты серии тестовых экспериментов.
В самом начале использования этого метода протеолитическое расщепление белков проводилось нами в присутствии Н2'80. Со временем была разработана оптимизированная процедура, в соответствии с которой протеолиз проводился в обычной воде, а после лиофилизации смесь пептидов
растворялась в буфере в Нг180. При этом в присутствии трипсина два атома 160 на С-конце пептида замещаются двумя атомами 180. Условия для каждого из этапов в таком процессе могут быть оптимизированы независимо друг от друга.
При использовании мечения 180 важным аспектом обработки результатов является коррекция интенсивностей пиков при наложении углеродных изотопных распределений. Для этого мы применили модифицированную концепцию виртуальной аминокислоты "аверагин" (см. ниже).
Файл масс-хроматограммы, полученной без использования тандемной масс-спектрометрии на приборе ионного циклотронного резонанса, обрабатывали программой Оесоп21з для выделения моноизотопных однозарядных ионов пептидов и определения их масс и времен удерживания в хроматографической колонке с учетом пиков пептидов, меченных кислородным изотопом 180.
После обработки спектров проводили нормировку значений времени удерживания по массам пептидов.
Далее проводили два цикла поиска по базе точных массово-временных меток: стандартный поиск и поиск по базе с массами, сдвинутыми на 4 Да (удвоенная разница масс между 180 и 160). Под стандартным поиском подразумевается поиск в АМТ-базе по сочетанию нормированного времени удерживания и массы пептида в хроматограмме без использования тандемной масс-спектрометрии (точность по массам составила 10 миллионных долей, а по значениям времени удерживания -. 2% от длительности хроматограммы).
Поскольку эффективность ионизации и времена удерживания на обращенно-фазовой хроматографической колонке меченого и немеченого пептидов одинаковы, то возможно произвести сопоставление обоих результатов поиска по времени удерживания и аминокислотной последовательности пептида: по результатам поиска выбирают те пептиды,
которые имеют одну и ту же последовательность (идентифицированную по АМТ-базе) и одинаковое время удерживания на хроматографической колонке. Малая разница по массам (порядка 2 или 4 Да) между одно- и двукратно меченным и немеченым пептидами создает сложность корректной оценки интенсивностей: изотопные распределения немеченого и одно- и двукратно меченных пептидов накладываются, то есть видимая интенсивность в спектре не соответствует реальной интенсивности моноизотопных пиков одно- и двукратно меченных пептидов.
Для решения этой проблемы была разработана процедура коррекции, основанная на использовании теоретической аминокислоты «аверагин», элементный состав которой соответствует усредненному элементному составу всего множества белков в протеоме человека (альтернативным является подход, в котором для каждого пептида в базе точных массовых меток-времен удерживания имеется запись, содержащая информацию о распределении интенсивностей пиков изотопных модификаций в масс-спектрах). В принятой нами процедуре для каждого пептида, точнее, его массы, записывается аминокислотная последовательность, состоящая только из аверагинов (С^змНудазК^туО^гоЗо.мп)» то есть приблизительный элементный состав соединения (пептида). По элементному составу можно построить теоретический масс-спектр получаемого соединения. В расчете учитываются атомы углерода, азота, кислорода и серы. Моделируются спектры, соответствующие трем пептидам (немеченому и двум меченым), за единицу принимают интенсивность моноизотопного пика немеченого пептида, и последовательно из интенсивности моноизотопного пика однократно меченого пептида вычитали интенсивность пика немеченого пептида, содержащего два углерода 13С, а затем также вычитали интенсивность однократно меченного пептида, содержащего два углерода 13С, из интенсивности моноизотопного пика двукратно меченного.
Следующая формула описывает корректировку интенсивности пика однократно меченного пептида за счет вычитания из его интенсивности
значения интенсивности пика, соответствующего пептиду, содержащему два углерода 13С:
аЫ = аЬг ———4,9384н--——1,3577/2,97+
2 111,1237 111,1237
1,4773/5,5)«(( Т 4,9384+-1,3577/2,97 +
111,1237 4111,1237 111,1237
+———1 4773 /5,5) —1)* 111,1237 ' ' 0,9890
где аЬО, аЬ2 - интенсивности пиков немеченого и меченого пептидов, mw -
молекулярная масса пептида, ab2_vis - видимая интенсивность
моноизотопного пика однократно меченного пептида; 111,1237 -
молекулярная масса аминокислоты аверагин, 4,9384; 1,35774 1,4773 -
количество атомов углерода, азота, кислорода в одной аминокислоте
аверагин (2,97 и 5,5 - коэффициенты, показывающие, во сколько раз в
природе ниже содержание изотопа 15N и 180, чем 13С).
Аналогичным образом осуществлялась коррекция .интенсивностей пиков для двукратно меченных пептидов.
Для иллюстрации принципиальной работоспособности метода, т.е. для определения ошибок метода, диапазона применимости, закономерностей систематического нестопроцентного мечения, был проведен модельный эксперимент на контрольном образце, в рамках которого были определены ошибки метода и диапазон применимости, проведена статистическая обработка для определения зависимостей систематического недомечения. В модельном эксперименте исследовалась смесь двух образцов, один из которых был помечен в присутствии трипсина кислородом-18.
В каждом из трех экспериментов было идентифировано более 150 пептидов. После чего для любых двух различных, случайно выбранных и идентичных по условиям экспериментов, пептидов было рассчитано отношение интенсивностей пиков, соответствующих немеченым и меченым пептидам. Результаты этого модельного эксперимента продемонстрировали высокую воспроизводимость и низкую ошибку (см. Рис.б-7).
Среднее отклонение от единицы (пропорции смешивания меченого и немеченого образцов) составило порядка 4,5% (см. рис. 6-7). Эта величина определяет погрешность разработанного метода.
Также в ходе статистической обработки экспериментов было выявлено отсутствие зависимости между степенью мечения и длиной пептида (продукта белкового гидролиза ферментом трипсином), степенью мечения и кислотностью М-концевой аминокислоты (в обоих случаях не выявлено никакой связи этих двух параметров пептидов со степенью мечения; коэффициенты корреляции в обоих случаях около нуля).
у
-С ,5 0 $ 1 5 2 5
Отношение интенсивности пика немеченого пептида к интенсивности меченого, эксл. X
Рис. 6. Степень мечения пептидов в двух идентичных ЬС-МБ-экспериментах (на каждой оси - отношение немеченого к меченому после корректировки; точка - один и тот же
пептид в обоих экспериментах), минимальное и максимальное значения по осям: -1.0 до 3.0, соответственно
» * в Щ
• 1 * • 1 »
в ® « ф •* • •
» & • " »...... » в • • •
S ® ф В
3 * •« № в #
в
0.8 0.85 0.9 0.95 1 1.05 1.1 1.15 1.2
Отношение интенсивности пика немеченого пептида к интенсивности меченого, эксп. 1
Рис. 7. Степень мечения пептидов в двух идентичных ЬС-МБ-экспериментах (на каждой оси - отношение немеченого к меченому после корректировки; точка - один и тот же пептид в обоих экспериментах), минимальное и максимальное значения по осям: 0.8 до 1.2, соответственно
Четвертая глава содержит описание подхода к совмещению атомно-силовой микроскопии и масс-спектрометрии с целью идентификации белков при сверхмалых концентрациях.
Это исследование было выполнено в процессе поиска методов обнаружения и идентификации белков в растворах при концентрациях, при
которых их не удается обнаружить стандартными методами хромато-масс-спектрометрии.
Нами был опробован подход последовательного применения методов атомно-силовой микроскопии (АСМ) и масс-спектрометрии. Кремниевую пластину с иммобилизованным на ее поверхности антителом погружали в раствор, содержащий исследуемый белок, который антитело захватывало. АСМ использовался для обнаружения образующихся на поверхности комплексов белок-антитело, а масс-спектрометрия использовалась для идентификации белка, для чего белок удалялся с поверхности, проводился гидролиз ферментом трипсин с последующим концентрированием образца; и измерялись масс-спектры на времяпролетном приборе при ионизации методом десорбции и ионизации из матрицы.
Задачей исследования являлось снижение порога обнаружения белковых молекул, до концентраций порядка 10"12М (стандартные методы LC-MS позволяют добиться чувствительности в -10"9М). При этом требуется обеспечить высокую эффективность гидролиза при сравнительно низкой концентрации белка.
Десорбирование белковых молекул для их последующего гидролиза и идентификации методами масс-спектрометрического анализа осуществлялся путем ультразвукового воздействия, в ходе которого белки отсоединяются от поверхности и переходят в жидкую фазу. Это отличает предложенный способ от других методов, где ультразвуковое воздействие используется для повышения скорости гидролиза.
В результате экспериментов была продемонстрирована возможность идентификации белка BSA (бычьего сывороточного альбумина) при концентрациях ~10"!2М, что позволяет сделать вывод о возможности снижения порога детектирования и идентификации белков при применении методов АСМ в сочетании с масс-спектрометрией.
Заключение
1. Создана база данных точных массово-временных меток пептидов протеома мочи человека, которая содержит более 3000 записей для триптических пептидов. База содержит 39 впервые обнаруженных в моче человека генных продуктов.
2. Продемонстрирована возможность использования базы данных для быстрого поиска и идентификации белков без применения методов фрагментации - идентификация производится по точной массе пептидов и временам их удерживания в хроматографической колонке.
3. Разработана процедура количественного анализа содержания белков в физиологических жидкостях человека на основе методов точной массово-временной метки, изотопного мечения кислородом-18 и гипотетической аминокислоты «аверагин» (для коррекции накладывающихся углеродных изотопных распределений).
4. Разработана процедура масс-спектрометрической идентификации белков, обнаруженных методом атомно-силовой микроскопии, которая в перспективе позволит понизить порог обнаружения низкокопийных белков.
Перечень работ, опубликованных по теме диссертации
1. Dmitry Avtonomov, Ilya Agron, Eugene Nikolaev. A New Approach to Deisotoping of Complex Isotopically Resolved Spectra. 58th Amer. Soc. Mass Spectrom. Annual Conf. on Mass Spectrometry & Allied Topics, Salt Lake City, UT, USA, 2010.
2. Ilya A. Agron, Dmitriy M. Avtonomov, Eugene Nikolaev. Implementation of 180 labelling for urine proteome quantification using accurate mass tag retention time data base. 58th Amer. Soc. Mass Spectrom. Annual Conf. on Mass Spectrometry & Allied Topics, Salt Lake City, UT, USA, 2010.
3. Ilya A Agron, Dmitriy M. Avtonomov, Eugene Nikolaev. Approach for Isotopic Distribution Deconvolution in Mass Spectra of Peptide Compounds. 8 th
Annual World Congress of Human Proteome Organization, Toronto, Canada, September 26-30, 2009.
4. A Bugrova, T Shevchenko, A Kononikhin, A Zhiryakova, I Popov, N Khristenko, I Agron, D Avtonomov, G Kalamkarov, E Nikolaev. Development of the Platform for Comparative Analysis of the Tear Proteome based on theAMT Approach. 8th Annual World Congress of Human Proteome Organization, Toronto, Canada, September 26-30,2009.
5. Dmitriy M. Avtonomov, Ilya A. Agron, Eugene N. Nikolaev. On the usage of information about the number of carbon atoms in peptides for protein identification. 57th Amer. Soc. Mass Spectrom. Annual Conf. on Mass Spectrometry & Allied Topics, Philadelphia, PA, USA, June, 2009.
6. E. Nikolaev, A. Kononikhin, V. Zgoda, S. Moshkovskiy, O. Harybin, I. Popov, D.Avtonomov, I. Agron, V. Kurova, O. Demina, S. Varfolomeev. Development and usage of accurate mass and time tag approach in mass spectrometry for chromato-mass-spectrometric analysis of urinary proteome. Fundamental Sciences - Medicine. Conference materials, Moscow.: «Slovo», p. 168-169, 2006.
7. Avtonomov DM, Popov IA, Kononikhin AS, Agron IA, Moshkovskiy SA, Larina IM, Zamulaeva IA, Varfolomeev SB, Archakov AI, Nikolaev EN. Creation of an accurate mass and time tags database for human urinary proteome and retention time normalization inside it. 3rd international school-conference "Mass spectrometry in chemical physics, biophysics and ecology", Zvenigorod (Moscow region), Russia, October 2010.
8. Evgenij N Nikolaev, IA Popov, AS Kononikhin, IA Agron, DM Avtonomov, SA Moshkovsky, IM Larina, IA Zamulaeva, С Masselon, AI Archakov. Accurate Mass Tag Retention Time Database for Urine Proteome. 8th Annual World Congress of Human Proteome Organization, Toronto, Canada, September 26-30, 2009.
9. D. M. Avtonomov, I. A. Agron, A. S. Kononikhin, I. A. Popov, E. N. Nikolaev. "A New Method for Normalization of the Peptide Retention Times in
Chromatographic/Mass Spectrometric Experiments ". Bioorganic chemistry (Moscow), 2011, Vol. 37, No. 2, pp. 146-150.
10. I. A. Agron, D. M. Avtonomov, A. S. Kononikhin, I. A. Popov, S. A. Moshkovskii, E. N.Nikolaev. "Accurate Mass Tag Retention Time Database for Urine Proteome Analysis by Chromatography-Mass Spectrometry". Biochemistry (Moscow), 2010, Vol. 75, No. 5, pp. 636-641.
11. Avtonomov D.M., Agron I.A., Kononikhin A.S., Nikolaev E.N. "Creation of Accurate Mass and Time tags database for quantitative and qualitative approaches in human urinary proteome research utilizing isotopic labeling". Trudy MFTI, No.l, 2009.
12. И.А. Агрон, Д.М. Автономов, A.C. Кононяхин, И.А. Попов, C.A. Мельник, C.A. Мошковский, Е.Н. Николаев «Комбинация подходов точной массово-временной метки и мечения изотопом кислорода 180 для количественного анализа протеома мочи человека» ТРУДЫ МФТИ. 2011. Том 3, № 3, страницы 3-10.
13. Патент #2419796 (заявка №2009144132 от 30.09.09), Способ проведения ферментативного гидролиза белков, иммобилизованных на подложке сканирующего микроскопа, авторы: И.А. Агрон, МФТИ (ГУ).
КОПИ-ЦЕНТР св. 7:07:10429 Тираж 100 экз. г. Москва, ул. Енисейская, д.36 тел.: 8-499-185-7954,8-906-787-7086
Введение.
Цель работы.
Научная новизна работы.
Практическая значимость работы.
Личный вклад автора.
Защищаемые положения.
Структура диссертации.
Список сокращений.
Глава 1. Методики качественной и количественной идентификации белков в смесях с применением масс-спектрометрии.
Развитие применения масс-спектрометрии в протеомике.
Подходы к идентификации белков методами масс-спектрометрии, существующие на данный момент.
Peptide mass fingerprint.
Подход bottom-up.
Подход top-down.
Секвенирование de novo.
Метод точных массово-временных меток.
Разрешающая способность и точность измерения масс.
Масс-спектрометрия ИЦР ПФ.
Подходы в количественной протеомике.
Совмещение методов атомно-силовой микроскопии и масс-спектрометрии.
Источники ионизации.
Источник ионов на основе электрораспыления в вакуум.
MALDI при атмосферном давлении.
Источник MALDI при атмосферном давлении.
APCI - химической ионизации при атмосферном давлении.
Глава 2. База точных массово-временных меток для протеома мочи человека
Объект исследования.
Методы исследования.
Сбор образцов мочи.
Подготовка проб для хромато-масс-спектрометрии.
Хромато-масс-спектрометрия.
Анализ данных и идентификация белков.
Структура базы данных.
Созданная база точных массово-временных меток для протеома мочи человека.
Глава 3. Количественная протеомика.
Пробоподготовка.
Получение образцов мочи.
Получение пептидов, меченных О.
Хромато-масс-спектрометрический эксперимент.
Обработка результатов эксперимента.
Выделение моноизотопных пиков однозарядных ионов.
Поиск по АМТ-базе.
Объединение результатов поиска.
Корректировка интенсивностей пиков.
Схема сравнительно-количественного анализа.
Модельный эксперимент.
Глава 4. Подход к совмещению методов атомно-силовой микроскопии и масс-спектрометрии.
Модельный эксперимент №1.
Модельный эксперимент №2.
При помощи современных методов, основанных на масс-спектрометрическом анализе, можно исследовать биологические объекты самого разного происхождения и сложности. Это стало возможным благодаря открытию новых методов ионизации вещества: метода электроспрей и метода лазерной десорбции/ионизации из матрицы (МАЛДИ) — которые позволили переводить в газовую фазу и одновременно ионизировать большие биологические молекулы, такие как пептиды, белки и полинуклеотиды. Среди методов масс-спектрометрии, используемых в протеомных исследованиях, масс-спектрометрия ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (ИЦР ПФ) занимает особое место. Главными достоинствами этого метода являются: сверхвысокая разрешающая способность и рекордная точность измерения масс. С помощью современного масс-спектрометра ИЦР ПФ можно однозначно как идентифицировать индивидуальные биомолекулы, так и определять состав их смесей.
В настоящее время полностью расшифрованы геномы различных организмов, в том числе и человека. В связи с исследованиями многообразия белков, содержащихся в различных биологических объектах, возникла новая фундаментальная концепция, названная «протеом» (ПРОТЕиновое дополнение к генОМу). Создана новая дисциплина - протеомика, которая призвана дополнить и аннотировать информацию, содержащуюся в геномах. Современная масс-спектрометрия (в том числе, и ИЦР ПФ) занимает передовые позиции в решении основной задачи протеомики идентификация белков. В настоящее время также ведется активная разработка масс-спектрометрических методов количественного анализа протеомов.
Масс-спектрометр ИЦР ПФ обладает ограниченным динамическим диапозоном, в то же время, протеомы различных организмов содержат белки в широком диапазоне относительных концентраций. И поэтому необходимо использовать масс-спектрометрии ИЦР ПФ в комбинации с существующими 4 методами разделения (жидкостная хроматография, электрофорез). Время удерживания пептида (продукта гидролиза белка энзимом трипсин) на хроматографе может являться дополнительным параметром при идентификации пептида.
В работе разрабатывались и оптимизировались методы, использующие масс-спектрометрию ИЦР ПФ для исследования протеомного состава одной из физиологических жидкостей человека — мочи. В работе были разработаны и использованы новые подходы для обработки и интерпретации полученных данных, в том числе, для сравнительного количественного анализа протеома. Также проводилась разработка подхода для совмещения методов атомно-силового микроскопа и масс-спектрометрии, где масс-спектрометрические методы использовались для идентификации молекул, обнаруживаемых АСМ.
Цель работы
1.разработать хромато-масс-спектрометрические методики анализа протеомного состава мочи человека;
2.разработать и применить в реальных исследованиях метод точной массово-временной метки для анализа протеома мочи;
3.создать новую базу данных, состоящую из точных массово-временных меток, для быстрого поиска и идентификации белков содержащихся в моче человека;
4.разработать методику сравнительного количественного анализа протеома, реального биологического объекта;
5.разработать подход масс-спектрометр ической идентификации белков детектируемых методами атомно-силовой микроскопии.
Научная новизна работы
1. Создана база данных точных массово-временных меток триптических пептидов протеома мочи человека.
2.Создана новая процедура нормирования времен удерживания на колонке жидкофазного хроматографа триптических пептидов белков, содержащихся в моче человека, которая может быть использована для идентификации белков методом точных массово-временных меток.
3. Разработан новый метод для сравнительного количественного анализа на основе использования методов точной массово-временной метки и изотопного мечения с применением концепции гипотетической аминокислоты «аверагин» для коррекции значений интенсивности пиков пептидов в спектрах.
4. Исследован протеомный состав мочи здорового человека, при помощи новой хромато-масс-спектрометрической методики, основанной на методе точной массово-временной метки. Обнаружено 39 новых генных продуктов.
5. Предложен подход совместного использования методов атомно-силовой микроскопии и масс-спектрометрии для идентификации и количественного определения содержания белков при сверхмалых концентрациях.
Практическая значимость работы
Разработанные хромато-масс-спектрометрические подходы для качественного и количественного анализа биологических жидкостей человека могут быть использованы при разработке методов диагностики различных паталогий, вызванных, в том числе, заболеваниями.
Новая база данных точных массово-временных меток может использоваться для высокопроизводительного анализа протеома мочи человека при поиске биомаркеров различных заболеваний.
Подход, разработанный для идентификации белков, детектируемых методами атомно-силовой микроскопии может применяться для исследования других объектов, содержащихся в сверхнизких концентрациях в реальных биологических жидкостях.
Личный вклад автора
Материал, представленный в диссертации, получен при непосредственном участи автора как в постановке задачи, так и при проведении исследований. База данных точных массово-временных меток создавалась автором совместно с Д.М. Автономовым (ИНЭП ХФ РАН), И.А. Поповым (ИБХФ РАН) и A.C. Кононихиным (ИНЭПХФ РАН). Метод количественного анализа был разработан автором совместно с Д.М. Автономовым (ИНЭП ХФ РАН). Подход к совместному использованию методов атомно-силовой микроскопии и масс-спектрометрии был разработан совместно с A.C. Батуриным, Е.В. Дедковой. Диссертационная работа выполнена в Институте энергетических проблем химической физики Российской академии наук, в Лаборатории ионной и молекулярной физики, часть работ выполнялась автором параллельно в Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук в период с 2005 по 2011 год.
Защищаемые положения
1.новая база данных точных массово-временных меток триптических пептидов протеома мочи;
2.новый метод количественного анализа протеома физиологических жидкости человека, основанный на использовании методик точной массово-временной метки и изотопного мечения триптических пептидов изотопом 180;
3.новая процедура нормирования времен удерживания на хроматографической колонке и идентификации пептидов;
4.метод идентификации белков при сверхмалых концентрациях с использованием масс-спектрометрии и атомно-силовой микроскопии.
Структура диссертации
Первая глава является литературным обзором, в котором описываются распространенные на данный момент подходы к идентификации белков при помощи масс-спектрометрии, приводится изложение сути метода точных массово-временных меток (АМТ меток). Выделяются и описываются проблемы и сложности, возникающие при реализации данного метода.
Во второй главе описывается методика постановки экспериментов, сбора образцов для них, структура спроектированной базы данных. Приводятся результаты по созданной базе точных массово-временных меток для протеома мочи человека.
В третьей главе изложено описание разработанной схемы для сравнительного количественного анализа, изложены результаты модельного эксперимента.
Четвертая глава содержит описание подхода к совмещению атомно-силовой микроскопии и масс-спектрометрии с целью идентификации белков при сверхмалых концентрациях.
Диссертация изложена на 87 страницах, содержит 19 рисунков, 2 таблицы, 4 приложения.
Список сокращений
ИЦР ПФ - ионный циклотронный резонанс с преобразованием Фурье; АМТ - подход точной массово-временной метки (accurate mass and time tags database);
LC - высокоэффективная жидкофазная хроматография (liquid chromatography);
MS - масс-спектрометрия (mass-spectrometry); MS/MS — тандемная масс-спектрометрия;
CID - столкновительно-индуцированная фрагментация (collision induced dissociation);
ECD - фрагментация при захвате медленнего электрона (electron capture dissociation);
IRMPD — инфракрасная мультифотонная диссоциация (infrared multi photon dissociation);
ACM - атомно-силовая микроскопия.
Заключение
1.Создана база данных точных массово-временных меток пептидов протеома мочи человека, которая содержит более 3000 записей для триптических пептидов. База содержит 39 впервые обнаруженных в моче человека генных продуктов (см. Приложение №4).
2.Продемонстрирована возможность использования базы данных для быстрого поиска и идентификации белков без применения методов фрагментации — идентификация производится по точной массе пептидов и временам их удерживания в хроматографической колонке.
3.Разработана процедура количественного анализа содержания белков в физиологических жидкостях человека на основе методов точной массово-временной метки, изотопного мечения кислородом-18 и гипотетической аминокислоты «аверагин» (для коррекции накладывающихся углеродных изотопных распределений).
4.Разработана процедура масс-спектрометрической идентификации белков, обнаруженных методом атомно-силовой микроскопии, которая в перспективе позволит понизить порог обнаружения низкокопийных белков.
Перечень работ, опубликованных по теме диссертации
1.Dmitry Avtonomov, Ilya Agron, Eugene Nikolaev. A New Approach to Deisotoping of Complex Isotopically Resolved Spectra. 58th Amer. Soc. Mass Spectrom. Annual Conf. on Mass Spectrometry & Allied Topics, Salt Lake City, UT, USA, 2010.
2.11ya A. Agron, Dmitriy M. Avtonomov, Eugene Nikolaev. Implementation of 180 labelling for urine proteome quantification using accurate mass tag retention time data base. 58th Amer. Soc. Mass Spectrom. Annual Conf. on Mass Spectrometry & Allied Topics, Salt Lake City, UT, USA, 2010. 3.11ya A Agron, Dmitriy M. Avtonomov, Eugene Nikolaev. Approach for Isotopic Distribution Deconvolution in Mass Spectra of Peptide Compounds. 8th Annual World Congress of Human Proteome Organization, Toronto, Canada, September 26-30, 2009.
4.А Bugrova, T Shevchenko, A Kononikhin, A Zhiryakova, I Popov, N Khristenko, I Agron, D Avtonomov, G Kalamkarov, E Nikolaev. Development of the Platform for Comparative Analysis of the Tear Proteome based on the AMT Approach. 8th Annual World Congress of Human Proteome Organization, Toronto, Canada, September 26-30, 2009.
5.Dmitriy M. Avtonomov, Ilya A. Agron, Eugene N. Nikolaev. On the usage of information about the number of carbon atoms in peptides for protein identification. 57th Amer. Soc. Mass Spectrom. Annual Conf. on Mass Spectrometry & Allied Topics, Philadelphia, PA, USA, June, 2009.
6.E. Nikolaev, A. Kononikhin, V. Zgoda, S. Moshkovskiy, O. Harybin, I. Popov, D.Avtonomov, I. Agron, V. Kurova, O. Demina, S. Varfolomeev. Development and usage of accurate mass and time tag approach in mass spectrometry for chromato-mass-spectrometric analysis of urinary proteome. Fundamental Sciences - Medicine. Conference materials, Moscow.: «Slovo», p. 168-169, 2006.
7.Avtonomov DM, Popov IA, Kononikhin AS, Agron IA, Moshkovskiy SA, Larina IM, Zamulaeva IA, Varfolomeev SB, Archakov AI, Nikolaev EN. Creation of an accurate mass and time tags database for human urinary proteome and retention time normalization inside it. 3rd international school-conference "Mass spectrometry in chemical physics, biophysics and ecology", Zvenigorod (Moscow region), Russia, October 2010.
8.Evgenij N Nikolaev, IA Popov, AS Kononikhin, IA Agron, DM Avtonomov, SA Moshkovsky, IM Larina, IA Zamulaeva, С Masselon, AI Archakov. Accurate Mass Tag Retention Time Database for Urine Proteome. 8th Annual World Congress of Human Proteome Organization, Toronto, Canada, September 26-30, 2009.
9. D. M. Avtonomov, I. A. Agron, A. S. Kononikhin, I. A. Popov, E. N. Nikolaev. "A New Method for Normalization of the Peptide Retention Times in Chromatographic/Mass Spectrometric Experiments". Bioorganic chemistry (Moscow), 2011, Vol. 37, No. 2, pp. 146-150.
10. Агрон И.А., Автономов Д.М., Кононихин A.C., Попов И.А., Мошковский С.А. и Николаев Е.Н. «База данных по точным массово-временным меткам для хромато-масс-спектрометрического анализа протеома мочи» в Т.75, №5, стр. 636-641, 2010 г.
11. Д.М. Автономов, И.А. Агрон, A.C. Кононихин, E.H. Николаев "Создание базы данных точных массово-временных меток для качественного и количественного подхода в исследовании протеома мочи человека с использованием изотопного мечения". Труды МФТИ, Номер 1, 2009, стр. 2429.
12. И.А. Агрон, Д.М. Автономов, A.C. Кононихин, И.А. Попов, С.А. Мельник, С.А. Мошковский, E.H. Николаев «Комбинация подходов точной массово-временной метки и мечения изотопом кислорода 180 для количественного анализа протеома мочи человека» ТРУДЫ МФТИ. 2011. Том 3, № 3, страницы 3-10.
13.Патент #2419796 (заявка №2009144132 от 30.09.09), Способ проведения ферментативного гидролиза белков, иммобилизованных на подложке сканирующего микроскопа, авторы: И.А. Агрон, A.C. Батурин, Е.В. Дедкова.
1. P. James, "Protein identification in the post-genome era: the rapid rise of proteomics.," Quarterly reviews of biophysics, vol. 30 (4), pp. 279-331, 1997.
2. M. B. Comisarow and A. G. Marshall, "Fourier transform ion cyclotron resonance spectroscopy," Chemical Physics Letters, vol. 25, no. 2, pp. 282-283, March 1974.
3. M. Yamashita and J. B. Fenn; "Electrospray ion source. Another variation on the free-jet theme," Journal of Physical Chemistry, vol. 88, no. 20, pp. 4451-4459, 1984.
4. J. B. Fenn, M. Mann, С. K. Meng, S. F. Wong, and С. M. Whitehouse, "Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules," Science, vol. 246 (4926), pp. 64—71,1989.
5. M.JI. Александров, JI.H. Галль, H.B. Краснов, В.И. Николаев, and В.А. Шкуров, "Прямая стыковка микроколоночного жидкостного хроматографа с масс-спектрометром," Биоорганическая химия, vol. 10, pp. 710-711,1984.
6. М. Karas and F. Hillenkamp, "Laser desorption ionization of proteins with molecular masses," Anal. Chem., vol. 60, no. 20, pp. 2299-2301, 1988.
7. M. S. Wilm and M. Mann, "Electrospray and Taylor-Cone theory, Dole's beam of macromolecules at last?," International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes, vol. 136, no. 2-3, pp. 167-180,1994.
8. F. S. Collins, E. D. Green, A. E. Guttmacher, and M. S. Guyer, "A vision for the future of genomics research," Nature, vol. 422(6934), pp. 835-847, 2003.
9. S. E. Lander, "Initial sequencing and analysis of the human genome," Nature, vol. 409(6822), pp. 860-921, 2001.
10. J. C. Venter, "The sequence of the human genome," Science, vol. 291, pp. 1304-51, 2001.t
11. International Human Genome Sequencing Consortium, "Finishing the euchromatic sequence of the human genome," Nature, vol. 431 (7011), pp. 93145, 2004.
12. O. N. Jensen, "Modification-specific proteomics: characterization of post-translational modifi-cations by mass spectrometry," Curr. Opin. Chem. Biol., vol. 8(1), pp. 33-41, 2004.
13. K. Tanaka, H. Waki, Y. Ido, S. Akita, Y. Yoshida, and T. Yoshida, "Protein and Polymer Analyses up to m/z 100 000 by Laser Ionization Time-of flight Mass Spectrometry," Rapid Commun Mass Spectrom, vol. 2, no. 20, pp. 151-3.
14. D. Fenyo, J. Qin, and B. J. Chait, "Protein identification using mass spectrometric information," Electrophoresis, vol. 19, pp. 998-1005,1998.
15. D. Fenyo, J. Eriksson, and R. Beavis, "Mass spectrometric protein identification using the global proteome machine," Methods Mol. Biol., vol. 673, pp. 189-202, 2010.
16. J. Eriksson and D. Fenyo, "Protein identification in complex mixtures," J Proteome Res, vol. 4, pp. 387-93, 2005.
17. J. Eriksson and D. Fenyo, "Improving the success rate of proteome analysis by modeling protein-abundance distributions and experimental designs," Nat Biotechnol, vol. 25, pp. 651-5, 2007.
18. O. N. Jensen, A. V. Podtelejnikov, and M. Mann, "Identification of the components of simple protein mixtures by high accuracy peptide mass mapping and database searching," Anal Chem, vol. 69, pp. 4741-50, 1997.
19. D. A. Wolters, M. P. Washburn, and J. R. Yates, "An Automated Multidimensional Protein Identification Technology for Shotgun Proteomics," Anal. Chem., vol. 73, no. 23, pp. 5683-5690, 2001.
20. K. Hakansson, H. J. Cooper, M. R. Emmett, C. E. Costello, A. G. Marshall, and C. L. Nilsson, "Electron Capture Dissociation and Infrared Multiphoton
21. Dissociation MS/MS of an N-Glycosylated Tryptic Peptide To Yield Complementary Sequence Information," Anal. Chem., vol. 73, no. 18, pp. 45304536, 2001.
22. Jack Simons, "Mechanisms for S-S and N-Ca bond cleavage in peptide ECD and ETD mass spectrometry," Chemical Physics Letters, vol. 484, no. 4-6, pp. 8195, 2010.
23. A. G. Harrison, "To b or not to b: the ongoing saga of peptide b ions," Mass Spectrom Rev, vol. 28, no. 4, pp. 640-54, 2009.
24. M.M. Savitski, F. Kjeldsen, M.L. Nielsen, and R.A. Zubarev,
25. Complementary sequence preferences of electron-capture dissociation and vibrational excitation in fragmentation of polypeptide polycations," Angewandte Chemie International Edition, vol! 45, no. 32, pp. 5301-5303, August 2006.
26. J. K. Eng, A. L. McCormack, and J. R. Yates, "An approach to correlate mass spectral data with amino acid sequences in a protein database," J Am Soc Mass Spectrom, vol. 5, p. 976,1994.
27. Matthias Mann and Matthias Wilm; "Error-tolerant identification of peptides in sequence databases by peptide sequence tags," Anal Chem, vol. 66, pp. 4390-9.
28. J. Zimmer, M.E. Monroe, Qian, W.J., and R.D. Smith, "Advances in proteomics data analysis and display using an accurate mass and time tag approach," Mass Spectrometry Reviews, vol. 25, pp. 450-482, 2006.
29. M. F. Khan, M. J. Bennett, C. C. Jumper, A. J. Percy, L. P. Silva, and D. C. Schriemer, "Proteomics by mass spectrometry—Go big or go home?," J. Pharm. Biomed. Anal., no. doi:10.1016/j.jpba.2011.02.012, February 2011.
30. N. L. Kelleher, H. Y. Lin, G. A. Valaskovic, D. J. Aaserud, E. K. Fridriksson, and F. W. McLafferty, "Top Down versus Bottom Up Protein Characterization by Tandem High-Resolution Mass Spectrometry," J. Am. Chem. Soc., vol. 121, pp. 806-812, 1999.
31. N. L. Kelleher, "Top-down proteomics," Anal Chem, vol. 76, no. 11, pp. 197A-203A, June 2004.
32. J. J. Coon, B. Ueberheide, J. E. P. Syka, D. D. Dryhurst, J. Ausio, J. Shabanowitz, and D. F. Hunt, "Protein identification using sequential ion/ion reactions and tandem mass spectrometry," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 102, pp. 9463-9468, 2005.
33. M.M. Savitski, M.L. Nielsen, F. Kjeldsen, and R.A. Zubarev, "Proteomics-Grade de Novo Sequencing Approach," J. Proteome Res., vol. 4, no. 6, pp. 23482354, 2005.
34. R.D. Smith, G.A. Anderson, M.S. Lipton, L. Pasa-Tolic, Y. Shen, T.P. Conrads, T.D. Veenstra, and H.R. Udseth, "An accurate mass tag strategy forquantitative and high-throughput proteome measurements," Proteomics, vol. 2, no. 5, pp. 513-523, 2002.
35. Y. Shen, N. Tolic, C. Masseion, L Pasa-Tolic, DGI Camp, K.K. Hixson, R. Zhao, G.A. Anderson, and R.D. Smith, "Ultrasensitive proteomics using high-effciency on-line micro-SPE-NanoLC-NanoESI MS and MS/MS," Anal. Chem., vol. 76, pp. 144-154, 2004.
36. T. Liu, M.E. Belov, N. Jaitly, W.J. Qian, and R.D. Smith, "Accurate Mass Measurements in Proteomics," Chem. Rev., vol. 107, pp. 3621-3653, 2007.
37. T. P.' Conrads, G. A. Anderson, T. D. Veenstra, L. Pasa-Tolic, and R. D Smith, "Utility of Accurate Mass Tags for Proteome-Wide Protein Identification," Anal. Chem., vol. 72, pp. 3349-3354, 2000.
38. Агрон И.А., Автономов Д.М., Кононихин A.C., Попов И.А., Мошковский С.А. и Николаев E.H. «База данных по точным массово-временным меткам для хромато-масс-спектрометрического анализа протеома мочи» в Т.75, №5, стр. 636-641, 2010 г.
39. Ют К. Hixson, "Label-Free Relative Quantitation of Prokaryotic Proteomes Using the Accurate Mass and Time Tag Approach," Methods in Molecular Biology, vol. 492, pp. 39-63, 2009.
40. А.Т. Kopylov, V.G. Zgoda The methods of quantitative proteomics // Biochemistry, 2008. V. 2, No. 1. - P. 28-46.
41. Spirson D.B. and Rittenberg D. Labeling of peptides during hydrolysis // Nature. 1951. - V. 167. - P. 484-487.
42. Senko M.W., Beu S.C. and McLafferty F.W. Determination of monoisotopic masses and ion populations for large biomolecules from resolved isotopic distributions // Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 1995. — V. 6. - P. 229-233.
43. Gygi S.P., Rist В., Gerber S.A., Turecek F., Gelb M.H., Aebersold R. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tag // Nat.Biotechnol. 2009. - V. 17. - P. 994-999.
44. Shen M., Guo L., Wallace A., Fitzner J., Eisenman J., Jacobson E., Jhonson R.S. Isolation and isotope labeling of cysteine-and methionine-containing tryptic peptides // Мої. Cell. Proteomics. 2003. - V. 2. - P. 315-324.
45. Warwood S., Mohammed S., Cristea I.M., Evans C., Whetton A.D., Gaskell S.J., Guanidination chemistry for qualitative and quantitative proteomics // Rapid Comm. Mass Spectrom. 2006. - V. 20. - P. 3245-3256.
46. Yao X., Freas A., Ramirez J, Demirev P.A., Fenselau C. Proteolytic 180 labeling for comparative proteomics: model studies with two serotypes of adenovirus // Anal Chem. 2001. - V. 73. - P. 2836-2842.
47. Yao X., Afonso C., Fenselau C. Dissection of proteolytic 180 labeling: endoprotease-catalyzed 160-to-180 exchange of truncated peptide substrates // J. Proteome Res. 2003. - V. 2. - P. 147-152.
48. Cao Yi, Balamurali M.M., Sharma D., Li H. A functional single-molecule binding assay via force spectroscopy // PNAS. 2007. V. 104. P. 15677-15681.
49. Hinterdorfer P., Dufrene Y.F. Detection and localization of single molecular recognition events using atomic force microscopy // Nat. Methods. 2006. V.3. P. 347.
50. Дедков В.Г., Дедкова Е.Г. Контактная атомно-силовая спектроскопия биологических тканей // Письма в ЖТФ. 2010. Т. 36. № 3. С. 76.
51. Fillaux F., de Loze С. Spectroscopic study of monosubstited amides. II. Rotation isomers in amides substituted by aliphatic side-chain models. // Biopolymers. 1972. V. 11. P. 2063.
52. Fillaux F., de Loze C. Spectroscopic studies of the monosubstituted amides. VI. Neutron inelastic scattering spectra of N-methyl acetamide // Chem. Phys. Lett. 1976. V. 39. P. 547.
53. Picquart M., Haro-Poniatowski E., Morhange J.F., Jouanne M. Low frequency vibrations and structural characterization of a murine IgG2amonoclonal antibody studied by Raman and IR spectroscopies // Biopolymers. 2000. V. 53. P. 342.
