Масс-спектрометрическое секвенирование биоактивных пептидов, выделенных из кожи лягушек Rana ridibunda и Rana arvalis тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им МВ ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

АРТЕМЕНКО КОНСТАНТИН АЛЕКСАНДРОВИЧ

МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОЕСЕКВЕНИРОВАНИЕ БИОАКТИВНЫХ ПЕПТИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ КОЖИ ЛЯГУШЕК RANA RIDIBUNDA И RANA ARVALIS

(02.00.03 - органическая химия)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2007

003065407

Работа выполнена на кафедре органической химии в лаборатории органического анализа Химического факультета Московского государственного университета им М В Ломоносова

Научный руководитель

доктор химических наук, профессор Лебедев Альберт Тарасович

Официальные оппоненты

доктор химических наук, профессор Заикин Владимир Георгиевич (Институт нефтехимического синтеза им А В Топчиева РАН, г Москва)

доктор химических наук, с н с Гусаков Александр Васильевич (Химический факультет МГУ им M В Ломоносова)

Ведущая организация Государственное учреждение Российский

Онкологический Научный центр им H H Блохина РАМН, г Москва

Защита состоится 3 октября 2007 года в 1100 часов на заседании Диссертационного совета Д 501 001 69 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им MB Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские горы, д 1, стр 3, МГУ, Химический факультет, аудитория 337

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им M В Ломоносова

Автореферат разослан 3 сентября 2007 г

Ученый секретарь Диссертационного Совета, у . ^

доктор химических наук, профессор Магдесиева Т В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Амфибии обладают широким набором соединений, секретируемых кожными железами Пептидная составляющая секрета является частью иммунной системы этих животных Секретируемые пептиды проявляют различные виды биологической активности среди них встречаются антибактериальные, противовирусные, антигрибковые, противоопухолевые и нейропептиды Такой химический арсенал обеспечивает защиту животного как от патогенных организмов, так и от хищников

Механизм действия биоактивных пептидов заключается в разрушении клеточной стенки патогенного организма При этом структура пептида коррелирует с особенностями строения мембран разрушаемых клеток, что обусловливает высокую специфичность действия пептида Например, антимикробные пептиды избирательно разрушают мембраны бактерий, но не активны в отношении соматических клеток Такая специфичность является очень привлекательной для использования пептидов в качестве направленных лекарственных препаратов нового типа, например, антибиотиков На сегодняшний день уже запатентованы и используются лекарства, созданные на базе синтетических пептидов, структурно совпадающих с пептидами, секретируемыми амфибиями В частности, это буфорин (антибиотик) и каерулеин-1 1 - препарат с сильнейшим анальгетическим эффектом

Создание таких препаратов начинается с установления первичной структуры пептида Существующие классические химические методы определения аминокислотной последовательности (секвенирования) пептида - например, деградация по Эдману - часто малоэффективны, поскольку требуют большого количества биоматериала и непригодны для анализа пептидных смесей Масс-спектрометрическое секвенирование лишено этих недостатков, но тоже сопряжено с определенными сложностями Поэтому актуальным является изучение возможностей масс-спектрометрии для de novo секвенирования пептидов амфибий, а также оптимизация самого масс-спектрометрического эксперимента

Дель работы Целью данной диссертационной работы является установление первичной структуры пептидов, секретируемых кожными железами лягушек рода Rana, при помощи метода тандемной масс-спектрометрии, а также проверка биологической активности ряда не описанных ранее de novo секвенированных пептидов

Научная новизна и практическая значимость Впервые охарактеризованы пептидные профили кожных секретов двух видов лягушек - Rana ndibunda и Rana arvalis Масс-спектрометрически установлены первичные структуры 33 пептидов, входящих в состав кожных секретов этих животных 22 пептида оказались не описанными в литературе

Разработан системный подход к de novo секвенированию неизвестных

пептидов методами тандемной масс-спектрометрии с использованием различных методов ионизации (МАЛДИ, электрораспыление (ESI)) и анализаторов (квадруполь-времяпролетный, ионная ловушка, ИЦР) Получены качественные масс-спектры относительно тяжелых пептидов (до 4 кДа), осложненных наличием С-терминального дисульфидного цикла Приведено сравнение методов восстановления/алкилирования и окисления дисульфидного цикла, впервые получены масс-спектры окисленных дисульфидсодержащих пептидов методом электрораспыления

Для установления пептидного профиля был оптимизирован подход «отпечатков пальцев» в методе МАЛДИ Установлены закономерности величины пиков молекулярных ионов пептидов амфибий от введения органических добавок в матрицу для МАЛДИ

Впервые исследована зависимость пептидного профиля Itndibunda от местообитания Получены данные о качественном и количественном изменении состава кожного секрета R ndibunda при сравнении особей из Средней полосы России и Кавказского региона

Пять новых пептидов с определенной методом МС/МС структурой были выделены в чистом виде и подвергнуты деградации аминокислот по Эдману Получена 100%-ная сходимость полученных результатов с данными масс-спектрометрического секвенирования

Четыре новых пептида были синтезированы и протестированы на всевозможные типы биологической активности Все они обладают антимикробной активностью, причем максимальную активность (MIC 25 мкг/мл) против грам-положительных бактерий Leuconostic lactis проявляет пептид бревинин-lR FFPAIFRLVAKWPSnCSVTKKC-OH с Мм 2663 Да Этот же пептид продемонстрировал сильнейшую активность в ингибировании синтеза NO при ICjo равном 4,0 мкМ Бревинин-lR - первый пептид, выделенный из лягушек рода Rana, который проявляет активность подобного рода

Публикации и апробация работы По материалам диссертации опубликовано 4 статьи Основные результаты исследования были представлены на конференциях Всероссийской конференции с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы» (Москва, 2005), 54th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics (Seattle, 2006), International Mass Spectrometry Conference (Prague, 2006), Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007» (Москва, 2007), 55th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics (Indianapolis, 2007)

Объем и структура работы Диссертационная работа изложена на 152 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части и выводов Иллюстративный материал содержит 13 таблиц, 19 схем и 37 рисунков Список цитируемой литературы состоит из 182 наименований

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Получение исходного биоматериала

Четыре особи R. ridibimda были пойманы в Московской области и содержались в неволе в течение 3 лет изучения 1 особь R ridibimda была отловлена в Абхазии Также было отловлено 10 особей R, arvahs Кожный секрет получали электростимуляцией спинных желез животных платиновым электродом, смывали деионизованной водой, разбавляли метанолом для осаждения и дезактивации протеаз Раствор лиофилизовывали и хранили при -24°С

2. Общая схема масс-спектрометрического секвенирования

Для секвенирования пептидов использовали метод тандемной масс-спектрометрии При этом нет необходимости выделять чистый пептид из смеси - его структура может быть установлена при выборе иона-предшественника Это одно из преимуществ масс-спектрометрического анализа над деградацией по Эдману, где требуется индивидуальный пептид

Для установления аминокислотной последовательности пептида всегда приходится использовать комплексный подход Это связано с инструментальными ограничениями любого масс-спектрометра Обладая достоинствами метода ионизации, активации фрагментации или режима съемки, прибор при этом может проигрывать, например, в разрешении или чувствительности, а также возможности стыковки с ВЭЖХ Не существует общего рецепта для масс-спектрометрического секвенирования новых пептидов (de novo секвенирования) Имеющиеся алгоритмы используют сравнение полученных масс-спектров с базами данных, построенными на основе генома и набора уже идентифицированных полипептидов и, следовательно, непригодны в случае секвенирования пептидов с неустановленной структурой

Нашей задачей являлась разработка алгоритма именно de novo секвенирования, достаточно универсальной и пригодной, по крайней мере, для класса изучаемых нами кожных пептидов амфибий рода Папа

Разработанная и применяемая нами стратегия de novo секвенирования приведена на схеме (с 6) Неразделенный секрет смешивали с матрицей и записывали масс-спектр МАЛДИ, представляющий собой пептидный профиль каждого из изучаемых нами видов лягушек (п 3) Одновременно устанавливали молекулярные массы мажорных компонентов кожных секретов

Исходные субстраты - сложные многокомпонентные пептидные смеси, и для определения структуры каждого из пептидов исходный материал разделяли ВЭЖХ на отдельные фракции Каждую фракцию анализировали комплексом масс-спектрометрических методов В качестве базовых были использованы два важнейших метода мягкой ионизации МАЛДИ и электрораспыление Применяемые техники суммированы в левой и правой частях предложенной схемы (затемненные поля)

Э л к к т 1> о р а с и 1.1 и.11 ие

Пробомо дгптонк а

МА Л Д И

Выводы О НХЛНЧИИ отдельных аминокислот и Х-З-СЕЖСЙ,

штсЩа возможно определение поеледо

дисульфид но го пикл^

/'Первичные лкшнме'й' снквснсе днеуяьфкд-содержащеге или ■ вдШаяпосясдава-.. тельное™ для | (шедшфщшровяк-

:ного ретида

' ' : ..............N

ИнформШ 1ИНО последовательности" внл три дисульфид-цикла. Установление полного сиккеисй

ДА С! (отри-п.цт. ионы)

ДАГ (нй;ю-¡101

ДА С; (положит пуны)

ДЭЗ

ДАС (чале- ]

жит ионы) ] 1ДАС (ИОЛО-

[ЖЙТ: ИОНЫ)

: ДЭЗ

МАЛДИ-ВП .(положит, и ОТрИШТ. ионы) ' Определение

.. Пептидный профиль

МАЛДИ-ВП (положит, и отришт ионы) Определение мол. массы

\'1ЛЛДИ-ВП;ВП (положит. ионы)

Ырни'шьн; шнные о

СИКНСНСС ДИСУЛьфид-

содсржлиитл и;:н полна л послело »а-

[, :ь"•!''. 1 :> для

н с.мо днф ит и-фрвак-.цою пептида

У

вэжх-мс/мс

/

Окис- Клрбоксйг

'ДОНЯС. МИДОМСТИг ■ ■ . ЛИрОВЕШИ.е

МАЛДИ-ВШВ11

(/[ОЛО^К^Л ионы)

ч

Информация о 1 юелсдов ателы сости внутри дисульфид-

ног о ЦИКЛЯ; : Установление полного СиквенСа

V._ У

Спектры фрагментов расщепления

I рипсищшй

Сокращения: МАЛДИ -■ матрично-атшированная лазерная десорбция/ионизация; ВП - время пролетный анализатор: ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ДАС - диссоциация, активированная соударениями; ДЭЗ - диссоциация при электронном захвате.

Известно, что S-S связь затрудняет фрагментацию между связанными цистеи-нами Поскольку предварительные данные указывали на наличие дисульфидного цикла во многих из проанализированных нами пептидов, для преодоления этой проблемы мы провели их дериватизацию Один из методов включал восстановление дисульфида с последующим алкилированием тиольных групп Это позволило установить последовательности внутри дисульфидного цикла как при помощи МАЛДИ, так и при ESI, причем лучших результатов удалось добиться при электрораспылении

Однако некоторые из дисульфидсодержащих пептидов восстановить не удалось, а часть аминокислот осталась не идентифицированной В связи с этим была применена альтернативная методика «раскрытия» дисульфидного цикла - окисление его до сульфокислоты Наилучшие спектры получены методом МАЛДИ-ВП/ВП Также впервые были получены репрезентативные спектры окисленных природных пептидов при электрораспылении, хотя в целом качество спектров было хуже, чем при использовании МАЛДИ

3. Установление общего пептидного профиля

Пептидный профиль является характеристикой вида амфибии и может применяться для отнесения лягушки к конкретной систематической единице, а также выявлять различия особей в разных условиях обитания Таким «отпечатком пальцев» служит хроматограмма (ВЭЖХ) совместно со спектром МАЛДИ кожного секрета амфибии В качестве примера приведена хроматограмма и спектры МАЛДИ положительных и отрицательных ионов секрета Л ап/акх

L12_DHB.cr1JtM_L124\1SLin

U2_DHB_cr1_!C!0_L1!'i1\lSLin

ВЭЖХ

LiuLi^

Профиль МАЛДИ в режиме отрицательных ионов более информативен Он содержит большее число пиков [М-Н]" пептидов и не осложнен сателлитными пиками [М+№]+ и [М+К]+, присутствующих наряду с [М+Н]+ в спектре МАЛДИ положительных ионов

Вид спектра МАЛДИ кожного секрета амфибий существенно зависит от загрязненности образца и используемой матрицы Для выявления оптимальных условий МАЛДИ-профилирования мы исследовали зависимость величины пиков

мажорных компонентов секрета R ridibunda от внесения в матрицу органических добавок, в частности, N-фенилмалеинимида, йодацетамида, нафталина, щавелевой кислоты, галактозы и октадекана Были исследованы добавки в стандартные матрицы 2,5-дигидроксибензойной (DHB) и а-циано-4-гидроксикоричной (НССА) кислот Установлено, что внесение незначительных добавок кристаллических органических соединений любой природы ведет к увеличению однородности (гомогенности) кристаллов DHB Эта однородность приводит к значительному (до 500 %) увеличению интенсивности и разрешения сигналов пептидов Другие возможные механизмы наблюдаемого эффекта добавок (увеличение гидрофобности образца, улучшение условий протонирования и поглощения лазерного излучения, появление в системе ловушек электронов) если и имеют место, то значительно в меньшей степени Это подтверждается примерно одинаковым увеличением интенсивности сигналов пептидов при воздействии всех добавок, вне зависимости от ее природы Эффект добавок отсутствует для НССА, которая сама по себе образует мелкие кристаллы, равномерно распределенные по образцу

Таким образом, были выработаны оптимальные условия съемки пептидного профиля амфибий методом МАЛДИ Потенциально более загрязненные образцы снимали в DHB (протестированные разнообразные добавки в той же степени имитируют загрязнения) Более чистые образцы снимали с использованием НССА, либо при использовании добавки щавелевой кислоты (1 100) к водно-ацетонитрильному раствору DHB в качестве матрицы

3. Использование масс-спектрометрпи отрицательных ионов при электрораспылении для секвенирования пептидов

Данный метод был применен для записи тандемных масс-спектров депротонированных молекул пептидов [М-Н]" в режиме ДАС Главная особенность таких спектров - выбросы из [М-Н]" СН20 (при наличии Ser), МеСНО (Thr), H2S (Cys), Н20 (Asp и Glu) и NH3 (Asn и Gin) Пептиды, содержащие С-концевой дисульфидный цикл, также претерпевают следующий процесс

Анализ выбросов из [М-Н]" подтверждает наличие в пептиде отдельных

аминокислот и S-S связей Из 33 идентифицированных нами пептидов 26 -

дисульфидсодержащие Ниже приведен фрагмент МС/МС отрицательных ионов бревинина-1 AVa из кожи Rarvahs

Выброс 44 Да (ТО2) и 66 Да (Н282) из [М-Н]" свидетельствует о наличии дисульфидного моста в пептиде и свободной карбоксильной группы на С-конце пептида, а дополнительный выброс 44 Да (МеСНО) - о присутствии ТЬг в сиквенсе Поскольку депротонирование молекул полипептидов происходит, как правило, на 1-2 порядка менее эффективно, чем их протежирование, получение спектров отрицательных ионов возможно только для мажорных компонентов пептидных смесей (табл 1)

Таблица 1

Вид Мол масса пептида, Да Нейтральные выбросы из [М-Н] Выводы об особенностях первичной структуры

R ridibunda 2675 -С02, -H2S2, - МеСНО Есть дисульфидный цикл, свободный С-конец, один Thr в последовательности, а- и ß-ионы указывают на сиквенс внутри дисульфидного цикла CKI-T/G-RKC

2636 -со2, -H2S2, - 2 HCHO Есть дисульфидный цикл, свободный С-конец, два Ser в последовательности

3516 -C02, -H2S2, - 3 HCHO Есть дисульфидный цикл, свободный С-конец, три Ser в последовательности

R arvalis 1810 -C02, -H2S2, - НСНО,- 2 МеСНО Есть дисульфидный цикл, свободный С-конец, один Ser и два Thr в последовательности

1874 -С02, -H2S2, - HCHO, -МеСНО Есть дисульфидный цикл, свободный С-конец, один Ser и один Thr в последовательности

1923 -со2, -H2S2, - HCHO, - 2 МеСНО Есть дисульфидный цикл, свободный С-конец, один Ser и два Thr в последовательности

1901 -С02,-H2S2,-HCHO, - МеСНО Есть дисульфидный цикл, свободный С-конец, один Ser и один Thr в последовательности

4. Использование масс-спектрометрии положительных ионов при электрораспылении для секвенирования пептидов

Основную информацию о последовательности аминокислот при de novo секвенировании пептидов обеспечивает тандемная масс-спектрометрия положительных ионов Пути распада МН+ при активации соударениями оказываются сходными для всех пептидов Разрыву полипептидной цепи предшествует нуклеофильная атака электронодефицитного карбонильного атома углерода, возникшего после протонирования атома кислорода соответствующей пептидной связи В результате образуются две доминирующие серии фрагментных ионов

О R,

ОН R„

R, О R3 О w R, I

H3^VHAh

+c

У2-ИОН (2 )

карбонильного

атома кислорода,

У2-ИОН

Очевидно, при протонировании принадлежащего другому аминокислотному остатку (т н модель мобильного протона), происходят разрывы других пептидных связей Таким образом, образуются серии Ъ и у комплементарных ионов

Ь2 Ь3

Н4"

При активации фрагментации методом ДАС ионы серий buy являются доминирующими в спектре Находя комплементарные пары, исходя из масс аминокислотных остатков, мы устанавливали первичные структуры всех пептидов

Прямое введение образца в электроспией. Часть пептидов была секвенирована при использовании прямого ввода образцов в источник ионов Предварительно разделенные ВЭЖХ фракции вводили шприцем в капилляр, соединенный с иглой источника электрораспы-ления Как правило, фракции содержали 1-3 интенсивных пика, соответствующих ионам мажорных пептидов данной фракции Использовали два типа приборов квадруполь-времяпролетный масс-спектрометр гибридной геометрии QTOF и ионную ловушку в стыковке с ячейкой ИЦР (LTQ-FT) На рисунке приведен спектр МС/МС пептида с М м 3516Да из кожного секрета R ridibunda, полученный на QTOF при активации соударениями

......................ïlXtil^ (n^si

W» 1W9 120g t$00 HOU 1«RÎ 1в<Й W®

bis

«KM Jyl4

185&1 1MW.

'1

ho

b23 Ш!

b2,

îi?

w

227B +

«даэ M

il

2523.5 УМ

2B37S 2685$

»«Л 2Ж5.4

birismi

37S2T

У%> „ Уза ms.s ум у,.

3ffii5.f '

eilL

Уи

3473.0

J51S.3

«вр 2060 2iQö ггм ж» ш> js® 2№ г?« жю awe a®» 31а> за»

Ион с m/z 3348 Да открывает _у-серию при потере 147 Да (Phe) из МЕГ, ион с m/z 171 Да - è-серию и представляет собой й2-ион со структурой [Gly+Leu/He]+ Обе серии достаточно интенсивны, причем è-серия длиннее, чем у (25 и 17 ионов соответственно) Отсутствие Ь -ионов тяжелее ¿27 и _у-ионов легче _}'* находится в соответствии с данными масс-спектра отрицательных ионов (табл 1) и объясняется наличием в структуре пептида дисульфидного цикла S-S связь, образующая этот цикл, препятствует фрагментации внутри него Ниже суммированы серии buy ионов, наблюдающиеся при фрагментации пептида сМм 3516 Да (G I/£Ö|M|M^DJ^QJI/l к/о|Й|7|а]к/о| т| ÂjG|K/Q| G|с—с-он

В данной схеме разделители характеризуют разрыв, причем ¿-ионы обозначаются символом , символизируя сохранение заряда на N-конце, адчионы -символом j_ , указывая на сохранение заряда на С-конце Скобки (G I/L) обозначают неидентифицированное взаиморасположение аминокислот Учитывая, что именно разрыв - вне зависимости от того, соответствует ли он b-, j-серии или им обеим -позволяет идентифицировать аминокислоту в последовательности, вышеприведенную схему разрывов можно записать в кратком виде (G-I/L)I/L-I/L-D-K/Q-I/L-K/Q-NFA-K/Q-TAG-K/Q-GV-I/L-K/Q-S-I/L-I/L-NTAS-ÇrrÇ-OH Для всех мажорных пептидов кожных секретов обеих лягушек были записаны спектры данного типа на масс-спектрометре QTOF Установленные аналогичным образом аминокислотные последовательности (в том числе ранее не описанных пептидов) приведены в табл 2 и 3 Поскольку молекулярные массы изомерных Leu/Ile идентичны, а изобарных Lys/Gin - очень близки (Leu/ Ile (L/I), 113 08 Да, Lys (К), 128 09 Да, Gin (Q), 128 06 Да), в

приведенном сиквенсе данные аминокислоты не отнесены (указаны два варианта через косую черту) Для отнесения изобарных аминокислот был использован масс-спектрометр высокого разрешения ЬТ<3-РТ На рисунке приведен спектр пептида с Мм 3516 Да, полученный на ионной ловушке в стыковке с ячейкой ИЦР Внизу

приведена установленная последовательность пептида

hs

Уи

Уп

1222 55

Уи

с

Уц

Уп

У29

Ум

> Уп

Г

МП-

Ум

m/z

(396 Да)-Е|к[м,|кJn|f|Ä|к|т ÄJg| k|g|vj—C-OH

В спектре отсутствуют пики с m/z ниже 750 Да Это обусловлено особенностями ионных ловушек, из теории работы которых следует неизбежная потеря в МС/МС пиков с m/z ниже -25% от массы иона-предшественника Приборы QTOF лишены этого недостатка Тем не менее, благодаря высокому разрешению LTQ-FT удалось отнести Lys/Gin (Lys6,8,12,16 и Gln20), что продемонстрировало необходимость использования комплексного подхода при de novo секвенирования пептидов

Однако ни один из приведенных выше методов не обеспечивает разрывов внутри дисульфидного цикла Для установления последовательности С-терминальной части этого пептида была применена процедура восстановления дисульфида дитиотреитолом с последующим алкилированием йодацетамидом согласно схеме

ê \ Hs SH 6уфер0 Ш1ч1Н^НСОз ^ ^

hn nh \ / hn nh

+ ICH2CONH2j 25°С

в темноте

Этот известный прием разрыва сшивающих белок в-в связей был впервые применен нами для раскрытия С-терминального цикла применительно к пептидам из семейства Яапа Спектр карбоксамидометилированного пептида с М м 3516Да(1ЛЧЗ-БТ) приведен ниже

<, 5£H

I "

I 40"

Ум

Ь,

7Я®

У, |

1226 S4

Ьы

¡

a^iuuu

Ьц

Ьи\

Уи Ь» и

' 252351

!ii

bu

2096 ZS

bjs í Уи

I Mlt

1 3634 00

¿„ У2 7®'»-« 2S91 so I

Ъп ' 3S34Q0 ¡lM3»7Si ¡ 3183И |

' isi I

L

Ti 1

11

ufo. !i

p,

(639 Да)-щ|к|к|р|а| k|t|a|g k|g^vJio|q|s

C*-OH

Символом С* обозначен цистеин, имеющий после восстановления/ алкилирования радикал -З-СНгСОМНг и массу 160 Да вместо 103 Да в исходном цистеине ¿-Серия проходит до конца и дает следующую структуру дисульфидного цикла СК-ЬЪ-вСКЗС Сумма трех спектров позволяет определить всю аминокислотную последовательность пептида сМм 3516 Да с точностью до 1/Ь Известно, что в коже лягушки Я. еысиЫЫа содержится бревинин-2Ес Его структура Р1ЬЬРКЬК№АКТАОКОУЪ08ЬЬШ'А8СКЬ800С-0а что полностью соответствует определенной для пептида с М м 3516 Да с точностью до 1/Ь Поскольку & езеи/еийаг -естественный гибрид Я. пскЬипскг и Я. 1е$$опае, логично присутствие идентичного пептида в кожном секрете как Я.ехси1еп1а, так и изучаемой нами Я.пЛЪипскг

Таким образом, выделенный нами пептид с М м 3516 Да - бревинин-2Ес Запись спектров исходного пептида, а затем его карбоксамидометилированного аналога была применена нами для анализа еще нескольких мажорных пептидов из кожных секретов какЯгиЬЪипЛа, так иЯ.агуа!^ Результаты суммированы втабл 2 иЗ

Альтернативой для раскрытия дисульфидного цикла в пептидах является их окисление надмуравьиной кислотой

\ / \

HN NH HN

/ \ / \ нсооон / \ о=< s—s >=о-»- о=( SO3H

) <

NH

ho3S v=°

С точки зрения пробоподготовки окисление обладает рядом преимуществ по сравнению с восстановлением-алкилированием, а именно 1) одностадийный процесс, 2) одинаковые > словия проведения реакции для любых полипептидов и 3) не требуется очистка пробы, так как реагент удаляется при лиофилизации образца Данный прием разрыва дисульфидных связей был нами также впервые применен к пептидам из семейства Rana, содержащим С-терминальный дисульфидный цикл Недостатком окисления является превращение тиольной группы цистеина в сильнокислую

сульфогруппу Кислый протон группы -БОзН может легко внутримолекулярно протонировать основные аминокислоты пептида, образуя цвитгер-ион В результате дополнительного протонирования молекулы в источнике электрораспыления образуются мультизарядные ионы, менее стабильные, чем ионы меньшей зарядности По мнению многих авторов, это приводит к их неуправляемой фрагментации и скрамблингу еще в источнике до достижения детектора В результате спектры окисленных пептидов, полученных при электрораспылении, были описаны лишь для малого числа коротких синтетических пептидов В то же время есть несколько указаний на неудачные попытки получить такие спектры для природных полипепгидов Уменьшая напряжение на капилляре в источнике электрораспыления, нам удалось зафиксировать молекулярные ионы пяти окисленных нами пептидов (М м 1810, 1874, 2675, 2636 и 3516 Да) Энергия активации фрагментации этих пептидов была ниже по сравнению с карбоксамидометилированными аналогами в 2-4 раза и составляла 1—15 эВ, что свидетельствует о снижении стабильности ионов окисленных пептидов в электроспрее Спектр МС1 уже содержал множество пиков фрагментных ионов Спектр МС2 бревинина-Ш записать не удалось В то же время для остальных пептидов были получены хорошие МС2-спектры В качестве примера приведен спектр выделенного из кожи Ист>а1г$ бревинина-1АУа после окисления (Мм окисленного пептида - 1908 Да)

МН (2+)

| У,

5 »

100^ 90г

6 «ь

; ь ? Ъ. 8

й ».у ,(2 )

ь„ I

400 600

1000 1200 1400 1600 1800 2000

Данный масс-спектр содержит идентифицируемые Ъ- и _у-серии, цистеин регистрируется с массой аминокислотного остатка 151 Да (-БСКН вместо -БН) Установленная последовательность суммирована на схеме

• А)|с°*|т [у

К

К

Сох-ОН

Аналогичные результаты были получены для четырех других пептидов, установленная последовательность которых приведена в табл 2 и 3

ВЭЖХ-МС/МС. Для секвенирования пептидов, присутствующих в кожном секрете амфибий в минорных количествах, метод непосредственного введения в ионный

источник не применим Это связано с протекающими при электрораспылении процессами перезарядки, что приводят к дискриминации сигналов компонентов, концентрация которых в смеси невелика Онлайн ВЭЖХ-разделение позволяет частично решать эту проблему При различных временах удерживания минорного и мажорного компонентов их молекулы в разное время попадают в ионный источник Это исключает перенос заряда от минорного компонента к мажорному (или минимизирует его) В результате происходит возрастание относительной величины пика минорного компонента Таким образом, в режиме ВЭЖХ-МС/МС становится возможной запись спектра минорного компонента в автоматическом режиме Очевидным недостатком такого анализа является именно автоматический режим, поскольку невозможно выставить оптимальную энергию соударений - она будет изменяться в пределах, задаваемых программой анализа Применив ВЭЖХ-МС/МС для анализа пептидных смесей Я.пЖЬгтЛа (из двух регионов) и А агуакэ мы установили структуру 18 минорных компонентов Были проанализированы все узкие фракции, собранные при разделении кожных секретов с помощью ВЭЖХ Каждая фракция была введена в систему ВЭЖХ-МС/МС в исходном виде, а затем дериватизованном - после восстановления и карбоксамидометилирования Подход к секвенированию не отличался от варианта с непосредственным введением в электроспрей Установленные последовательности суммированы в табл 2 и 3 В частности, при установлении первичной структуры пептида с массой 2663 Да, выделенного из кожи Я гкЬЪипс/а, при анализе исходного пептида была получена следующая аминокислотная последовательность

Б|Р|-428 Да| 1/ь| У^А^^у!^7^ -----С - ОН

Однако после восстановления и алкилирования пик молекулярного иона модифицированного пептида зарегистрировать не удалось, что, по-видимому, вызвано близкими временами удерживания карбоксамидометилированного пептида и одного из мажорных компонентов Мы предположили, что наложения пиков можно избежать, анализируя фрагменты модифицированного пептида с малой массой, которые можно получить при энзиматическом расщеплении пептида, например, трипсином Трипсин гидролизует полипептиды по С-концу лизина и аргинина Достоверно установив лизин и аргинин (см схему), мы провели трипсинолиз карбоксамидометилированной фракции, содержащей интересующий пептид, ожидая получения как минимум трех фрагментов расщепления (по Я и по К) Фрагмент 1/Ь-УАК-ОН зафиксировать не удалось, в то же время были обнаружены пики, соответствующие продуктам трипсинолиза с массами 1202 67 Да и 897 50 Да По спектрам ДАС были установлены последовательности обоих фрагментов

Р Б Р А 1/Ь Б Я У V Р Э1/Ь1/Ь С* 8 V Т К

Последовательность во втором фрагменте включает разрывы внутри дисульфидного цикла, где присутствует лизин, что и обеспечивает гидролиз

Поскольку дисульфидный цикл состоит из семи аминокислот, точная масса и вся остальная последовательность пептида нам известна, легко вычислить массу недостающего аминокислотного остатка 128 09 Да (Lys) Таким образом, была установлена вся последовательность FFPA-I/L-FR-1/L-VAKVWS-I/L-I/L-CSVTKKC-OH

В режиме ВЭЖХ-МС/МС на приборе LTQ-FT возможна также запись спектров с использованием отличного от ДАС метода активации фрагментации Данный метод -диссоциация при электронном захвате (ДЭЗ) применим только для многозарядных ионов (т е для ионов пептидов, полученных в электроспрее) и только в ячейке ИЦР Схема фрагментации при этом отлична от ДАС - основные разрывы продуцируют появление серий с- и г-ионов

1

ш-

I

R—С—NH—CH-R1

с" ,

R—С—NH—CH—R

(n-lf

ОН I

I ,

- R—С—-NH—СН— R -

nCn-ir

Œ

I

►Ег-С=Ш

л1

-, (№l>

CHR 2

Комплементарные серии с- и z-ионов несут важную структурную информацию и могут использоваться в de novo секвенировании пептидов В частности, одно из основных преимуществ масс-спектров, полученных при ДЭЗ, - вероятный разрыв боковой цепи из г-иона и возможность идентификации изомерных Ile/Leu

сн3 сн3

сн г

С ¿Нг О НО

V I II I II

^ СН—С—(NH—СН-С)-—ОН

-СзН7

СЯ, о R О

и 2 II I II

сн—с —(NH—СН-С ) — ОН

2„

В качестве иллюстрации ниже приведен ДЭЗ-спектр продукта трипсинолиза пептида с массой 2663 Да - БЕРА-М^-РЯ

1 7 897 5 0

г.

w.

'3

390 21

723 39

Z

705 38 , ,1,

б

735 41 . il.

838 47

На приведенном спектре присутствует и^-ион, образующийся за счет потери 29 Да (этильный радикал) из г3-иопа Наличие его однозначно свидетельствует в пользу изолейцина в положении 5 последовательности Структура данного продукта трипсинолиза - РБРАППИ Аналогичные выбросы могут происходить и из я-ионов Как а, так и г-ионы могут формироваться непосредственно при активации столкновениями за счет статистической возможности гемолитического разрыва полипептидной цепи Внимательная обработка спектров, полученных методом ДАС, позволила во многих случаях найти соответствующий разрыв и произвести идентификацию аминокислот в неоднозначных ситуациях Аналогично, многие Ьеи/Пе были идентифицированы при

наблюдении ve-ионов в спектрах ДЭЗ, где их вероятность образования выше, чем в условиях ДАС (z-ионы - доминантные в спектре)

5 Масс-спектрометрическое секвенирование с использованием МАДЦИ

Характерной особенностью МАЛДИ является образование однозарядных ионов, а также их высокая внутренняя энергия при выходе из источника Высокоэнергетическое состояние ионов обусловливает менее специфическую фрагментацию ионов пептидов, так как фактически энергии достаточно для разрыва любой связи в молекуле При электрораспылении энергия значительно ниже, что делает результаты фрагментации в МАЛДИ и электроспрее различными Как правило, в спектрах МАЛДИ содержится больше ионов всевозможных типов, при этом Ъ- и у-ионы доминируют

Определяя структуру пептидов при помощи электрораспыления, параллельно те же пептиды анализировали методом МАЛДИ-ВП/ВП Наблюдаемые при этом разрывы зачастую проясняли картину Например, для пептида с массой 2636 Да, выделенного из кожного секрета R ridibunda, при анализе методом электрораспыления (LTQ-FT) была получена последовательность (WL)PFVASVAAEMMQ-(1162 Да) МС/МС отрицательных ионов подтверждают наличие дисульфидного цикла (табл 1) Спектр МАЛДИ-ВП/ВП позволил уточнить последовательность до VI/LPFVASVAAEMMQHVY(763 Да) Учитывая данные табл 1 и наличие единственного серина в ациклической части, мы заключили, что второй серин располагается внутри дисульфидного цикла Структуру последнего предполагалось установить после анализа карбоксамидометилированного пептида Но несмотря на попытки провести восстановление тремя разными восстановителями (дитиотреитолом в аммиачном буфере, с добавлением денатурируещего избытка гуанидиний-хлорида, а также меркаптоэтанолом), при варьировании температур (56°С, 37°С и 95°С) и времен реакции (15 мин, 1 и 3 часа), восстановления дисульфидной связи добиться не удалось вероятно, из-за особенностей вторичной структуры данного пептида

Окисление дисульфидного цикла надмуравьиной кислотой - удалось осуществить В результате произошло увеличение массы пептида на 194 Да, что свидетельствует об окислении не только обоих цистеинов (прирост массы 96 Да), но и ряда других аминокислот Анализ окисленного пептида с помощью электрораспыления не дал никаких результатов (п 4) по-видимому, в мультипротонированном состоянии данный пептид крайне нестабилен Монопротонирование в условиях МАЛДИ позволило получить более устойчивый ион и записать его МС/МС, содержащий интенсивные серии Ъ и у-ионов, позволяющие без труда установить аминокислотную последовательность как ациклической части, так и внутри дисульфидного цикла исходного пептида (V-I/L-PFVASVAAEMMQHVYCAASRRC-OH)

У»

JMB-CEjSOjHf

Известным недостатком окисления является протекание побочных реакций окисления некоторых аминокислотных остатков, в частности, Туг (окисление фенольного фрагмента), Тгр (окисление индолильного радикала) и Met (окисление атома серы), а также формилирования Lys В пептиде с массой 2636 Да было

зафиксировано окисление метионина согласно схеме

/ /

HN

HN

2 [О]

В связи с этим вместо ожидаемых 131 Да разница между соседними ионами Ь и ^-серий, соответствующих разрыву пептидных связей метионина, составила 163 Да

Спектры МАЛДИ-ВП/ВП были записаны нами для ряда мажорных пептидов как в исходном состоянии, так и после окисления и/или карбоксамидометилирования (табл 2 и 3) Стоит отметить, что во всех случаях спектры окисленных пептидов оказались более информативными, чем спектры карбоксамидометилированных По-видимому, это связано с протонирующей способностью сульфогруппы, образовавшейся на месте цистеина после окисления Этот протон, вероятно, способен выступать как аналог мобильного протона в электроспрее, обеспечивая квазимультипротонированное состояние пептида и, как следствие, более интенсивную и неспецифическую фрагментацию Стоит также отметить, что побочных реакций окисления ни в одном из анализируемых пептидов (кроме пептида с М м 2636 Да) не наблюдалось В спектрах присутствуют интенсивные Ъ- и j-серии, а также наблюдается серия Ъ -ионов, образующихся в результате самопроизвольно протекающей МС3 тяжелых ионов типов Ъ и у Ъ* - Серия наблюдается как для исходных, так и для дериватизованных пептидов

6. Пептиды, идентифицированных в кожных секретах £ псЫЬипйа и Л.аю<йк

Таблица 2 Пептиды И псЯЬипда

№ Пептид, М м, Да Метод Установленная последовательность 1азванис пептида

1 3516 Исх ЖХ-МС2 (О1ЕЕ)ОК1К№АК(ТА)ОКОУЕ08ЕЕНТА8 (С----С-ОН) Бревинин-2Ес

Исх Пр ввод (С1)ЬЬО/Ша>1РАетАОА:ОУЬР8ЬЬКТА8(С—С-ОН)

САМ ЖХ-МС2 (О1ЕЕВК)ЕК№РАКТА(ОК)(СУ)Е08ЕЕ1ЧТА8 С*КЬ8О0С*-ОН

ОХ ЖХ-МС7' (С1)ШЖЕКМРАК(ТА)(СК)(ОУ)Е08ЕЕМТА8 СохКЬ8О(}С°х-0Н

Исх МАЛДИ СТЬЬОА'ЕА'МРААТАОА'ОУЕРБЬЬМТАЗГС-----С-ОШ

САМ МАЛДИ (0[)ЕЕ0АЪАОТАХГА0АГ;УЕ08ЕЕЫТА8С*ИЖ;-(ОС*-ОН)

ОХ МАЛДИ (С1)Е1ЛЖЬА:К Р АГГАОДгаУЦ? 8иЛЧТА 8СохАХ80-(?С°х-ОН

£ О1ЬижЬКМРАКТАОКОУЬ08ЬЬМТА8СК1_5СОС-0Н

2 2673 Исх Пр ввод РЬР1ХАОЕААКРЕ(Р*0(1Р)ГС-----С-ОН) Бревинин-

Исх ЖХ-МС2 (РЬ)РЬЬАОЬААОТЬРК(1Л(С-----С-ОН) 1Е

ОХ ЖХ-МС*1' РЕРЕЕАОЬААМРЦРК)1РСохК(1Т)ЕКСох-ОН

Исх МАЛДИ РЬРЬЬАОЬААКРЕРА1Р(С-----С-ОН)

САМ МАЛДИ (Р1 ,)РЕЕ АСЕ А А№'ЕР/ЛРС "НТМХ: -ОН

ОХ МАЛДИ (РЕ)Р1ХАОЕААМРЕРА1РСохИТК/Х'"-ОН

Е РЕРЕЬАОЕААОТРРК1РСК1ТРЖС-ОН

3 3821 Исх ЖХ-МС2 (С1)ЕЕ8ЕУКУАКЕАСКТРАКЕООКР(ОЕ)ЕР1А (С-----С-ОН) Эскулен-гин- 2И

Исх Пр ввод (01)ЕЕ5ЕУКУАКЕАС/ГГРАЮ500КР0ЕЕР1А (С—-С-ОН)

I 01ЬЬ8ЬУКУАКЬАСЖТРАКЕООКРОЬЕР1АСК1/Р8ЬЕС-ОН

4 2990 Исх ЖХ-МС2 (01)Ь08ЬККРА(К0)АА(01)ЬЬКЬСА8(С-—С-ОН) Бревинин-

Исх ЖХ-МС2 (ДЭЗ) 01ЬВ8аКМРАК)ФАА011ХК)(КА8С-----С-ОН) 2Иа

X 01Е08Ь1а^ШАКтА011ХККА8СКХ800С-0Н

5 2635 Исх Пр ввод (У1)РРУА8УААЕММ(?(НУУ)СС-----С)-ОН Бревинин-

ОХ МАЛДИ У1РРУА8УААЕММОНУУСохАА8ЯЯСох-ОН 1Иа

2 У1РРУА8УААЕММОНУУСАА8КЯС-ОН

6 2918 Исх ЖХ-МС2 (ОЕ)М81ЬКОАА(ТК)ААУТЕЕККЬ0(С-----С-ОН) Бревинин-

САМ ЖХ-МС2 (GL)M(ST)L(KG)AATNAAVTLLNKLQC*KLTGTC*-ОН 2Ш)

2 ОЬМЗТЕКОААТЫААУТЕЕЫКЕОСКЕТОТС-ОН

7 2947 Исх ЖХ-МС2 ОЕМЗТЪКОААТОУАУТЕЕКСК^ОГС-----С-ОН) Бревинин

ОЬМЗТЬКОААТНУАУТиичКЕОСКЬТОТС-ОН 2Ис

8 3012 Исх ЖХ-МС2 О1ЬО8ЬКНЬАКМАА0ШЕ1ЧКА8С£Ь8О0С-0Н Бревинин 2Я

9 2662 Исх Пр ввод РР(РА1РЯ)ЬУАКУУР8П(С-----С-ОН) Бревинин-

САМ, трипс-з ЖХ-МС2 РРРА1РЯ-ОН и ЬУАКУУРвНС* вУТК-ОН 1Я

£ РРРА1РКЬУАКУУР811С8УТККС-ОН

10 2707 Исх Пр ввод РЕРЕЕАОЕАА№РРЮРШХМС-ОН Бревинин-1Ес

11 4795 Исх Пр ввод GIFSXLAGJK(L/I)i?NLLISGLiïNVGKEVGMDVVRTG тгАОсетшЕС-он Эскулен-тин-la/b

12 3791 Исх ЖХ-МС2 GIFLDKLKNFAKGVAOSLLNKASCKLSGOC-OH Бревинин-2Ei

13 3369 Исх ЖХ-МС2 GIMDTLKNLAKTAGKGALQSLVKMAS CKLSGOC-OH Бревинин-2Ef

14 3371 Исх Пр ввод GIMDTLKNLAJCTAGXGALQSLLNHAS CKLSGOC-OH Бревинин-I 2Eg

15 2688 Исх Пр ввод NVGJŒVGMDWRTGIDIAGCiOSrGEC-OH Эскулентин la/b 21-46

16 2928 Исх Пр ввод LfflSTVG/ŒVGMDWRTGIDIAGCiO^GEC-OH Эскулентин la/b 19-46

17 1073 Исх ЖХ-МС2 RPPGFTPFR-OH [Thr6]6pa-днкинин

18 1060 Исх жх-мс2 RPPGFSPFR-OH Брадикинин

Таблица 3 Пептиды из R arvahs

№ Пептид M м, Да Метод Установленная последовательность Название пептида

1 1810 Исх Пр ввод, FLPLLAASFAfC-----C-OH) Бревинин-1 AVa

САМ жх-мс2 (FL)PLLAASFAC"TVTKKC*-OH

ОХ жх-мс2 FLPLLAAS(FA)CoxTVTKKCox-OH

САМ МАЛДИ (FL)PLLAASFAC*TV(T£)íCC"-OH

ОХ МАЛДИ (FL)PLLAASFACoxTVTiXCox-OH

2 FLPLLAASFACTVTKKC-OH

2 1873 Исх Пр ввод, жх-мс2 FVPLLVSKLV(C-—C-OH) Бревинин -lAYb

САМ ЖХ-МС2 (FV)PLLVSKLVC*WTKKC*-OH

ОХ ЖХ-МС2 (FV)(PL)LVSK(LV)CoxVYTKKCox-OH

САМ МАЛДИ (FV)PLLVSAbVC*VVTAXC*-OH

ОХ МАЛДИ (FV)PLLVSAXVCoxWTi¡X:Cox-OH

2 FVPLLVSKLVCWTKKC-OH

3 1891 Исх Пр ввод FVP-I/L-I/L-VSAT-I/L-VC(AVFAX)C-OH Brevimn-lAVc

4 1902 Исх ЖХ-МС2 KNLLASALDKLKCKVTGC-OH Ранатуерин-2АУа

5 1923 Исх ЖХ-МС2 KNXFASAIDTIKC(KITG)C-OH Ранатуерин-2АУЬ

6 1060 Исх ЖХ-МС2 RPPGFSPFR-OH Брадикинин

7 806 Исх ЖХ-МС2 PGFSPFR-OH [des-Arg',Pro2] эрадикинин

8 1188 Исх жх-мс2 AGRPPGFSPFR-OH AR-11

9 1244 Исх жх-мс2 RPPGFSPFRIA-OH RA-11

10 1341 Исх жх-мс2 RPPGFSPFRIAP-OH RP-12

11 1499 Исх жх-мс2 RPPGFSPFRIAPAS-OH RS-14

12 1713 Исх жх-мс2 RPPGFSPFRIAPA STL-OH RL-16

13 1729 Исх жх-мс2 (RP)(HypG)(FS)(PFRI)A(PA)STL-OH [Hypá]RL-16

ДЭЗ (RPHyp)(GF)(SP)(FRI)A(PA)STL-OH

2 RPHypGFSPFRIAPA STL-OH

Обозначения в таблицах ОХ - окисленный пептид, САМ - карбоксамидометилированный пептид, Трипс-з - пептид после трипсинолиза, для случаев отнесения изомерных Leu/He и изобарных Lys/Gin введены обозначения I, L - жирный шрифт означает что для данных аминокислот были обнаружены d или w-ионы в соответствующих масс-спектрах, I/L - отнесение не удалось провести ни одним из вышеозначенных способов, К, Q- курсив означает идентификацию аминокислоты на приборах низкого разрешения, отсутствие курсива - идентификация аминокислот при записи масс-спектров высокого разрешения (LTQ-FT)

7. Сравнительное масс-спектрометрическое изучение пептидных профилей К.пдгЬипЛа, обитающих в разных климатических условиях

Известно, что пептидный профиль кожного секрета идентичен для лягушек одного и того же вида и может являться признаком таксономической единицы В то же время пептидный профиль зависит от местообитания вида, а также подвержен сезонным изменениям и.пЖЫтскг образует естественный гибрид с ЯЛеххопае, так называемую съедобную лягушку К ехси1еп(а Все три вида не сильно отличаются внешне, поэтому актуальным для зоологов является поиск надежного и воспроизводимого критерия таксономической идентификации этого комплекса С этой целью нами был изучен пептидный профиль двух лягушек, морфологически определенных как КпйгЪипНа, но с различными условиями обитания - Московская область и Абхазия В секрете кавказской лягушки присутствуют все пептиды, обнаруженные нами ранее в КпйгЪигиМ Московской области (1, 2, 3, 5, 6, 9, 11, 17, 18 из табл 2) В то же время в секрете абхазской озерной лягушки присутствуют три новых, ранее не описанных пептида I, П и Ш, принадлежащие к эскулентинам-1 и 2

Таблица 3 Кожные пептиды из И пЛЬипба (Абхазия)

№ Пептид, Мм, Да Метод Установленная последовательность Название пептида

I 3711 Исх ЖХ-МС2 ОП^ЬУКСААКЬШКОЬАКЕОСКУОиЕ Р1АСК-1/Ь-81,ЕС-ОН Эскулентин-21*а

II 4771 Исх жх-мс2 01Р8КЬАСККЪКМШ50ЬК8У0КЕУСМ ВУУЮГСГО1АОСК1КОЕС-ОН Эскулентин-1Я

III 3805 Исх жх-мс2 ОШЗЬУКОУАКЬАОКТЬАКЕООКРОЬЕЬ АМСК1АКОС-ОН Эскулентин-2Щ>"

Как количественные, так и качественные различия легко можно наблюдать на ВЭЖХ- и на МАЛДИ (отрицательные ионы) профилях

1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

Чаш*

В целом профили (хрома™ рафический и МАЛДИ) сов налаю- , что свидетельствует о видовой идентичности обеих особей Стоит также отметить, что именно МАЛДИ обеспечивает большую наглядность при сопоставлении профилей.

Основное различие пептидны я профилей двух лягушек ййояВДяется Й количественном соотношении мажорных пептидов - 1, 2, 5 и 9 (табл 2). Отношения двух доминирующих н обоих профилях пептидов (2 к 1) равны 2 : 1 и 1 2 для .московской и кавкяз&сай лягушек соответственно. Количество пептида 5 приблизительно одинаково для двух особей, тогда как лягушка из Московской области выделяет в пять раз больше пептида 9 и в четыре раза Дольше [ТЬг6]браднкинина 17 Оценка соотношений пептидов проводилась па основании ВЭЖХ вйщеления пептидов и представлена на гистограмме (за 100% принята площадь максимального пика па ВЭЖХ):

I R.ruiibunda □ R.ridibumia (Москва)

120 -100 ■

О -

п к

I I

щ >5

8. Проверь'» биологической активности ряда новых пептидов, выделенных ИЗ кожи R.ridihimda и R.un'alis

Кожный секрет амфибий помимо регуляторной функции обладает защитными свойствами за счет биологической активности входящих в его состав пептидов Как Следует из табл 2, кйжный секрет R.ridihimda содержи) брадикиинн и ряд мощных антимикробных пептидов, включая описанные ранее для вида h'.esci/lcma бревинчи-Ш, бревинин-)Ее и эскулен'гим-la/lb (активны в отношении широкого спектра грам-положительных и грам^йрицате льн ых бактерий); бревинин-2Ес (активен, в основном, в отношении X ра м- поло жи тель ных микроорганизмов) и 6pesii Hf iK-2Eg (активен против грам-отриМртельных бактерий) в концентрациях порядка 10 мкМ Помимо этого, в секрете Uridibtmda содержит множество новых пептидов. Два из них бревинины-lR и IRa - были синтезцрованы и протестированы на различные типы биологической активности. Бревинин-IR обладает средней антимикробной активностью (MIC 25

мкг/мл), а бревинин-lRa вообще неактивен в концентрациях ниже 100 мкг/мл, тогда как сходные пептиды из семества бревининов обнаруживали мощную антимикробную активность В аналогичной ситуации, например, с австралийскими амфибиями выделенные пептиды всегда обнаруживали другой тип активности например, ингибирование синтеза N0, спазмолитическую активность в отношении гладкой мускулатуры, или полного подавления размножения Т-лимфоцитов Наличие амфипатической пептидной цепи (вне дисульфидного цикла) вкупе с некоторым количеством гидрофобных боковых цепей предполагает потенциальную активность этих двух новых бревининов в ингибировании синтеза N0 Оба пептида - бревинин-lR и IRa - действительно показывают такую активность (IC50 равны 86,9 и 4,0 мкМ соответственно) Бревинин-lR более активен и является первым пептидом из кожного секрета лягушек рода Rana, который значительно ингибирует действие нейрональных NO-синтаз

Rar-vahs содержит только один из ранее описанных пептидов - встречающийся во многих лягушках мощный нейропептид брадикинин Все остальные пептиды оказались новыми и для трех мажорных компонентов - бревининов-lAVa, lAVb и фрагмента ранатуерина-2АУа была проведена деградация по Эдману, которая на 100% подтвердила установленный масс-спектрометрически сиквенс Бревинин-lAVa (Мм 1810 Да) и фрагмент ранатуерина-2АУа (Мм 1902 Да) были синтезированы Их МС/МС идентичны спектрам природных аналогов Оба синтетических пептида были протестированы на антимикробную активность против 15 различных микроорганизмов Их 1С50 минимальны в отношении Leuconostic ¡actis и равны 32,4 и 72,9 мкМ соответственно

ВЫВОДЫ

1 Впервые установлен пептидный профиль двух распространенных на территории РФ видов амфибий Rridibimda и Rarvahs Выделено и идентифицировано при помощи комплекса масс-спектрометрических методов 33 пептида, 22 из которых ранее не описаны Проведен анализ по Эдману пяти новых пептидов Полученная аминокислотная последовательность полностью совпадает с установленным масс-спектрометрически сиквенсом, что доказывает надежность предлагаемой стратегии de novo секвенирования

2 Описан системный подход к секвенированию дисульфидсодержащих пептидов с использованием комплекса масс-спектрометрических методов, ВЭЖХ и способов дериватизации исходного материала Приведено сравнение методов восстановления-алкилирования и окисления дисульфидного цикла, впервые получены масс-спектры полипротонированных окисленных дисульфидсодержащих пептидов методом электрораспыления

3 Исследована зависимость интенсивности пиков протонированных молекулярных ионов пептидов амфибий от присутствия органических добавок в стандартных матрицах (или, аналогично, загрязнений в пробе) при записи пептидного профиля с

помощью МАЛДИ

4 Четыре пептида были синтезированы и протестированы на различные типы биологической активности Все они обладают средней антимикробной активностью (25<1С5о<85 мкМ) Кроме того, 2 пептида оказались ингибиторами синтеза NO в нейрональной NO-синтазе Бревинин-IR FFPAgRLVAKVVPSIICSVTKKC-OH оказался первым пептидом, выделенным из кожи лягушек рода Rana, проявляющий высокую активность подобного рода (при концентрации 4 мкМ) 5. Исследована зависимость пептидного профиля, являющегося таксономическим идентификатором, от местообитания вида Установлена идентичность качественного состава пептидных профилей лягушек Rndibunda, обитающих в Московской области и в Кавказском регионе Незначительные отличия состоят в наличии трех минорных пептидов в коже лягушки из Кавказского региона, отсутствующих в кожном секрете подмосковной особи Мажорные компоненты обеих особей совпадают, но присутствуют в кожном секрете в различных соотношениях

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях

1 К А Артеменко, ТЮ Самгина, А Т Лебедев Масс-спектрометрическое de novo секвенирование пептидов //Масс-спекгрометрия -2006 -Т 3(4) -С 225-254

2 RA Горшков, КА Артеменко, ТЮ Самгина, А Т Лебедев Влияние органических добавок на увеличение интенсивности сигналов протонированных пептидов в масс-спектрах матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации // Масс-спекгрометрия - 2007 - Т 4(1) - С 5-10

3 КА Артеменко, ТЮ Самгина, А Т Лебедев, ДжР Дойл, ЛЕ Лъюелин, Д Билусич, ДжХ Бови Защитные пептиды, выделенные из кожного секрета европейской озерной лягушки Rana ndibunda //Масс-спектрометрия -2007 -Т 4(2) - С 79-88

4 TYu Samgma, KA Artemenko, VA Gorshkov, A T Lebedev,ML Nielsen, MM Savitski, RA Zubarev Electrospray ionization tandem mass spectrometry sequencing of novel skm peptides from Ranid frogs containing disulfide bndges // European Journal of Mass Spectrometiy -2007 -V 13 (2) -P 155-163

5 ТЮ Самгина, KA Артеменко, С В Огурцов, А Т Лебедев, Дж Бови Комплексное использование электрораспыления в режиме положительных и отрицательных ионов для определения первичной структуры недериватизированных пептидов на примере бревинина-1Е, выделенного из кожного секрета Rana ridibunda И Тезисы П Съезда ВМСО "Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы", Москва, 12-16 сентября, 2005, МБС-2

6 TYu Samgma, KA Artemenko, SV Ogurtsov, AT Lebedev, J H Bowie MS study of peptide profile of Russian frog Rana ridibunda II Proc 54th ASMS Conference On Mass Spectrometiy and Allied Topics, May 28 - June 1, 2006, Seattle, USA, A060484

7 TYu Samgina, К A Artemenko, A T Lebedev, RA Zubarev Comparative MS

Study of Peptide Profiles of Frogs Rana ridibunda from Different Parts of Former USSR. // Proc 17th International Mass Spectrometry Conference, August 27 - September 1, 2006, Prague, p 242

8 K.A Артеменко Окисление дисульфидной связи в пептидах подход к увеличению покрытия сиквенса в методе ESI-MS/MS II Материалы XTV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых " ЛОМОНОСОВ-2007", Секция "Химия", 11-14 апреля 2007 года, Москва, с 327

9 TYu Samgma, К A Artemenko, VA Gorshkov, А Т Lebedev Oxidation vs caiboxymethylation of S-S bond in frog peptides pro and contra for de novo MALDI-MS sequencing I I Proc 55th ASMS Conference On Mass Spectrometry and Allied Topics, June 3 - 7, 2007, Indianapolis, USA, ThPF 080

Благодарности

Автор выражает благодарность к х н Самгиной Т Ю (Химический факультет МГУ), к б н Огурцову С В (Биологический факультет МГУ), Prof J Н Bowie и Dr D Bilusich (University of Adelaide, Australia), Prof R Zubarev, Dr M Lund-Nielsen и Dr С Adams (Uppsala University, Sweden) за ценные замечания в ходе данного исследования и предоставленные приборные возможности

Подписано в печать 29 августа 2007 г

Формат 60x90/16

Объем 1,5 п л

Тираж 120 экз

Заказ № 2908067

Оттиражировано на ризографе в ООО «УниверПринт» ИНН/КПП 7728572912Y772801001

Адрес 117292, г Москва, ут Дмитрия Ульянова, д 8, кор 2 Тел 740-76-47, 125-22-73 http //www umverpnnt ш

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Масс-спектрометрическое de novo секвенирование пептидов

1. Методы определения первичной структуры пептидов

1.1. Методы классической биохимии 10 Деградация по Эдману 10 Методы генной инженерии

1.2. Методы масс-спектрометрии

1.3. Комбинированный метод - леддерное секвенирование

2. De novo секвенирование пептидов методами тандемной масс-спектрометрии положительных ионов

2.1. Диссоциация, активированная соударением (ДАС)

2.2. Диссоциация при электронном захвате (ДЭЗ)

2.3. Использование МАЛДИ для секвенирования пептидов

2.4. Фотоактивация диссоциации

3. Основные ограничения масс-спектрометрии положительных ионов при секвенировании пептидов и пути их устранения

3.1. Изобарные аминокислоты 32 Лизин и глутамин 32 Фенилаланин и окисленный метионин

3.2. Изомерные аминокислоты: лейцин и изолейцин

3.3. Пептиды, содержащие дисульфидную связь 41 Химические методы 41 Методы масс-спектрометрии

4. Использование масс-спектрометрии отрицательных ионов для секвенирования пептидов

II. Пептиды из кожи амфибий рода Rana

1. Общие сведения

2. Нейропептиды

3. Антибактериальные пептиды

4. Пептидное профилирование: значение в систематике и эволюции

ГЛАВА 2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

I. Получение исходного биоматериала

II. Общая схема масс-спектрометрического секвенирования

III. Установление общего пептидного профиля

1. Оптимизация ВЭЖХ-разделения

2. Оптимизация эксперимента МАЛДИ

IV. Результаты МС - секвенирования пептидов при электрораспылении в режиме отрицательных ионов

V. Результаты масс-спектрометрического секвенирования при электрораспылении в режиме положительных ионов

1. Результаты МС-секвенирования пептидов, полученные прямым распылением образцов в источник ионов

1.1. Недериватизованные (исходные) пептиды

1.2. Дериватизованные дисульфидсодержащие пептиды

2. Результаты масс-спектрометрического секвенирования пептидов, полученные с применением ВЭЖХ-МС/МС (LTQ-FT)

2.1. Диссоциация при электронном захвате (ДЭЗ)

VI. Результаты масс-спектрометрического секвенирования пептидов с использованием МАЛДИ

VII. Детализация пептидного профиля R.ridibunda

VIII. Детализация пептидного профиля R.arvalis

IX. Сравнительное масс-спектрометрическое изучение пептидных профилей R.ridibunda, обитающих в различных климатических условиях

X. Проверка биологической активности ряда новых пептидов, выделенных из кожи R.ridibunda и R.arvalis

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 121 ВЫВОДЫ 127 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

• ББА - бомбардировка быстрыми атомами

• ВП (TOF) - времяпролетный анализатор (time-of-flight)

• ВЭЖХ, ЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

• Да - дальтон (1 а.е.м., атомная единица массы)

• ДАС (CAD) - диссоциация, активированная соударением (collisionally activated dissociation)

• кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота

• ДОЭ (EDD) - диссоциация при отрыве электрона (electron detachment dissociation)

• ДПЭ (ETD) - диссоциация при переносе электрона (electron transfer dissociation)

• ДЭЗ (ECD) - диссоциация при электронном захвате (electron capture dissociation)

• ИКМФД (IRMPD) - инфракрасная мультифотонная диссоциация (infrared multiphoton dissociation)

• ИЦР - ионный циклотронный резонанс

• М.м. - молекулярная масса

• МАЛДИ (MALDI) - матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (matrix-assisted laser desorption/ionisation)

• МС - масс-спектрометрия, масс-спектр

• МС/МС, МС2 - тандемный масс-спектр

• мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

• РПИ (PSD) - распад после источника (post-source decay)

• ТСХ - тонкослойная хроматография

• ТФУ (TFA) - трифторуксусная кислота (trifluoroacetic acid)

• УФФД (UVPD) - ультрафиолетовая фотодиссоциация (ultraviolet photodissociation)

• ФТГ - фенилтиогидантоиновый

• АРМ - аминопептидаза M

• BETA - (2-бромэтил)триметиламмоний бромид

• BIRD - blackbody radiative infrared dissociation (диссоциация, активированная ИК-излучением абсолютно черного тела)

• CDAP - тетрафторборат 1-циано-4-диметиламинопиридиния

• СРР - карбоксипептидаза Р

• CPY - карбоксипептидаза Y

• DHB - 2,5-дигидроксибензойная кислота

• DTE - дитиоэритритол

• DTNB - 5,5 - дитиобис(2-нитробензойная кислота)

• DTT - дитиотреитол

• FM - N- флуоресцеинилмалеинимид

• НССА - а-циано-4-гидроксикоричная кислота

• HECD - hot electron capture dissociation (диссоциация при захвате высокоэнергетического электрона)

• IAM - йодацетамид

• 2-МЕ - 2-меркаптоэтанол

• NEM-N-этилмалеинимид

• NPM - N-фенилмалеинимид

• QLT - quadrupole-linear trap (квадрупольная линейная ловушка)

• QTOF - quadrupole - time-of-flight (квадруполь-времяпролетный тандемный масс-спектрометр)

• ТСЕР - трис(2-карбоксиэтил)фосфин

• TNB-CN - 2-нитро-5-тиоцианобензойная кислота

• 4-VP - 4-винилпиридин

• itz - иминотиазолидин

Обозначения аминокислот (одно- и трехбуквенные), а также их молекулярные массы и структурные формулы, представлены в приложении 1.

Амфибии обладают широким набором соединений, секретируемых кожными железами. Благодаря им обеспечиваются регуляторные функции кожи животного. Пептидная составляющая секрета является также интегральной частью иммунной системы амфибий. Секретируемые пептиды проявляют различные виды биологической активности: среди них встречаются антибактериальные, противовирусные, антигрибковые, противоопухолевые и нейропептиды. Такой химический арсенал обеспечивает защиту животного как от патогенных организмов, так и от хищников.

Механизм действия биоактивных пептидов заключается в разрушении клеточной стенки патогенного организма. При этом структура пептида коррелирует с особенностями строения мембран разрушаемых клеток, что обусловливает высокую специфичность действия пептида. Например, антимикробные пептиды избирательно разрушают мембраны бактерий, но не активны в отношении соматических клеток. Такая специфичность является очень перспективной для использования пептидов в качестве направленных лекарственных препаратов нового типа, например, антибиотиков. Кроме того, благодаря иному, чем у традиционных антибиотиков механизму действия на патогенные организмы, невозможно появление штаммов, устойчивых к их действию. Это делает их привлекательными для фармакологической индустрии, постоянно ведущей поиск лекарств нового поколения. На сегодняшний день уже запатентованы и используются лекарства, созданные на базе синтетических пептидов, структурно совпадающих с пептидами, секретируемыми амфибиями. В частности, это буфорин (антибиотик) и каерулеин-1.1 - препарат с сильнейшим анальгетическим эффектом.

Создание таких препаратов начинается с установления первичной структуры пептида. Существующие классические химические методы определения аминокислотной последовательности (секвенирования) пептида -например, деградация по Эдману - часто малоэффективны, поскольку требуют большого количества биоматериала и непригодны для анализа пептидных смесей.

Масс-спектрометрия зарекомендовала себя как экспрессный и чувствительный метод de novo секвенирования, который, в отличие от традиционной деградации по Эдману, не требует больших количеств образца, что позволяет работать с минорными компонентами кожного секрета. Кроме того, отпадает необходимость выделения анализируемого пептида в чистом виде - это открывает путь к работе с исходными смесями без предварительного их разделения на отдельные компоненты. И, наконец, она обеспечивает установление сиквенса длинных пептидов с массой более 4 тыс. Да: при деградации по Эдману этого достичь довольно трудно, поскольку с каждым шагом надежность определения уменьшается. Однако и масс-спектрометрическое секвенирование сопряжено с определенными сложностями. Поэтому актуальным является изучение возможностей масс-спектрометрии для de novo секвенирования пептидов амфибий, а также оптимизация самого масс-спектрометрического эксперимента.

Целью данной диссертационной работы является оптимизация стратегии масс-спектрометрического метода de novo секвенирования пептидов и установление первичной структуры пептидов, секретируемых кожными железами лягушек рода Rana (виды Rana rídibunda и Rana arvalis), а также проверка биологической активности ряда не описанных ранее de novo секвенированных пептидов.

выводы

1. Впервые установлен пептидный профиль двух распространенных на территории РФ видов амфибий R.ridibunda и R.arvalis. Выделено и идентифицировано комплексом масс-спектрометрических методов 33 пептида, 22 из которых ранее не описаны. Проведен анализ по Эдману пяти новых пептидов. Полученная аминокислотная последовательность полностью совпадает с установленным масс-спектрометрически сиквенсом, что доказывает надежность предлагаемой стратегии для de novo секвенирования.

2. Описан системный подход к секвенированию дисульфидсодержащих пептидов с использованием комплекса масс-спектрометрических методов, ВЭЖХ и способов дериватизации исходного материала. Приведено сравнение методов восстановления/алкилирования и окисления дисульфидного цикла; впервые получены масс-спектры полипротонированных окисленных дисульфидсодержащих пептидов методом электрораспыления.

3. Исследована зависимость величины пиков протонированных молекулярных ионов пептидов амфибий от присутствия органических добавок в стандартных матрицах (или, аналогично, загрязнений в пробе) при записи пептидного профиля с помощью МАЛДИ.

4. 4 обнаруженных пептида были синтезированы и протестированы на различные типы биологической активности. Все они обладают средней антимикробной активностью (25<1С5о<85 мкг/мл). Кроме того, 2 пептида оказались ингибиторами синтеза N0 в нейрональной NO-синтазе. Бревинин-IR FFPAIFRLVAKWPSIICSVTKKC-OH оказался первым пептидом, выделенным из кожи лягушек рода Rana, проявляющий сильнейшую активность подобного рода (при IC50 4 мкМ).

5. Исследована зависимость пептидного профиля, являющегося таксономическим идентификатором, от местообитания вида. Установлена идентичность качественного состава пептидных профилей лягушек

К.псИЬипс1а, обитающих в Московской области и в Кавказском регионе. Незначительные отличия состоят в наличии трех минорных пептидов в коже лягушки из Кавказского региона, отсутствующих в кожном секрете подмосковной особи. Мажорные компоненты обеих особей совпадают, но присутствуют в кожном секрете в различных соотношениях.

1. J.R. Yates. Mass spectrometry and the age of the proteome. // J. Mass Spectrom. -1998.-V.33.-P. 1-19.

2. J. Peng, S.P. Gygi. Proteomics: the move to mixtures. // J. Mass Spectrom. 2001. -V. 36.-P. 1083-1091.

3. M.J. Polce, D.Ren, C. Wesdemiotis. Dissociation of the peptide bond in protonated peptides. // J. Mass Spectrom. 2000. - V. 35. - P. 1391-1398.

4. V.H. Wysocki, G. Tsaprailis, L.L. Smith, L.S. Breci. Mobile and localized protons: a framework for understanding peptide dissociation. // J. Mass Spectrom. 2000. -V. 35.-P. 1399-1406.

5. F. Sanger. The free amino acid groups of insulin. // Biochem. J. 1945. - V. 39. -P.507-515.

6. P. Edman. A method for the determination of the amino acid sequence in peptides. // Arch. Biochem. 1949. - V. 22. - P. A15-416.

7. P. Edman. Method for determination of the amino acid sequence in peptides. // Acta Chem. Scand. 1950. - V. 4. - P. 283-293.

8. В.П. Комов, B.H. Шведова. Биохимия. // M.: Дрофа. 2004.

9. P. Edman, G. Begg. A protein sequenator. // Eur. J. Biochem. 1967. - V. 1. -P. 80-91.

10. A.C. Коничев, Г.А. Севастьянова, Молекулярная биология. // M.: Академия, 2003.

11. T. Chen, C. Scott, L. Tang, M. Zhoua, C. Shawa. The structural organization of aurein precursor cDNAs from the skin secretion of the Australian green and golden bell frog, Litoria aurea. II Regulatory Peptides. 2005. - V. 128. -P. 75-83.

12. C.V. Bradley, D.H. Williams, M.R. Hanley. Peptide sequencing using the combination of Edman degradation, carboxypeptidase digestion and fast atom bombardment mass spectrometry. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1982. -V. 104(4).-P. 1223-1230.

13. D.F. Hunt, A.M. Buko, J.M. Ballard, J. Shabanowitz, A.B. Giordani. Sequence analysis of polypeptides by collision activated dissociation on a triple quadrupole mass spectrometer. // Biomed. Mass Spectrom. 1981. - V. 8. - P. 397-408.

14. A.T. Лебедев. Масс-спектрометрия в органической химии. // М.: БИНОМ, 2003.

15. М. Barber, R.S. Bordoli, R.D. Sedgwick, A.N. Tyler. Fast atom bombardment of solids (F.A.B.): A new ion source for mass spectrometry. // J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1981. - V. 7. - P.325-327.

16. M. Yamashita, J.B. Fenn. Electrospray ion source: another variation on the free-jettheme. // J. Phys. Chem. 1984. - V. 88. - P. 4451-4459.

17. M. Yamashita, J.B. Fenn. Negative ion production with the electrospray ion source.

18. J. Phys. Chem. 1984. - V. 88. - P. 4671-4675.

19. M. Karas, D. Bachmann, U. Bahr, F. Hillenkamp. Matrix-assisted ultraviolet laserdesorption of non-volatile compounds. // Int. J. Mass Spectrom. Ion Proc. 1987. -V. 78.-P. 53-68.

20. P.E. Andren, M.R. Emmett, R.M. Caprioli. Microelectrospray: zeptomole/attomoleper microliter sensitivity for peptides. // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1994. -V. 5. - P. 867-869.

21. M. Wilm, M. Mann. Analytical properties of the nano-electrospray ion source. // Anal. Chem. 1996. - V. 68. - P. 1-8.

22. М.Л. Александров, Л.Н. Галль, H.B. Краснов, В.И. Николаев, В.А. Павленко,

23. В.А. Шкуров, Г.И. Барам, М.А. Грачев, В.Д. Кнорре, Ю.С. Куснер. Прямая стыковка микроколоночного жидкостного хроматографа с масс-спектрометром. // Биоорган, химия. 1984. - Т. 10. - С. 710-712.

24. D.N. Nguyen, G.W. Becker, R.M. Riggin. Protein mass spectrometry: applicationsto analytical biotechnology. // J. Chromatogr. A. 1995. - V. 705. - P. 21-45.

25. B. Thiede, B. Wittmann-Liebold, M. Bienert, E. Krause. MALDI-MS for C-terminal sequence determination of peptides and proteins degraded by carboxypeptidase Y and P. // FEBS Lett. 1995. - V. 357. - P. 65-69.

26. A.S. Woods, A.Y. Huang, R.J. Cotter, G.R. Pasternack, D.M. Pardoll, E.M. Jaffee.

27. Simplified high-sensitivity sequencing of a major histocompatibility complex class I-associated immunoreactive peptide using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. // Anal. Biochem. 1995. - V. 226. -P. 15-25.

28. P. Roepstorff. MALDI-TOF mass spectrometry in protein chemistry, "Proteomics"in: Functional Genomics: Protein Structure Analysis (Eds P. Jolles, H. JQrnvall). // Basel: Birkhauser, 2000.

29. V. Bonetto, A.C. Bergman, H. JQrnvall, R. Sillard. C-terminal sequence analysis ofpeptides and proteins using carboxypeptidases and mass spectrometry after derivatization of Lys and Cys residues. // Anal. Chem. 1997. - V. 69. -P. 1315-1319.

30. H.A. Itano, E.A. Robinson. 4-Thialaminine, a strongly basic chemical modificationof cysteine. // J. Biol. Chem. 1972. - V. 247. - P. 4819^824.

31. A.P. Jonsson. Mass spectrometry for protein and peptide characterisation. // Cell. Mol. Life Sci. 2001. - V. 58. - P. 868-884.

32. F.W. McLafferty, D.M. Horn, K.Breuker, Y.Ge, M.A. Lewis, B. Cerda, R.A. Zubarev, B.K. Carpenter. Electron capture dissociation of gaseous multiply charged ions by FTTCR. // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2001. - V. 12. -P.245-249.

33. R.A. Zubarev. Electron capture dissociation of peptides, in: Mass spectrometry andhyphenated techniques in neuropeptide research (Eds J. Silberring, R. Ekman). // New York: John Wiley & Sons, 2002.

34. M. Kinter, E. Sherman. Protein Sequencing and identification using tandem mass spectrometry. // New York: John Wiley & Sons, 2000.

35. T. Chen, F. David, D.F. Orr, A.J. Bjourson, S. McClean, M. O'Rourke, D.G. Hirst,

36. P. Rao, C. Shaw. Novel bradykinins and their precursor cDNAs from European yellow-bellied toad (Bombina variegata) skin. // Eur. J. Biochem. 2002. -V. 269.-P. 4693-4700.

37. L. Sleno, D.A. Volmer. Ion activation methods for tandem mass spectrometry. // J. Mass Spectrom. 2004. - V. 39. - P. 1091-1112.

38. R.A. Zubarev, N.L. Kelleher, F.W. McLafferty. Electron capture dissociation of multiply charged protein cations. A non-ergodic process. // J. Am. Chem. Soc. -1998. V. 120. - P. 3265-3266.

39. R.A. Zubarev. Reactions of polypeptide ions with electrons in the gas phase. // Mass Spectrom. Rev. 2003. - V. 22. - P. 57-77.

40. J.E.P. Syka, J.J. Coon, M.J. Schroeder, J. Shabanowitz, D.F. Hunt. Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry. // PNAS (Proc. Natl. Acad. Sei. USA). 2004. - V. 101. - P. 9528-9533.

41. S.A. Trauger, W. Webb, G. Siuzdak. Peptide and protein analysis with mass spectrometry. // Spectroscopy. 2002. - V. 16. - P. 15-28.

42. S. Jespersen, P. Chaurand, F.J.C. van Strien, B. Spengler, J. van der Greef. Direct sequencing of neuropeptides in biological tissue by MALDI-PSD mass spectrometry. // Anal. Chem. 1999. - V. 71. - P. 660-666.

43. B. Spengler, D. Kirsch, R. Kaufmann. Metastable decay of peptides and proteins inmatrix-assisted laser desorption mass spectrometry. // Rapid Commun. Mass Spectrom. 1991. - V. 5. - P. 198-202.

44. B. Spengler, D. Kirsch, R. Kaufmann, E. Jaeger. Peptide sequencing by matrix assisted laser desorption mass spectrometry. // Rapid Commun. Mass Spectrom. -1992.-V. 6.-P. 105-108.

45. B. Spengler, D. Kirsch; R. Kaufmann. Fundamental aspects of postsource decay inmatrix-assisted laser desorption mass spectrometry. 1. Residual gas effect. // J. Phys. Chem. 1992. - V. 96. - P. 9678-9684.

46. C.R Jimenez, A. ter Maat, A. Pieneman, A.L. Burlingame, A. B. Smit, K. W. Li.

47. Spatio-temporal dynamics of the egg-laying-inducing peptides during an egg-laying cycle: a semiquantitative matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry approach. // J. Neurochem. 2004. - V. 89. - P. 865-875.

48. M.S. Thompson, W. Cui, J.P. Reilly. Fragmentation of singly charged peptide ionsby photodissociation at X.=157 nm. // Angew. Chem., Int. Ed. 2004. - V. 43. -P.4791-4794.

49. S.A. Raspopov, A. El-Faramawy, B.A. Thomson, K.W.M. Siu. Infrared multiphoton dissociation in quadrupole time-of-flight mass spectrometry: top-down characterization of proteins. // Anal. Chem. 2006. - V. 78. -P. 4572-4577.

50. K. Hakansson, M.J. Chalmers, J.P. Quinn, M.A. McFarland, C.L. Hendrickson, A.G. Marshall. Combined electron capture and infrared multiphoton dissociation for multistage MS/MS in an FT-ICR mass spectrometer. // Anal. Chem. 2003. -V. 75.-P. 3256-3262.

51. W.D. Price, P.D. Schnier, E.R. Williams. Tandem mass spectrometry of large biomolecule ions by blackbody infrared radiative dissociation. // Anal. Chem. -1996.-V. 68.-P. 859-866.

52. J.S. Klassen, P.D. Schnier, E.R Williams. Blackbody infrared radiative dissociationof oligonucleotide anions. // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1998. - V. 9. -P. 1117-1124.

53. P.A. Chrisman, S.J. Pitteri, J.M. Hogan, S.A. McLuckey. SCV* electron transfer ion/ion reactions with disulfide linked polypeptide ions. // J. Am. Soc. Mass Spectrom.-2005.-V. 16.-P. 1020-1030.

54. C. S. Brinkworth, J. H. Bowie. Negative ion electrospray mass spectra of the maculatin peptides from the tree frogs Litoria genimaculata and Litoria eucnemis. II Rapid Commun. Mass Spectrom. 2003. - V. 17. - P. 2215-2225.

55. U. Bahr, M. Karas, R. Kellner. Differentiation of lysine/glutamine in peptide sequence analysis by electrospray ionization sequential mass spectrometry coupled with a quadrupole ion trap. // Rapid Commun. Mass Spectrom. -1998. -V. 12.-P. 1382-1388.

56. W. Mo, Y. Ma, T. Takao, T. A. Neubert. Sequencing of oxidized methionine-containing peptides for protein identification. // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2000. - V. 14.-P. 2080-2081.

57. F.M. Lagerwerf, M. van de Weert, W. Heerma, J. Haverkamp. Identification of oxidized methionine in peptides. // Rapid Commun. Mass Spectrom. 1996. -V. 10.-P. 1905-1910.

58. L. Aubagnac, B. El Amrani, F.M. Devienne, R. Conbarieu. Characterization of leucine and isoleucine by use of the FAB ionization method in tandem mass spectrometry. // Org. Mass Spectrom. 1985. - V. 20. - P. 428-429.

59. T. Nakamura, H. Nagaki, Y. Ohki, T. Kinoshita. Differentiation of leucine and isoleucine residues in peptides by consecutive reaction mass spectrometry. // Anal. Chem. 1990. - V. 62. - P 311-313.

60. B.L. Milman. Towards a fixll reference library of MS" spectra. Testing of the library containing 3126 MS spectra of 1743 compounds. // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005. - V. 19. - P. 2833-2839.

61. B.M. de Souza, M.R. Marques, D.M. Tomazela, M.N. Eberlin, M.A. Mendes, M.S.

62. Palma. Mass spectrometric characterization of two novel inflammatory peptides from the venom of the social wasp Polybia paulista. II Rapid Commun. Mass Spectrom. 18,1095-1102 (2004).

63. C.V.F. Batista, A. Scaloni, D.J. Rigden, L.R. Silva, A.R. Romero, R. Dukor, A. Sebben, F. Talamo, C. Bloch. A novel heterodimeric antimicrobial peptide from the tree-frog Phyllomedusa distincta. IIFEBS Lett. 2001. - V.494. - P. 85-89.

64. A. Beck, M-C. Bussat, N. Zorn, V. Robillard, C. Klinguer-Hamour, S. Chenu, L.

65. Goetsch, N. Corn, A. Van Dorsselaer, J-F. Haeuw. Characterization by liquid chromatography combined with mass spectrometry of monoclonal anti-IGF-1 receptor antibodies produced in CHO and NS0 cells. // J. Chromatogr. B. 2005. -V.819.-P. 203-218.

66. T.-Y. Yen, H. Yan, B.A. Macher. Characterizing closely spaced, complex disulfidebond patterns in peptides and proteins by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry. // J. Mass Spectrom. 2002. - V. 37. -P. 15-30.

67. H. John, W.-G. Forssmann. Determination of the disulfide bond pattern of the endogenous and recombinant angiogenesis inhibitor endostatin by mass spectrometry. // Rapid Commun. Mass Spectrom- 2001. V. 15. -P.1222-1228.

68. ON. Krokhin, K. Cheng, S.L. Sousa, W. Ens, K.G. Standing, J.A. Wilkins. Mass spectrometric based mapping of the disulfide bonding patterns of integrin a-chains. // Biochemistry. 2003. - V. 42. - P. 12950-12959.

69. W.W.H. Wu, J.P. Wong, J. Kast, R.S. Molday. RSI, a discoidin domain-containingretinal cell adhesion protein associated with x-linked retinoschisis, exists as a novel disulfide-linked octamer. // J. Biol. Chem. 2005. - V. 280. -P. 10721-10730.

70. R. Mhatre, J. Woodard, C. Zeng. Strategies for locating disulfide bonds in a monoclonal antibody via mass spectrometry. // Rapid Commun. Mass Spectrom. -1999.-V. 13.-P. 2503-2510.

71. A. Tsarbopoulos, J. Varnerin, S. Cannon-Carlson, D. Wylie, B. Pramanik, J. Tang,

72. T.L. Nagabhushan. Mass spectrometric mapping of disulfide bonds in recombinant human interleukin-13. // J. Mass Spectrom. 2000. - V. 35. -P.446-453.

73. D.A. Lappi, W. Kapmeyer, J.M. Beglau, N.O. Kaplan. The disulfide bond connecting the chains of ricin. // PNAS (Proc. Natl. Acad. Sci. USA). 1978. -V. 75.-P. 1096-1100.

74. J. Messens, G. Hayburn, A. Desmyter, G. Laus., L Wyns. The essential catalytic redox couple in arsenate reductase from staphylococcus aureus. // Biochemistry. -1999.-V. 38.-P. 16857-16865.

75. J.J. Pitt, E. Da Silva, J.J. Gorman. Determination of the disulfide bond arrangementof Newcastle disease virus hemagglutinin neuraminidase. // J. Biol. Chem. 2000. -V. 275.-P. 6469-6478.

76. J.-P. Bingham, N.M. Broxton, B.G. Livett, J.G. Down, A. Jone, E.G. Moczydlowski. Optimizing the connectivity in disulfide-rich peptides: a-conotoxin SII as a case study. // Anal. Biochem. 2005. - V. 338. - P. 48-61.

77. J.M. Hogan, S.A. McLuckey. Charge state dependent collision-induced dissociation of native and reduced porcine elastase. // J. Mass Spectrom. 2003. -V. 38.-P. 245-256.

78. S. Odani, K. Baba, Y. Tsuchida, Y. Aoyagi, S. Wakui, Y. Takahashi. Hepatic fatty acid-binding proteins of a teleost, Lateolabrax japonicus. The primary structures and location of a disulfide bond. // J. Biochem. 2001. - V. 129. - P. 69-76.

79. D.C. Brune. Alkylation of cysteine with acrylamide for protein sequence analysis. // Anal. Biochem. 1992. - V. 207. - P. 285-290.

80. M. Friedman, L.H. Krull, J.F. Cavins. The chromatographic determination of cystine and cysteine residues in proteins as s-p-(4-pyridylethyl)cysteine. // J. Biol. Chem. 1970. - V. 245. - P. 3868-3871.

81. J.A. Jakubowski, J.V. Sweedler. Sequencing and mass profiling highly modified conotoxins using global reduction/alkylation followed by mass spectrometry. // Anal. Chem. 2004. - V. 76. - P. 6541-6547.

82. G.R. Jacobson, M.H. Schaffer , G.R. Stark, T.C. Vanaman. Specific chemical cleavage in high yield at the amino peptide bonds of cysteine and cystine residues. // J. Biol. Chem. 1973. - V. 248. - P. 6583-6591.

83. J. Wu, J.T. Watson. A novel methodology for assignment of disulfide bond pairings in proteins. // Prot. Sci. 1997. - V. 6. - P. 391-398.

84. Y. Yang, J. Wu, J.T. Watson. Disulfide mass mapping in proteins containing adjacent cysteines is possible with cyanylation/cleavage methodology. // J. Am. Chem. Soc. 1998. - V. 120. - P. 5834-5835.

85. O. Burlet, C.Y. Yang, S.J. Gaskell. Influence of cysteine to cysteic acid oxidationon the collision-activated decomposition of protonated peptides evidence for intraionic interactions. // J. Am. Soc. Mass Spectrom- 1992. - V. 3. -P. 337-344.

86. M.F. Bean, S.A. Carr. Characterization of disulfide bond position in proteins andsequence analysis of cystine-bridged peptides by tandem mass spectrometry. // Anal. Biochem. -1992. V. 201. - P. 216-226.

87. M.D. Jones, S.D. Patterson, H.S. Lu. Determination of disulfide bonds in highly bridged disulfide-linked peptides by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry with postsource decay. // Anal. Chem. 1998. - V. 70. -P. 136-143.

88. Y.M.E. Fung, F. Kjeldsen, O.A. Silivra, T.W.D. Chan, R.A. Zubarev. Facile disulfide bond cleavage in gaseous peptide and protein cations by ultraviolet photodissociation at 157 nm. // Angew. Chem., Int. Ed. 2005. - V. 44. -P.6399-6403.

89. H. Lioe, M. Duan, R.A.J. O'Hair. Can metal ions be used as gas phase disulfide bond cleavage reagents? // Proceedings of the 54th ASMS conference on mass spectrometry and allied topics, Seattle (USA), 2006, A060790.

90. J.H. Bowie, C.S. Brinkworth, S. Dua. Collision-induced fragmentations of the (M-H)~ parent anions of underivatized peptides: and aid to structure determinationand some unusual negative ion cleavages. // Mass Spectrom. Rev. 2002. - V. 21. -P. 87-107.

91. C.S Brinkworth, S. Dua, A.M. McAnoy, J.H. Bowie. Negative ion fragmentations of deprotonated peptides: backbone cleavages directed through both Asp and Glu. // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2001. - V. 15. - P. 1965-1973.

92. B.A. Budnik, K.F. Haselmann, R.A. Zubarev. Electron detachment dissociation of peptide di-anions: an electron-hole recombination phenomenon. // Chem. Phys. Lett. 2001. - V. 342. - P. 299-302.

93. V. Erspamer. Bioactive secretions of the amphibian integument, in: Amphibian Biology. The Integument, ed. H. Heatwole and G. Bartholameus. // Chipping-Norton, N.S.W: Surrey, Beatty & Sons, 1994.

94. US Pat. 07/963007, filed 19/10/1992; now; US Pat. 5,643,878.

95. M. Zasloff, M. Anderson. The development of antimicrobial peptides of animal origin as vaginal microbicides: the challenges ahead and the potential. // AIDS. -2001.-V. 15.-S54.

96. D.J.M. Stone, J.H. Bowie, M.J. Tyler, J.C. Wallace. The structure of caerin 1.1, a novel antibiotic peptide from Australian tree frogs. // J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1992.-V. 17.-P. 1224-1225.

97. B. T. Clarke. The natural history of amphibian skin secretions, their normal functioning and potential medical applications. // Biol. Rev. 1997. - V. 72. -P.365-379

98. P.A. Wabnitz. Chemistry and medical implications of novel amphibian peptides. A thesis submitted for the degree of Doctor of Philosophy. // Adelaide, South Australia, Australia. University of Adelaide, Dept. of Chemistry. 1999.

99. T. L. Pukala, J. H. Bowie, V.M. Maselli, I.F. Musgrave, M. J. Tyler. Host-defence peptides from the glandular secretions of amphibians: structure and activity. // Nat. Prod. Rep. 2006. - V. 23. - P. 368-393.

100. J. M. Conlon, U. Aronsson. Multiple bradykinin-related peptides from the skin of the frog, Rana temporaria. II Peptides. 1997. - V. 18. - P. 361-365.

101. A. Anastasi, V. Ersparmer, G. Bertaccini. Occurence of bradykinin in the skin of Rana temporaria. II Comp. Biochem. Physiol. 1965. - V. 14. - P. 43-52.

102. H. Yan, R.E.W. Hancock. Synergistic interactions between mammalian antimicrobial defense peptides. // Antimicrob. Agents Chemother. 2001. -V. 45.-P. 1558-1560.

103. Wegener K. L. Amphibian peptides: their structures and bioactivity. A thesis submitted for the degree of Doctor of Philosophy. // Adelaide, South Australia, Australia. University of Adelaide, Dept. of Chemistry, 2001.

104. N. Morikawa, K. Hagiwara, T. Nakajima. Brevinin-1 and -2, unique antimicrobial peptides from the skin of the frog, Rana brevipoda porsa. II Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1992.-V. 189.-P. 184-190.

105. M. Simmaco, G. Mignogna, D. Barra. Antimicrobal Peptides from Amphibian Skin: What do They Tell Us? // Biopolymers (Peptide Science). 1998. - V. 47. -P.435-450.

106. J. Goraya, F.C. Knoop, J.M. Conlon. Ranatuerins: antimicrobial peptides isolated from the skin of the American bullfrog, Rana catesbeiana. II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. - V. 250. - P. 589-592.

107. J.M. Park, J.E. Jung, B.J. Lee. Antimicrobial peptides from the skin of a Korean frog, Rana rugosa. II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. - V. 205. -P. 948-954.

108. S. Suzuki, Y. Ohe, T.Okubo, T. Kakegawa, K. Tatemoto. Isolation and characterization of novel antimicrobial peptides, rugosins, A, B, and C from the skin of the frog, Rana rugosa. II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. -V. 212. - P. 249-254.

109. J.M. Conlon, J. Kolodziejek, N. Nowotny. Antimicrobial peptides from ranid frogs: Taxonomic and phylogenetic markers and a potential source of new therapeutic agents. // Biochim. Biophys. Acta. 2004. - V. 1696. - P. 1-14.

110. T. Halverson, Y.J. Basir, F.C. Knoop, J.M. Conlon. Purification and characterization of antimicrobial peptides from the skin of the North American green frog Rana clamitans. II Peptides. 2000. - V. 21. - P. 469-476.

111. M. Simmaco, G. Mignogna, S. Canofeni, R. Miele, M.L. Mangoni, D. Barra. Temporins, antimicrobial peptides from the European red frog Rana temporaria. II Eur. J. Biochem. -1996. V. 242. - P. 788-792.

112. L. Marenah, P.R. Flatt, D.F. Orr, S. McClean, C. Shaw, Y.H.A. Abdel-Wahab. Brevinin-1 and multiple insulin-releasing peptides in the skin of the frog Rana palustris. II J. Endocrinol. 2004. - V. 181(2). - P. 347-354.

113. M.F. Ali, K.R. Lips, F.C. Knoop, C.M. Fritzsch, J.M. Conlon. Antimicrobial peptides and protease inhibitors in the skin secretions of the crawfish frog, Rana areolata. // Biochem. Biophys. Acta. 2002. - V. 1601. - P. 55-63.

114. J.M. Conlon, A. Sonnevend, A. Davidson, A. Demandt, T. Jouenne. Host-defense peptides isolated from the skin secretions of the Northern red-legged frog Rana aurora aurora. II Dev. Comp. Immunol. 2005. - V. 29. - P. 83-90.

115. J.M. Conlon, B. Seidel, P.F. Nielsen. An atypical member of the brevinin-1 family of antimicrobial peptides isolated from the skin of the European frog Rana dalmatina. II Comp. Biochem. Physiol., 137C.-2004.-V. 137.-P. 191-196.

116. J.M. Conlon, A. Sonnevend, T. Jouenne, L. Coquet, D. Cosquer, H. Vaudry, S. Iwamuro. A family of acyclic brevinin-1 peptides from the skin of the Ryukyu brown frog Rana okinavana. II Peptides. 2005. - V. 26. - P. 185-190.

117. J.M. Conlon, T. Halverson, J. Dulka, J.E. Platz, F.C. Knoop. Peptides with antimicrobial activity of the brevinin-1 family isolatedfrom skin secretions of the southern leopard frog, Rana sphenocephaly II J. Pept. Res. 1999. - V. 54. -P. 522-527.

118. B. Mattute, K. Storey, F.C. Knoop, J.M. Conlon. Induction of synthesis of an antimicrobial peptide in the skin of the freeze-tolerant frog, Rana sylvatica, in response to environmental stimuli. // FEBS Lett. 2000. - V. 483. - P. 135-138.

119. Y. Wang, F.C. Knoop, I. Remy-Jouet, C. Delarue, H. Vaudiy, J.M. Conlon. Antimicrobial peptides of the brevinin-2 family isolated from gastric tissue of the frog, Rana esculenta. II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. - V. 253. -P. 600-603.

120. M.F. Ali, F.C. Knoop, H. Vaudiy, J.M. Conlon. Characterization of novel antimicrobial peptides from the skins of frogs of the Rana esculenta complex. // Peptides. 2003. - V. 24. - P. 955-961.

121. J.B. Kim, S. Iwamuro, F.C. Knoop, J.M. Conlon. Antimicrobial peptides from the skin of the Japanese mountain brown frog, Rana ornativentris. II J. Pept. Res. -2001.-V. 58.-P. 349-356.

122. H.S.Won, S.S. Kim, S.J. Jung, W.S. Son, B. Lee, B.J. Lee. Structure-activity relationships of antimicrobial peptides from me skin of Rana esculenta inhabiting in Korea. // Mol. Cells. 2004. - V. 17. - P. 469-476.

123. K. Kangawa, H. Kozawa, J. Hino, N. Minamino, H. Matsuo. Four novel tachykinins in frog (Rana catesbeiana) brain and intestine. // Regul. Pept. 1993. -V. 46.-P. 81-88.

124. Y.A. Lu, J.L. Peng, Y.Q. Zhu, S.X. Wu, Y.Q. Tang, S.H. Tian, G. Zou. Synthesis and biological activity of a new frog skin peptide, ranamargarin. // Sci. China. -1990.-V. 33.-P. 170-177.

125. T. Chen, D.F. Orr, A.J. Bjourson, S. McClean, M. O'Rourke, D.G. Hirst, P. Rao, C. Shaw. Bradykinins and their precursor cDNAs from the skin of the fire-bellied toad (Bombina orientalis). II Peptides. 2002. - V. 23. - P. 1547-1555.

126. J.M. Conlon. Molecular diversity, localization, and biological actions of elasmobranch tachykinins. // J. Exp. Zool. 1999. - V. 284. - P. 535-540.

127. G. Mignogna, C. Severini, G. Falconieri-Erspamer, R. Siciliano, G.Kreil, D. Barra. Tachykinins and Other biologically active peptides from the skin of the Costa Rican phyllomedusid frog Agalychnis callidryas. II Peptides. 1997. -V. 18.-P. 367-372.

128. M. Simmaco, D. DeBiase, C. Severini, M. Aita, G. Falconieri-Erspamer, F. Bossa. Purification and characterization of bioactive peptides from skin extracts of Rana esculenta. II Biochem. Biophys. Acta. 1990. - V. 1033. - P. 318-323.

129. D. Regoli, A. Rizzi, G. Calo, S. N. Allogho, F. Gobeil. B1 and B2 kinin receptors in various species. Immunopharmacology. 1997. - V. 36. - P. 143-147.

130. V. Erspamer, G. Falconieri-Erspamer, J.M. Cei. Active peptides in the skins of two hundred and thirty American amphibian species. // Comp. Biochem. Physiol.- 1986.-85C.-P. 125-137.

131. E.R. Spindel, B.W. Gibson, M.Kelly. Cloning of cDNAs encoding amphibian bombesin: evidence for the relationship between bombesin and gastrin-releasing peptide. // PNAS (Proc. Natl. Acad. Sci USA). 1990. - V. 87. - P. 9813-9817.

132. S.T. Steinborner, C.W. Gao, M.J. Raftery, R.J. Waugh, T. Blumenthal, J.H. Bowie. The structures of four tryptophyllin and three rubellidin peptides from the Australian red tree frog Litoria rubella. II Aust. J. Chem. 1994. - V. 47. -P. 2099-2108.

133. G. Ingram, C. Corben. Litoria electrical a new tree frog from western Queensland. // Mem. Qld. Mus. 1993. - V. 28. - P. 475-478.

134. M.G. Giovannini, L. Poulter, B.W. Gibson, D.H. Williams. Biosynthesis and degradation of peptides derived from Xenopus laevis prohormones. // Biochem. J. 1987.-V. 243.-P. 113-120.

135. M.J Tyler, D.J.M. Stone, J.H. Bowie. A novel method for the release and collection of dermal, glandular secretions from the skin of frogs. // J. Pharm. Toxicol. Methods. 1992. - V. 28. - P. 199-200.

136. V. Frankevich, R. Knochenmuss, R. Zenobi. The origin of electrons in MALDI and their use for sympathetic cooling of negative ions in FTICR. // Int. J. Mass Spectrom. 2002. - V. 220. - P. 11-19.

137. V.E. Frankevich, J. Zhang, S.D. Friess, M. Dashtiev, R. Zenobi. Role of electrons in laser desorption/ionization mass spectrometry. // Anal. Chem. 2003. - V. 75. -P. 6063-6067.

138. M.V. Gorshkov, V.E. Frankevich, R. Zenobi. Letter: Characteristics of photoelectrons emitted in matrix-assisted laser desorption/ionization Fourier transform ion cyclotron resonance experiments. // Eur. J. Mass Spectrom. 2002. -V. 8.-P. 67-69.

139. M. Dashtiev, V. Frankevich, R. Zenobi. Signal enhancement in matrix-assisted laser desorption/ionization by doping with Cu (II) chloride. // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005. - V. 19. - P. 289-291.

140. P. Lecchi, M. Olson. The role of esterification on detection of protonated and deprotonated peptide ions in matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)mass spectrometry (MS). // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2005. - V. 16. -P. 1269-1274.

141. T.M. Bilecci, J.T. Stults. Tryptic mapping of recombinant proteins by matrixassisted laser desorption/ionization mass spectrometry. // Anal. Chem. 1993. -V. 65.-P. 1709-1716.

142. A.I. Gusev, W.R. Wilkinson, A. Proctor, D.M. Hercules. Direct quantitative analysis of peptides using matrix-assisted laser desoption ionization. // Fresenius J. Anal. Chem. 1996. - V. 354. - P. 455-463.

143. S. Laugesen, P. Roepstroff. Combination of two matrices results in improved perfomance of MALDI MS for peptide mass mapping and protein analysis. // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2003. - V. 14. - P. 992-1002.

144. L. Men, Y. Wang. Further studies on the fragmentation of protonated ions of peptides containing aspartic acid, glutamic acid, cysteine sulfinic acid, and cysteine sulfonic acid. // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005. - V. 19. -P. 23-30.

145. G. Tsaprailis, H. Nair, A. Somogyi, V.H. Wysocki, W. Zhong, J.H. Futrell, S.G. Summerfield, S.J. Gaskell. Influence of Secondary Structure on the Fragmentation of Protonated Peptides. // J. Am. Chem. Soc. 1999. - V. 121. - P. 5142-5154.

146. G. Tsaprailis, H. Nair, W. Zhong, K. Kuppannan, J.H. Futrell, V.H. Wysocki. A mechanistic investigation of the enhanced cleavage at histidine in the gas-phase dissociation of protonated peptides // Anal. Chem. 2004. - V. 76. -P. 2083-2094

147. J.M. Conlon. Bradykinin and its receptors in non-mammalian verterbrates. // Regul. Pept. 1999. - V. 79. - P. 71-81.

148. J.K. Lewis, J. Wei, G. Siuzdak. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry in peptide and protein analysis, in: Encyclopedia of Analytical Chemistry (Ed. R.A. Meyers). // Chichester: John Wiley & Sons Ltd., 2000.

149. M.W. Hunkapiller, R.M. Hewick, W.J. Drewer, L.E. Hood. Peptide sequencing by Edman degradation. // Methods Enzymol. 1983. - V. 91. - P. 399-406.

150. E. Atherton, R.C. Sheppard. Solid Phase peptide synthesis: a practical approach. // Oxford: IRL Press, 1989.

151. Я Аминокислота тт I —Ш-СН-СО— Символ Структура радикала R Масса остатка1. Глицин Gly(G) —H 57.021. Алании Ala (А) -CH3 71.041. Серин Ser(S) —CH2OH 87.03

152. Пролин Pro (Р) О —N-CH-CO- 97.05

153. Валин Val (V) -CH(CH3)2 99.07

154. Треонин Thr(T) —CH(OH)CH3 101.04

155. Цистеин Cys(C) —CH2SH 103.011. OH 1

156. Гидроксипролин Hyp л —N-CH-CO- 113.05

157. Лейцин Leu (L) —CH—CH(CH3)2 113.08

158. Изолейцин Ile (I) —CH(CH3)—CH2CH3 113.08

159. Аспарагин Asn (N) —CH2—CONH2 114.04

160. Аспарагиновая кислота Asp (D) —CH2COOH 115.03

161. Глутамин Gln(Q) —CH2—CH2CONH2 128.06

162. Лизин Lys(K) -(CH2)4NH2 128.09

163. Глутаминовая кислота Glu (E) —CH2—CH2COOH 129.04

164. Метионин Met(M) —CH2—CH2—S—CH3 131.041. Гистидин His (H) 137.06

165. Окисленный метионин MetoX (MoX) -CH2-CH2-S-CH3 ö 147.03

166. Фенил ал анин Phe(F) —CH2—Ph 147.07

167. Окисленный цистеин cox —CH2—S03H 150.99

168. Аргинин Arg(R) —(CH2)3-NH-C-NH2 NH 156.10

169. Карбоксамидометилцистеин C* —CH2—s—CH2CONH2 160.03

170. Тирозин Туг (Y) —CH2-H^^-OH 163.06

171. Фосфорилированный серин PS —CH20—PO(OH)2 167.00

172. Триптофан Trp(W) CHJ-U 186.081. Г-Х35-Г-хЮг-х35100.1 908070а> и1.60а <й