Выделение и биологические свойства пептидов из мозга зимоспящих и холодоадаптированных животных тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ' ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М.М.ШЕМЯКИНА и Ю.А. ОВЧИННИКОВА

Р Г Б ОД

На правах рукописи УДК 577.171.55

Знгзншин Рустам Хусманович

ВЫДЕЛЕНИЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПЕПТИДОВ ИЗ МОЗГА ЗИМОСПЯЩИХ И ХОЛОДОАДАПТИРОВАННЫХ ЖИВОТНЫХ

Спецпхчьность: 02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА - 1994

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Научный руководитель : кандидат химических наук И.И.Михалева

Официальные оппоненты: доктор химических наук Л.Д.Румш кандидат биологических наук В.Л.Воейков

Ведущая организация: НИИ нормальной физиологии им. П.К.Анохина РАМН 23.-М

Защита состоится в -/^часов на заседании специализированного совета при Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН по адресу: 117871 Москва, В-437, ул.Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им.М.М.Шемякина - Ю.АОвчннникова РАН

•</3

Автореферат разослан " " сентября 1994г.

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теиы. В ходе эволюции многие растительные и животные > организмы приобрели (или — сохранили) способность резко снижая уровень энергетических затрат переживать в состоянии пшобиоза неблагоприятные внешние условия. Явление зимней спячки у млекопитающих представляет собой один из наиболее ярких феноменов этого рода в природе. Несмотря на интенсивные исследования проблемы регуляции природных гипометаболических состояний, биохимический механизм их индукции и поддержания до сих пор не выяснен. Имеющиеся к настоящему времени экспериментальные данные говорят о наличии в организме животного, находящегося в состоянии оцепенения, биологически активных веществ пептидной природы с выраженным гипометаболическим—гипотермическим эффектом действия. Выделение, установление структуры, исследование биологических свойств и выяснение роли данных соединений в механизмах регуляциии торпидности у млекопитающих представляет большой теоретический и практический интерес.

Цель работы. Целью настоящей работы является выделение и установление первичной структуры новых биологически активных пептидов из мозга зимоспяшего суслика и холодоадоптированной якутской лошади.

Научная новизна. В результате работы выделены тридцать четыре новых эндогенных соединений пептидной природы, установлена их структура и исследована биологическая активность некоторых из них в ряде тестов на клеточном, органном и организменном уровне.

Практическая пенность работы. Установлено, что выделенные биологически активные пептиды обладают способностью регулировать ионные токи сердечных и нервных клеток, проявляют кардиогропную и терморегуляторную активность и могут быть использованы для изучения механизмов регуляции физиологических функций организма, а некоторые из них - в качестве вероятных прототипов новых лекарственных препаратов.

Апробация работы и публикации. Результаты исследования доложены на 5 международных и 3-х Всесоюзных симпозиумах. По материалам исследований подготовлено и опубликовано более 20 печатных работ.

Структура лиссертапии. Диссертационная работа изложена на 114 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы, 33 рисунка и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы (163 ссылки).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Выделение и установление структур иовых пептидов В результате исследований, проводившихся в Якутском институте биологии СО РАН, Институте биофизики клетки РАН и Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова, было показано, что уксуснокислые экстракты мозга зимоспящих сусликов и холодоадаптированной якутской лошади обладают, в отличие от экстрактов мозга, полученных от этих видов животных в летнее время, выраженным гипотермическим, гипометаболическим и кардиотропным действием при введении лабораторным животным. Опираясь на результаты этих исследований, была предпринята попытка выделения из мозга гибернирунмцих сусликов Gtellus undulatvs и холодоадаптированной якутской лошади веществ с кардиотропной, гипометаболической и гипотермической активностью, возможно участвующих в регуляции природных гипометаболи-ческих состояний.

1.1. Выделение и установление структур новых пептидов из мозга зимоспящих сусликов. Схема получения экстракта гомогената мозга зимоспящего суслика и его первичного фракционирования методом ультрафичьтрации приведена на рис. 1.

В результате ультрафильтрации экстракта были получены 3 фракции: фракция CI (М>10 кДа), фракция СИ (М=1-10 кДа), фракция CIII (М<1 кДа). Тестирование фракций показало, что фракция СИ при внутрибрюшинном введении мышам (1 мг/г) вызывала выраженное гипометаболическое и гипотермическое воздействие (снижение ректальной температуры в среднем на 5-7°С и потребление кислорода на 60%). Эта же фракция на изолированном сердце лягушки, кролика и кошки вызывала дозо-зависимое угнетение ритма сердцебиений и снижение амплитуды сокращения сердца (в концентрации lxlO"4 г/л вызывая полную остановку работы сердца). Фракция CII была подвергнута дальнейшему разделению методом гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-25 (рис. 2). В результате тестирования было показано, что фракция, содержащая (согласно калибровке колонки) вещества в диапазоне молекулярных масс 1—2 кДа (далее фракция CII-3) вызывает в дозе 30 мкг/г понижение температуры тела на 4°С. Эта же фракция проявляла отрицательное хроно- и инонотропное действие на изолированных сердцах лягушки, кошки и кролика; активность данной фракции была на порядок выше, чем у исходной. На всех видах использованных препаратов изолированного сердца действие данной фракции проявлялось в дозо-зависимом (1*10-7—1*10-4 г/л) угнетении ритма

сердцебиений и снижении амплитуды сокращений, вызывая в концентрации 1*10~4 г/л полное прекращение работы сердца.

МОЗГ

¡.Гомогенизация (1 М СН3СООН) 2.Центрифугирование

СУПЕР 1АТАНТ 1 ОСАДОК

1.Гомогенизация 2.Водяная баня (100°С) 3.Центрифугирование

1 1 ?

СУПЕРНАТАНТ 1+2

Ультрафильтрация (Аписоп РМ-10)

ОСАДОК

ФРАКЦИЯ С1 (М>10 кДа)

ФИЛЬТРАТ

Г

Ультрафильтрация (Ахшсоп иМ-2)

I

ФРАКЦИЯ СЗ (М<1 кДа)

ФРАКЦИЯ С2 (М = Ь10 кДа)

Гель—фильтрация

Обращенно-фазовая ВЭЖХ

Рис. 1. Схема получения экстракта мозга и его фракционирования.

Количество вещества, получаемого при дальнейшем разделении фракции СИ—3, не позволяло проводить тестирование в вышеуказанных тестах. В поисках более экономичного теста сотрудниками Института экспериментальной и теоретической биофизики был предложен чувствительный электрофизиологический тест, основанный на функциональных особенностях сердечнососудистой системы зимоспящих, отличающих их от незимоспящих. Известно, что потенциалы действия (далее ПД) сердечной мышцы у гибернирующих

А254

Голубой декстран

I

i-1-1-1—i-1-1

о

200 300 400 500 600 МЛ

Рис. 2. Хроматографическое разделение 200 мг фракции СП на колонке с сефадексом G-25 f в 0,5 М уксусной кислоте. Скорость элюции 16,6 ил/ч. Цифрами 1-6 помечены собранные фракции. Фракция 3 по данным калибровки содержит вещества с условной молекулярной массой 1-2 кДа (далее фракция СИ-З). Стрелками показаны места выхода маркерных веществ. DSIP - пептид дельта-сна (WAGGDASGE) (М 849).

животных (монофазные, зарегистрированные на целом сердце в экспериментах ia vivo и внутриклеточные - на клетках папиллярной мышцы) имеют характерные особенности : у них практически отсутствует фаза плато ПД и сильно замедлено окончание фазы реполяризации. На сердце плато ПД формируют входящий Са2+ ток и выходящий К4 ток. При этом показано, что падение температурного порога возникновения фибрилляции желудочка сердца и уменьшение частоты сокращений прямо связано с подавлением транспорта ионов Са2+ и К+ в мышечных волокнах сердца. Таким образом, поиск пептидных активаторов и блокаторов ионного транспорта миокардиальных клеток мог, по нашему мнению, привести к выделению из мозга зимоспящих веществ, принимающих непосредственное участие в регуляции физиологических функций у гибернангов в переходные периоды цикла спячка-бодрствование.

Большая часть работы по тестированию фракций экстракта мозга гибернирующих сусликов электрофизиологическими методами выполнена на предсердных волокнах лягушки Rana ridibunda.

Тестирование фракции CII на кардиомиоцитах лягушки показало, что через 10-15 мин действия ПД клетки принимает форму, характерную для ПД зимоспяших животных: отсутствует плато, замедлена фаза реполяризации

потенциала вблизи потенциала покоя. Практически во всех экспериментах незначительно падает амплитуда ПД (при действии фракции в течение 10-15 мин, как правило, удается наблюдать полную или частичную обратимость этого эффекта после отмывки в течение 15-20 минут). Потенциал покоя, регистрируемый в течение каждого эксперимента, не отличался от контрольного. Са2+ ток регистрировали после подавления тока (для подавления входящего натриевого тока использовали тетродотоксин в концентрации 5х10"7 М). Наблюдаемый пороговый потенциал возникновения Са2+ тока - около 30-35 мв (длительность деполяризующей ступеньки 100 мсек). Через 10 минут действия фракция более чем наполовину подавляет медленный входящий ток. Анализ выходящей компоненты тока показывает, что уменьшение входящего тока в основном определяется подавлением Са2+ тока. После 10-минутного действия эффект блокирования тока частично снимается при 10-минутной отмывке. Однако после 20 минут действия фракции в некоторых экспериментах отмывка не дает заметного результата. Практически во всех экспериментах в присутствии фракции возрастает выходящий ток. В отличие от Са2+-тока, его рост продолжается и при отмывке.

Фракция СИ—3 вызывала характерные изменения ПД и Са2+ тока, наблюдавшиеся при действии фракции СИ. Эффект действия этой фракции был выражен значительно сильнее, чем у СИ. При используемой в опытах концентрации (1 мг/л) после 5-10 минут действия фракции Са2+ ток не удается восстановить (даже частично) при отмывке в течение 25-30 минут. В отличие от действия фракции СИ, фракция СП-3 при малых потенциалах уменьшает выходящие К+ токи, т.е. среди активных соединений, пептидной фракции мозга зимоспящих животных есть соединения как активирующие, так и блокирующие суммарную компоненту К+ тока.

Фракция СН-З, полученная в результате гель-фильтрации, была подвергнута дальнейшему разделению методом обрашенно-фазовой ВЭЖХ (рис. 3). В результате тестирования полученных при разделении методом ВЭЖХ фракций была локализована область веществ (фракция 4 на рис. 3), обладающих способностью блокировать Са2+ токи, а из близлежащей к ней фракции СН-3-5 был выделен гомогенный пептид, который, напротив, обратимо увеличивал Са2+ токи в этом тесте. Пептид был идентифицирован как неокиоторфин (ТИг-Зег-Ьув-Туг-Агв), выделенный ранее японскими исследователями из мозга быка и известный как слабый анальгетик.

А 220

[CH3CN], %

г 36

1 , 2 ,3,4,5, 6

- 27

- 18

- 9

- О

О

10

20

30

40

50 МИН

Рис. 3. ООрашецно-фазовая ВЭЖХ 0,5 мг фракции CII-3 на колонке Niicleosil 7 C[S (4x250 мм), уравновешенной в 0.1% TFA, в градиенте концентрашш ацетогштрила 0 - 39% за 90 ммн. Скорость элюшш 0,5 мл/мин. Детекция - по поглощеш1Ю при 220 им)

Цифрами 1 - 6 помечены собранные фракции. Фракция 4 обладает способностью блокировать потецциалозависимые Са2+-токи предсердных волокон лягушки (далее фракция CII-3-4). Цифры над пиками соответствуют номерам пептидов в таблице. Звездочкой (*) помечен пик вещества непептидной природы.

В результате разделения фракции C1I—3-4 методами обращенно-фазовой и ионнообменней ВЭЖХ Оылп выделены и установлены первичные структуры ряда пептизоп. (2-20. см. таблицу 1). из которых Asp-Туг, Ala-Leu, Plie-Ile, Phe-Pro, Val-Gly и Val-Asp были исследованы в электрофизиологическом тесте (мембранный потенциал фиксировали методом сахарозного моста), выявившем способность блокировать потенциало-зависимыи Са2+ ток предсердных волокон лягу шки у Asp-Tyr. Насышаюшая концентрация дипептида была 10"5 М, при 10~6 M ток блокировался наполовину. Исследование электрофизиологической активности Asp-Tyr на изолированных кардиомиоцитах крысы и суслика методом перфорированного пэтч-клямпа (whole cell perforated patch-clamp), однако, показало, что у атп\ видов животных данный днпептид вызывает активацию Са2"1 юка. Подобное различие в регуляции ионного транспорта в клетках сердца холоднокровных животных по сравнению с теплокровными, а также наличие ряда методических проСлем юс тужили причиной перехода от тестирования фрикций п сшие шронанни* ieii• млок на предсердных волокнах лягушки

методом сахарозного моста к технике "пэтч-клямп" на миокардиоцитах крысы и суслика. Среди пептидов, выделенных из фракции СП-3-4, синтезированных и исследованных в электрофизиологическом тесте на миокардиоцитах крысы, ТЬг-.Чег-Ьуз-Туг проявил способность блокировать Са2+ ток.

Таблица 1.

Структуры пептидов, выделенных из мозга зимоспящих сусликов

Номер Структура пептида Фракция Номер Структура пептида Фракция

1 FK 0 11-3-3 16 SM II-3-4

2 AL с 11-3-4 17 AGG II-3-4

3 DYa,m II-3-4 18 VGG II-3-4

4 FI с II-3-4 19 LG II-3-4

5 FP с 11-3-4 20 MG 11-3-4

6 VG с II-3-4 21 TSKYR b,d II-3-5

7 VD с 11-3-4 22 TS H-3-6

8 TSK.Y 1 II-3-4 23 VLSPAe II-3-6

9 QSKY II-3-4 24 VVAGVANA f II-3-6

10 SKYR 11-3-4 25 VHLSDGEKNAISTAWG g II-3-6

11 RLL 11-3-4 26 VHLSDGEKNAISTAh 11-3-6

12 LS II-3-4 27 INDPF ' 11-3-6

13 LR 11-3-4 28 IVIVMA k 11-3-6

14 IQ II-3-4 29 YQK. m II-3-3'

15 LT 11-3-4 30 EYK • 11-3-3'

а - блокатор кальциевого тока предсердных волокон лягушки

b - активатор кальциевого тока предсердных волокон лягушки .

с - не оказывает влияния на кальциевый ток предсердных волокон лягушки

d - фрагмент 137-141 a-цепи гемоглобина (С. citellus;

е - фрагмент 1-5 a-цепи гемоглобина (С. citellus)

f- фрагмент 133-140 Р-цепи гемоглобина (С. citellus)

g - фрагмент 1-16 Р-цепи гемоглобина (С. citellus)

h - фрагмент 1-14 Р-цепи гемоглобина (С. citellus)

i - фрагмент 30-34 глицеральдегид-З-фосфат дегидрогеназы (крыса)

к - фрагмент 110-115 Р-цепи гемоглобина (С. citellus)

1 - блокатор кальциевого тока миокардиоцитов крысы и суслика

m - активатор кальциевого тока миокардиоцитов крысы и суслика

Необходимо отметить, что достигаемая при разделении фракции CII-3 степень очистки не коррелирует с увеличением искомой активности, наблюдаемой »о фракции CII-3-4, что позволяет ожидать присутствия в экстракте лругих активных соединении. По этой причине мы пропели более детальное исследование иегкпдного состава фракции CII-3. Наряду с фракцией CII-3-4, была наработана и разделена фракция СП-3-6, из которой были выделены еще

несколько пептидов, для некоторых установлены первнтаые структуры (22-28, см. таблицу 1).

Ввиду того, что использование аналитической обращенно-фазовой колонки для разделения фракции СН-З не обеспечивало необходимый для дальнейшего разделения и тестирования расход вещества, было решено несколько изменить схему разделения. Фракция СН-З была подвергнута фракционированию препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке БПазагЬ 7/Сц (25x250 мм) ("Хроматосервис", Россия) (рис. 4). Тестирование фракций, полученных в результате этого разделения, выявило способность блокировать Са2+ токи во фракции 3' (далее фракция СЦ-3-3')(см. рис. 4).

А28о МеОН, %

70

-35

-0

О 10 20 30 40 50 60 70 МИН

Рис. 4. Обращенно-фазовая ВЭЖХ 95 мг фракции CII-3 на колонке Silasorb 7/Cis (25x250 мм) ("Хроматосервис", Россия), уравновешенной в 0.04% TFA, в градиенте концентрации метанола 0 - 70% за 60 мин. Скорость элюции 8 мл/мин; детекция - по поглощению при 280 ни). Цифрами 1' - 5' помечены собранные фракции.

Разделение фракции СН-3-3' последовательно методами ионообменной ВЭЖХ (колонка Ultropac TSK 535 СМ (7.5x150 мм) ("LKB", Швеция)) (рис. 5) и обращенно-фазовой ВЭЖХ (колонка Nucleosil 7/Сц (4x250 мм) ("Macherey Nagel", ФРГ)) (рис. 6) привело к наработке узких фракций, обладающих способностью как блокировать, так и активировать Са2+ токи. Рехрома-тографирование этих фракций на колонке Separon SGX RP-S (CI8 Super) (5 ц, 2x250 мм) ("Элсико", Россия) привело к выделению и очистке индивидуальных пептидов, структура которых была установлена при помощи газофазного секвенатора (пептиды 8, 29-30 в таблице 1).

Рис. 5. Ионнообменная ВЭЖХ 1 мг фракции СН-З-З' на колонке иНгорас ТБК 535 СМ (7,5x150 мм) в 50% метаноле в 0,05 М ТЕАА рН 3,6. Скорость элюции - 2 мл/мин; детекция по поглощению при 220 нм). Цифрами 1-4 помечены собранные фракции.

А220 [CH3CN], %

Рис. 6. Обращенно-фазовая ВЭЖХ 1 мг фракции C-II-З-З'-З на колонке Nucleosil 7/Cis (4x250 мм) (Macherey Nagel, ФРГ) в градиенте концентрации ацетошприла 0 - 32,5% за 45 мин. Скорость элюции 0,5 мл/мин; детекция по поглощению при 220 нм. Цифрами 1 - 6 помечены собранные фракции.

1.2 .Выделение и установление структур биологически активных пептидов из иозга хододоадаптированноЛ яяутсхой лошади.

Получение экстракта из мозга холодоадоптированной якутской лошапи и его фракционирование методом ультрафильтрации проводили по схеме, приведенной на рис. 1.

Фракции Л1 (М.М.>10кДа), ЛИ (М.М.=1-10 кДа) и ЛШ ,(М.М.<1 кДа), полученные в результате ультрафильтрации, были исследованы на наличие у них электрофизиологической (регистрировали влияние фракций на кальциевые токи миокардиальных волокон крысы), гипометаболической и гипотермической ахтивности (измеряли потребление кислорода и ректальную температуру при внутрибрюшинном введении фракций мышам).

Рис. 7. Хроматографическое разделение 200 мг фракции Л-И на колонке с Тоуореаг1 Н\У-40 Г Скорость элюции 20 мл/ч; детекция по поглощению при 280 нм. Цифрами 1-10 помечены собранные фракции.

Тестирование показало, что наиболее активной в обоих тестах была фракция ЛИ (М.М.=1-10 кДа), вызывавшая (в концентрации 0,1 мг/мл) снижение Са2+ токов кардиоцитов крысы на 25% и понижавшая у мышей (в дозе 1 мг/г) потребление кислорода на 60% и ректальной температуры на 8-9°С.

Фракция ЛИ была подвергнута дальнейшему разделению методом гель-фильтрации на колонке с Тоуореаг! Н\У-40 (". (рис. 7)

1.2.1. Выделевие из ыоата холодоадаптироваииой якутской лошади терыорегуляторво активных пептидов.

Непроизводительность и неэкономичность (большой расход сырья) теста, в котором исследовалась гипотермическая и гипометаболическая активности фракций, не позволяли использовать его в качестве рабочей тест—системы для отбора фракций. Для решения задач исследования была необходима более производительная и более чувствительная модель тестирования. Такая тест-система была предложена сотрудниками института химической физики РАН.

В предложенной модели тестирования гипотермической активности фракций эксперименты проводились на крысах в термостатируемой при 4-6°С камере. В условиях пониженной температуры окружающей среды процессы теплопродукции у животных доминируют над процессами теплоотдачи, что позволяет с большей чувствительностью регистрировать наличие и выраженность гипотермического эффекта действия исследуемых фракций, вызывающих снижение уровня теплопродукции. Производительность экспериментальной установки, позволяющей тестировать одновременно 10 животных, давала возможность в течение нескольких дней получать статистически достоверные результаты, требовавшие в условиях предыдущей модели более месяца напряженной работы и в несколько раз больше тестируемого материала.

Тестирование терморегуляторной активности фракций, полученных в результате разделения фракции ЛИ при помощи гель-фильтрации, выявило гипотермическую активность у фракций ЛИ—3, ЛИ—6, ЛИ—8 и гипертермическую активность у фракции ЛИ—7.

Наибольшим эффектом на температуру тела крыс оказывала фракция ЛП-3, которая и была подвергнута дальнейшему последовательному разделению двумя различными вариантами препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ. Аналитическое разделение гипотермически активной фракции ЛН-3-6-2 (рис. 9), полученной в результате препаративных разделений, показало, что она представляет собой смесь небольшого числа соединений. Определение первичной структуры двух основных пиков этой фракции (помеченных на рис. 9 цифрами 1 и 2) дало следующий результат: 1. AVHLPNDFTPAV (фрагмент 110-121 а-цепи гемоглобина (лошадь)); 2. АУНЬР^РТРАУНА81ЛЖ (фрагмент 110-127 а-цепи гемоглобина (лошадь)). Пик 4 содержал в себе два пептида: УЬЗААБКТМУКААШЗКУОО (фрагмент 1-19 а-цепи гемоглобина (лошадь)) и АКУАУЬОАЗООЮОРЬБ (фрагмент 1-17 митохондриальной малатдегидрогеназы (крыса)). Структуру пептида, содержащегося в пике 3, однозначно установить не удалось. Препаративное разделение фракции ЛИ—3-6-2 и тестирование полученных фракций показало, что гипотермическая активность фракции ЛН—3-6-2 обусловлена восемнадцатичленным пептидом АУНЬРЫПГТРАУНАЗЬВК.

I л.

MeCN, %

2

1.0 -

50

0.5 -

25

5

0.0 --—v

0

О

5

10

15

20 мин

Рис. 9. Обращенно-фазовая ВЭЖХ 35 мкг фракции ЛН-3-6-2 на колонке Ыис1еоы1 120-3/Си (4x125 мм), уравновешенной в 0,01 М ацетате аммония рН 8,0, в градиенте концентрации ацетонитрила: 0 - 50% за 15 мин; 50% в течение 5 мин. Скорость элюции 0,2 мл/мин; детекция при 220 нм. Основные пики фракции помечены цифрами 1-5 (см. в тексте).

С целью изучения биологической активности пептидов, выделенных из узких, активных фракций экстрактов мозга зимоспящих сусликов и холодоадаптированной якутской лошади, был проведен их химический синтез. Синтез проводили как твердофазным методом, так и в растворе. Индивидуальность полученных пептидов подтверждали данными аминокислотного анализа, масс-спекгрометрии (FAB) и аналитической ВЭЖХ. Помимо синтеза пептидов непосредственно выделенных из исследуемых экстрактов, были синтезированы также [D-Ser^-aHanor неокиоторфина (по данным японских авторов среди десяти синтезированных ими аналогов неокиоторфина данный аналог обладал наивысшей анальгетической активностью) и сульфатированный по остатку Туг аналог дипептида Asp-Туг. Синтез данного аналога был осуществлен с учетом того обстоятельства, что дипептид Asp-Туг совпадает с N-концевым фрагментом природного октапептида холецистокинина, остаток Туг которого сульфатирован, причем сульфатирование остатка Туг является весьма существенным для биологической активности октапептида. Список синтезированных пептидов приведен в таблице 2.

2. Сяятеа пептидом.

Таблица 2. Синтезированные пептиды и их физико-химические характеристики.

Структура пептида Вид животного R,' (мин) Rf" Масс-спектр (ГМН'П-

1 TSKYR суслик 11 R,=0,46 (В); Ri=0,23 (Г). 635

2 Thr-(D-Ser)-Lys-Tyr-Arg - 11,1 Rl=0,46 (В); R(=0.23 (Г). 655

3 YOK суслик 8.7 438

4 DY суслик 9,3 Rf-0,35 (А), Ri=0,42 (Г). 297

5 Asp-Tyr(SOiH) _ 10 377

6 EYK суслик 8.2 439

7 OSKY суслик 11.2 525

9 TSKY суслик 11.2 498

10 HASLDK „ 11.1 670

И AVHLPNDFTPAVHASLDK якутская лошадь 29,1 1933

* Rt (время удерживания) приведено для колонки Nucleosil 300 7/Cig. Разделение проводили в градиенте концентрации 0,1% TFA-ацегонитрил (1%/мин); скорость элюции 1 мл/мин. " Rf приведены для систем растворителей А,Б,В,Г (см. ниже по тексту). приведены экспериментально полученные значения масс-спектров.

2.1. Синтез пептидов в растворе.

Синтез пептидов в растворе проводили последовательным наращиванием пептидной цепи с С-конца методом N-оксисукцинимидных эфиров. Для синтеза пептидов использовали аминокислоты и их производные фирмы "Reanal" (Венгрия); индивидуальность полученных соединений проверяли методом ТСХ на хроматографических пластинках Kieselgel 60 (Merck, ФРГ) в системах растворителей: н-бутанол - уксусная кислота - вода 4:1:1 (А); хлороформ -метанол - уксусная кислота 6:1:1 (Б); н-бутанол - уксусная кислота - вода -пиридин 2:1:1:1 (В); н-бутанол - уксусная кислота - вода - пиридин 3:1:1:1 (Г). Вещества на пластинках обнаруживали с помощью хлор—бензидина. Вос-защитные группы удалялись 70% CF3COOH в СН3СООН. Гидрирование пептидов проводили в присутствии палладиевой черни (катализатора брали 10% от веса пептида). Очистку пептидов после деблокирования проводили последовательно гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-I5 и препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ.

2.2. Твердофазный святеа пептидов

Твердофазный синтез пептидов проводили на автоматическом синтезаторе МШЮеп/Вю$еагсЬ 9500 (США) с использованием Вос-схемы. В качестве конденсирующего агента применяли диизопропилкарбодиимид с 1-гадроксибензотриазолом (НОВг)(1:1). Протокол синтеза приведен в таблице 3.

Таблица 3. Протокол твердофазного синтеза по Вос-схеме

№ Растворитель Объем Число про- Время

шага (ил) мывок (мин)

1 СН3С1 30 2 0.5

2 ТРА/СН3С1 (1:1) 30 2 1; 19

3 СН3С1 75 5 0.5

4 01РЕА в СН3С1 30 2 1

5 СН3С1 75 5 0.5

6 В реактор добавляют 0,6М раствор в димсгкиформамиде: 3 экв. защищенной аминокислоты + 3 экв. НСШ, 3 экв. двдэопропилхарбодиимида; перемешивание 60, 120 мин (в случае двухкратной реакции конденсации

повторяют стадии 3-7)

7 ОМР/СН3С1 (1:1) 30 2 1

8 СН3С1 30 2 0.5

9 отбирают 5 мг для нингидринового теста

10 по окончании каждого цикла повторяют стадии 1-9; по окончании синтеза

повторяют стадии 1-5.

11 этанол 45 3 0.5

Конечное деблокирование проводили жидким фтористым водородом в присутствие п-крезола (9:1) в течение 1 часа при 0°С. После упаривания фтористого водорода реакционную смесь промывали эфиром (5x10 мл) на стеклянном фильтре, затем экстрагировали 10% уксусной кислотой (3x10 мл) и лиофилизовывали. Лиофилизат, полученный после деблокирования пептидов, растворяли в 4 мл 0,1 М уксусной кислоты, центрифугировали 5 мин (20 тыс. оборотов в минуту) и супернатант подвергали гель-фильтрации на колонке 2,5x100 см с сефадексом в-Ю в 0,1 М уксусной кислоте (скорость элюции — 45 мл/час; детекция при 226 нм). Дальнейшую очистку проводили с помощью препаративной ВЭЖХ в градиенте концентраций 0,1% ТРА - \leCN, скорость элюции — 8 мл/мин. Чистота продуктов подтверждалась аналитической обращенно-фазовой ВЭЖХ в градиенте концентраций 0.1% ТБА - МеСЫ (скорость элюции 1 мл/мин, детекция при 220 нм).

3. £'£<•.• ios тестирование синтезированных пептидов.

Биологические свойства выделенных и синтезированных пептидов были исследованы на клеточном, органном и организменном уровнях. На клеточном уровне исследовали влияние пептидов на ионные токи предсердных волокон лягушки (Rana ridibunda) и изолированных миокардиоцитов белых крыс и сусликов; на органном - действие пептидов на изолированное сердце лягушки, а на организменном уровне - терморегуляторные эффекты действия пептидов при внутрибрюшинном введении белым крысам.

Изучение влияния синтезированных пептидов на ионные токи предсердных волокон лягушки и изолированных миокардиоцитов крысы проводилось совместно с Институтом экспериментальной и теоретической биофизики РАН.

Изучение влияния синтезированных пептидов на систему терморегуляции крысы проводилось совместно с Институтом химической физики РАН.

Исследование влияния неокиоторфина на находящихся в состоянии зимней спячки сусликов проводилось совместно с Институтом биофизики клетки РАН.

Неокиоторфии (Thr-Ser-Lys- Tyr-Arg).

Тестирование пентапептида показало, что в концентрации 1(Н М он обратимо увеличивал потенциало-зависимые Са^-токи предсердных волокон лягушки (Ко,5=0,5 мкМ). Кроме того было обнаружено, что начиная с 0,1 мкМ неокиоторфин увеличивал внутриклеточную концентрацию Са2"1" в миокардиоцитах желудочка крысы. Увеличение внутриклеточной концентрации Са2+ наблюдалось также и в присутствии блокатора кальциевых каналов D-600. Рост концентрации С а24" осуществлялся, вероятно, за счет мобилизации ионов из внутриклеточных депо, поскольку увеличение наблюдати и в отсутствие внешнего Са21-. Исследование влияния неокиоторфина на К+-ток кардиоцитов крысы показало, что в концентрации 10~5 М он увеличивает вероятность пребывания АТР-зависимых К+-каналов в закрытом состоянии. Полученные результаты говорят о способности неокиоторфина активизировать работу сердца на клеточном уровне.

Изучение влияния неокиоторфина ¿ii vivo проводилось на находящихся в состоянии спячки сусликах. При этом регистрировали частоту сердечных сокращений, температуру тела и уровень потребления кислорода. Исследование показало, что внутрибрюшинное введение пептида в дозе 1,5 мг/кг приводило к

резкому увеличению сердечного ритма от 7-12 до 170 ударов/мин через 90 мин и достигала к 120-й минуте 420-ти ударов/мин. В последующие 2-3 ч сердечный ритм постепенно возвращался к норме активного животного. Изменение деятельности сердца значительно опережало рост температуры тела, которая достигала субнормальных значений спустя 3 ч после инъекции. Уровень потребления кислорода, составлявший в состоянии спячки около 1% от этого показателя активного животного, также резко возрастал в результате инъекции неокиоторфина, превышая в момент достижения максимальной скорости повышения температуры тела животного уровень нормотермии более, чем в 5 раз (обычно - не более, чем в 2,5-3 раза). После повышения температуры тела животного выше 20°С и по мере достижения нормотермии потребление кислорода постепенно уменьшалось до уровня бодрствующего животного. Эффективность действия неокиоторфина зависела от состояния животного. Внутрибрюшинная инъекция пептида сусликам на стадии вхождения в спячку и в первый день баута в дозах 1,5 и даже 4 мг/кг не оказывало пробуждающего эффекта, а лишь кратковременно задерживало снижение частоты сердечных сокращений и температуры.

С целью исследования терморегуляторной активности неокиоторфина проведено 4 серии экспериментов на крысах. Эксперименты проводили в термостатируемой камере при различных температурных режимах, каждый из которых характеризуется определенным функциональным состоянием системы терморегуляции:

1. в термонейтральной среде (температура камеры 26-28°С), когда процессы теплопродукции и теплоотдачи находятся в динамическом равновесии и уровень основного обмена не зависит от внешней температуры;

2. в холодной среде (температура камеры 4-6°С), когда процессы теплопродукции доминируют над процессами теплоотдачи ;

3. в жаркой среде (31-32°С), когда процессы теплоотдачи доминируют над процессами теплопродукции;

4. при резком повышении температуры камеры от комнатной до 36°С со скоростью 10°/с, когда для поддержания постоянной температуры тела в ответ на тепловое воздействие развиваются компенсаторные сосудистые реакции, направленные на сброс избыточного тепла.

Результаты проведенных исследований показали, что при внутрибрюшинном и интраназальном введениях (в дозе 500 и 150 мкг/кг соответственно) в холодной и жаркой средах, т.е. в условиях максимального напряжения компенсаторных механизмов, неокиоторфин не оказывал заметного воздействия. В термонейтральной среде введение пептида вызывало увеличение температуры тела с последующим развитием компенсаторной реакции вазодилатации, приводившей через 40 мин после введения к снижению температуры тела до исходного уровня и ниже. В условиях нестационарных тепловых воздействий неокиоторфин вызывал торможение развития компенсаторной реакции вазодилатации на перегрев. Анализ полученных данных позволяет предположить, что неокиоторфин в термонейтральной среде и в условиях нестационарных тепловых воздействий вызывает изменение температурной чувствительности центральных или периферических термосенсоров, сдвигая регуляцию физиологического термостата на другой уровень температурной чувствительности.

На основании результатов комплекса исследований можно предположить, что неокиоторфин является эндогенным регулятором процесса гибернации, одной из функций которого, возможно, является выведение животного из состояния зимней спячки. Такое действие неокиоторфина, вероятно, связано со стимуляцией работы сердца в условиях пониженной активности последнего. Это предположение подтверждает факт выделения небольшого количества эндогенного тепла, наблюдаемый на крысах в термонейтральных условиях среды. Полученные данные подтверждают гипотезу о роли Са^-токов сердца в сезонных ритмах зимнеспящих животных.

Asp-Tyr.

Исследование дипептида в электрофизиологическом тесте выявило у него способность блокировать потенциало-зависимый Са2+-ток предсердных волокон лягушки. Насыщающая концентрация дипептида была 10~5 М, при 10"* М ток блокировался наполовину. Кроме того отметим, что при проведении экспериментов по определению зависимости указанного эффекта от дозы пептида было обнаружено значительное увеличение выходящего тока при действии пептида. Электрофизиологическое тестирование Asp-Tyr на

ю

изолированных миокардиоцитах крысы показало, что на этих клетках пептид, напротив, активировал потенциало-зависимый Са^-ток.

Изучение влияния дипептида на механическую активность и ритмику изолированного сердца лягушки Яапа ¡етрогапа в условиях круговой перфузии препарата выявило дозо-зависимое угнетение частоты сокращений и снижение амплитуды механической активности сердца (вплоть до полного прекращения работы сердца при концентрации 1 мМ).

Выявленное различие в электрофизиологических свойствах пептида в зависимости от типа тест-модели представляет собой интересный феномен и требует для своего объяснения более детальных исследований.

Аяр- Туг(БОзН).

Принимая во внимание тот факт, что М-концевым фрагментом природного октапептида холецистокшшна является дипептид /\sp-Tyr и что сульфатирование остатка Туг существенно повышает биологическую активности октапептида, нами был синтезирован сульфатированный аналог выделенного дипептида - А^р-Туг(ЗОзН). Действие сульфатированного аналога более специфично: в его присутствии не изменяется выходящий ток. Кроме того, анализ кривой зависимости эффекта действия сульфатированного дипептида от концентрации показывает, что в отличие от несульфатированного аналога, он блокирует не весь Са^-ток. Мы не проводили специальных исследований, но можно высказать предположение, что сульфатированный дипептид блокирует Са2*"-к;.налы только Ь-типа. Косвенным доводом в пользу такого утверждения может служить тот факт, что во всех экспериментах доля заблокированного тока составляла значительную часть от исходного, приблизительно соответствуя соотношению Ь и Т типов Са2+-каналов на предсердных волокнах лягушки. Его константа полуэффекта равна 0,5 мкМ, т.е. сульфатированный дипептид более эффективен, чем несульфатированный.

Тут-Оп-Ьу^.

Исследование трипептида в электрофизиологическом т^с: .' пыяиню у нло способность активировать потенциало-зависимый Са-'-юк изолированных миокардиоцитов крысы (при концентрации пептида 1 мкМ >величенне тока

достигало 25%, а при 10 мкМ - 38%). Внутрибрюшинное введение этого пептида крысам не вызывало у животных изменения ректальной температуры по сравнению с контрольными животными.

Thr-Ser-Lys-Tyr.

Исследование тетрапептида в электрофизиолошческом тесте ъыявило у него способность блокировать потенциало-зависимый Са2+-ток изолированных миокардноцитов крысы (константа полуэффекта 10 мкМ). В холодных условиях (4-6°С) вн)трнбрюшинное введение этого пептпда крысам вызывало у животных незначительное (0,27°С через 100 мин) увеличение ректальной температуры

GIn-Ser-Lys-Tyr и Glu-Туг- Lys.

Данные пептиды не проявили значимой активности в тестах на электрофизиологическую и терморегуляторную активности.

Ala-Val-His-Leu-Pro-Asn-Asp-Phe-Thr-Pro-Ala-Val-His-Ala-Ser-Leu-Asp-Lys. Пептид обладал значительной пшотермической активностью при температуре окружающей среды 4-6°С, вызывая при внутрибрюшинном введении в дозе 5 мг/кг падение температуры тела на 0,8°С. Исследование электрофизиологичес-koi'í активности данного октадекапептида показало, что он блокирует Са2*" ток изолированных миокардноцитов крысы (при концентрации пептид? 5 мкМ падение тока составляло 32%, а при 25 мкМ - 58%).

His-Ala-Ser-Leu-Asp-Lys.

Внутрибрюшинное введение пептида, яшшюшегося С-концевым фрагментом рассмотренного выше пептида, обладающего пшотермической активностью, вызывало у крыс повышение температуры тела при температуре окружающей среды 4-6°С. Электрофизиологические исследования гексапептида на миокардиоцитах крысы не выявили достоверных изменений ионной проиолимостп клеток при его воздействии.

4. Исследование содержания некоторых из выделенных пептидов в экстрактах ыозга зимних и летних животных.

Используя в качестве маркерных веществ синтезированные пептиды Thr-Ser-Lys-Tyr-Arg, Thr-Ser-Lys-Tyr (выделенные из мозга зимоспящих сусликов) и Ala- Val-His-Leu-Pro-Asn-Asp-Phe-Thr-Pro-Ala- Val-Hís-Ala-Ser-Leu-Asp-Lys (выделенный из мозга якутской лошади), мы определили содержание указанных пептидов хроматографическими методами в экстрактах мозга активных летних и зимоспящих сусликов и летней и зимней якутской лошади соответственно (результаты этой работы представлены в таблице 4).

Таблица 4. Сезонные изменения содержания некоторых пептидов в мозге суслика и якутской лошади.

Пептид Источник выделения Содержание пептида в мозге (нМ/г)

лето зима зима/лето

TSKYR суслик 24 32 1,33

TSKY суслик 0,4 0,6 1,5

AVHLPNDFTPAVHASLDK лошадь 1,61 1,27 0,79

Выявленные различия в содержании вышеупомянутых пептидов в мозге зимних и летних животных, соотнесенные с результатами их биологического тестирования, не позволяют на данном этапе сделать однозначного вывода о месте и роли этих пептидов в механизмах регуляции природных гипометабо-лических состояний. Необходимы дополнительные исследования биологических свойств данных пептидов на разных уровнях для более точного установления спектра их биологического действия.

ВЫВОДЫ

I. Получены уксуснокислые экстракты мозга активных летних и зимоспящих сусликов агеЁЧБ ипс1иШм, а также нормотермной летней и находящейся в состоянии гипобиоза зимней якутской лошади. Установлено, что фракции экстрактов мозга зимних животных, содержащие вещества с молекулярной массой 1-10 кДа, в отличие от аналогичных фракций экстрактов мозга летних животных, блокируют потенциало-зависимые токи предсердных волокон лягушки и миокардиоцитов предсердия крысы и суслика; вызывают дозо-зависимое угнетение ритма сердцебиений и снижение амплитуды

сокращения сердца на изолированном сердце лягушки, кролика и кошки; снижают температуру тела у крыс.

II. Проведено выделение и установлены аминокислотные последовательности тридцати четырех пептидов из активных фракций экстрактов мозга зимоспящих сусликов Gtellus undulatus и холодоадаптированной якутской лошади, из них пять обладают биологической активностью.

III. Осуществлен синтез ряда выделенных пептидов и аналогов некоторых из них.

.IV. Проведено исследование биологической активности синтезированных пептидов. Выявлены соединения, активирующие потенци ало-зависимый кальциевый ток сердечных клеток (неокиоторфин, его [D-Ser2]-аналог и Туг-Gln-Lys) и блокирующие этот ток (Thr-Ser-Lys-Tyr и октадекапептид Ala- Val-His-Leu-Pro-Asn-Asp-Phe-Thr-Pro-Ab-Val-His-Ala-Scr-Leu-Asp-Lys), а также способные как ингибировать Са21" ток, так и активировать его ^ зависимости от условий тестирования. Выявлена неизвестная ранее способность неокиоторфина активировать сердечную деятельность и потребление кислорода у зимоспящих сусликов. Обнаружена терморегуляторная активность у неокиоторфина и октадекапептида.

V. Исследовано содержание неокиоторфина и Thr-Ser-Lys-Tyr в экстрактах мозга зимоспящих и активных летних сусликов, а также октадекапептида Ala-Val-His-Leu-Pro-Asn-Asp-Phe-Thr-Pro-Ala-Val-His-AIa-Ser-Leu-Asp-Lys в экстрактах мозга летней и зимней якутской лошади. Показано, что содержание неокиоторфина у зимоспящих сусликов на 33%, а тетрапептида на 50% выше, чем у активных летних животных. Содержание октадекапептида у якутской лошади в зимнее время составляет 79% от его содержания в летний период.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Vaskovsky B.V., Ivanov V.T., Mikhaleva I.I., Kolaeva S.G., Kokoz Yu.M., Svieryaev V.I., Ziganshin R.H., Sukhova G.S., Ignatiev D.A. // Neokyotorphin from the brain of hibernating ground squirrels can participate in heart activation and arousal from hibernation. Peptides. Chemistry, Structure and Biology. /Eds. E. River and G.R.Marshall, p.302-304, Escom, Leiden, 1990

2. Mikhaleva 1.1., Svieryaev V.I., Vaskovsky B.V., Ziganshin R.H., Ivanov V.T., Kokoz Yu.M., Povzun A.A., Alekseev AE., Ignatiev D.I., Kolaeva S.G., Sukhova G.S.// Isolation, identification and specific biological activity of peptides from hibernating ground squirrels. Chemestry of peptides and proteins /Eds Brandenburg, Ivanov, Voelter. v. 5/6 part A, DWI Reports 1993, 112A, pp. 287-297

»

3. Mikhaleva I.I., Svieiyaev V.I., Vaskovsky B.V., Ziganshin R.H., Ivanov V.T., Kokoz U.M., Povzun A.A., Alexeev A.E., Ignatiev D.A, Sukhova G.S., Emelyanova T.G. //The peptides from the brain of hibernating ground squirrels and their biological effects, Chemestry of peptides and proteins v. 5/6 part B, DWI Reports 1993, 112B, pp. 299-308.

4. Svieryaev V.I., Vaskovsky B.V., Ziganshin R.H., Mikhaleva I.I., Ivanov V.T., Kokoz Yu.M., Povzun A.A., Alekseev A.E., Sukhova G.S. // Peptides from hibernating ground squirrels and their phisiological activity. Proceedings of the 21 European Peptide Symposium, Peptides 1990 /Eds. E. Giralt and D.Andreu, p.751-752, Escom, Leiden 1991

5. Mikhaleva 1.1., Svieryaev V.I., Vaskovsky V.I., Ziganshin R.H., Ivanov V.T., Kokoz Yu.M., Povzun AA., Kolaeva S.G. // Neokyotorphin from the brain of hibernating ground squirrels and its specific biolocal activity. J. of Cellular Biochemestry, Supplement 14C, 1990, p. 244

6. Сухова Г.С., Левашова В.Г., Крамарова Л.И., Свиряев В.И., Зиганшин Р.Х., Колаева С.Г., Михалева И.И., Повзун А.А. //Кардиотропная активность пептидных препаратов из тканей гибернирующих сусликов , ДАН СССР, раздел Физиология, 307, N6,1512-1514, 1989.

7. Зиганшин Р.Х., Михалева И.И., Свиряев В.И., Васьковский Б.В., Кокоз Ю.М., Повзун АА., Иванов В.Т. //Пептидные регуляторы внутриклеточного транспорта Са2+ и К+, выделенные из мозга зимоспящих сусликов и их роль в механизмах зимней спячки, Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума по химии пептидов, 1990, стр. 16.

8. Сухова Г.С., Игнатьев Д;А., Ахременко АК., Левашова В.Г., Михалева И.И., Свиряев В.И., Ануфриев АИ., Зиганшин Р.Х., Крамарова Л.И., Гнутов Д.Ю., Колаева С.Г., Ашмарин И.П. // Кардиотропная, гипометаболическая и гипотермическая активность пептидных фракций из тканей зимоспящих и холодоадаптированных животных. Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 1990 г, т. 26, N 5, стр. 623-629

9. Зиганшин Р.Х., Михалева И.И., Свиряев В.И., Васьковский Б.В., Кокоз Ю.М., Повзун А.А., Алексеев А.Е., Сухова Г.С., Гурская И.Е. //Биологически активные пептиды, выделенные из мозга гибернирующих сусликов, и их роль в механизмах зимней спячки., Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума : "Механизмы зимней спячки", стр. 47-48, 1990, г. Махачкала.

10. Ziganshin R.H., Svieryaev V.I., Vaskovsky B.V., Mikhaleva I.I., Ivanov V.T., Kokoz Yu.M., Alexeev AE., Ignatiev D.A., Kruman I.M. Sukhova G.S., Emelyanova T.G. //Bioactive peptides from the brain of hibernating ground squirrels and their

possible participation in hibernation mechanisms, Abstracts of the Symposium "Structure and function of regulatory polypeptides, Moscow, 1992, N1, p.90.

11. Сухова Г.С., Левашова В.Г., Игнатьев Д.А., Михалева И.И., Крамарова Л.И., Свиряев В.И., Сухов В.П., Зиганшин Р.Х., Колаева С.Г., Ашмарин И.П. //Кардиотропная активность пептидных фракций из тканей зимнесшпцих животных, В сборнике: Эколого-физиологические характеристики природных гипометаболических состояний, стр. 125-132.

12. Покровский В.М., Осадчий О.Е., Шейх-Заде Ю.Р., Свиряев В.И., Васьковский Б.В., Зиганшин Р.Х., Михалева И.И. //Ваготрогшое действие пептидов, выделенных из мозга гибернирующих пептидов, Физиологический журнал им. И.М. Сеченова, т.78 №4, 1992, стр. 26-31.

13. Зиганшин Р.Х., Свиряев В.И., Васьковский Б.В., Михалева И.И., Иванов В.Т., Кокоз Ю.М., Алексеев А.Е., Корыстова А.Ф., Сухова Г.С., Емельянова Т.Г., Усенко А.Б. //Биологически активные пептиды, выделенные из мозга зимоспящих сусликов. Биоорг. химия, 1994, № 8-9, cip. 899-918.