Синтез и некоторые биологические свойства низкомолекулярных железосодержащих иммуноактивных пептидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

На нравах рукописи

ШШЗ й НЕКОТОРЫЕ ШОЯОШШШ шоШш ШШО-

зб

(Специальность 02.00.03 - Органическая химия)

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата химических наук

академик АН Республики Таджикистан, доктор медицинских наук, профессор ХЩ4Р0Б Ж Д. кандидат химических наук ВОЗДЕВ Г.М.

1999

СОДЕРЖАНИЕ

а. даведотай опор..................................... . а

2.1. Вщделеше и биологические функции тицусных гормонов....8

2.2. Синтез, биологические свойства тимозинов ш их аналогов.18

2.3. Синтез, биологические свойства координационных соединений аминокислот и пептидов с металлами..,............26

3. Ойвдрщ шю....................................29

3.1. Синтез пептидов........................................29

3.2. Синтез координационных соединений триптофансодертшцих дипептадов с ионом Ре^4*................................47

3.3. Биологические исследования.............................54

3.3Д. Биологическая активность полученных соединений.......54

3.3.2. Биологические свойства препаратов, разработанных на основе синтезированных соединений....................56

3.3.3. Применение триптофансодержащих пептидов в медицине...63

4. 'аИСШИШЕВШШЯ ЧШ£Ь..................................68

ВШОда......................................................86

штРШРЛ..................................................87

ИЖШШЕ.................................................Д09

Т)&я - об, «зС-диметил-З^-диметоксибензилоксикарбонил 2 - бензилокеикарбошил Вое - трет-бутшшксикарбонил

ОЗи - Ж -ОКСИСуКЦЙНЙМИДИЛ

Вй1 - бензил

ОМе - сложноэфирная метальная группа

0Ви^ - трет-бутйльная сложноэфирная группа

РДЗК - реакция длительного связывания комплемента

Й14 - имцунофе рментный анализ

РШ - рентгенофлюорографичеекие исследования

БШХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ВВЕДШИЕ Актуальность проблемы> Главную роль в процессе формирования и регуляции иммунного ответа играет тимус, осуществляющий свои функции посредством выделяемых им гормонов. К настоящему времени выделены и охарактеризованы такие тимусные гормоны как тимозины, тимопоэтины, сывороточный тимусный фактор, оказываюшре при введении в организм иммуностимулирующее и имцун о модули рующе е действие. Применение их в медицинской практике позволяет значительно повысить эффективность и сократить срок лечения различных заболеваний, а в случае имцунодефицито в - даже заменить традиционные препараты. Однако незначительное содержание их в животных организмах, сложность выделения и химического синтеза ограничивают их широкое применение в медицинской и ветеринарной практике. Поэтов весьма актуальным является поиск низкомолекулярных пептидов, обладающих активностью тиь^сных гормонов. К настоящему времеш уже определены активные центры тимозина тимопозтинов I, II и III, сывороточного тимусного фактора. Выделен дипептид H-Glu-Tip-OH , обладающий активностью тимозина сС j.

Наличие в составе дипептида H-Glu-Trp-OH полифункциональных аминокислот делает необходимыми стадии введения и удаления защитных групп боковых функциональных групп аминокислот, что в случае триптофана может значительно осложнять синтез. Поэтому поиск путей синтеза триптофансодержащих пептидов, позволяющих осуществлять его без введения защитных групп в остаток триптофана, а также без вцделеная и очистки промежуточных соединений является достаточно актуальным. Также актуальным является поиск низкомолекулярных пептидов, обладающих большей, чем дипептид н-Glti-Trp-Cil j биологической активностью.

Большое значение для живого организма имеет такой металл как

железо, участвующий во многих жизненно важных процессах организма. Поэтому получение н изучение биологической активности координационных соединений железа с низкомолекудярныш иммунсактив-ныш пептидами позволив значительно расширить спектр применения последних. В связи с этим поиск методов получения и изучение биологической активности таких координационных соединений также является весьма актуальным.

Поскольку почти каждое заболевание человека и животных сопровождается нарушениями функционирования именной системы организма, то является актуальным изучение возможности применения шзкомолекулярных иммуноактквных пептидов при их лечении с целью повышения его эффективности и сокращения срока.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является поиск наиболее оптимальных путей синтеза триптофанеодержащих им-муноактивных дипептидов, синтез гибридных аналогов бурсина и ди-пептида н-сии-шгр-он, получение ко о рди наци о нных соединений шзкомолекулярных иммуноактивных пептидов с ионом и изучение их биологической активности с целью применения при лечении различных заболеваний человека и животных.

Дая достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

- разработать методику синтеза триптофанеодержащих дипептидов без выделения из реакционной смеси и дополнительной очистки промежуточных соединений с использованием триптофана без защиты оС-карбоксильной и индольной групп и синтезировать разработанным способом ряд триптофанеодержащих дипептидов;

- провести синтез гибридных аналогов бурсина и дипептида н-йХи-шгр-он ;

- получить координационные соединения триптофанеодержащих да-

пептидов с ионом

- изучить биологические свойства синтезированных дипептидов и полученных координационных соединений.

Наущая новизна. Впервые триптофансодержащие иммуноактивные дипептиды пожучены без выделения ж дополнительной очистки промежуточных соединений с использованием триптофана без защиты карбоксильной и ивдольной групп. Синтезированы новые аналоги бурсина и дипептида н-йХи-Тгр-он . Показано, что при взаимодействии триптофансодержащих дипептидов с ионом происходит образование координационных соединений, в результате чего увеличивается биологическая активность исходных дипептидов.

Практическая значимость. На основе триптофансодержащих им-ьгуноактивных дипептидов разработан иммуностимулирующий препарат тимогар, применение которого совместно с традиционными лекарственными препаратами сокращает срок и увеличивает эффективность лечения заболеваний животных и человека. На основе координационных соединений триптофансодержащих дипептидов с ионом разработан иммуностимулирующий препарат ферунол, который применяется в ветеринарии.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены, обсуждены и одобрены на международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию со дня рождения одного из основателей Таджикского технического ушверситета Сулейманова Абдул-хая Сангиновича (Душанбе, 1998), республиканской конференции яШи-зиолого-биохишческие основы продуктивности растений" (Душанбе, 1998), юбилейной научно-теоретической конференции, посвященной 50-летиго ТГШ" (Душанбе, 1998), республиканской конференций "Вклад ученых биологов в развитие биологической науки в Таджикистане"

Публикации, Но материалам диссертации опубликовано 16 работ.

Объем и структура диссертации, ^ссертация изложена на Ц5 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, практических предложений, выводов, списка литературы, содержащего 187 источников, из них 84 отечественных и 103 зарубежных авторов и приложения.

2.1. Вьщеление и биологические функции тимусных гормонов.

К настоящее времени не только установлена центральная роль тимуса в развитии, становлении и функционировании ишунной системы, но и обнаружено, что эту функцию тимус выполняет посредством веществ, которые синтезируются в железе й часть из которых секретируется и обнаруживается в крови человека и животных /36, 62/. Таким образом, тимус также представляет собой эндокринный орган, который контролирует развитие, дифференциро вку и созревание Т-лимфоцитов и с помощь© этих клеток регулирует иммунный ответ /111,122,146,147,161/. Многие из выделенных иммунологичес-ки активных веществ тимуса имеют пептидную природу. Знание химической структуры которых дает возможность детально исследовать многие молекулярные механизмы, лежащие в основе развития, становления и функционирования иммунной системы.

Ввделение тишческих факторов шло двуш путями из-за существования двух гипотез. А.Гольдштейн выдвинул идею о синтезе нескольких тимичееких факторов, участвующих в процессе Т-кле-точной дифференцировки на разных уровнях процесса созревания /176/. Другая группа исследователей вслед за Комеа /110/ придерживается того мнения, что тимус продуцирует один фактор, который выполняет все иммунологические функции тимуса /53/.

Из тимуса /119,121/ и сыворотки крови /97,98,102,159/ в разное время было выделено большое количество иммуноактивных веществ, имеющих пептидную природу. Вее эти пожиевтщды изучались в различных тест-системах и находятся на разных стадиях охарактеризовать

В 1975 г. в лабораторий А.Гольдштейна был ввделен биологи-

чески активный препарат тимуса, названный тимозин фракция § Сти-мозин <55) 7171/, состоящий из группы полипептидов е молекулярными массами от 1000 до 15000 дальтон. При изоэлектрическом фокусировании выявляется более 30 компонентов /169/. Условно били выделены три зоны: об'-область - пептиды с р1 ниже 5,0; ^-область - р1 5,0-7,0; ^-область - р1 выше 7,0. Кроме того, по мере выделения каждому пептиду присваивается соответствующий порядковый номер ($ X» р ZVL дологически активные полипептиды получили название тимозины. Тимозин фракция 5 активен во многих биологических тестах /114/. Выло показано, что она частично или полностью восстанавливает иммунные функции у животных и людей с иммунодефицитом и онкологическими заболеваниями /102,114,171/.

Первым пептидом, обладающим высокой биологической активностью, ввделенным из тимозин фракции 5 с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии, был тимозин (С | /169/. Лоу и др. /137/ сообщили о вьзделении этого же пептида из свиной, бараньей и человеческой тимозин фракции 5 с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ. Анализ фракций, полученных этим путем, на содержание тимозина с£ показал, что иммунореактивный пик совпадает с временем выхода бычьего тимозина сС ^ /131,137/. Также сообщалось /107/ о выделении тимозина оС| из человеческой крови с использованием ультра-фильтрации и иммуноаффинной хроматографии. Значение изоэлектрической точки (р1) тимозина оказалось равным 4,2 /169/. Была определена аминокислотная последовательность тимозина £^ /143/. Оказалось, что он состоит из £3 аминокислотных остатков, я -концевая аминогруппа тимозина сС-^ блокирована ацетильной группой, молекулярный вес - 3X08 дальтон. Обращает на себя внимание тот факт, что в последовательности тимозина сС ^

имеются 6 повторяющихся аминокислотных остатков: в положении 3-4 Ala-Ala, 8-9 - Ser-Ser , 12-13 - Thr-Thr, 19-20 - Lys-Lys , " 22-23 - Yal-Yal , 24-25 - Glu-Glu (рис.1). Значение этих повторений пока неясно. При исследовании биологической активности тимо-зина d-j было обнаружено, что он преимущественно действует на протимоциты с образованием Т-хелперных клеток /145/. Тимозин cXTj в 10^1000 раз более активен, чем тимозин Ш5, однако, во многих тестах он не проявляет биологической активности /114/.

Хорекер и др. /179/ показали, что тимозин tCj_ действительно синтезируется в тимусе. Они также предположили, что он синтезируется как длинная пептидная цепь с молекулярным весом I6G00 дальтон а процессируется или деградирует с образованием пептидов, определяемых в тимусе.

Из сС--области тимозин фракции 5 бшю выделено еще два полипептида, обладающих биологической активностью и названных тимози-наш (Xg и Х7 /174/. Эти два гормона являются сильно кислыми полипептидаш и их изоэлектрические точки равны 3,5. Молекулярные веса тимозина и аС^ равны, соответственно, 3000 и 2000 дальтон. При исследовании биологической активности этих гормонов было обнаружено, что они являются возможными ивдуктораш супрессорных клеток у мышей и активаторами при ивдцировании Т-клеточных маркеров /114,145/. Также было показано, что тимозин ¿Су супрессирует продукцию ^-интерферона m vivo у мышей С 57 BL/6 /177/.

1з тимозин фракции 5А был выделен так называемый полипептид J) J /169/, состоящий из 74 аминокислотных остатков и имеющий молекулярный вес 8451 дальтон ш изоэлектрическую точку, равную 6,7 /143/. Так как этот полипептид оказался неактивным во многих иммунологических тестах, его не включают в число ти-

щуснмх гормонов.

Из этой же тимозиновой фракции были выделены два полипептида, названные тимозинами jJg и /142,174/. Тимозин ji 4 был также выделен из тимозин фракции 5 /142/. Выход тимозина шз тимозин фракции 5А составил а из тимозин фракции 5 -

0,45%. качения изоэлектрических точек тимозина f g и ^ равны, соответственно, 5,2 и 5,1, а молекулярные веса - 5550 и 5250 дальтон, соответственно* Подобно тимозину $5 оба этих гормона влияют на стволовые клетки, превращая их в протимоциты /128/, а тимозин J3 4 также ингибирует миграцию макрофагов /134/. Анализ аминокислотной последовательности тимозина J3^ показал, что он состоит из 43 аминокислотных остатков и имеет молекулярный вес 4963 дальтон и, как тимозин ct р содержит на н -конце ацетильную группу. Очень интересной является внутренняя дубликация в аминокислотной последовательности тимозина j3 ^ между остатками 18-30 и 31-43 (рисД). Недавно в одной из работ ставилось подсомнение, что тимозин jj 4 является производным только тимуса, так как он был обнаружен в селезенке, головном мозге, легких, печени и сердечной мышце крыс и мышей /178/.

Тимозины р q и р д были ввделены в 1982 г. из тимозин фрак-щи 5 /124/. При анализе аминокислотной последовательности этих пептидов было обнаружено, что они гомологичны тимозину /124/. Из 38 аминокислотных остатков тимозина jj q 31 аминокислотный остаток идентичен соответствующим аминокислотным остаткам тимозина 4. Тимозин J3 9 является идентичным тимозину J3 3, но у него на карбоксильном конце присутствует добавочный дипептид с последовательностью Ala-Lys-OH . Аминокислотные последовательности этих пептидов также показаны на рисЛ. Биологические функции тимозинов ji q и J> g еще не определены.

Среди тимозиновых пептидов были обнаружены гормоны, названные тимозинами J3 jq, j3 ^ , J> ц, гомологичные тимозину jjСтепень гомологии тимозина jq, состоящего из 42 аминокислотных остатков, с тимозином j3 4 составляет 74% - с I по 42 аминокислотный остаток /175/. Степень гомологии тимозина JJjq. Arg , состоящего из 43 аминокислотных остатков, с тимозином J3 4 составляет 75% /155/. Ташке был вьщелен пожпептид, состоящий из 41 аминокислотного остатка и названный тимозином ß ц* Его степень гомологии с тимозином J} £ составляет 80% - с I по 41 аминокислотный остаток /127/. Аминокислотные последовательности всех тимозиновых полипептидов представлены на рис.1.

Сообщалось о выделении двух полипептидов, названных тимо-зинами di 11 /118/ и имеющих очень высокую степень

гомологии с тимозином ocj.

йз свиной сыворотки в 1977 г. был выделен гормон, названный тимулином или тимусным фактором /136,159/. Он был также вьщелен из сыворотки крови человека /141/. Прямое доказательство присутствия еывороточного фактора в тимусе было получено с помощью различных методов, использующих вьщеление из тимусных экстрактов /115/, Присутствие тимулина в тимусных эпителиальных клетках было доказано иммунохишчески с использованием ксеноантисыворотки несколькими исследователями /105,132/, а также с помощью мо-ноклональных антител /129,173/, отобранных по их способности ки-гибировать биологическую активность сывороточного фактора in vitro и in vivo /149/.

Молекулярный вес сывороточного тимусного фактора оказался равным 847 /159/. При анализе его аминокислотной последовательности было показано, что он является 9-члешшм пептидом с последовательностью H-Gl ü-Al a-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-OH /129,

160/, причем аминокислотные последовательности этого гормона, выделенного от свиней, телят и человека, являются идентичны-

Дарденне и др. /III/ было показано, что этот гормон может находиться в двух формах, одна из которых является биологически активной, а другая - биологической активностью не обладает. Главным отличием этих двух форм является то, что в соетав биологически активной формы входит цинк /106/, Шло показано, что цинк присоединяется к тимулину по ji-C0M2 группе аспарагина, находящегося в положении 9. При изучении биологической активности сывороточного тщусного фактора было показано, что он усиливает генерацию эффекторных Т-клеток и ингибирует контактную чувствительность у шлей /III/.

Г.Гольдштейном с сотрудниками из тщсв, получены и полностью охарактеризованы по аминокислотной последовательности два пептида - тимопоэтин I ж тимопоэтин II /121,156/. Тймопоэтйны содержат 49 аминокислотных остатков, имеют молекулярный вес 5562 дальтона и изоэлектрическую точку, равную 5,5. Они отличаются только двумя аминокислотными остатками в положениях I и 43 /132, 156,173/. Тймопоэтйны I и II были идентифицированы в экстрактах тимуса по подавлению нервно-мышечной проводимости у крыс /120/. йозднее было показано, что тймопоэтйны индуцируют in vitro экспрессию некоторых антигенов Т-лимфоцитов на поверхности стволовых клеток и усиливаю�