Синтез и структурно-функциональное исследование иммуноактивных пептидов ряда тимопоэтина, тимозина и бурсина тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

Бобиев, Гуломкодир Муккамолович АВТОР
кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
Душанбе МЕСТО ЗАЩИТЫ
1996 ГОД ЗАЩИТЫ
   
02.00.03 КОД ВАК РФ
Автореферат по химии на тему «Синтез и структурно-функциональное исследование иммуноактивных пептидов ряда тимопоэтина, тимозина и бурсина»
 
Автореферат диссертации на тему "Синтез и структурно-функциональное исследование иммуноактивных пептидов ряда тимопоэтина, тимозина и бурсина"

На правах рукописи

и ил .

ы

ВОБИЕВ ГУЛОЖОДИР МУККАМОЛОВИЧ

ЭДГ547 Ж6. • 547.96

синтез и структурно - функциональное исследование 'иммуноактивных шятвдов ряда тймопоэтина, жозина

и БУРСША.' ( 02.00.03 -. Органическая хкшя )

автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических нау:с

ДУШАНБЕ - 1996

Работа выполнена в Институте экспериментальной кардиологии ВКНЦ Российской Федерации, научно-исследовательской лаборатории кафедры органической химии Таджикского Госуниверситета, МП "ЗАВД".

Научные руководители: кандидат химических наук, Генеральпый'директор ВИЦШ "Пептос" Дейгин Б.И.; доктор химических наук, профsnoop, заведующий кафедрой органической химии ТПУ Халиков Ш,Х,

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторной химии природных соединений Института химии им. Ь.И. Никитина Ali Республики Таджикистан Буриченко В.К.

кандидат химичбских наук, доцент кафедры химии ДГАУ' Каримов Г.К.

Ведущая организация: Душанбинский Государственный педагогический университет им. К. Джураева.

Защита диссертации состоится " — 1996 г,

в /¿у часов на заседании диссертационного совета Д.013.02.01 по заците диссертации на соискание ученой степени доктора наук в Институте химии им. В.И. Никитина АН Республики Таджикистан по адресу: 734063, Душанбе, ул. Айни, 299/2.

С диссертацией мочено ознакомиться в библиотеке Института химии им. В.И. Никитина АН Республики Таджикистан.

Автореферат разослан

Тл

Ученый секретарь диссертационного сонета /¡1/У1Ш Воронцова М.Д.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. После установления главной роли тимуса в формировании и регуляции иммунного ответа организма,были начаты интенсивные исследования по вьделению и изучению структуры тимусных гормонов. Из различных фракций экстрактов тимуса были выделены такие тимусные гормоны,как тимолнн.тимопоэтин,сывороточный тимусннй фактор,бурсин. Данные гормоны благодаря своей биологической активности,привлекли большое внимание исследовате-» 1 лей.

Было установлено,что эти пептиды при введении в организм являются весьма э£фективннш при устранении различных £орм иммуноде-(£ицитов. Поэтому их применение в качестве лекарственных препаратов при лечении таких заболеваний является очень перспективным.

• Однако,использование их для этой .цели ограничено небольшим содержанием в животных организмах и сложностью вьщеления.Химический синтез этих горкомов так^е 'представляет собой елочную практическую задачу,так как их молекулы состоят из большого количества аминокислотных остатков.Поэтому в настоящее время ведутся интенсивные исследования по определе-ни» местоположения активных участков их молекул и выявлению различных структурно-^унщюна чь-ных зависимостей в ряду этих гормонов с целью поиска более коротких пептидов,обладающие биологической активностью,присущей этим гормонам.

К настоящему времени' уте выяснено,что активным г(ентром молекулы тимопоэтина является фрагмент, 32-36,представляющий собой пентапептид с последовательностью 'Н-Агя-1.уз-Азр-Уа1-Туг-ОН. Биологически активной частью молекулы тимозина ^является С-ксн-цевяя часть, стэечащая остаткам 15-2о.Было синтезировано большое ччао пептидных аналогов активных участков этих гормонов,но до сих пор не удалось до конца выявить обдпе последовательности п минога: здот и обобщить какие-либо структурные особенности .которые являются необходимыми для обеспечения их специфической '.'активности. Поэтому разработка путей хи№ чес кого синтеза данных гормонов ■ и проведение структурно-функ^юнальных исследований и и к роду . имеет большое теоретическое и практическое значение. С теоретической точки зрения данные исследования помогут выяснить, механизм действия гормонов,а с практической - приведут к созцпшго :><?-•7дктилннх лекарственных црепзрат'з» для лечения рлячкчпых ,-уорм иммунодефиците?. и гомологических ппболсвяний.

Цель и задачи исследований. Основной целью настоящей работы

являлся синтез и изучение биологической активности тимопентина--пентапептида с последовательности) Н-Агг-Ьуя-АЕр-Уа1-Туг-0Н, представляющего собой фрагмент 32-36 молекулы тимолоэтина и являющегося ее активным центром и его аналогов: ди-,три-,тетра- и пентапептидов,обладающих активностью тимозинасЦ : бурсина -три-пептида о последовательностью Н-Ьуя-Н1Е-а1у-!га2 и его гибридного аналога с дипептидом Н-а1и-Тгр-ОН, облачающего активностью тимозина <зС 1 •

Для достижения этой цели необходимо было решить следурзие задачи:

- разработать оптимальные схемы синтеза пептидов, получить тимо-пентин и его аналоги;

- провести синтез дипептида н- С1и-Тгр-0Н, обладающего активностью тимозинаоЦ и его дипептидных аналогов,заключавшийся в получении свободных дипептидов без выявления п5>одуктов реакции конденсации из реакционной смеси и их очистки;

- наиболее оптимальным вариантом синтезировать бурсин и его гибридный аналог с дипептидом Н-С1и-Тгр-ОН со следующей аминокислотной последовательности) н-1уя-н1в-с1у-л"гнг-тгр-с1и-н;

- изучить физико-химические свойства полученных пептидов;

- изучить биологическую активнооть синтезированных пептидов в тесте Е-роэеткообразования лимфатических клеток.

Научная новизна. Впервые для синтеза тп юпентина был использован метод активированных эмиров,который позволил увеличить выход реакции конденсации на какдой стадии на 1Ь-2Ь7.Правильный выбор защитных групп позволил значительно упростить стадии деблокирования и очистки конечных продуктов.Впервые сикте,.:;.овакы новые пятичленпые и шестичленные пептидные аналоги тимопентина. Синтезирован ряд аналогов дипептида н-с1и-Тгр-ОН, обладающих активноотью тимозинаоЦ . Разработан метод синтеза,позволяющий получить конечные свободные дипептиды без дополнительного выделения защищенных дипептидов и их очистки из реакционной смеси. Впервые синтезирован гибридный аналог бурсинас целью изучения Т- и В-клеточной активности.Установлено,что некоторые испытуемые пептиды обладают гормональной активностью и участвует в дк^е.'енциации Т- и В-клеток.

- з -

Практическая значимость. Разработаны методические подходы в оценке иммуномоделирущих синтетических препаратов-аналогов аминокислотной последовательности тимопентина и тимозина оЦ .Разработанные оптимальные зарианты синтеза пептидов применяются в настоящее вреуя для выполнения аналогичных исследований с другими типа!м тимусных пептидов. На основе синтезированных пептидов получены экспериментальные образцы,обладащие активностью тимопоэтина и тимозина ., •

Положения выносимые на задиту.

- Синтез тимопентина методом активированных эмиров с использованием по выбору защитных групп позволяющий увеличить выход промежуточных и конечных продуктов и упростить процесс их очистки.

- Синтезаналогов тимопентина методом' активированных э^ров со следующей аминокислотной' последовательностью: Н-А^-Ьуэ-С1и--Уа1-Туг-ОН, Н-А^-1уз-Аяр-Уа1-Тгр-0Н, Н-АГ5-Х-уз-С1и-Уа1-Тгр-0Н, Н-Агв-Ьуя-Авр-7а1-Гуг-Агв-0Н.

- Результаты исследования биологической"активности синтезированных тимопентина и его аналогов в тесте Е-розеткообразования клетки по сравнении с биологической активностью тимопентина.

- Использование для синтеза дипептида Н-Я1и-Тгр-ОН карбодиимг-да с применением нуклео^ильной добавки 1-бензотриазола позволило получать свободные конечные дипептиды с выходом 80-9СЙ.

- Синтез три-,тетра- и пентапептидных аналогов дипептида И-Ич-- Тгр-ОН методом активированных эфиров.

- Еиологкческая активность дипептидов н-Ии-Ггр-ОН.Н-Ие-Тгр-ОН, н-с1и(Тгр-он)-он, пиро-51и-Тгр-он,н-А8р-тгр-он в тесте Е-розет-

кообразования клеток составляла 100,100,50,40 и 30%,соответственно.

- Синтез бурсина-рипептида р последовательностью Н-Ьуз-Н1в-С1у-?гя2 путем ступенчатого наращивания пептидной цепи начиная с N-конца ,

- Синтез гибридного аналога бурсинв и дипептида Н-С1и-Тгр-ОН с . последовательностью н-ьув-н1в-с1у-и2н„-тгр-с1и-н.

Апробация работы. Результаты диссертации были доложены,обсуждены и одобрены на 1-й Всесоюзной конференции по биорегуляторам (Ленинград,1Й17), УИ Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пе- * птидов(Таллинн,1937), Республиканских научно-практических конфе-

ренциях молодых ученых и специалистов(Душанбе, 1967,1989).научной конференции "Теоретические и прикладные проблемы химии"(Душанбе, 1995) .научной конференции,посвященной 50-летию Института химии им.В.И.Никитина АН Республики Таджикистан(Душанбе,1996)

Публиками. По материалам диссертации опубликовано II работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 12(2 страницах машинописного текста,состоит из введения,обзора литературы, об суждения результатов,экспериментальной части.выводов и списка литературы,включающего 126 источников,из низ 2 отечественных и 124 зарубежных авторов.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Пептиды. Тимопентин и его аналоги были синтезированы методом активированных эфиров путем ступенчатого наращивания пептидной цепи начиная с С-конца. В качестве активированных эфиров были использованы п-нитрофениловые и М-оксисукцинимидные эфиры. Пептид н-01и-Тгр-0Н и его дипептидные аналоги были синтезированы карбодиимидным методом с использованием нуклеофильной добавки 1-гидроксибензотриазола без выделения защищенных дипептидов из реакционной смеси и дополнительной очистки деблокированных дипептидов с помощью ВЭМХ. Три-,тетра- и пентапептидные аналоги дипептида н-СХи- Тгр-он синтезированы методом активированных эфиров путем ступенчатого наращивания пептидной цепи начиная с С-конца. Бурсин был получен методами активированных эфиров и смешанных ангидридов путем наращивания пептидной цепи начиная с N -конца. Гибридный аналог бурсина и дипептида Н-С1и-Тгр-ОН был получен методом смешанных ангидридов при конденсации гидрази-да трипептида 2-Ьуя(г)-Н1а-С1у- тШд и дипептида Ъ- 01и(0В^)--Тгр-ОН.

Для защиты ¿и и ¿-аминогрупп использовались ъ- и Воо-защи-тныегруппы. Карбоксильные группы были защищены путем превращения их в метиловые,этиловые и трет-бутиловые эфиры. При синтезе ди-пептидных аналогов пептида н-С1и-Тгр-ОН карбоксильные группы аминокомпонентов были защищены путем солеобразования с использованием в качестве основания триэтиламина. При синтезе дипептида Н-С1и(Тгр-ОН)-ОН сО -С00Н группу ^-трет-бутилового эфира кар-бобензокеиглутаминовой кислоты защищали с помощью 9-флуоренил-каг.5с;:ильной защитной группы. При синтеее бурсина а£-СС0Н группу

гистидина защищали путем солеобразования с помощью тритона Б.

Карбобензокси- к бензильиую группы удаляли каталитическим гидрированием над Ю-ннм Vf/С. Трет-бутилоксикарбонильную и трет-бутильнуя группы снимали действием смеси трифторуксусняя кислота-анизол-метилзтилсуль^ид (424:60:2Ь)или действием сухого бромис.то-> го водорода в растворе три*торуксусной кислоты(для дипептида Вос-Туг(Боо)-Агд-ОН при синтезе гексапептидного аналога тимопсн-тина). ¡¿етиловие и этиловые э^ирн омыляли щелочным гидролизом действием 1н тствора NaOH и течение суток на холоду или 10-ным раствором nèÇjCO-,b течение часа(для пептидов,содержащих С- концевой остаток триптофана).

2.2.Очистка свободных пептидов. Тимопентин очищали колоночной хроматографией на колонке,заполненной сефадексом G-I0.Аналоги тимопентииа очищали с помоью B3iX на колонке 160x20мм, заполненной обращенно-г[азовъи силикагелечСиласорб Cj^ в градиенте этанол-ацетатаммоннйного буфера.

Очистку дипептиднкх аналогов пептида H-Glu-ïrp-Olî jairee осуществляли с пошью ВЭлХ на обращеш-ю-фпзовой колонке( IGGx2ômm) заполненной си лики гелем ^Сил-чсорб Ср в градиенте ацетонитрил-ацетатлииопнЛного буфера СрН б,Ь) от 10 до ¿>0% при скорости потока 14мл/|-жн, при длине волны 220нм.

f Для очистки бурелна такче использовали ВЭЖХ на коленке(160х 35мм).заполненной обраденно-$азовым силикагеяем Силаеорб Cjg в 0,0IJ-hom растворе трифторуксусной кислоты в градиенте метанола от 5 до 70% при длине Волны 254нм. Аналитическую ВЭйХ проводили на колонке Ultro3phere-ODS(4,6x50 мм, 5мм):

2.3.Определение биологической активности. Биологическую активность синтезированных пептидов определяли в тесте Е-розетко-образования ктзтки по методике,использованной At>iko et al.,1980.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1.Синтез тимопентина и его анаюгов. На первом этапе работы было необходимо синтезировать пентапяптид с последовательностью H-Arg-lyd-Aap-Val-Tyr-OHпредставляющий собой активный ' центр молекулы тимопоэтина и имитирующий-последовательность -32-36 этого гормона.Синтез был осуществлен по схеме,приведенной г га рис.1.

Выход продуктов реакции на стадиях конденсации достигал 60-

- 6 -

90%(рис.1), за исключением стадии конденсации п-нитрофенилового эфира трикарбобензпксиаргинина с защищенным тетрапептидом Н-Ьуа (Бос)-Аяр(0Ви^)-Уа1-Туг-СИ , на которой выход составил 55%.

При данном выборе защитных групп пептиды после деблокирования -аминогрупп вводились в реакцию конденсации без выделения, что позволило избегать дополнительных стадий очистки промежуточных пептидов и упростить очистку конечного свободного пентапепти-да и избегать потерь на этой стадии,выход конечного продукта на которой составил Т/%.

• 1уя

Н-

-ОЗр н-

Аар

Ъ—

' Вое

Бос

Воо

ЧЭое

Уа! »уг -ОЗи Н-— 02

05 и НОВи*

ОЗи

ОЗи

"-О

1Ви

'ОВи

ОВи

ОВи*

овг

0Е4

оях

03 ь

он

он

ОН<55£) он

ОНПП)

Рис Л. Схема синтеза тимопентина.

Здесь не был получен тетрап.ъг.тидний фрагмент 33-36 тамог.оэ?»:-на с последовательностью Н-ЬуЕ-Аяр-Уа1-?уг-0Н.

С целью модификации тимопентина был синтезирован его аналог, в котором остаток тирозина был замещен остатком триптофана. Схема синтеза данного пентапелтида приведена на рис. 2. Как и при синтезе т'люпентина пептиды после .удаления ЯН^задитных групп вводились & реакцию конденсации без выделения.

С цельи проведения структурно-функциональных исследований был синтезирован гексапептидгшй аналог ткмопентина, к С-концу которого был добавлен остаток аргинина. Синтез был осуществлен по схеме,приведенной на рис.3. Использование С-концевого остатка аргинина без защиты гуанидиновой и карбоксильной групп значительно упрощало весь процесс получения пептидов,поскольку исключается трудоемкая и часто плохо воспроизводимая стадия введения и удаления защитных группировок на гуанидиновую и карбоксильную группы аргинина. Кроле того, известную трудность представляет очистка Н-за^иЩенных пептидов,содержащих С-концевой остаток аргинина с блокированными гуанидиновой и карбоксильной группам!. Эти трудности связаны с высокой гигроскопичностью леп-

Атт;

нИ-

Ъуз

'Азр

Уа1

7,2-

-ОНр н-

\

ОЭи I!-----

Вое

Все '

Вое

'Вое

7,-

-ОЗи Н-' ОВи*

' ОВи"

тгр

-ОБи Н-

чОВи

ОВи

ОЗи

-ОВи

~"Во.с

■ОВи

—ОМв

-ОМе

-ом-

-ОМе

—ОМе

-ОМе

-ОМе

-ОМе

-ОМе -ОН

Рис.2. Схема синтеза Н-А.ге-Ьуо-Азр-Т'аЗ.-Тгр-ОН гидов, их сходной растворимостью с исходным аргинином или арги-нинсодертащими пептидами. Использование для этой цели метода последовательного переосо"щения такте обладает рядом суцейтоеи-ных недостатков. К этим недостаткам относятся: использование бользих избытков актяЕирогаН!П4Х эмиров х-зюрщенных аминокислот; многократное повторение операций очнекл^применение специально очищенных и тщатслыю ы'"^г"оннк;х растворителей;ентченне

выхода целевого продукта,связанное с механическими потерям! в процессе оседдекик фильтрования. Использование в данном синтезе аргинина со свободньми гуанидиновой и карбоксильной группами позволило избегать подобных трудностей. Активированные э^иры на стадиях конденсации использовались с избытком в 1,02-1,05 раза. Только на стадии получения гексапептида с избытком Э% был использован пентапептид. Еыходы пептидов составили 76-о(>Х. В данном случае значительно упростился процесс очистки защищенных пептидов,который проводили промыванием их н-бутанольного раствора уксусной кислотен или однократным осат^дением эфиром из спиртового раствора сразу после реакции конденсации и удаления растворителя.

Агг

Авр

Уа1

Ъ-

-0!Гр н-

2-

Ъ-

ОЗи Я-Воо .

N

Вое

Вое

Вис

г-ъ-

-05 г; Н-" ОВи^

14 ОВи*

\ г

ОВи

ОВи

ОВи"

ОВи"

Туг

Агр

Вос-Вос-

^ОКр Н-Вос

\

-ОКр Н-

Вос

-ОН

-он

-он -он -он

-он -он

—01!

-он -он

-ОН

-он

Рис.3.Схема синтеза гексапептида Н-Аге-Ьус-Аор-Уа1-Туг-Аге-ОН

'аете был синтезирован аналог тимопентина,у которого остаток аспараглновой кислоты был замещен на остаток глутамнноэта кислоты я остаток тирозина - на остаток триптофана. Синтез данного-. пептида с последовательностью Н-Аг?-Х,уз-01и-Уе1-Тгр--СК бы ' проведен по схеме,изображенной на сис.4.

Arg

Lye

Glu

Val

-OHp H-

-OSu R-•Boe

-Boc

'Boo

г—OSu H-

Nb«*

OBut

' OBu

' OBu

OBu1

-OSu H-

-OMe -OMe -OMe

-OMe

-OMe' -OMe

-OMe -OMe

H-H-

Boo

ХОВи*

Boo '

XOBu*

—OMe

-OMe -OH

Рис.4. Схема синтеза пентапептида H-Arg-Lya-Glu-Val-Trp-OH

Здесь же был синтезирован тетрапептид с последовательностью H - Lys-Glu- Val-lrp-OH,аналитическая ВЭЖХ которого для примера приведена на рис.5.

3.2. Синтез дипептида . H-Glu-Trp-OH и его аналогов.

Недавно из тимолиновой фракции экстракта тимуса был выделен дипептид H-Glu-Trp-OH .который проявлял активность тимозина«^' С целью разработки оптимзльных условий синтеза данного дипептида и проведения структурно-функциональных исследований был синтезирован этот дипептид и его различные дипептидные аналоги:

13. H-îrp-Arg-OH

14. H-Gln-Trp-OH

15. H-Gly-T rp-OH

16. H-Glu-Trp-ira2

1. H-Glu-Trp-OH 7. H-Leu-Trp-OH

2. H-Trp-Glu-OH 8. H-Lys-îrp-OH

3. H-Trp-Ser-OH 9. H-Val-Trp-OH

4. H-Ser-Trp-OH 1С. K-Asp-Trp-OH

5. H-His-Trp-OH II. пиро -Glu-Trp-OH

6. H-Ile-Trp-OH 12. H-Glu -OH

èrp—DU

Все дипептиды были получены взаимодействием активированных I-гидроксибензотриазоловых эфкрол ^-карбобензсксиаминокислот

р

- ю

со свободными аминокислотами, зС-СООН группа которых была защищена путемсолеобразования с использованием в качестве основания триэтиламина. Активированные эфиры были получены карбодиимидным методом и в реакцию коцденсацши с ашнокомпонентами вводились без выделения и дополнительной очистки.

Следует отметить,что для синтеза дипептида Н-01и(Тгр-ОН)-ОН, содержащего ^-пептидную связь,необходимо было защитить сЛ-СООН группу глутаминовой кислоты,оставив свободной при этом, ^-СООН группу. Прямой синтез защищенной таким образом, глутаминовой кислоты практически невозможен. Такое производное ыожно получить только обходным путем. Для этой цели ¿¿-СООН группу ?,-г,1и(0Ви*)--СН защищали с помощью 9-флуоренилкарбонильной защитной группы, а затем после удаления ОВи*-группы полученное производное глутаминовой кислоты вводили в реакцию конденсации аналогично другим дипептидам.

Подобный выбор защитных групп при использовании активированных э£иров в реакции конденсации в растворе в одну стадию позволил до предела упростить синтез,включая деблокирование и очистку дипептидов. После очистки и лиофилизации пептиды получали с выходом 70-90$.

Амид глутамил-триптофан был получен из защищенного дипептида 2-й1и(0Ви*)-Тгр-0Н реакцией с аммиаком в метанольном растворе на холоду в течение суток с выходом 00,4% и последующим удалением защитных групп.

С целью1 модификации пептида Н-Ии-Тгр-ОН и проведения струк-турно-функциональних исследований были синтезированы три-,тет-ра- и пентапептидные аналоги данного дипептида:

1. Н-*.гв-С1и-Тгр-0Н

2. Н-Ьув-С1и-Тгр-0Н

3. Н-Н1о-С1и-Тгр-0Н

4. Н-Ии-Тгр-Туг-ОН

5. Н-С1и-Тгр-Агг-0Н

6. Н-01и-С1и-Т гр-Т гр-ОН

7. Н-Атв-Ъуа-С1и-Тгр-0Н

8. Н-А1в-01и-Ии-Тгр-Тгр-0Н

9. Н-С1и-Тгр-С1и-Аяр-А1а-0Н

10. Н-Агв-в1и-Тгр-!Ш?

Триаептиды Н-Агв-01и-Тгр-ОН,Н-Ъуа-С1и-Тгр-ОН,Н-Н1а-С1и-Тгр-0Н

были синтезированы по схемам,аналогичным,приведенной на рис.6.

100 90

80

70 60

50 40

30 20 10

Рис.5. Аналитическая ВЭлСХ тетрепептида H-Lya-Glu-Vnl-Trp-OH на колонке Ultrasphere - ODS(4,6x25Омм, 5мм).

Выход защищенного трипептида Zj~Arg-Glu(OBu't)-Trp-OH составил 68,2?. При синтезе трипептида н-г.ур-Ми-Тгр-он -группу лизина защищали z -группой,а ¿'-МНд-группу-Вос-защйтной группой. с^-СООН группу лизина активировали превращением ее в Л-ок-. сисукцинимидный эфир. Защищенный трипептид z-Lys(Boc)-Glu(OBut)--Trp-oiie был получен с выходом 63%. При получении трипептида H-His-Glll-Trp-OH ДЛЯ конденсации С ДИПеПТИДОМ H-GIuiOEub-Trp-OH был использован я-оксисукцинимидный эфир ди-Вос-гистидина. В этом случае выход защищенного трипептида составил всего лишь 17,7^,хотя реакция конденсации велась в 1,5-2раза доль:пе,чем при по прении двух других трипептидов.

Тетрапептид H-Arg-Lys-Glu-Trp-OH был получен исходя из защищенного трипептида H-byc(Boc)-Glu(OBut)-Trp-OMe после удале- ■ ния с. 11н?-группм лизина карбобензоксизащиты конденсацией с п-нптро^сниловш эфиром трпкарбобензоксиаргштна. Выход тетрлпепти-да при этом составил 65,1%.

Трипептидн, содержащие. ¿ра-мент H-Glu-Trp с N-конца цепи

сн3он

/ > ■ ;

—у

10 20 30

Are

кн-

-Olíp

Nbu*

Trp

OSu H-

OBu

OBu

-OBu

4 OBu

-OMe

-OMe

-OMe

-OMe

-OMe -OMe -OH

Рнс.6 Схема синтеза типептида H-Arg-Glu-Trp-OH Glu Trp. Туг

H-

OSu Ht

OBu

OBu

OBu

-ONp H-

R

R

\

■OBu OBu OBu OBu OBu OBu ÖBu OBu -OBu ' OBu -OH

Рис.7. Схема, синтеза трипептида H-Clu-Trp-Tyr-OH

GjLu C}u Typ Trp

ONp H-

Z—^-OSu. H-OBu

w

^Blt.

'OBu'

•OBu'

OBu'

"OBu

-OMe -ÖMe

-OMe -OMe -OMe

-CV.E -OMe

-OMe -OH

Рис-Ç. Схема синтеза тетрапептида H-Glu-Glu-Trp-Trp-OH

G

- 1-3 -

н-С1и-Тгр.-Туг-он, н-С1и-Тгр-л^-он были синтезированы путем ступенчатого наращивания пептидной цепи начиная с С-конца методом активированных эфиров. Для примера на рис.7 приведена схема синтеза три пептида н-С1и-Тгр-Туг-он.

- Остаток аргинина при синтезе дипептида г-Тгр-Аг^-он в реакцию конденсации вводился без защиты оС-каРбоксильной и гуани-диновой групп, что позволило избежать значительных трудностей при очистке промежуточных и конечного пептидов.Защищенный дипеп-тид г-Тгр-Туг(г!Ви^)-ови{: был получен с выходом 47,

а выход дипептида з-Тгр-Агя-ОН составил Для получения трипептидов дипептиды со свободными аминогруппами вводили з реакцию конденсации с м-оксисукцинимиднкм эфиром ^-трет-бутилкарбо-бензоксиглутаминовой кислоты. Защищенный трипептид 2-31и(СЕи")--Тгр-ТугЮВи1 )-овиг был получен с выходом 70,£Й,а трипептид 2-С1и(ов\1г)-Тгр-Агг-он - с выходом 7а,

Тетрапептид с аминокислотной последовательность» Н-С1и--С1и-Тгр-ТгрОН был синтезирован согласно схеме, изображенной на р::с.о.дипептид ?.-Тгр-Тгр-ОКе был получен с выходом ЬЗ,ол.Защищенный трипептид 2-С1и(0Ви^)-Тгр-Тгр-0Ые был получен с выходом а защищенный тетрапептид г-01и(0Ви1:)-О1и(ОВиг)-?гр-Тгр-оке - с выходом 7Ъ,5%.

Пентапептид с а.минокислотной последовательностью Н-Аге-С1и-П1и~тгр-тгр-он был получен из защищенного тетрапептида н-С1и(ови4)-С1и(ози^)-Тгр-Тгр-оме и карбобензоксинитроаргини-на при использовании в качестве коеденсируххцего реагента дифенил-фосфорилазида с выходом <ЬСЙ.

Пентапептид с аминокислотной последовательностью Н-С1и-Тгр--С1и-Азр-А1а-ОН также был синтезирован методом активированных эфиров путем ступенчатого наращивания пептидной цепи начиная с С-концп согласно схеме,приведенной на рис.9.На этом же рисунке показаны выходы защищенных пептидов на каждой стадии конденсации.

3.3. Синтез бурсина и его гибридного аналога.

После выделения из бурсы Фабрициуса трипептидного гормона с последовательностью аминокислот Ьуз-Н1а-а1у-Ш0 .избирательно дифференцирующего 3-клетки,он был синтезирован твердофазным методом несколькими исследовательскими группами.Синтетический бурсин проявлял активность аналогичную проявляемой природным гормоном.

С целью разработки оптимальных путей синтеза этого пептида классическими методами пептидного синтеза в растворе был синтезирован пептид, соответствующий природному бурсину,Синтез данного трипептида был осуществлен наращиванием аминоксилотной цепи от к-конца к С-концу методами активированных эмиров и смешанных ангидридов.

Для блокирования о^ и -аминогрупп лизина и Н -аминогруппы гистидина была использована карбобензокси- защита. <Х -Карбоксильную групцу лизина активировали превращением' ее в Н-оксисукцини-мидный эфир карбодиимидныы методом в этилацетатном растворе. Ди-карбобензоксилизил-гистидин получали конденсацией 2-Ьуз(2)-03и с гистидином в диметилформамидном растворе. оС/-Карбоксильную группу аминокомпонента защищали цутем coлeoбpaзqвaния с помощью тритона В. Полученный пептвд очищали промыванием его н-бутанольного• раствора 2&-ной уксусной кислотой 'и водой.

С1и

гс°Ч1 У-

Они

•Р

С1и

ъ-ъ-

Ч

Авр

СВи НОВи

ОВи

ОВи

ч

ОВи

'ОВи

'ОВи

Ч)Ви

\ви*

А1а

г—ОЭи НОВи*

"ОВц

чГ *

Ч^

ОВи

ОВи

-ОВи

-ОВи

-ОВи

-ОВи -ОВи

-ОВи

-ОВи

вгГо

81,8%

91,655

•ОВи 88.5Й

-ОВи

-он

Рис.9. Схема синтеза пентапептида н-С1и-Тгр-С1и-А8р-А1а-ОН

Первоначально трипептид г-Ьуз(г)-Н5 з-Иу-1Ш2 пытались получить конденсацией дипептида 2-Ьуа(г )-Н1е- ОН с Н-01у-Ш2 карбодиимид-ным методом. Однако,при этом обнаружилось,что из-за участия в этой реакции имидазольного кольца гистидина,образовывалось значительное количество побочных продуктов,при удалении которых возни-

кали значительные трудности. Для того,чтобы избегать получения на этой стадии побочных продуктов и возникающих при очистке конечного пептида трудностей,данный трипептид был синтезирован с хорошим выходом по аналогичной схеме мзтодом смешанных ангидридов в пиридиновом растворе. Полученный этим путем трипептид очищали промыванием его н-бутанольного раствора 2%-ноЯ уксусной кислотой. Окончательное деблокирование трипептида было осуществлено каталитическим гидрированием. Предварительную очистку свободного амида трипептида проводили путем экстракции его н-бутанолом из водного раствора. Окончательная очистка была осуществлена с помощью ЕШХ. После лиофилизации очищенный амид трипептида был получен с выходом Ь0%.

Индивидуальность и состав полученного амида трипептида были подтверждены с помощью аналитической £ШХ и данными аминокислотного анализа.

С целью повшения биологической активности дипептида Н-а1и--Трр-он имитирующего по своим биологическим- свойствам тимозин

а таете с целью получения пептида, который бы участвовал в дифференциации как Т-клеток,так и В->клеток,был синтезирован гибрид дипептида п-Ии-Тгр-он и бурсина, имеющий следующую аминокислотную последовательность: Н-Ьуз-Н1э-01у-И2Н2-Тгр-01и-Н согласно схеме, приведенной на рис. 10.

На первой стадии синтеза этого соединения защищенный дипеп-тид с последовательностью 2-с1и(0ВиЪ-Тгр-0Ме подвергался щелочному гидролизу в мягких условиях обработкой 10^-ным раствором карбоната натрия. На следующей стадии эфир защищенного трипептида г-Ьуз(7.)-Н1а-С1у-0Ме был превращен в гидразид обычным способом. Конденсацию этих соединений осуществляли методом смешанных ангидридов,причем в качестве карбоксильного компонента fvл использован дипептид' 2-01и(0Ви*)-Тгр-0На в качестве амино-компонента-гидразид трипептида г-Ьуа(2)-Н1з-С1у-Ш-ТГН2. Реакцию конденсации проводили в смеси диметилформамид-диоксан (1:1) и времени активации карбоксильного компонента-2минуты. Время реакции конденсации составило 4 часа. Очистку защищенного продукта осуществляли промыванием его растворами бикарбоната нат-рия(0,он).,2£-ноЯ серной кислотой и водой с последующим осаждением эфиром из этилацетатного раствора. Выход защищенного продукта составил 27,2%. Карбобензокси-защитные группы удаляли

каталитическим гидрированием над 1Ш?-ным ра/С. Трет-бутильную сложноэфирную группу удаляли обработкой трифторуксусной кислотой в смеси с анизолом и метилэтилсульфидом(425:50:25). Свободный продукт очищали с помощью обраценно-фазовой высокоэффективный жидкостной хроматографии.

Ъув

\

Н-

Н18

-он

-ОЭи Н-

\

н-н-

-он Н—ом«

-он н-

Тгр

он СМй

■ ома сн3о-

-оме сн3<>-

!Ш-Ш2 Н0-

ЕиО-

t

ХОВи*

—г

'ОВи-чови*

—7, • ОВи

—н

4 ОВи*

— н

Ric.ro.Схема синтеза гибридного аналога дипептида Н-Ии-Тгр-ОН и бурсина.

Структура данного .соединения была подтверждена данными аналитической ВЭКХ и аминокислотного анализа.

3.4. Биологическая активность и структурно-функциональные исследования в ряду синтезированных пептидоЕ.

Одним из распространенных и чувствительных методов изучения иммуностимулирующей активности синтэтиеских пептидов является метод, основанный нг. наблюдениях за Е-розеткообразованием клетки . Поэтому биологическую активность синтезированных пептидов изучали именно в тесте Е-розеткообразования клетки.

Результаты, полученные при определении биологической активности синтезированных тимопентина и ег" аналогов,представлены в таблице I.

Как видно из таблицы, тетрапептидные аналоги, у которых в положении 32 отсутствует остаток аргинина, являются в этом тесте

Биологическая активность тимопентина и его аналогов*.

___Табл.1.

Последовательность синтезированного |Биологическая активность пептида 'относительно синтезитзо-_! ванного тимопентина,%

Н-Аг^-Ьуз-Аяр-Уо1-Туг-Он(тим0пентин) 100,0

H-Lya-Asp-Val-Tyr-OH 0,0

H-Arg-bys-Glu-Val-Tyr-OH , 92,3

3-Arg-Ьуз-Азр-Val-Trp-OH 5-1,0

Fi-Arg-Ly3-A3p-VQl~Tyr-Arg-0H 100,0

H-Arg-Lyo-Glu-Val-Trp-OH 4,2

H-bys-fllu-Y el-Trp-CH__;_0,0 _

полностью неактивными, что свидетельствует о необходимости присутствия этого остатка для проявления пептида?.« иммуностимулирующей активности. Этот факт согласуется о результатами,подученными с более длинньки пептидами(Abiko ei ,al., 1979) ,где было показано,что г.эптид 33—"II является полностьп неактивным и о тесте З-розеткообразования клетки и в рздиорецепторном анализе, а активность пептида 32-41 в этих тестах равна активности тимопентина.

Если рассмотреть структуру тимопентина с точки зрения наличия в нем гидрофильных и гидрофобных аминокислот,а также наличия в аминокислоттк остатках заряженных групп,то можно увидеть, что из пяти аминокислотных остатков гидрофильной является только аспарагиновая кислота, находят,алея в центре молекулы.На ГГ-конце молекулы расположены слабогидрофобные остатки( Arg,Lyo), а на С-конце - сильно гидрофобное( 7"1 ,?уг) .Причем заряженные аминокислота расположены и Я-концоь:.,! половине молскулы-дво положительно заряженные! ,\гг, , Lyn);; отрицательно заряженная ( Агр). ''сходя из этого ¡южно сделать предположение о том,что присутствие кпелотно-оензнны/. аминоксилот может влиять на биологически активность. Л^едзклая в отоЗ работе замена остатка \„р на более отрицательно заряженный и гл^рофальнк-Л остаток

4 i-аботч провоаились о Институт" Всеяно;! Ахяз&ет медииияегого vчилига ь г..Тенин гриде/Днститу-ге иммунологии

'.■//'.т.-тьч i-здерации. Гддж.НЯЗИ.

Glu .привела к получению пентапептида с меньшей биологической активностью. Замена слабокислого остатка тирозина на более гидрофобный и основной остаток триптофана привела к более сильной потере биологической активности.Две аминокислотные законы в положении 34 остатка Asp на Glu и положении 36 остатка Туг на Тгр приводит к потере более чем 50% биологической активности. Следовательно, положение 32,34 и 36 играют важную роль в проявлении аналогами тикопентина свойственной тимопоэтиначбиологичес- ' кой активности и от аминокислот,находящихся в этих положениях, может зависеть сила взаимодействия пептидов с полярными структурными элементами в липофильной среде мембраны на клеточной поверхности .

Полученные здесь результаты говорят в пользу предположения (Heavaer et al IS65), согласно которому связывание тим'опоэ-тина с рецептором более активно идет по положениям 32,34 и 36,а аминокислоты в положениях 33 и 35,возможно,включаются в основном в создание присущих молекуле изгибов, модельно совмещаемых с предварительно теоретически вычеслекиыш конф-оркациями.

С целью изучения влияния проведенных с-чмен на вторичную структуру пептидов был проведен теоретический анализ вторичной структуры уимопоэтина по методу Choy P.Y., Fasraan G.O., 1978. Профили вероятного расположения ci -спиральных, ^-складчатых участков и -изгибов в молекуле тимопоэтина приведены на pnc.II. Согласно сделанным расчетам, участок 32-36 молекулы тимопоэтина с больвой вероятностью принимает Ji-складчатую конформацию. Но классификации Чоу и Фасмана аспарагиновая кислота является индифферентно;; как к образованию ¿^-спиральных, так и ^-складчатых участков.а тирозин является разруиающим е^-спирали и обра>-зующим Jî-структуры остатком.Замена этих аминокислот на сильно ¿X/ -образующий остаток глутаминовой кислоты и ^-образующий остаток триптофана нарушает ^-структуру участка 32-36 и, как следствие этого,снижается биологическая активность аналогов тимопен-тина.

Присоединение слабогидрофобного и имеющего сильный положительный заряд остатка аргинина к С-кон"евому остатку тирозина приводит к получению гекгапептида с биологической активностью рашюЯ активности тамопентина. Вероятно, присутствие положительного заряда на С-конце тимопентина облегчает взаимодействие пептида с клеточными рецепторами,результатом чего являет-

гексагйпт/дкого анашга,сосчитанная та -.нзтоду Чэу и ïac-

ся высокая биологическая активность гексапептида. Кроме того, если рассматривать данный гексапептщ/как фрагмент 32-37 молекулы тимопоэтина у которого остаток ваяина в положении 37 заменен остатком аргинина, то с точки зрения изменения втор;.-.ной структуры(рис.11 обозначены пунктирной линией), такая замена увеличивает вероятность образования р -структуры, что также может влиять на увеличение биологической активности.

Следовательно,зависимость биологической активности от аминокислотной последовательности пептида проявляется не только на уровне первичной структуры, определяемая наличием, гидрофильных, гидрофобных и заряженных аминокислотных остатков, но и на уровне вторичной структуры, которая определяет полноту связывания пептидов с клеточными рецепторами.

Результаты исследования биологической активности синтезироп. ванных дипептидньгх аналогов пептида Н-С1и-Тгр-0Н приведены в таблице 2.

Результаты биологических исследований синтезированных дипепти,довх(3^-с!.!.стр117) Табл.2

------1-

Формула дипептида !Биологическая активность относитель-

но тимозина оЬ^, й

1. Н-С1и-Тгр-0Н 100,0

2. Н-Тгр-Ии-ОН 0,0 Н-Т'гр-5ег-0Н 0,0

А. Н-Эег-Тгр-ОН 0,0

5. Н-Н1б-Тгр-0Н 0,0

6. Н-Ие-Тгр-ОН 100,0

7. Н-Ьси-Тгр-О:! 0,0 Ь. П-Ьуз-Тгр-ОН 0,0 9. Н-Уг;1-Тгр-0К 0,0 Ю.И-Аср-Тгр-ОК 30,0

илиро--ГЛи-Тгр-ОН 40,0- "

т?.;;-г,1и-он 50,0

^гр-ОН

Как видно из таблицы, пептиды н-с;1и-тгр-0н,н-1.1с-тгр-0н , 1!-сии(Тгр-он)-он, пироС1и-Тгр-сн, и-Азр- Тгр- .он имеют актив-

¡^ость равную 100,100,50,40 и 30% активности тимозина р соответственно.

Если расположить и -концевые аминокислоты в порядке уменьшения их гидрофильности согласно данным (Иеккег Е1.Р., 1977),то можно увидеть,что при переходе от более гидрофильной аминокислоты (глутамино; ой) к менее гидрофильной(аспарагиновой) биологическая активность синтезированных пептидов снижается и пептид Н-с1у-тгр-0Н является уже полностью неактивным.

Кроме гидро^ильности аминокислот для проявления биологической активности, по всей вероятности,необходимо наличие у -концевой аминокислоты сгободной карбоксильной группы, значение рК котороя может влиять на биологическую активность пептида за счет возможного образования внутренних солей. Сила электростатического взаимодействия между положительно и отрицательно заряженными частями которой будет зависеть от рК боковой карбоксильной группы./ аспарагиновой кислоты оК ^-СООН-группы равна 3,6а, а у глутаминовой-3,22. И, возможно, из-за того,что боковая карбоксильная группа глутаминовой кислоты обладает более сильными кислотными свойствами, образуются более стойкие внутренние соли и пептид Н-01и-Тгр-0Н имеет высокую биологическую активность, а"пептид Н-А.зр-Тгр-ОН - обладает активностью,равной 30£ активности пептида Н-01и-Тгр-0Н.

Также возможно образование водородных связей между гидрок-силом боковой карбоксильной группы и ДН-группой индольной части остатка триптофана, за счет чего пептид принимает конфермя-цип,необходимую для проявления им биологической активности.Причем этот вариант образования вторичной структуры пептида является более вероятным.В связи с тем,что у пептида Н-31и(Тгр--0Н)-0Н остается свободной «СДЗООН-группа, ее рК=2,19, то в случае образования внутренних солей его активность должна быть выше активности пептида н-Ии-Тгр-ОН .Однако этого не происходит и активность н-С1и(Тгр-0Ю-0Н в два раза ниже активности пептида Н-П1и-Тгр-0Н .Но если допустить образование водородных связей, сила которых зависит от расстояния мехцу группировками, их образующих, то можно объяснить разницу в биологической активности синтезированных пептидов. Расстояние мечщу индольной и ^-СООН группами "у пептида к-г-1и-Тгр-он меньше, чем у пептида н-С1и(Тгр--0Н)-0Н и поэтому его активность вьпе и его конформйция являет-

ся оптимальной для проявления высокой биологической активности. У аспар агиновой кислоты jfc-COOH группа находится дальше от индольной группировки триптофана и активность этого дипепгида составляет 30л активности дипептида H-Glu-Trp-OH.

Относительно высок:угё(4СЙ активности H-Glu- Trp-OHj активность дипептида пиро- Glu-Trp-QH вероятно,можно объяснить тем,что его информация близка к оптимальной не за счет образования водородных связей, в за счет каких-то кснформационнЬх изменений.

Исключением является дипептид Н-11е-Тгр-ОН, который проявляет активность, равную активности H-Glu-Trp-OH хотя Н-конце-вым остатком этого пептида'является незаряженный и гидрофобный остаток изолейцина.

При изучении биологической активности синтезированного бур-сина in vitro было показано,что он обладает активностью природ- . ного гормона. Учитывая биологическую активность бурсина и дипептида H-Glu-Trp-OH можно было ожидать, что синтезированный гибрид этих пептидов H-bys-His-Gly-lffl-NH-Trp-GlUH Н будет, одновременно проявлять и Т- и В-активность. Однако, этот пептид при исследований in vitro не проявил биологической активности ни по отношению к дифференциации Т-клеток, ни по отношению к дифференциации В-клеток. Вероятно, это связано с тем; что со стороны дипептида H-Glu-Trp-OH у остатка триптофана отсутствует свободная «¿-карбоксильная группа, а со стороны бурсина-сво-бодная амвдная группа.

ВЫВОДЫ

1. Методом активированных эфиров синтезировано 42 различных пептида - фрагмента природных тимопоэтина и тимозина ctj.Bte-

. стороннее изучение их свойств позволило решить теоретические и практические проблемы создания лекарственных препаратов на основе тимусных гормонов.

2. Установлено,что биологическая активность тимопентина и его аналогов, проявляемая в тесте Е-розеткообразования клетки, является сравнимой с активностью тимопоэтина. Активность тимопентина и его гексапептидного аналога H-Arg-Lys-Asp-Val--Tyr- A.rg-OH равна активности известного тимопоэтина.

3. Разработана оптимальная схема синтеза дипептида H-Glu-Trp-OH проявляющего активность тимозина <A/j, и его 26 ди-,три,тетра-и пентапептидных аналогов.

4. Установлено, что в тесте Е-розеткообразования клетки биологическая активность дипептидов H-Glu-Trp-OH.H-Ile-Trp-OH,

H—С! 1 u(Тгр-ОН)-ОН rapO-Glu-Trp-OH.H-Asp-Trp-OH по сравнению с биологической активностью известного тииозина o6j составляет соответственно 100,100,50,40,и ЗСЙ.

5. С использованием методов активированных эмиров и смешанных ангидридов путем ступенчатого наращивания пептидной цепи начиная с V-конца синтезирован амид трипептида с последова -тельностью н-ьуз-н1з-01у-ин„, являющийся гормоном бурсы Фабрициуса - буренном, избирательно дифференцирующим Б-клетки.

и его гибридный аналог с дипептидом H-Glu-Trp-CH. Биологическая активность синтезированного бурсина, определяемая in vitro, соответствует биологической активности природного го-.рмона.

6. Индивидуальность и состав полученных пептидов были подтверждены данными аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии и аминокислотного анализа.

По материалам диссертации опубликовано:

1. Дейгин В.И..Короткое A.M..Помогайбо C.B.,Бобиев Г.М.,Халиков Ш.Х.,Гречанинова Л.А.,Михальцов А.Н.,Титов М.И. Синтез и исследование биологической активнеоти иммуноактивных пептидов. //УП Всесоюзный симпозиум по химии белков и пептидов.Тез. докл.Таллин.-19-23 октября ISb7.-C.I73.

2. Дейгин В.И.,Короткое A.M.,Бобиев Г.М.,Михальцов А.Н.,Т^тов М.И.Выделение и структурно-функциональное исследование иммуноактивных пептидов.//Цитомедамат.Тезисы I Всесоюзной конференции по биорегуляторам!, Ленин град.-19Ь7.

3. Бобиев Г.М.Синтез низкомолекулярных иммуноактивных пептидов. (Сообщение I).//Республиканская научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов.Тез .докл.Душанбе.1937,--С.49.

4. Бобиев ГЛ.Синтез дипептидов,выделенных их тимолиновых îpaK-•Д1й экстракта тимуса.//Республиканская научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов.Тез.докл.Душанбе. -13-14 апреля IStí9.-C.63-64.

г). Бобиеб Г.М. Синтез трипептида H-Lya-His-Gly-mî, бурсика-гормона бурсы {абрициуса.//Республиканская научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов.Гез.докл.Ду-

1 шанбе .-13-14 апреля ISÔ9.-C.65-66.

6.Бобиев Г.М. Синтез аналога бурсина.//Материалы научнойкснфе-ренции "Теоретические и прикладные проблемы химии" .Тез .г о .сл. Душанбе.-1995.-С.59.

7.Бобиев Г.М. Синтез низкомолекулярных иммуноактивных пептидов (Сообщение 2).//Материалы научной конференции, посвященной 50-летию Института химии им.В.И.Никитина АН Республики Таджики стан. Тез. докл. Душанбе.-1996. -С 3.1.

В.Бобиев Г.М. Биологический свойства низкомолекулярных иммуноактивных пептидов.//Материалы научной конференции,посвященной 50-летии Института химии им.В.И.Никитина АН Республики Таджики стан . Тез .докл .Душанбе . -1996 . -С .22 •

9,Бобиев Г.М.,Алиева C.B. Использование метода активированных эфиров для синтеза тимопентина и его аналогов.//Материалы научной конференции, посвященной 50-летию Института химии им. В.И.Никитина АН Республики Таджикистан.Тез.докл..Душанбе.-1996.

Ю.БобиеГ) -Г.М. Синтез и биологическая активность тимопентина и его аналогов.//Диагностика, лечение и профилактика ин?екци-онпньгх, инвазионных и незаразных болезней сельскохозяйственных животных.Сб.научн.тр.ТаджНИВИ.Душанбе.-1995.-С.82-86.

П.Бобиез Г.М. Пептиды,обладающие активностью тимозина

//Диагностика, лечение и профилактика инфекционных, инвазионных и назар?.зных болезней сельскохозяйственных животных,Сб. научн.тр.ТаджНИВИ .Душанбе.-1995.-С.86-89.

-с.23,

РАКАЗ 287 ТИРА1:'50 ОБ!ИЛ 1,5 п.л. ПОДПИСАНО к ПЕЧАТИ 9.04.^6 г. ДУШАНБЕ ПЕРВАЯ ТШЮГРАНШ