Синтез и структурно-функциональное исследование иммуноактивных пептидов ряда тимопоэтина, тимозина и бурсина тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ
Бобиев, Гуломкодир Муккамолович
АВТОР
|
||||
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
Душанбе
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
1996
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.03
КОД ВАК РФ
|
||
|
На правах рукописи
и ил .
ы
ВОБИЕВ ГУЛОЖОДИР МУККАМОЛОВИЧ
ЭДГ547 Ж6. • 547.96
синтез и структурно - функциональное исследование 'иммуноактивных шятвдов ряда тймопоэтина, жозина
и БУРСША.' ( 02.00.03 -. Органическая хкшя )
автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических нау:с
ДУШАНБЕ - 1996
Работа выполнена в Институте экспериментальной кардиологии ВКНЦ Российской Федерации, научно-исследовательской лаборатории кафедры органической химии Таджикского Госуниверситета, МП "ЗАВД".
Научные руководители: кандидат химических наук, Генеральпый'директор ВИЦШ "Пептос" Дейгин Б.И.; доктор химических наук, профsnoop, заведующий кафедрой органической химии ТПУ Халиков Ш,Х,
Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторной химии природных соединений Института химии им. Ь.И. Никитина Ali Республики Таджикистан Буриченко В.К.
кандидат химичбских наук, доцент кафедры химии ДГАУ' Каримов Г.К.
Ведущая организация: Душанбинский Государственный педагогический университет им. К. Джураева.
Защита диссертации состоится " — 1996 г,
в /¿у часов на заседании диссертационного совета Д.013.02.01 по заците диссертации на соискание ученой степени доктора наук в Институте химии им. В.И. Никитина АН Республики Таджикистан по адресу: 734063, Душанбе, ул. Айни, 299/2.
С диссертацией мочено ознакомиться в библиотеке Института химии им. В.И. Никитина АН Республики Таджикистан.
Автореферат разослан
Тл
Ученый секретарь диссертационного сонета /¡1/У1Ш Воронцова М.Д.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
Актуальность проблемы. После установления главной роли тимуса в формировании и регуляции иммунного ответа организма,были начаты интенсивные исследования по вьделению и изучению структуры тимусных гормонов. Из различных фракций экстрактов тимуса были выделены такие тимусные гормоны,как тимолнн.тимопоэтин,сывороточный тимусннй фактор,бурсин. Данные гормоны благодаря своей биологической активности,привлекли большое внимание исследовате-» 1 лей.
Было установлено,что эти пептиды при введении в организм являются весьма э£фективннш при устранении различных £орм иммуноде-(£ицитов. Поэтому их применение в качестве лекарственных препаратов при лечении таких заболеваний является очень перспективным.
• Однако,использование их для этой .цели ограничено небольшим содержанием в животных организмах и сложностью вьщеления.Химический синтез этих горкомов так^е 'представляет собой елочную практическую задачу,так как их молекулы состоят из большого количества аминокислотных остатков.Поэтому в настоящее время ведутся интенсивные исследования по определе-ни» местоположения активных участков их молекул и выявлению различных структурно-^унщюна чь-ных зависимостей в ряду этих гормонов с целью поиска более коротких пептидов,обладающие биологической активностью,присущей этим гормонам.
К настоящему времени' уте выяснено,что активным г(ентром молекулы тимопоэтина является фрагмент, 32-36,представляющий собой пентапептид с последовательностью 'Н-Агя-1.уз-Азр-Уа1-Туг-ОН. Биологически активной частью молекулы тимозина ^является С-ксн-цевяя часть, стэечащая остаткам 15-2о.Было синтезировано большое ччао пептидных аналогов активных участков этих гормонов,но до сих пор не удалось до конца выявить обдпе последовательности п минога: здот и обобщить какие-либо структурные особенности .которые являются необходимыми для обеспечения их специфической '.'активности. Поэтому разработка путей хи№ чес кого синтеза данных гормонов ■ и проведение структурно-функ^юнальных исследований и и к роду . имеет большое теоретическое и практическое значение. С теоретической точки зрения данные исследования помогут выяснить, механизм действия гормонов,а с практической - приведут к созцпшго :><?-•7дктилннх лекарственных црепзрат'з» для лечения рлячкчпых ,-уорм иммунодефиците?. и гомологических ппболсвяний.
Цель и задачи исследований. Основной целью настоящей работы
являлся синтез и изучение биологической активности тимопентина--пентапептида с последовательности) Н-Агг-Ьуя-АЕр-Уа1-Туг-0Н, представляющего собой фрагмент 32-36 молекулы тимолоэтина и являющегося ее активным центром и его аналогов: ди-,три-,тетра- и пентапептидов,обладающих активностью тимозинасЦ : бурсина -три-пептида о последовательностью Н-Ьуя-Н1Е-а1у-!га2 и его гибридного аналога с дипептидом Н-а1и-Тгр-ОН, облачающего активностью тимозина <зС 1 •
Для достижения этой цели необходимо было решить следурзие задачи:
- разработать оптимальные схемы синтеза пептидов, получить тимо-пентин и его аналоги;
- провести синтез дипептида н- С1и-Тгр-0Н, обладающего активностью тимозинаоЦ и его дипептидных аналогов,заключавшийся в получении свободных дипептидов без выявления п5>одуктов реакции конденсации из реакционной смеси и их очистки;
- наиболее оптимальным вариантом синтезировать бурсин и его гибридный аналог с дипептидом Н-С1и-Тгр-ОН со следующей аминокислотной последовательности) н-1уя-н1в-с1у-л"гнг-тгр-с1и-н;
- изучить физико-химические свойства полученных пептидов;
- изучить биологическую активнооть синтезированных пептидов в тесте Е-роэеткообразования лимфатических клеток.
Научная новизна. Впервые для синтеза тп юпентина был использован метод активированных эмиров,который позволил увеличить выход реакции конденсации на какдой стадии на 1Ь-2Ь7.Правильный выбор защитных групп позволил значительно упростить стадии деблокирования и очистки конечных продуктов.Впервые сикте,.:;.овакы новые пятичленпые и шестичленные пептидные аналоги тимопентина. Синтезирован ряд аналогов дипептида н-с1и-Тгр-ОН, обладающих активноотью тимозинаоЦ . Разработан метод синтеза,позволяющий получить конечные свободные дипептиды без дополнительного выделения защищенных дипептидов и их очистки из реакционной смеси. Впервые синтезирован гибридный аналог бурсинас целью изучения Т- и В-клеточной активности.Установлено,что некоторые испытуемые пептиды обладают гормональной активностью и участвует в дк^е.'енциации Т- и В-клеток.
- з -
Практическая значимость. Разработаны методические подходы в оценке иммуномоделирущих синтетических препаратов-аналогов аминокислотной последовательности тимопентина и тимозина оЦ .Разработанные оптимальные зарианты синтеза пептидов применяются в настоящее вреуя для выполнения аналогичных исследований с другими типа!м тимусных пептидов. На основе синтезированных пептидов получены экспериментальные образцы,обладащие активностью тимопоэтина и тимозина ., •
Положения выносимые на задиту.
- Синтез тимопентина методом активированных эмиров с использованием по выбору защитных групп позволяющий увеличить выход промежуточных и конечных продуктов и упростить процесс их очистки.
- Синтезаналогов тимопентина методом' активированных э^ров со следующей аминокислотной' последовательностью: Н-А^-Ьуэ-С1и--Уа1-Туг-ОН, Н-А^-1уз-Аяр-Уа1-Тгр-0Н, Н-АГ5-Х-уз-С1и-Уа1-Тгр-0Н, Н-Агв-Ьуя-Авр-7а1-Гуг-Агв-0Н.
- Результаты исследования биологической"активности синтезированных тимопентина и его аналогов в тесте Е-розеткообразования клетки по сравнении с биологической активностью тимопентина.
- Использование для синтеза дипептида Н-Я1и-Тгр-ОН карбодиимг-да с применением нуклео^ильной добавки 1-бензотриазола позволило получать свободные конечные дипептиды с выходом 80-9СЙ.
- Синтез три-,тетра- и пентапептидных аналогов дипептида И-Ич-- Тгр-ОН методом активированных эфиров.
- Еиологкческая активность дипептидов н-Ии-Ггр-ОН.Н-Ие-Тгр-ОН, н-с1и(Тгр-он)-он, пиро-51и-Тгр-он,н-А8р-тгр-он в тесте Е-розет-
кообразования клеток составляла 100,100,50,40 и 30%,соответственно.
- Синтез бурсина-рипептида р последовательностью Н-Ьуз-Н1в-С1у-?гя2 путем ступенчатого наращивания пептидной цепи начиная с N-конца ,
- Синтез гибридного аналога бурсинв и дипептида Н-С1и-Тгр-ОН с . последовательностью н-ьув-н1в-с1у-и2н„-тгр-с1и-н.
Апробация работы. Результаты диссертации были доложены,обсуждены и одобрены на 1-й Всесоюзной конференции по биорегуляторам (Ленинград,1Й17), УИ Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пе- * птидов(Таллинн,1937), Республиканских научно-практических конфе-
ренциях молодых ученых и специалистов(Душанбе, 1967,1989).научной конференции "Теоретические и прикладные проблемы химии"(Душанбе, 1995) .научной конференции,посвященной 50-летию Института химии им.В.И.Никитина АН Республики Таджикистан(Душанбе,1996)
Публиками. По материалам диссертации опубликовано II работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 12(2 страницах машинописного текста,состоит из введения,обзора литературы, об суждения результатов,экспериментальной части.выводов и списка литературы,включающего 126 источников,из низ 2 отечественных и 124 зарубежных авторов.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Пептиды. Тимопентин и его аналоги были синтезированы методом активированных эфиров путем ступенчатого наращивания пептидной цепи начиная с С-конца. В качестве активированных эфиров были использованы п-нитрофениловые и М-оксисукцинимидные эфиры. Пептид н-01и-Тгр-0Н и его дипептидные аналоги были синтезированы карбодиимидным методом с использованием нуклеофильной добавки 1-гидроксибензотриазола без выделения защищенных дипептидов из реакционной смеси и дополнительной очистки деблокированных дипептидов с помощью ВЭМХ. Три-,тетра- и пентапептидные аналоги дипептида н-СХи- Тгр-он синтезированы методом активированных эфиров путем ступенчатого наращивания пептидной цепи начиная с С-конца. Бурсин был получен методами активированных эфиров и смешанных ангидридов путем наращивания пептидной цепи начиная с N -конца. Гибридный аналог бурсина и дипептида Н-С1и-Тгр-ОН был получен методом смешанных ангидридов при конденсации гидрази-да трипептида 2-Ьуя(г)-Н1а-С1у- тШд и дипептида Ъ- 01и(0В^)--Тгр-ОН.
Для защиты ¿и и ¿-аминогрупп использовались ъ- и Воо-защи-тныегруппы. Карбоксильные группы были защищены путем превращения их в метиловые,этиловые и трет-бутиловые эфиры. При синтезе ди-пептидных аналогов пептида н-С1и-Тгр-ОН карбоксильные группы аминокомпонентов были защищены путем солеобразования с использованием в качестве основания триэтиламина. При синтезе дипептида Н-С1и(Тгр-ОН)-ОН сО -С00Н группу ^-трет-бутилового эфира кар-бобензокеиглутаминовой кислоты защищали с помощью 9-флуоренил-каг.5с;:ильной защитной группы. При синтеее бурсина а£-СС0Н группу
гистидина защищали путем солеобразования с помощью тритона Б.
Карбобензокси- к бензильиую группы удаляли каталитическим гидрированием над Ю-ннм Vf/С. Трет-бутилоксикарбонильную и трет-бутильнуя группы снимали действием смеси трифторуксусняя кислота-анизол-метилзтилсуль^ид (424:60:2Ь)или действием сухого бромис.то-> го водорода в растворе три*торуксусной кислоты(для дипептида Вос-Туг(Боо)-Агд-ОН при синтезе гексапептидного аналога тимопсн-тина). ¡¿етиловие и этиловые э^ирн омыляли щелочным гидролизом действием 1н тствора NaOH и течение суток на холоду или 10-ным раствором nèÇjCO-,b течение часа(для пептидов,содержащих С- концевой остаток триптофана).
2.2.Очистка свободных пептидов. Тимопентин очищали колоночной хроматографией на колонке,заполненной сефадексом G-I0.Аналоги тимопентииа очищали с помоью B3iX на колонке 160x20мм, заполненной обращенно-г[азовъи силикагелечСиласорб Cj^ в градиенте этанол-ацетатаммоннйного буфера.
Очистку дипептиднкх аналогов пептида H-Glu-ïrp-Olî jairee осуществляли с пошью ВЭлХ на обращеш-ю-фпзовой колонке( IGGx2ômm) заполненной си лики гелем ^Сил-чсорб Ср в градиенте ацетонитрил-ацетатлииопнЛного буфера СрН б,Ь) от 10 до ¿>0% при скорости потока 14мл/|-жн, при длине волны 220нм.
f Для очистки бурелна такче использовали ВЭЖХ на коленке(160х 35мм).заполненной обраденно-$азовым силикагеяем Силаеорб Cjg в 0,0IJ-hom растворе трифторуксусной кислоты в градиенте метанола от 5 до 70% при длине Волны 254нм. Аналитическую ВЭйХ проводили на колонке Ultro3phere-ODS(4,6x50 мм, 5мм):
2.3.Определение биологической активности. Биологическую активность синтезированных пептидов определяли в тесте Е-розетко-образования ктзтки по методике,использованной At>iko et al.,1980.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1.Синтез тимопентина и его анаюгов. На первом этапе работы было необходимо синтезировать пентапяптид с последовательностью H-Arg-lyd-Aap-Val-Tyr-OHпредставляющий собой активный ' центр молекулы тимопоэтина и имитирующий-последовательность -32-36 этого гормона.Синтез был осуществлен по схеме,приведенной г га рис.1.
Выход продуктов реакции на стадиях конденсации достигал 60-
- 6 -
90%(рис.1), за исключением стадии конденсации п-нитрофенилового эфира трикарбобензпксиаргинина с защищенным тетрапептидом Н-Ьуа (Бос)-Аяр(0Ви^)-Уа1-Туг-СИ , на которой выход составил 55%.
При данном выборе защитных групп пептиды после деблокирования -аминогрупп вводились в реакцию конденсации без выделения, что позволило избегать дополнительных стадий очистки промежуточных пептидов и упростить очистку конечного свободного пентапепти-да и избегать потерь на этой стадии,выход конечного продукта на которой составил Т/%.
• 1уя
Н-
-ОЗр н-
Аар
Ъ—
' Вое
Бос
Воо
ЧЭое
Уа! »уг -ОЗи Н-— 02
05 и НОВи*
ОЗи
ОЗи
"-О
1Ви
'ОВи
ОВи
ОВи*
овг
0Е4
оях
03 ь
он
он
ОН<55£) он
ОНПП)
Рис Л. Схема синтеза тимопентина.
Здесь не был получен тетрап.ъг.тидний фрагмент 33-36 тамог.оэ?»:-на с последовательностью Н-ЬуЕ-Аяр-Уа1-?уг-0Н.
С целью модификации тимопентина был синтезирован его аналог, в котором остаток тирозина был замещен остатком триптофана. Схема синтеза данного пентапелтида приведена на рис. 2. Как и при синтезе т'люпентина пептиды после .удаления ЯН^задитных групп вводились & реакцию конденсации без выделения.
С цельи проведения структурно-функциональных исследований был синтезирован гексапептидгшй аналог ткмопентина, к С-концу которого был добавлен остаток аргинина. Синтез был осуществлен по схеме,приведенной на рис.3. Использование С-концевого остатка аргинина без защиты гуанидиновой и карбоксильной групп значительно упрощало весь процесс получения пептидов,поскольку исключается трудоемкая и часто плохо воспроизводимая стадия введения и удаления защитных группировок на гуанидиновую и карбоксильную группы аргинина. Кроле того, известную трудность представляет очистка Н-за^иЩенных пептидов,содержащих С-концевой остаток аргинина с блокированными гуанидиновой и карбоксильной группам!. Эти трудности связаны с высокой гигроскопичностью леп-
Атт;
нИ-
Ъуз
'Азр
Уа1
7,2-
-ОНр н-
\
ОЭи I!-----
Вое
Все '
Вое
'Вое
7,-
-ОЗи Н-' ОВи*
' ОВи"
тгр
-ОБи Н-
чОВи
ОВи
ОЗи
-ОВи
~"Во.с
■ОВи
—ОМв
-ОМе
-ом-
-ОМе
—ОМе
-ОМе
-ОМе
-ОМе
-ОМе -ОН
Рис.2. Схема синтеза Н-А.ге-Ьуо-Азр-Т'аЗ.-Тгр-ОН гидов, их сходной растворимостью с исходным аргинином или арги-нинсодертащими пептидами. Использование для этой цели метода последовательного переосо"щения такте обладает рядом суцейтоеи-ных недостатков. К этим недостаткам относятся: использование бользих избытков актяЕирогаН!П4Х эмиров х-зюрщенных аминокислот; многократное повторение операций очнекл^применение специально очищенных и тщатслыю ы'"^г"оннк;х растворителей;ентченне
выхода целевого продукта,связанное с механическими потерям! в процессе оседдекик фильтрования. Использование в данном синтезе аргинина со свободньми гуанидиновой и карбоксильной группами позволило избегать подобных трудностей. Активированные э^иры на стадиях конденсации использовались с избытком в 1,02-1,05 раза. Только на стадии получения гексапептида с избытком Э% был использован пентапептид. Еыходы пептидов составили 76-о(>Х. В данном случае значительно упростился процесс очистки защищенных пептидов,который проводили промыванием их н-бутанольного раствора уксусной кислотен или однократным осат^дением эфиром из спиртового раствора сразу после реакции конденсации и удаления растворителя.
Агг
Авр
Уа1
Ъ-
-0!Гр н-
2-
Ъ-
ОЗи Я-Воо .
N
Вое
Вое
Вис
г-ъ-
-05 г; Н-" ОВи^
14 ОВи*
\ г
ОВи
ОВи
ОВи"
ОВи"
Туг
Агр
Вос-Вос-
^ОКр Н-Вос
\
-ОКр Н-
Вос
-ОН
-он
-он -он -он
-он -он
—01!
-он -он
-ОН
-он
Рис.3.Схема синтеза гексапептида Н-Аге-Ьус-Аор-Уа1-Туг-Аге-ОН
'аете был синтезирован аналог тимопентина,у которого остаток аспараглновой кислоты был замещен на остаток глутамнноэта кислоты я остаток тирозина - на остаток триптофана. Синтез данного-. пептида с последовательностью Н-Аг?-Х,уз-01и-Уе1-Тгр--СК бы ' проведен по схеме,изображенной на сис.4.
Arg
Lye
Glu
Val
-OHp H-
-OSu R-•Boe
-Boc
'Boo
г—OSu H-
Nb«*
OBut
' OBu
' OBu
OBu1
-OSu H-
-OMe -OMe -OMe
-OMe
-OMe' -OMe
-OMe -OMe
H-H-
Boo
ХОВи*
Boo '
XOBu*
—OMe
-OMe -OH
Рис.4. Схема синтеза пентапептида H-Arg-Lya-Glu-Val-Trp-OH
Здесь же был синтезирован тетрапептид с последовательностью H - Lys-Glu- Val-lrp-OH,аналитическая ВЭЖХ которого для примера приведена на рис.5.
3.2. Синтез дипептида . H-Glu-Trp-OH и его аналогов.
Недавно из тимолиновой фракции экстракта тимуса был выделен дипептид H-Glu-Trp-OH .который проявлял активность тимозина«^' С целью разработки оптимзльных условий синтеза данного дипептида и проведения структурно-функциональных исследований был синтезирован этот дипептид и его различные дипептидные аналоги:
13. H-îrp-Arg-OH
14. H-Gln-Trp-OH
15. H-Gly-T rp-OH
16. H-Glu-Trp-ira2
1. H-Glu-Trp-OH 7. H-Leu-Trp-OH
2. H-Trp-Glu-OH 8. H-Lys-îrp-OH
3. H-Trp-Ser-OH 9. H-Val-Trp-OH
4. H-Ser-Trp-OH 1С. K-Asp-Trp-OH
5. H-His-Trp-OH II. пиро -Glu-Trp-OH
6. H-Ile-Trp-OH 12. H-Glu -OH
èrp—DU
Все дипептиды были получены взаимодействием активированных I-гидроксибензотриазоловых эфкрол ^-карбобензсксиаминокислот
р
- ю
со свободными аминокислотами, зС-СООН группа которых была защищена путемсолеобразования с использованием в качестве основания триэтиламина. Активированные эфиры были получены карбодиимидным методом и в реакцию коцденсацши с ашнокомпонентами вводились без выделения и дополнительной очистки.
Следует отметить,что для синтеза дипептида Н-01и(Тгр-ОН)-ОН, содержащего ^-пептидную связь,необходимо было защитить сЛ-СООН группу глутаминовой кислоты,оставив свободной при этом, ^-СООН группу. Прямой синтез защищенной таким образом, глутаминовой кислоты практически невозможен. Такое производное ыожно получить только обходным путем. Для этой цели ¿¿-СООН группу ?,-г,1и(0Ви*)--СН защищали с помощью 9-флуоренилкарбонильной защитной группы, а затем после удаления ОВи*-группы полученное производное глутаминовой кислоты вводили в реакцию конденсации аналогично другим дипептидам.
Подобный выбор защитных групп при использовании активированных э£иров в реакции конденсации в растворе в одну стадию позволил до предела упростить синтез,включая деблокирование и очистку дипептидов. После очистки и лиофилизации пептиды получали с выходом 70-90$.
Амид глутамил-триптофан был получен из защищенного дипептида 2-й1и(0Ви*)-Тгр-0Н реакцией с аммиаком в метанольном растворе на холоду в течение суток с выходом 00,4% и последующим удалением защитных групп.
С целью1 модификации пептида Н-Ии-Тгр-ОН и проведения струк-турно-функциональних исследований были синтезированы три-,тет-ра- и пентапептидные аналоги данного дипептида:
1. Н-*.гв-С1и-Тгр-0Н
2. Н-Ьув-С1и-Тгр-0Н
3. Н-Н1о-С1и-Тгр-0Н
4. Н-Ии-Тгр-Туг-ОН
5. Н-С1и-Тгр-Агг-0Н
6. Н-01и-С1и-Т гр-Т гр-ОН
7. Н-Атв-Ъуа-С1и-Тгр-0Н
8. Н-А1в-01и-Ии-Тгр-Тгр-0Н
9. Н-С1и-Тгр-С1и-Аяр-А1а-0Н
10. Н-Агв-в1и-Тгр-!Ш?
Триаептиды Н-Агв-01и-Тгр-ОН,Н-Ъуа-С1и-Тгр-ОН,Н-Н1а-С1и-Тгр-0Н
были синтезированы по схемам,аналогичным,приведенной на рис.6.
100 90
80
70 60
50 40
30 20 10
Рис.5. Аналитическая ВЭлСХ тетрепептида H-Lya-Glu-Vnl-Trp-OH на колонке Ultrasphere - ODS(4,6x25Омм, 5мм).
Выход защищенного трипептида Zj~Arg-Glu(OBu't)-Trp-OH составил 68,2?. При синтезе трипептида н-г.ур-Ми-Тгр-он -группу лизина защищали z -группой,а ¿'-МНд-группу-Вос-защйтной группой. с^-СООН группу лизина активировали превращением ее в Л-ок-. сисукцинимидный эфир. Защищенный трипептид z-Lys(Boc)-Glu(OBut)--Trp-oiie был получен с выходом 63%. При получении трипептида H-His-Glll-Trp-OH ДЛЯ конденсации С ДИПеПТИДОМ H-GIuiOEub-Trp-OH был использован я-оксисукцинимидный эфир ди-Вос-гистидина. В этом случае выход защищенного трипептида составил всего лишь 17,7^,хотя реакция конденсации велась в 1,5-2раза доль:пе,чем при по прении двух других трипептидов.
Тетрапептид H-Arg-Lys-Glu-Trp-OH был получен исходя из защищенного трипептида H-byc(Boc)-Glu(OBut)-Trp-OMe после удале- ■ ния с. 11н?-группм лизина карбобензоксизащиты конденсацией с п-нптро^сниловш эфиром трпкарбобензоксиаргштна. Выход тетрлпепти-да при этом составил 65,1%.
Трипептидн, содержащие. ¿ра-мент H-Glu-Trp с N-конца цепи
сн3он
/ > ■ ;
—у
10 20 30
Are
кн-
-Olíp
Nbu*
Trp
OSu H-
OBu
OBu
-OBu
4 OBu
-OMe
-OMe
-OMe
-OMe
-OMe -OMe -OH
Рнс.6 Схема синтеза типептида H-Arg-Glu-Trp-OH Glu Trp. Туг
H-
OSu Ht
OBu
OBu
OBu
-ONp H-
R
R
\
■OBu OBu OBu OBu OBu OBu ÖBu OBu -OBu ' OBu -OH
Рис.7. Схема, синтеза трипептида H-Clu-Trp-Tyr-OH
GjLu C}u Typ Trp
ONp H-
Z—^-OSu. H-OBu
w
^Blt.
'OBu'
•OBu'
OBu'
"OBu
-OMe -ÖMe
-OMe -OMe -OMe
-CV.E -OMe
-OMe -OH
Рис-Ç. Схема синтеза тетрапептида H-Glu-Glu-Trp-Trp-OH
G
- 1-3 -
н-С1и-Тгр.-Туг-он, н-С1и-Тгр-л^-он были синтезированы путем ступенчатого наращивания пептидной цепи начиная с С-конца методом активированных эфиров. Для примера на рис.7 приведена схема синтеза три пептида н-С1и-Тгр-Туг-он.
- Остаток аргинина при синтезе дипептида г-Тгр-Аг^-он в реакцию конденсации вводился без защиты оС-каРбоксильной и гуани-диновой групп, что позволило избежать значительных трудностей при очистке промежуточных и конечного пептидов.Защищенный дипеп-тид г-Тгр-Туг(г!Ви^)-ови{: был получен с выходом 47,
а выход дипептида з-Тгр-Агя-ОН составил Для получения трипептидов дипептиды со свободными аминогруппами вводили з реакцию конденсации с м-оксисукцинимиднкм эфиром ^-трет-бутилкарбо-бензоксиглутаминовой кислоты. Защищенный трипептид 2-31и(СЕи")--Тгр-ТугЮВи1 )-овиг был получен с выходом 70,£Й,а трипептид 2-С1и(ов\1г)-Тгр-Агг-он - с выходом 7а,
Тетрапептид с аминокислотной последовательность» Н-С1и--С1и-Тгр-ТгрОН был синтезирован согласно схеме, изображенной на р::с.о.дипептид ?.-Тгр-Тгр-ОКе был получен с выходом ЬЗ,ол.Защищенный трипептид 2-С1и(0Ви^)-Тгр-Тгр-0Ые был получен с выходом а защищенный тетрапептид г-01и(0Ви1:)-О1и(ОВиг)-?гр-Тгр-оке - с выходом 7Ъ,5%.
Пентапептид с а.минокислотной последовательностью Н-Аге-С1и-П1и~тгр-тгр-он был получен из защищенного тетрапептида н-С1и(ови4)-С1и(ози^)-Тгр-Тгр-оме и карбобензоксинитроаргини-на при использовании в качестве коеденсируххцего реагента дифенил-фосфорилазида с выходом <ЬСЙ.
Пентапептид с аминокислотной последовательностью Н-С1и-Тгр--С1и-Азр-А1а-ОН также был синтезирован методом активированных эфиров путем ступенчатого наращивания пептидной цепи начиная с С-концп согласно схеме,приведенной на рис.9.На этом же рисунке показаны выходы защищенных пептидов на каждой стадии конденсации.
3.3. Синтез бурсина и его гибридного аналога.
После выделения из бурсы Фабрициуса трипептидного гормона с последовательностью аминокислот Ьуз-Н1а-а1у-Ш0 .избирательно дифференцирующего 3-клетки,он был синтезирован твердофазным методом несколькими исследовательскими группами.Синтетический бурсин проявлял активность аналогичную проявляемой природным гормоном.
С целью разработки оптимальных путей синтеза этого пептида классическими методами пептидного синтеза в растворе был синтезирован пептид, соответствующий природному бурсину,Синтез данного трипептида был осуществлен наращиванием аминоксилотной цепи от к-конца к С-концу методами активированных эмиров и смешанных ангидридов.
Для блокирования о^ и -аминогрупп лизина и Н -аминогруппы гистидина была использована карбобензокси- защита. <Х -Карбоксильную групцу лизина активировали превращением' ее в Н-оксисукцини-мидный эфир карбодиимидныы методом в этилацетатном растворе. Ди-карбобензоксилизил-гистидин получали конденсацией 2-Ьуз(2)-03и с гистидином в диметилформамидном растворе. оС/-Карбоксильную группу аминокомпонента защищали цутем coлeoбpaзqвaния с помощью тритона В. Полученный пептвд очищали промыванием его н-бутанольного• раствора 2&-ной уксусной кислотой 'и водой.
С1и
гс°Ч1 У-
Они
•Р
С1и
ъ-ъ-
Ч
Авр
СВи НОВи
ОВи
ОВи
ч
ОВи
'ОВи
'ОВи
Ч)Ви
\ви*
А1а
г—ОЭи НОВи*
"ОВц
чГ *
Ч^
ОВи
ОВи
-ОВи
-ОВи
-ОВи
-ОВи -ОВи
-ОВи
-ОВи
вгГо
81,8%
91,655
•ОВи 88.5Й
-ОВи
-он
Рис.9. Схема синтеза пентапептида н-С1и-Тгр-С1и-А8р-А1а-ОН
Первоначально трипептид г-Ьуз(г)-Н5 з-Иу-1Ш2 пытались получить конденсацией дипептида 2-Ьуа(г )-Н1е- ОН с Н-01у-Ш2 карбодиимид-ным методом. Однако,при этом обнаружилось,что из-за участия в этой реакции имидазольного кольца гистидина,образовывалось значительное количество побочных продуктов,при удалении которых возни-
кали значительные трудности. Для того,чтобы избегать получения на этой стадии побочных продуктов и возникающих при очистке конечного пептида трудностей,данный трипептид был синтезирован с хорошим выходом по аналогичной схеме мзтодом смешанных ангидридов в пиридиновом растворе. Полученный этим путем трипептид очищали промыванием его н-бутанольного раствора 2%-ноЯ уксусной кислотой. Окончательное деблокирование трипептида было осуществлено каталитическим гидрированием. Предварительную очистку свободного амида трипептида проводили путем экстракции его н-бутанолом из водного раствора. Окончательная очистка была осуществлена с помощью ЕШХ. После лиофилизации очищенный амид трипептида был получен с выходом Ь0%.
Индивидуальность и состав полученного амида трипептида были подтверждены с помощью аналитической £ШХ и данными аминокислотного анализа.
С целью повшения биологической активности дипептида Н-а1и--Трр-он имитирующего по своим биологическим- свойствам тимозин
а таете с целью получения пептида, который бы участвовал в дифференциации как Т-клеток,так и В->клеток,был синтезирован гибрид дипептида п-Ии-Тгр-он и бурсина, имеющий следующую аминокислотную последовательность: Н-Ьуз-Н1э-01у-И2Н2-Тгр-01и-Н согласно схеме, приведенной на рис. 10.
На первой стадии синтеза этого соединения защищенный дипеп-тид с последовательностью 2-с1и(0ВиЪ-Тгр-0Ме подвергался щелочному гидролизу в мягких условиях обработкой 10^-ным раствором карбоната натрия. На следующей стадии эфир защищенного трипептида г-Ьуз(7.)-Н1а-С1у-0Ме был превращен в гидразид обычным способом. Конденсацию этих соединений осуществляли методом смешанных ангидридов,причем в качестве карбоксильного компонента fvл использован дипептид' 2-01и(0Ви*)-Тгр-0На в качестве амино-компонента-гидразид трипептида г-Ьуа(2)-Н1з-С1у-Ш-ТГН2. Реакцию конденсации проводили в смеси диметилформамид-диоксан (1:1) и времени активации карбоксильного компонента-2минуты. Время реакции конденсации составило 4 часа. Очистку защищенного продукта осуществляли промыванием его растворами бикарбоната нат-рия(0,он).,2£-ноЯ серной кислотой и водой с последующим осаждением эфиром из этилацетатного раствора. Выход защищенного продукта составил 27,2%. Карбобензокси-защитные группы удаляли
каталитическим гидрированием над 1Ш?-ным ра/С. Трет-бутильную сложноэфирную группу удаляли обработкой трифторуксусной кислотой в смеси с анизолом и метилэтилсульфидом(425:50:25). Свободный продукт очищали с помощью обраценно-фазовой высокоэффективный жидкостной хроматографии.
Ъув
\
Н-
Н18
-он
-ОЭи Н-
\
н-н-
-он Н—ом«
-он н-
Тгр
он СМй
■ ома сн3о-
-оме сн3<>-
!Ш-Ш2 Н0-
ЕиО-
t
ХОВи*
—г
'ОВи-чови*
—7, • ОВи
—н
4 ОВи*
— н
Ric.ro.Схема синтеза гибридного аналога дипептида Н-Ии-Тгр-ОН и бурсина.
Структура данного .соединения была подтверждена данными аналитической ВЭКХ и аминокислотного анализа.
3.4. Биологическая активность и структурно-функциональные исследования в ряду синтезированных пептидоЕ.
Одним из распространенных и чувствительных методов изучения иммуностимулирующей активности синтэтиеских пептидов является метод, основанный нг. наблюдениях за Е-розеткообразованием клетки . Поэтому биологическую активность синтезированных пептидов изучали именно в тесте Е-розеткообразования клетки.
Результаты, полученные при определении биологической активности синтезированных тимопентина и ег" аналогов,представлены в таблице I.
Как видно из таблицы, тетрапептидные аналоги, у которых в положении 32 отсутствует остаток аргинина, являются в этом тесте
Биологическая активность тимопентина и его аналогов*.
___Табл.1.
Последовательность синтезированного |Биологическая активность пептида 'относительно синтезитзо-_! ванного тимопентина,%
Н-Аг^-Ьуз-Аяр-Уо1-Туг-Он(тим0пентин) 100,0
H-Lya-Asp-Val-Tyr-OH 0,0
H-Arg-bys-Glu-Val-Tyr-OH , 92,3
3-Arg-Ьуз-Азр-Val-Trp-OH 5-1,0
Fi-Arg-Ly3-A3p-VQl~Tyr-Arg-0H 100,0
H-Arg-Lyo-Glu-Val-Trp-OH 4,2
H-bys-fllu-Y el-Trp-CH__;_0,0 _
полностью неактивными, что свидетельствует о необходимости присутствия этого остатка для проявления пептида?.« иммуностимулирующей активности. Этот факт согласуется о результатами,подученными с более длинньки пептидами(Abiko ei ,al., 1979) ,где было показано,что г.эптид 33—"II является полностьп неактивным и о тесте З-розеткообразования клетки и в рздиорецепторном анализе, а активность пептида 32-41 в этих тестах равна активности тимопентина.
Если рассмотреть структуру тимопентина с точки зрения наличия в нем гидрофильных и гидрофобных аминокислот,а также наличия в аминокислоттк остатках заряженных групп,то можно увидеть, что из пяти аминокислотных остатков гидрофильной является только аспарагиновая кислота, находят,алея в центре молекулы.На ГГ-конце молекулы расположены слабогидрофобные остатки( Arg,Lyo), а на С-конце - сильно гидрофобное( 7"1 ,?уг) .Причем заряженные аминокислота расположены и Я-концоь:.,! половине молскулы-дво положительно заряженные! ,\гг, , Lyn);; отрицательно заряженная ( Агр). ''сходя из этого ¡южно сделать предположение о том,что присутствие кпелотно-оензнны/. аминоксилот может влиять на биологически активность. Л^едзклая в отоЗ работе замена остатка \„р на более отрицательно заряженный и гл^рофальнк-Л остаток
4 i-аботч провоаились о Институт" Всеяно;! Ахяз&ет медииияегого vчилига ь г..Тенин гриде/Днститу-ге иммунологии
'.■//'.т.-тьч i-здерации. Гддж.НЯЗИ.
Glu .привела к получению пентапептида с меньшей биологической активностью. Замена слабокислого остатка тирозина на более гидрофобный и основной остаток триптофана привела к более сильной потере биологической активности.Две аминокислотные законы в положении 34 остатка Asp на Glu и положении 36 остатка Туг на Тгр приводит к потере более чем 50% биологической активности. Следовательно, положение 32,34 и 36 играют важную роль в проявлении аналогами тикопентина свойственной тимопоэтиначбиологичес- ' кой активности и от аминокислот,находящихся в этих положениях, может зависеть сила взаимодействия пептидов с полярными структурными элементами в липофильной среде мембраны на клеточной поверхности .
Полученные здесь результаты говорят в пользу предположения (Heavaer et al IS65), согласно которому связывание тим'опоэ-тина с рецептором более активно идет по положениям 32,34 и 36,а аминокислоты в положениях 33 и 35,возможно,включаются в основном в создание присущих молекуле изгибов, модельно совмещаемых с предварительно теоретически вычеслекиыш конф-оркациями.
С целью изучения влияния проведенных с-чмен на вторичную структуру пептидов был проведен теоретический анализ вторичной структуры уимопоэтина по методу Choy P.Y., Fasraan G.O., 1978. Профили вероятного расположения ci -спиральных, ^-складчатых участков и -изгибов в молекуле тимопоэтина приведены на pnc.II. Согласно сделанным расчетам, участок 32-36 молекулы тимопоэтина с больвой вероятностью принимает Ji-складчатую конформацию. Но классификации Чоу и Фасмана аспарагиновая кислота является индифферентно;; как к образованию ¿^-спиральных, так и ^-складчатых участков.а тирозин является разруиающим е^-спирали и обра>-зующим Jî-структуры остатком.Замена этих аминокислот на сильно ¿X/ -образующий остаток глутаминовой кислоты и ^-образующий остаток триптофана нарушает ^-структуру участка 32-36 и, как следствие этого,снижается биологическая активность аналогов тимопен-тина.
Присоединение слабогидрофобного и имеющего сильный положительный заряд остатка аргинина к С-кон"евому остатку тирозина приводит к получению гекгапептида с биологической активностью рашюЯ активности тамопентина. Вероятно, присутствие положительного заряда на С-конце тимопентина облегчает взаимодействие пептида с клеточными рецепторами,результатом чего являет-
гексагйпт/дкого анашга,сосчитанная та -.нзтоду Чэу и ïac-
ся высокая биологическая активность гексапептида. Кроме того, если рассматривать данный гексапептщ/как фрагмент 32-37 молекулы тимопоэтина у которого остаток ваяина в положении 37 заменен остатком аргинина, то с точки зрения изменения втор;.-.ной структуры(рис.11 обозначены пунктирной линией), такая замена увеличивает вероятность образования р -структуры, что также может влиять на увеличение биологической активности.
Следовательно,зависимость биологической активности от аминокислотной последовательности пептида проявляется не только на уровне первичной структуры, определяемая наличием, гидрофильных, гидрофобных и заряженных аминокислотных остатков, но и на уровне вторичной структуры, которая определяет полноту связывания пептидов с клеточными рецепторами.
Результаты исследования биологической активности синтезироп. ванных дипептидньгх аналогов пептида Н-С1и-Тгр-0Н приведены в таблице 2.
Результаты биологических исследований синтезированных дипепти,довх(3^-с!.!.стр117) Табл.2
------1-
Формула дипептида !Биологическая активность относитель-
но тимозина оЬ^, й
1. Н-С1и-Тгр-0Н 100,0
2. Н-Тгр-Ии-ОН 0,0 Н-Т'гр-5ег-0Н 0,0
А. Н-Эег-Тгр-ОН 0,0
5. Н-Н1б-Тгр-0Н 0,0
6. Н-Ие-Тгр-ОН 100,0
7. Н-Ьси-Тгр-О:! 0,0 Ь. П-Ьуз-Тгр-ОН 0,0 9. Н-Уг;1-Тгр-0К 0,0 Ю.И-Аср-Тгр-ОК 30,0
илиро--ГЛи-Тгр-ОН 40,0- "
т?.;;-г,1и-он 50,0
^гр-ОН
Как видно из таблицы, пептиды н-с;1и-тгр-0н,н-1.1с-тгр-0н , 1!-сии(Тгр-он)-он, пироС1и-Тгр-сн, и-Азр- Тгр- .он имеют актив-
¡^ость равную 100,100,50,40 и 30% активности тимозина р соответственно.
Если расположить и -концевые аминокислоты в порядке уменьшения их гидрофильности согласно данным (Иеккег Е1.Р., 1977),то можно увидеть,что при переходе от более гидрофильной аминокислоты (глутамино; ой) к менее гидрофильной(аспарагиновой) биологическая активность синтезированных пептидов снижается и пептид Н-с1у-тгр-0Н является уже полностью неактивным.
Кроме гидро^ильности аминокислот для проявления биологической активности, по всей вероятности,необходимо наличие у -концевой аминокислоты сгободной карбоксильной группы, значение рК котороя может влиять на биологическую активность пептида за счет возможного образования внутренних солей. Сила электростатического взаимодействия между положительно и отрицательно заряженными частями которой будет зависеть от рК боковой карбоксильной группы./ аспарагиновой кислоты оК ^-СООН-группы равна 3,6а, а у глутаминовой-3,22. И, возможно, из-за того,что боковая карбоксильная группа глутаминовой кислоты обладает более сильными кислотными свойствами, образуются более стойкие внутренние соли и пептид Н-01и-Тгр-0Н имеет высокую биологическую активность, а"пептид Н-А.зр-Тгр-ОН - обладает активностью,равной 30£ активности пептида Н-01и-Тгр-0Н.
Также возможно образование водородных связей между гидрок-силом боковой карбоксильной группы и ДН-группой индольной части остатка триптофана, за счет чего пептид принимает конфермя-цип,необходимую для проявления им биологической активности.Причем этот вариант образования вторичной структуры пептида является более вероятным.В связи с тем,что у пептида Н-31и(Тгр--0Н)-0Н остается свободной «СДЗООН-группа, ее рК=2,19, то в случае образования внутренних солей его активность должна быть выше активности пептида н-Ии-Тгр-ОН .Однако этого не происходит и активность н-С1и(Тгр-0Ю-0Н в два раза ниже активности пептида Н-П1и-Тгр-0Н .Но если допустить образование водородных связей, сила которых зависит от расстояния мехцу группировками, их образующих, то можно объяснить разницу в биологической активности синтезированных пептидов. Расстояние мечщу индольной и ^-СООН группами "у пептида к-г-1и-Тгр-он меньше, чем у пептида н-С1и(Тгр--0Н)-0Н и поэтому его активность вьпе и его конформйция являет-
ся оптимальной для проявления высокой биологической активности. У аспар агиновой кислоты jfc-COOH группа находится дальше от индольной группировки триптофана и активность этого дипепгида составляет 30л активности дипептида H-Glu-Trp-OH.
Относительно высок:угё(4СЙ активности H-Glu- Trp-OHj активность дипептида пиро- Glu-Trp-QH вероятно,можно объяснить тем,что его информация близка к оптимальной не за счет образования водородных связей, в за счет каких-то кснформационнЬх изменений.
Исключением является дипептид Н-11е-Тгр-ОН, который проявляет активность, равную активности H-Glu-Trp-OH хотя Н-конце-вым остатком этого пептида'является незаряженный и гидрофобный остаток изолейцина.
При изучении биологической активности синтезированного бур-сина in vitro было показано,что он обладает активностью природ- . ного гормона. Учитывая биологическую активность бурсина и дипептида H-Glu-Trp-OH можно было ожидать, что синтезированный гибрид этих пептидов H-bys-His-Gly-lffl-NH-Trp-GlUH Н будет, одновременно проявлять и Т- и В-активность. Однако, этот пептид при исследований in vitro не проявил биологической активности ни по отношению к дифференциации Т-клеток, ни по отношению к дифференциации В-клеток. Вероятно, это связано с тем; что со стороны дипептида H-Glu-Trp-OH у остатка триптофана отсутствует свободная «¿-карбоксильная группа, а со стороны бурсина-сво-бодная амвдная группа.
ВЫВОДЫ
1. Методом активированных эфиров синтезировано 42 различных пептида - фрагмента природных тимопоэтина и тимозина ctj.Bte-
. стороннее изучение их свойств позволило решить теоретические и практические проблемы создания лекарственных препаратов на основе тимусных гормонов.
2. Установлено,что биологическая активность тимопентина и его аналогов, проявляемая в тесте Е-розеткообразования клетки, является сравнимой с активностью тимопоэтина. Активность тимопентина и его гексапептидного аналога H-Arg-Lys-Asp-Val--Tyr- A.rg-OH равна активности известного тимопоэтина.
3. Разработана оптимальная схема синтеза дипептида H-Glu-Trp-OH проявляющего активность тимозина <A/j, и его 26 ди-,три,тетра-и пентапептидных аналогов.
4. Установлено, что в тесте Е-розеткообразования клетки биологическая активность дипептидов H-Glu-Trp-OH.H-Ile-Trp-OH,
H—С! 1 u(Тгр-ОН)-ОН rapO-Glu-Trp-OH.H-Asp-Trp-OH по сравнению с биологической активностью известного тииозина o6j составляет соответственно 100,100,50,40,и ЗСЙ.
5. С использованием методов активированных эмиров и смешанных ангидридов путем ступенчатого наращивания пептидной цепи начиная с V-конца синтезирован амид трипептида с последова -тельностью н-ьуз-н1з-01у-ин„, являющийся гормоном бурсы Фабрициуса - буренном, избирательно дифференцирующим Б-клетки.
и его гибридный аналог с дипептидом H-Glu-Trp-CH. Биологическая активность синтезированного бурсина, определяемая in vitro, соответствует биологической активности природного го-.рмона.
6. Индивидуальность и состав полученных пептидов были подтверждены данными аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии и аминокислотного анализа.
По материалам диссертации опубликовано:
1. Дейгин В.И..Короткое A.M..Помогайбо C.B.,Бобиев Г.М.,Халиков Ш.Х.,Гречанинова Л.А.,Михальцов А.Н.,Титов М.И. Синтез и исследование биологической активнеоти иммуноактивных пептидов. //УП Всесоюзный симпозиум по химии белков и пептидов.Тез. докл.Таллин.-19-23 октября ISb7.-C.I73.
2. Дейгин В.И.,Короткое A.M.,Бобиев Г.М.,Михальцов А.Н.,Т^тов М.И.Выделение и структурно-функциональное исследование иммуноактивных пептидов.//Цитомедамат.Тезисы I Всесоюзной конференции по биорегуляторам!, Ленин град.-19Ь7.
3. Бобиев Г.М.Синтез низкомолекулярных иммуноактивных пептидов. (Сообщение I).//Республиканская научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов.Тез .докл.Душанбе.1937,--С.49.
4. Бобиев ГЛ.Синтез дипептидов,выделенных их тимолиновых îpaK-•Д1й экстракта тимуса.//Республиканская научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов.Тез.докл.Душанбе. -13-14 апреля IStí9.-C.63-64.
г). Бобиеб Г.М. Синтез трипептида H-Lya-His-Gly-mî, бурсика-гормона бурсы {абрициуса.//Республиканская научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов.Гез.докл.Ду-
1 шанбе .-13-14 апреля ISÔ9.-C.65-66.
6.Бобиев Г.М. Синтез аналога бурсина.//Материалы научнойкснфе-ренции "Теоретические и прикладные проблемы химии" .Тез .г о .сл. Душанбе.-1995.-С.59.
7.Бобиев Г.М. Синтез низкомолекулярных иммуноактивных пептидов (Сообщение 2).//Материалы научной конференции, посвященной 50-летию Института химии им.В.И.Никитина АН Республики Таджики стан. Тез. докл. Душанбе.-1996. -С 3.1.
В.Бобиев Г.М. Биологический свойства низкомолекулярных иммуноактивных пептидов.//Материалы научной конференции,посвященной 50-летии Института химии им.В.И.Никитина АН Республики Таджики стан . Тез .докл .Душанбе . -1996 . -С .22 •
9,Бобиев Г.М.,Алиева C.B. Использование метода активированных эфиров для синтеза тимопентина и его аналогов.//Материалы научной конференции, посвященной 50-летию Института химии им. В.И.Никитина АН Республики Таджикистан.Тез.докл..Душанбе.-1996.
Ю.БобиеГ) -Г.М. Синтез и биологическая активность тимопентина и его аналогов.//Диагностика, лечение и профилактика ин?екци-онпньгх, инвазионных и незаразных болезней сельскохозяйственных животных.Сб.научн.тр.ТаджНИВИ.Душанбе.-1995.-С.82-86.
П.Бобиез Г.М. Пептиды,обладающие активностью тимозина
//Диагностика, лечение и профилактика инфекционных, инвазионных и назар?.зных болезней сельскохозяйственных животных,Сб. научн.тр.ТаджНИВИ .Душанбе.-1995.-С.86-89.
-с.23,
РАКАЗ 287 ТИРА1:'50 ОБ!ИЛ 1,5 п.л. ПОДПИСАНО к ПЕЧАТИ 9.04.^6 г. ДУШАНБЕ ПЕРВАЯ ТШЮГРАНШ