Влияние бифункциональных аминокислот на биологическую активность аналогов тимопентина тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

* / ' , . •

.'• 'г.,:.'' V-' ' ' . _ "V г--..,

АКАДЕМИЯ НАУК РЕС1ЖШШШ ТАЩШСШ ИНСТИТУТ ХИМИИ имени В.И.НИКИТИНА

На правах рукописи

ШАХМАТОВ АЛЕКСАНДР НИКОЛАЕВИЧ

ВЛИЯНИЕ ШШИЩЮШШШ АМИНОКИСЛОТ НА БИОЛОГИЧЕСКУЮ ШШШШк АНАЛОГОВ ИМОШНШНА

(Специальность 02.00,03 - Органическая химия)

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата химических наук

НАУЧНЫЙ РЛСОВО^ШЬ: кандидат химических наук

шдав г.м.

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ:

академик АН Республики Таджикистан, доктор медицинских наук, профессор

аддАРов к.х.

МШШ - 1999

Список использованных сокращений........................3

ВБЕ^рСНИЕ ..••.»••«•••••■••»»»•••••*•«*«»••«••».......»«..4

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР .......................•••...••.•..в

2.1. Предсказание вторичной структура белков по аминокислотной доследовательносад..................6

2.1.1. Вероятностные методы............................ .8

2.1.2. Физико-химические методы .....12

2.1.2.1. Методы, основанные на стереохимических

данных •.««>»»•«.«•..«.»«»..«.««*•»......•*»..*12

2.1.2.2. Методы, основанные на статистической механике .14

2.2. Взаимосвязь между структурой и функциями низкомолекулярных пептидов............................15

2.3. Выделение и биологические функции тимусных гормонов ...*.•.•*•.....•.•.».....•..«.*••.«••>..»....18

2.4. Синтез тимопоэтинов» их фрагментов и аналогов.....21

3. ОБСУЗДЕШЕ РЕЗУЛЬТАТОВ..............................33

3.1. Изучение вторичной структуры тимопоэтина и аналогов тимопентина................................ .33

3.2. Синтез тимопентина и его аналогов.................47

3.3. Изучение биологической активности синтезированных аналогов тимопентина ..............................63

3.4. Структурно-функциональные исследования ............64

4. ЖШШШШШ ЧАСТЬ.............................68

ВЫВОДЫ •««##« «ее«*»« ««09 »»осе«*« ^Й»

Список использованных сокращений

Тгоо - 9 ¡!>*$-трихлорэтилоксикарбонильная группа

% - карбобензоксигруппа

Вое - трет-бутилоксикарбонил&ная группа

ОР^р - пентафторфенил

ОМ -сложноэфирная этильная группа

В21 - бензильная группа

Мроо - 2-(1-адамантил)-2-пропилоксикарбонильная группа

Аос - аллилоксикарбонильная группа

ОТсе - ^» ^ -трихлорэтиловый эфир

МЬв - метилен-2-сульфонильная группа

!Щ - трифторметансульфокислота

«Еоз - тозильная группа

ЛоВвж -циклогексиловый эфир

ШВОХ - водорастворимый карбодиимид

ФозОН - п-толуолсульфокислота

РДСК - реакция длительного связывания комплемента

ИФА - мммунофз рментны й анализ

Актуальность проблемы. Исследование структурной и функциональной организации молекул пептидно-белковых лмгандов» поиск ж изучение группировок, обеспечивающих процессы **узанавадаяи» компл&ксообраэования и активации клеточных рецепторов, имеет огромное значение для изучения механизмов их действия на молекулярном уровне и понимания общих принципов функционирования клеточных регуляторных систем. Это обусловлено тем» что в различных биологических системах, таких как фермент-субстратное взаимодействие, реакции фотосинтеза и переноса электронов» проявление аллостерических эффектов» формирование четвертичных структур белков и т.д., принципы я закономерности пептид-белкового и белок-белкового взаимодействия являются одни» и теш; же. Выявление .механизма действия пептидных лигандов кроме научного» обладает и огромным практическим значением» так как выяснение основных закономерностей строения и действия молекул природных биорегуляторов является необходимой предпосылкой целенаправленной модификации их структур с целью создания новых биостимуляторов и лекарственных препаратов для медицины ш ветеринарии. "

Одной из главных задач при лечении различных заболеваний человека и животных является восстановление и коррекция нарушенной деятельности иммунной системы организма. Исследования последних десятилетий показали» что в регуляции иммунологических реакций ключевое значение имеют пептидно-бел ко вые вещества -иммуноглобулины и их фрагменты»'основные негистоновые белки, гормоны тимуса, которые координируют образование» дифференциацию и функциональную активность иммунокомпетентшх клеток крови. Эти вещества при введении в живой организм оказывают на не-

го иммуномодулирущее действие. Но поскольку они труднодоступны» лабильны, либо неспецифичны, основной путь создания новых средств избирательной коррекции отдельных звеньев иммунной системы состоит в их химическом синтезе на основе доступных природных или синтетических низкомолекулярных пептидов.

С этой точки зрения одними из наиболее перспективных в качестве основы для создания ищуномодулирукицих препаратов являются тимопоэтины, участвующие в процессах созревания и дифференциации Т-клеток. У этих гормонов определен активный центр -фрагмент 32-36 с последовательностью Н-Аге-Ьув-Азр-ТаХ-гуг-ОЫ , называемый тимопентином. Однако несмотря на большое количество синтезированных его аналогов, до настоящего времени не наедены какие-либо структурные закономерности, объясняющие наличие или отсутствие биологической активности у аналогов тимопентина, без знания которых невозможно создание высокоактивных и специфичных иммуномодулирующих препаратов. Поэтому проведение структурно-функциональных исследований, а также синтез на основе их результатов биологически активных аналогов тимопентина является достаточно актуальным.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы являлся синтез тимопентина и его аналогов, выбранных на основе теоретического расчета вторичной структуры, изучение их биологической активности и проведение структурно«»фушциональных исследований в ряду синтезированных пептидов.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

- провести теоретический расчет вторичной структуры тимопоэти-на, активного центра гормона и его аналогов;

- разработать новую методику синтеза тимопентина я его аналогов,

позволяющую получать конечный продукт без выделения и дополнительной очистки промежуточных соединений и изучить их биологическую активность;

- на основе сопоставления вторичной структуры пептидов с их биологической активностью определить закономерности, объясняющие наличие или отсутствие биологической активности у аналогов тимопентина.

Научная новизна. Проведен теоретический расчет вторичной структуры тимопозтина, активного центра гормона и его аналогов. Впервые синтез тимопентина и его аналогов проведен с использованием пентафторфенило вых эфиров без выделения и дополнительной очистки промежуточных активированных эфиров и защи-¡ценных пептидов. Доказано, что применение биологически активных аналогов тимопентина с живой противотейлериозной вакциной способствует усилению антителогенеза у иммунизированных животных.

Практическая значимость. Предложен практический подход в оценке биологической активности аналогов тимопентина, основанный на расчете их вероятной вторичной структуры, который может быть использован для синтеза биологически активных пептидов. Методика синтеза пептидов, позволяющая получать конечные продукты без выделения и дополнительной очистки промежуточных активированных эфиров и защищенных пептидов может быть рекомендована для синтеза пептидов. Синтезированные пептиды после глубокого изучения иммунологических свойств могут быть использованы в лечебной практике.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на конференции "Морфологические и физиологические основы адаптации организма" (Душанбе,1997), республиканской конференции,

посвященной 50-летию Таджикского государственного национального университета "Вклад ученых биологов в развитие биологической науки в Таджикистане" (душанбе,1998).

Публикации. Но материалам диссертации опубликовано II работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 121 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающего 162 источника, из них §4 отечественных ш IQ8 зарубежных авторов, приложения.

2, ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОШОР

2,1. Предсказание вторичной структуры белков по аминокислотной последовательности.

Известно, что в порядке расположения аминокислот заложена полная информация о структуре белка /63/. Поэтому считается, что можно установить пространственное строение молекулы белка по его аминокислотной последовательности. Существующие методы предсказания вторичной структуры по аминокислотной последовательности можно разделить на две группы: вероятностные и физико-химические . К первой группе относятся методы, которые устанавливают закономерности на основе статистического анализа исходных рентгеноструктурных данных. Физико-химические методы используют иную структурную информацию.

2.1.1. Вероятностные методы.

В 1972 г. Диркс /ЬШ/ применил сашй простейший, чисто статистический подход. Он определил частоту встречаемости каждого из 20 аминокислотных остатков в сС-спиралях, £ -структу-раз и реверсивных поворотах цепей (гЪ ), использую кристалло- ■■ графические структуры белков. Эти частоты были затем приняты в качестве характеристик$ отражающих склонность остатков встраиваться в оС - и гЬ-конформации.

Для предсказания сС -С^3-, згЪ») структуры остатка в каждом положении цепи рассчитывался потенциал Ы- - (~9 гЬ-) как среднеарифметическое ы. - (^3 склонностей ® ближайших

по цепи остатков. Как только потенциал оС - (^3-, превы-

шал некоторое пороговое значение, для остатка предсказывалась об - г1>») конформация. Схема определения среднеарифмети-

ческого фиксировалась. Три пороговые величины, а также значение

ш были выбраны по наилучшему совпадению предсказанном и наблюдаемой вторичной структуры в исходном наборе. Оптимальные значения щ равны 17» XI и 3» соответственно, для аС-, р - и предсказаний.

Также для предсказания реверсивных поворотов Льюисом и др. /105/ была использована информация об отдельных остатках (синг-летах). Эти авторы определяли реверсивные повороты пептидной цепи как фрагменты из четырех остатков 1, 1+1 , 1+2 , 1+3 , в которых расстояние между С,^ -атомами в положении 1 и 1+з меньше 7А, а цепь при этом не находится в «¿-спиральной конформации. Однако, в отличие от Диркса, четыре положения в повороте не считались эквивалентными. Частота встречаемости, определенная для каждого остатка в положениях 1, 1+1 » 1+2 , 1+3 была названа "склонностью данного остатка встречаться в данном месте поворота". гЪ-Потенциал квартета остатков затем определялся как произведение соответствующих склонностей. Пороговое значение потенциала было установлено по наилучшему совпадению с известными экспериментальными данными.

Подобные частоты встречаемости использованы'Кроуфордом и др. /79/, и затем Чоу ж фасманом /75/ для предсказания реверсивных поворотов цепи, идентифицированных согласно данным Льюиса и др. /105/.

Простой подход с использованием еинглетдох склонностей применили также Птицын и Финкельштейн для оС-». и ^ -предсказаний /41,42/. Но утверждению этих авторов /86/ никакой дополнительной информации из встречаемостей пар остатков (.дублетов) получить нельзя. Но поскольку они использовали данные всего 9 белков и разделение 20 остатков на четыре категории было произведено довольно произвольно, это их положение является достаточно спорным.

Поэтому многие метода предсказания используют информацию о дублетах» поскольку она отражает взаимодействие между близкими по цепи остатками. Например, Неритм /121/ использовал дублеты для предсказания ¿¿--спиралей и -структур чисто вероятностным методом» Он рассмотрел 27 дублетов, в каждом из которых остатки находились в положениях 1-1 , iXz ..&£б в расчете на то, что при более далеких расстояниях взаимодействия между остатками отсутствуют, Всего было получено 10800 дублетов разных видов* Дня каждого остатка была рассмотрена возможность реализации состояний об, J3- и клубка (ни d-э ни. j$ состояние).' Дня предсказания вторичной структуры данного остатка в конкретной аминокислотной последовательности по таблице оценивались и комбинировались по стандартной статистической методике склонности к клу-

бок) структуре 27 типов дублетов. Таким путем был получен (jв-, клубок-)потенциал. Затем эти потенциалы сопоставлялись и самый высокий мз них выбирался для определения состояния.

Для предсказания d JB - и rfe-конформаций Робсон я др. /118,126-131,145/ использовали синглеты совместно с 16 дублетами,-образованными анализируемым остатком м остатками, находящимися в положениях 3Д1 # ¿¿8 » Склонности синглетов и дублетов были определены по соответствующим частотам встречаемости в базовом наборе, а затем преобразованы в d -, J3 - и ^потенциалы для данного положения остатка с помощью стандартных методов теории информации. Эти.потенциалы сопоставлялись с тремя различными порогами, по одному на каждый тип вторичной структуры. Выла проведена также раздельная коррекция всех трех порогов по лучшему соответствию между предсказанной и наблюдаемой в базовом наборе вторичной структурой. Предсказания d J5 - и ^структур проводились независимо одно от другого.

Нагано /112-216/ использовал те же дублеты» что и йерити /121/, но в качестве максимального расстояния использовал не б, а 7 остатковЭто дало Ш дублетов,, влияющих на анализируемый

остаток. Таким путем были определены склонности всех типов дубле:. тов данного остатка конкретной аминокислотной последовательности, а затем их линейной комбинацией были получены о*' -, и ^потенциалы. Аналогично Робсону и др. ,./126-131/, Нагано обосновывал свое предсказание на раздельном сопоставлении потенциалов с тремя разными порогами. Кавдый порог подгонялся до получения наилучшего соответствия в базовом наборе. Нагано также расширил использующийся базовый набор путем добавления (с малым весом) информации, полученной из аминокислотной последовательности белков» гомологичных белкам с известной структурой, и в своей более поздней работе /115/ он предпринял попытку учета частот встречаемости и склонности триплетов.-

Кабат и Ву использовали триплеты соседних в последовательности остатков для предсказания не только вторичной структуры /162/, но также и свертывания всей цепи /99,161/. Для предсказания укладки цепи углы (ф, Ц ) центральных остатков всех: триплетов в белках с известными трехмерным! структурами, образующими базовый набор» были записаны в виде таблицы {Ф % ^ )» которая включала 20 20 20 » 8000 позиций, по одной на каждый тип триплета.

Этот метод был применен к предсказанию общего свертывания цепи группы родственных белков (цитохроми е или иммуноглобулины),; где многие аминокислотные последовательности характеризуются аналогичной укладкой цепи, т.е. идентичными углами (Ф * ^ )• Поэтому

для данного остатка в положении можно составить триплеты , 4 » ) по всем гомологичным белкам, а затем с помощью таблицы

{ф9 if ) выбираются в качестве предсказательных для остатка ¿ , Предсказанное свертывание цепи получают повторяя эту процедуру для всех остатков.

2.1.2. Физико-химические методы.

Физико-химические методы в отличие от вероятностных основываются не только на известных корреляциях между аминокислотной последовательностью и структурой в базовом наборе глобулярных белков, а используют также другие экспериментальные и теоретические данные. Эти методы можно подразделить на применяющие стерео-химический анализ и статистическую механику.

2.I.2.I. Методы, основанные на стереохимических данных.

Самый простой стереохишчвский подход для предсказания был предложен Кунтцем /103/. Он обратил внимание на то, что повороты цепи располагаются почти исключительно на поверхности белка. В связи с этим, им было высказано предположение, что все триплеты

полярных остатков (Asp, Glu, Gly, His, I#s9 Asn, Pro» Slix, Argf Serf fiupr Туг ) имеют конформацию реверсивного поворота.

Несколько другой подход был предложен Шиффером и Эдмундсо-ном /Х34Д35/. С помощью графов, содержащих 5 витков спирали, ими было показано, что неполярные остатки группируются на одном краю спирали, образуя неполярные дуги. Пример такого -спирального колеса показан на рис. I. Дня предсказания спирали авторы исследовали наличие неполярных триплетов в положениях±, , д+4 (относительные положения 1-4-5), а также в положениях ¿, i-3 t ¿«4 (1-2-5) данной аминокислотной последовательности. Затем эти положения были приняты за спиральные нуклеации и относительно них были построены "спиральные колеса". Предполагалось,

Рис, I. Спиральный круг Сиконцевой об-спирали аденилат-киназы.

а - круг представляет собой проекцию положений всех боковых цепей вдоль оси спирали на плоскость Остаток в положении I - УаХ -179, последний остаток в положении 16 - ьуз -194. Неполярные остатки (обведены кружками) располагаются с одной стороны спирали, которая в трехмерной структуре обращена к гидрофобному ядру? другая сторона спирали составляет часть внешней поверхности молекулы, б - положения боковых цепей на цилиндрической диаграмме -тС-спира-лй. Остатки, образующие