Синтез некоторых низкомолекулярных иммуноактивных пептидов и их координирующие свойства при взаимодействии с ионами цинка и меди тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

На правах рукописи

ЧАРИЕВА САЙДА АЛЛАМУРАТОВНА

СИНТЕЗ НЕКОТОРЫХ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ИММУНОАКТИВНЫХ ПЕПТИДОВ И ИХ КООРДИНИРУЮЩИЕ СВОЙСТВА ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С ИОНАМИ ЦИНКА И МЕДИ

02.00.03 - органическая химия

Ч

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени - кандидата химических наук

Душанбе-2010

4843217

Работа выполнена на кафедре органической и биологической химии Таджикского государственного педагогического университета им. С.Айни и в Обществе с ограниченной ответственностью «Зацд».

Научные руководители: доктор химических наук, профессор Бандаев Сироджидин Гадоевич доктор биологических наук, профессор Бобиев Гуломкодир Муккамолович

Официальные оппоненты: член-корр. Академии наук Республики Таджикистан, доктор химических наук, профессор Куканиев Мухамадчо Ахмадович кандидат химических наук Юсупов Тилло Юсупович

Ведущая организация: Таджикский государственный медицинский университет им. Абуали ибни Сино, кафедра биоорганической и физколлоидной химии

Защита состоится «12» января 2011 г. в Ю00_часов на заседании диссертационного совета ДМ 047.003.01 при Институте химии им. В.И.Ншагпгаа АН Республики Таджикистан по адресу: 734063, г.Душанбе, ул. Айни, 299/2. Е-таИ: gulchera@list.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института химии им.В. И.Никитина АН Республики Таджикистан.

Автореферат разослан « »ПС-Р^\а020Ю г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

КасымоваГ.Ф.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В последние десятилетия методы синтетической органической химии находят все более широкое применение при синтезе аналогов биологически активных веществ с целью создания новых высокоэффективных лекарственных препаратов. Перспективными соединениями для создания на их основе высокоэффективных и нетоксичных иммуномодулирующих препаратов являются низкомолекулярные иммуноактив-ные пептиды и их координационные соединения с биометаллами. Также, одной из перспективных аминокислот является тирозин, входящий в состав биологически активных пептидов - лейцин-и метионин-энкефалинов, тимолентана, окситоцина и вазопрессина, гонадолиберина и целого ряда других, а также активных центров многих ферментов. Кроме этого, тирозин входит в состав активного центра тимусного гормона тимопоэтина и иммунологически активного пентапептвда, представляющего собой активный центр тимопоэтина — тимопентша и применяемого в медицинской практике в качестве иммуности-мулирующего препарата. Другой перспективной аминокислотой является триптофан, обладающий нейро-и иммунотропной активностью.

Одной из важнейших систем, обеспечивающих нормальную жизнедеятельность организма, является имммунная система, выпол-няюхцая свои функции в тесном взаимодействии с нервной и эндокринной системами. Из экстрактов тимуса, центрального органа иммунной системы, были выделены триптофансодержащие дипептиды Н-Ии-Тгр-ОН и Н-Пе-Тгр-ОН, обладающие не только иммунотропной, но и психотропной активностью.

Установлено, что биологическая активность пептидов определяется активностью составляющих их аминокислот. Многие процессы в организме, вызываемые короткими биологически активными пептидами, основаны на реакциях комплексообразования, в том числе и с ионами биологически активных металлов. Установлено, что при образовании координационных соединений биологически активных пептидов с ионами биологически важных металлов - железом, цинком происходит увеличение специфической активности пептидов. Биометаллами, имеющими важное значение для функционирования иммунной системы, являются медь и цинк. Вследствие этого координирующие свойства аминокислот и низкомолекулярных пептидов с ионами различных металлов являются одними из наиболее интенсивно изучаемых, и продолжение исследований в этом направлении имеет огромное практическое значение и является весьма актуальным.

Важным этапом при этом является определение состава образующихся координационных соединений. Применение спектрофотометрических методов ограничено тем, что из 20 природных аминокислот только фенилаланин, тирозин и триптофан обладают собственным поглощением, а также тем, что при ионизации их функциональных групп максимумы поглощения смещаются в коротко- или в длинноволновую области на 1-2 нм, в результате чего перекрываются максимумы поглощения исходных аминокислот и образующихся координационных соединений. При изучении комплексообразования ионов бесцветных металлов применение спектрофотометрических

методов вообще невозможно. Все это обуславливает необходимость поиска способов применения спектрофотометр ических методов при изучении комштексообразования бесцветных ионов металлов с аминокислотами.

Все вышеизложенное обуславливает особую актуальность поиска путей синтеза низкомолекулярных пептидов и изучения их комплексо-образующих свойств с ионами меди и цинка.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка оптимальных схем синтеза триптофансодержащих дипептидов Н-УаУГгр-ОН и Н-Иу-Тф-ОН, гистидинсодержащего аналога дипептидного тимомиметика Н-Шв-Не-Тф-ОН, тарозинсодержащих аналогов фрагментов дерморифина и изучение комплексообразунмцих свойств дипелтвдов Н-Оу-Тгр-ОН и Н-Уа1-Тгр-ОН, биологически активных аминокислот тирозина, аргинина и триптофана с медью и цинком.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

разработать оптимальные схемы синтеза дипептидов Н-Уа1-Тгр-ОН и Н-01у-Тгр-ОН;

разработать оптимальную схему синтеза и синтезировать гистидин-содержащий аналог дипептида Н-11е-Тф-ОН - Н-Н'ю-Ие-Тф-ОН; - ■ синтезировать тирозинсодержащие аналоги фрагментов дерморифина;

изучить комплексообразукнцие свойства тирозина, аргинина и триптофана с ионами Си1+ и 2пг+;

изучить границы применимости спектрофотометрических методов для определения состава координационных соединений, образующихся при взаимодействии тирозина и дипептида Н-Иу-Тф-ОН с ионом Zn2+;

методом рН-метрического титрования определить состав и константы образования координационных соединений, образующихся при взаимодействии дипептидов НЧЛу-Тф-ОН и Н-Уа1-Тгр-ОН с ионом Хп2+.

Научная новизна. Впервые синтезирован гистидинсодержащий аналог пептидного тимомиметика Н-ЬКв-Пе-Тф-ОН. Определены состав и константы образования координационных соединений дипептидов Н-Иу-Тгр-ОН и Н-Уа1-Тгр-ОН с ионом Zn2+. Показана возможность применения спектрофотометрических методов для изучения процессов комплексо-образования биологически активных аминокислот тирозина и триптофана с ионами Си2+ и 2пг+.

Практическая значимость. Разработаны оптимальные схемы синтеза триптофансодержащих дипептидов, гистидинсодержащего аналога пептидного тимомиметика - дипептида Н-Ие-Тгр-ОН, содержащего остаток гистидина на И-конце пептидной цепи, тирозинсодержащих тетрапептидных аналогов дерморфина. Разработан-ные подходы к изучению состава координационных соединений тирозина, аргинина, триптофана, дипептидов Н-Уа1-Тф-ОН и Н-01у-Тгр-0Н с ионами Си2+ и Хт?+ могут найти применение при проведении подобных исследований с другими биологически активными низкомолекулярными пептидами и аминокислотами.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию со дня рождения одного из основателей Таджикского технического университета

Сулейманова A.C. (Душанбе,1998 г.), Международной научно-практической конференции, посвященной 60-летию ТаджНИВИ «Актуальные проблемы болезней животных в современных условиях» (Душанбе, 2003 г.), 53-й годичной научно-практической конференции ТГМУ (с международным участием) «Лекарства и здоровье», посвященной 1025-летию со дня рождения Абуали ибни Сино (Душанбе, 2005 г.), научно-теоретической конференции «Современные проблемы физики и астрофизики» (Душанбе, 2005 г.), Международной конференции «Состояние и перспективы развития биохимии в Таджикистане» (Душанбе, 2009 г.), республиканской научно-практической конференции «Проблемами таълимк тафрикдвй» бахшида ба 70-солагии корманди шоистаи Точикистон, академики илмхои педагоги, доктори илмх,ои педагоги, профессор Убайд Зубайдов» (Душанбе, 2009 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 статей и 2 тезиса докладов, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 133 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающего 178 источников и приложения.

Материалы в методы исследования

В работе использовали аминокислоты L-ряда и производные аминокислот, которые получали по стандартным методикам. Ход реакций, индивидуальность и степень чистоты синтезированных соединений контролировали тонкослойной хроматографией (ТСХ). рН-метрическое титрование проводили с использованием рН-метра MS-20 (Чехия).

Электронные спектры поглощения снимали на спектрофотометре СФ-46 в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см.

Состав соединений устанавливали после их предварительного разложения и перевода в раствор с использованием методов комплексонометрического титрования (определение содержания меди) и спектрофотометрически (определение содержания тирозина).

Основное содержание работы

1. Синтез низкомолекулнрных биологически активных пептидов 1.1. Синтез дипептидов H-Gly-Trp-OH и II-Val-Trp-QH

На первом этапе исследования был получен метиловый эфир №°-формил триптофана путем пропускания тока сухого хлористого водорода через раствор триптофана в муравьиной кислоте. Окончание реакции контролировали на УФ-спектрофотометре по поглощению при 298 нм. Продукт реакции осаждали эфиром. Выход хлоргидрата метилового эфира Nm-формил-триптофана составил 94,3%.

В дальнейшем были осуществлены реакции по следующим схемам: Z-Gly-OSu + H-Trp(Form)-OMe — Z-Gly-Trp(Form)-OMe H-Gly-Trp-OH Z-Val-OSu + H-Trp(Foim)-OMe Z-Val-Trp(Form)-OMe H-Val-Trp-OH

. Z-Gly-OSu + H-Trp-OMe —»■ Z-Gly-Trp-OMe —H-GIy-Tip-OH , Z-Val-OSu + H-Trp-OMe ->Z-Val-Trp-OMe ->• H-Val-Trp-OH

Во всех случаях активированные Ы-оксисукцинииидныс эфиры получали карбодиимвдным методом с использованием в качестве конденсирующего реагента дициклогексилкарбодиимида.

Очистку защищенного дипептида во всех случаях осуществляли обработкой их этилацетатных растворов 0,4 М лимонной кислотой и 5% ИаНСОз. После высушивания над безводным сульфатом натрия защищенные дипептиды переосаждали из этилацетата гексаном. Чистоту продуктов контролировали тонкослойной хроматографией. Необходимо отметить, что при обработке кислыми растворами дипептвдов со свободной индольной группой, отмечалось пожелтение кислотного раствора, что свидетельствовало о переходе в него дипептида и непрореагировавшего метилового эфира триптофана с окисленной индольной группой.

Выходы дипептидов составили: 2-01у-Тгр(Рогт)-(Же - 77,4%, Z-Val-Тгр{Рогт)-ОМе - 79,5%, /-«у-Тф-ОМс - 73,6%, 2-Уа1-Тгр-0Ме - 72,4%.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что использование остатка триптофана с защищенной индольной группой позволяет повысить выход защищенного дипептида за счет снижения потерь целевого продукта при очистке обработкой кислыми реагентами.

В первых двух случаях деблокирование защищенного дипептида осуществляли последовательно: каталитическим гидрированием в присутствии 5% палладия на активированном угле для удаления карбобензокешруппы, обработкой 10% раствором триэтиламина для удаления формильной группы и обработкой 1М раствором гидроксида натрия дня удаления сложноэфирной метальной группы. Свободные дипептиды первоначально были очищены экстракцией н-бутанолом из подкисленного водного раствора, а затем многократным переосаждением из водного раствора ацетоном. Выход дипептвда Н-Иу-Тгр-ОН - 99%, Н-Уа1-Тгр-ОН - 98,3%.

В остальных случаях деблокирование защищенных дипептидов осуществляли последовательным проведением щелочного гидролиза в мягких условиях с помощью карбоната натрия для удаления сложноэфирной метальной группы и каталитического гидрирования для удаления карбобензоксигруппы. Свободный дипептид первоначально был очищен экстракцией н-бутанолом из подкисленного водного раствора, а затем многократным переосаждением из водного раствора ацетоном. Выход свободного дипептида составил 99%. Степень чистоты, индивидуальность синтезированного дипептида были подтверждены данными тонкослойной хроматографии.

Дипептид валил-триптофан получали по такой же схеме. Выход защищенного дипептида составил 72,4%, свободного - 93,2%.

Общий выход дипептида Н-Яу-Тгр-ОН с защищенной индольной группой составил 76,6%, со свободной индольной группой - 72,86%, дипептида Н-Уа1-Тгр-ОН - 78,15 и 67,48%, соответственно.

Таким образом, применение при синтезе триптофана с защищенной индольной группой позволяет повысить выход свободного дипептида за счет снижения потерь при очистке защенного и свободного дипептидов. 1.2. Синтез дипептидного тпмомиметика и его шлндин содержат его

аналога

Одними нз пептидных тимомиметиков являются дипептиды глутамил-триптофан и изолейцил-триптофан, оказывающие при введении в организм регулирующее влияние на субпопуляции Т-клеток.

Известно, что гистидин является как медиатором, опосредующим синаптическое возбуждение в центральной нервной системе млекопитающих, так и модулятором синаптической передачи, способствующим защите мембранных рецепторов и клеточных мембран от неблагоприятных факторов окружающей среды вследствие нейтрализации избыточных концентраций протонов, ионов металлов переменной валентности и свободных радикалов. Поэтому было предположено, что введение остатка гистидина на №конец дипептидов изолейцил-триптофан и глутамил-триптофан будет способствовать повышению их специфической активности.

Для проверки этого предположения нами был синтезирован гистидинсодержащий аналог иммуноактивного триптофансодержащего дипептида - трипептид гистидил-изолейцил-триптофан.

Синтез был проведен путем ступенчатого наращивания пептидной цепи начиная с С-конца методом активированных эфиров с использованием в качестве последних п-нитрофениловых, полученных карбодиимидным методом с использованием в качестве конденсирующего реагента дициклогексил-карбодиимида. Схема синтеза данного трипептида приведена на рис. 1.

Рис.1. Схема синтеза трипептида Н-ШБ-Пе-Тгр-ОН.

Для защиты а-карбоксильной группы ! триптофана была использована сложноэфирная метальная группа, а-амино(групп остатков изолейцина и гистидина - карбобензоксигруппа, которую удаляли каталитическим гидрированием в присутствии 5%-ного палладия на активированном угле.

Защищенный динептид г-Пе-Тгр-ОМе первоначально очищали промыванием этилацетатного раствора реакционной смеси кислыми и основными реагентами, а затем переосаждением из этилацетата гексаном. Выход защищенного дипептида г-Ие-Тгр-ОМе ¡вставил 79,4%.

После удаления карбобензоксигруппы каталитическим гидри-рованием дипептид со свободной аминогруппой вводили в реакцию конденсации с п-нитрофениловым эфиром карбобснзоксигистидина сразу после удалений катализатора и замены растворителя на ди мет ил формами д. Первоначально защищенный трипептид очищали также как и дипептид г-11е-Тгр-ОМе.

Окончательную очистку проводили колоночной хроматографией на силикагеле Ь-100/160 при элюировании системой хлороформ-метанол-уксусная кислота (18:2:1). После упаривания элюента и переосаждения из этилацетата гексаном выход трипептида 7,- Н'к-Пе-Тгр-ОМе составил 69,7%.

Деблокирование защищенного трипептида осуществляли последовательным омылением метилового эфира действием №ОН, а затем каталитическим гидрированием. Полученный свободный трипептид переосаждали из метанола эфиром и этилацетатом. Выход составил 79,5%. Общий выход конечного трипептида гистадил-изолейцил-триптофан составил 44%, что позволяет считать метод активированных эфиров одним из оптимальных путей синтеза гистидин- и триптофансодержащих пептидов. 13. Синтез тирозинсодержащих пептидов.

Как известно, тирозин входит в состав многих биологически активных пептидов, в том числе и обладающих нейро- и иммунотропной активностью. Поэтому для синтеза были выбраны тирозинсодержащие пептиды, являющиеся модифицированными фрагментами дерморфина: Н-Туг-Ьуз-РЬе-Иу-ОН и Н-Туг-Туг-Рго-8ег-Ш2.

Тетрапептид был синтезирован методом активированных эфиров путем ступенчатого наращивания пептидной цепи начиная с С-конца по схеме, приведенной на рис. 2.

Туг

Вое

Вое Вое Н

Ьув

РИе

ау

Вое Вое

чОРЬр Н "Вг1

Ш

г г

орър г

ОРЬр н

-ОВи' ОВи' ОВи*

-ОВи*

-ОВи'

-ОВи* -ОВи' -ОН

Рис.2. Схема синтеза тетрапептида Н-Туг-ЬуБ-РЬе-С 1у-ОН.

Для временного блокирования а-аминогруппы фенилаланина использовали харбобензоксигруппу, лизина и тирозина - трет-бутилоксикарбонильную группу, е-аминогруппы лизина -карбобензоксигруппу. Гидроксильную группу фенольного кольца тирозина блокировали бензильной группой. Карбоксильную группу глицина блокировали сложноэфирной трет-бутильной группой.

Дипептид 7-01у-0Ви' получали методом активированных (пентафтор-фениловых) эфиров. Третбутиловый эфир глицина вводили в реакцию конденсации в виде фосфорнокислой соли, которую снимали карбонатом натрия. Реакцию конденсации проводили в течение суток при комнатной температуре. Защищенный дипептид очищали стандартной процедурой промыванием его этил ацетатного раствора кислыми (2% Н2804) и основными (5% ЫаНС03) реагентами. После упаривания этилацетата и кристаллизации из эфира гексаном выход защищенного дипептида составил 87%.

Карбобензоксигруппу с защищенного дипептида удаляли каталитическим гидрированием над палладиевой чернью з присутствия муравьиной кислоты. После промывания раствором бикарбоната натрия выход маслообразного продукта составил 70%.

Дальнейшие стадии конденсации также проводили методом активированных (пентафторфениловых) эфиров, но в отличие от предыдущего синтеза иным был выбор защитных групп. а-Аминогруппы были защищены трет-бутилоксикарбонильной группой, а боковые функции лизина и тирозина -карбобензокси- и бензильной группами соответственно.

Карбобензоксигруппу с дипептида г-РЬе-Иу-ОВи' удаляли каталитическим гидрированием над палладиевой чернью в присутствии муравьиной кислоты. Формиат снимали перед проведением коденсации обработкой 5% раствором бикарбоната натрия. Выход дипептида со свободной аминогруппой составил 70%.

В реакцию конденсации с дипептидом вводили Вос-Ьун^)-ОРГр в диоксане. Активированный эфир использовали с избытком 25%. Выход защищенного трипептида составил 70%.

Для получения тетралептида трет-бутилоксикарбонильную группу снимали действием 70% водным раствором трифторуксусной кислоты в течение 2 часов при комнатной температуре. После упаривания и высушивания под вакуумом выход трифторацетета трипептида составил 100%.

Активированный эфир в реакцию конденсации вводили с избытком 20%. Реакцию конденсации вели в диоксане при комнатной температуре в течение суток. После упаривания растворителя и обычной обработки кислыми и основными реагентами выход защищенного тетралептида составил 68,4%.

Деблокирование тетралептида проводили последовательно каталитическим гидрированием над палладиевой чернью и обработкой 70% водным раствором трифторуксусной кислоты. После переосаждения из метанола этилацетатом выход свободного тетралептида составил 99%.

Синтез тетралептида Н-Туг-Туг-Рго-Бег-М^ был проводили по схеме, приведенной на рис.3.

В этом случае также была выбрана тактика максимальной защиты. На первой стадии синтеза дипептид Вос-Туг(Вг1)-Рго-ОН был синтезирован методом активированных (пентафторфениловых) эфиров. а-Карбоксильную группу пролина защищали солеобразованием с помощью ШОН. При этом использовали двукратный избыток пролина. Реакцию конденсации вели в тетрагидрофуране в течение суток при комнатной температуре. Дипептид обрабатывали кислыми реагентами и кристаллизовали в смеси эфира с гексаном. Выход защищенного дипептида составил 92%. На следующей стадии

было необходимо синтезировать амид трет-бутилоксикарбонил(0-бензил)-серина. Реакцию аммонолиза проводили в хлороформе в присутствии 1 экв триэтиламина путем пропускания сухого газообразного аммиака в течение 20 мин при 0°С. Продукт предварительно был очищен обработкой 1 н раствором карбоната калия, а затем переосаждением из этилацетата гексаном. Выход составил 79,2%.

Туг

Н

Вое Вое Вое

Вое -ЦОРЬр Н В^

Вое Вое Вое

Туг

ОРЬр Н Вг1

Рго

Бег

Вг1

Ш

Ш

Вг1

Вг1

Вг1

Вг1

-<Жа ОК'а Вое

ОН Вг1

ОН Н-|ч£И2 Вг1

Вг1

Вг1

Вг1 ЫН2

-ш2

Рис.3. Схема синтеза тетрапептида Н-Туг-Туг-Рго-8ег-МН2.

Для синтеза трипептида пентафторфениловый эфир защищенного дипептвда Вос-Туг(В21)-Рго-ОН был получен карбодиимидным методом с использованием в качестве конденсирующего реагента дициклогексил-карбодиимида. Пентафторфенол использовали с избытком 20%, дициклогексилкарбодиимид - 4%. Полученный активированный эфир кристаллизовали смесью гексан-эфир (1:1). Выход Вос-Туг(Вг1)-Рго-ОРф составга 94%.

Перед стадией ковденсации трет-бутилоксикарбонильную группу с Вос-8ег(Вг1)-МН2 удаляли обработкой смесью - трифторуксусная кислота-хлороформ (1:1) при комнатной температуре в течение 2 часов. Трифторацетат О-бензилового эфира амида серииа после перекристаллизации из смеси этанол-эфир был получен с выходом 97,3%.

Конденсацию активированного эфира дипептида и амида эфира серина проводили в тетрагидрофуране в течение суток при комнатной температуре. Очистку защищенного трипептида проводили также как и дипептида. Выход продукта составил 97%.

Трет-бутилоксикарбонильнуго группу с защищенного трипептида снимали действием 70% водного раствора трифторуксусной кислоты. Выход трифторацетата трипептида на этой стадии составил 94,1%.

При получении тетрапептида, амино- и карбоксильный компоненты вводили в реакцию конденсации в эквимолярном соотношении. После очистки обработкой кислыми и основными реагентами и кристаллизации из эфира выход защищенного тетрапептида составил 98,8%.

Деблокирование проводили каталитическим гидрированием и обработкой смесью - трифторуксусная кислота-хлороформ (1:1). Выход свободного тетрапептида после кристаллизации из эфира составил 88,2%. 2. Изучение комплексообразукицих свойств биологически активных

аминокислот с ионами биометаллов 2.1. Изучение комплексообразующих свойств тирозина с ионом Хп1*.

Применение спектрофотометрических методов для изучения процессов комплексообразования ограничено тем, что из 20 природных аминокислот только фенилаланин, тирозин и триптофан обладают собственным поглощением, а также тем, что при ионизации их функциональных групп максимумы поглощения смещаются в коротко- или длинноволновую области на 1-2 нм, в результате чего перекрываются максимумы поглощения исходных аминокислот и образующихся координационных соединений. Все это обуславливает необходимость поиска способов применения спектрофотометрических методов при изучении комплексообразования бесцветных ионов металлов с аминокислотами.

В связи с этим, на первом этапе исследований было необходимо определить применимость указанных методов для изучения процесса комплексообразования цинка и тирозина.

Кислотно-основные равновесия тирозина в водных растворах можно выразить следующими уравнениями:

¡УН3+-СН-СООН < 1Г ^ > М1/-СН-СОСГ < ■■> ¡ЧНг-СК-СОО" о

I ' I ' I

сн2 сн2 сн2

I I I

СбН-г-ОН С4Н5-ОН СбНз-ОН

-> Шг-СИ-СООГ

I

снг I

с4Н5-о-

Значения рКь рК2 и рК3 для тирозина составляют, соответственно 2,20, 9,11 и 10,07, Следовательно, ионизация каждой функциональной группы может отразиться на УФ-спектре тирозина. Поэтому, необходимо было определить

влияние ионизации каждой функциональной

положение характерного максимума поглощения при 275 нм.

группы на УФ-спектр тирозина и

Результаты показали, что диссоциация кабоксильной группы тирозина приводила к сдвигу на 1 нм в коротковолновую область максимума поглощения при 275 нм, ионизация аминогруппы - к сдвигу максимума поглощения на 1 нм в длинноволновую область и появлению плеча в области 277-282 нм. При ионизации гидроксильной группы тирозинового кольца отмечалось появление максимумов поглощения при 238 нм и при 292 нм, а в области 275 нм, наоборот, отмечался минимум. Подобные изменения спектра поглощения согласуются с литературными данными.

На втором этапе исследований была изучена применимость метода молярных отношений для определения состава координационных соединений цинка и тирозина

Для изучения взаимодействия цинка и тирозина готовили две серии растворов СХуг = const и С/„ - const с соотношением CTyr/CZn от 0,14 до 7.

Взаимодействие цинка и тирозина осуществляли по схеме:

Zn(CHjCOO)2 + nH-Tyr-OH [Zn(H-Tyr-OH)n](CH3COO)2

Реакцию проводили при 60°С в течение 30 мин.

На УФ-спектрах исследуемых серий растворов в области 270-280 нм отмечается максимум поглощения, характерный для тирозина. После взаимодействия с цинком, максимум поглощения при 275 нм сдвигается в коротковолновую область на 1 нм. Такой незначительный сдвиг свидетельствует о том, что гидроксильная группа тирозина не участвует во взаимодействии с цинком, поскольку при ее диссоциации должны появляться максимумы поглощения при 240 и 293 нм.

Сдвиг максимума поглощения в коротковолновую область свидетельствует о диссоциации карбоксильной группы тирозина. При диссоциации протона карбоксильной группы ароматических аминокислот отмечается сдвиг максимума поглощения в коротковолновую область, а протона аминогруппы - в длиноволновую на 1-2 нм.

Кривые насыщения (рис.4) не имели четко выраженной точки перегиба

Наибольшие отклонения от идеального случая наблюдались при соотношении CXyr/CZn от 0,33 до 1. Объяснением данному факту могут служить два предположения: первое - при взаимодействии цинка и тирозина образуются координационные соединения различного состава и, второе - вследствие незначительных спектральных изменений метод молярных отношений неприменим для изучения комплексообразования цинка и тирозина Предположение об образовании непрочных координационных соединений можно исключить, поскольку в нашем случае отмечается не сглаживание излома на кривой насыщения, а наоборот - кривая имеет зигзагообразный характер.

Таким образом, при взаимодействии цинка и тирозина происходит ионизация карбоксильной группы аминокислоты, о чем свидетельствует коротковолновый сдвиг максимума поглощения, а вследствие малой величины этого сдвига для определения состава координационных соединений, образующихся при этом, метод молярных отношений не применим. В связи с этим, возникает необходимость поиска новых подходов для применения спектрофотометрических методов при изучении комплексообразования цинка и тирозина

Рис.4. Кривые насыщения, полученные при взаимодействии тирозина и цинка при 274 нм —•—CZn = const---«-■•Ctyr = const

Для этого при изучении взаимодействия цинка и тирозина и определения состава образующихся при этом координационных соединений мы применили дифференциальную спектрофотометрию.

Исследовали две серии растворов: в одной - была использована постоянная концентрация тирозина (0,002 М), а во второй - ацетата цинка (0,002 М). Растворы смешивали в соотношениях СтУг/С2п 2:1, 1:1 и 1:2. Координационные соединения получали при 60° С в течение 30 мин. Были сняты спектры: полученных координационных соединений против воды, против эквимолярного раствора тирозина и против эквимолярного раствора ацетата цинка.

Как показали результаты исследований при Cz„=const, дифференциальные УФ-спектры координационных соединений! снятые против эквимолярных растворов ацетата цинка в области 240-350 |нм идентичны спектрам, снятым против воды и соответствуют спектрам тирозина с различной концентрацией.

Отличия отмечаются в области 220-230 нм. На спектрах, снятых против ацетата цинка, у растворов с соотношением тирозина и цинка 2:1 и 1:1 отмечается узкий максимум поглощения при 226 нм.

Наибольшие отличия отмечаются нк УФ-спектрах, снятых против эквимолярных растворов тирозина. Дифференциальный уф-спектр раствора с соотношением тирозина и цинка, равный 1:2 соответствует УФ-спектру тирозина в положительной области с максимумом поглощения при 275 нм.

Дифференциальные УФ-спектры растворов с соотношением тирозина и цинка 2:1 и 1:1 почти целиком лежат в отрицательной области значений оптической плотности. В области 230-250 нм они схожи и имеют максимум при 235 нм, причем более интенсивный у раствора с соотношением компонентов 1:1, где отмечается широкая полоса поглощения в области 245-280 нм.

У раствора с соотношением компонентов 2:1 в данной области отмечается минимум. У обоих этих растворов отмечается максимум при 295 им. При 300 нм у раствора с соотношением компонен тов 1:1 отмечается максимум, а у раствора с соотношением компонентов 2:1 - минимум.

Исходя из этого можно предположить, что изучение дифференциальных спектров поглощения растворов с различным соотношением компонентов может способствовать установлению состава координационных соединений, образующихся при взаимодействии цинка и тирозина

На дифференциальных УФ-спектрах растворов с соотношением компонентов 2:1 и 1:1, снятых против эквимолярных растворов ацетата цинка, максимум поглощения расположен при 274 нм, а с соотношением компонентов 1:2 максимум поглощения расположен при 275 нм.

В отличие от дифференциальных спектров, снятых против ацетата цинка, спектры, снятые против тирозина отличаются большим числом максимумов поглощения. Первый максимум поглощения отмечается на всех трех спектрах при 233 нм. Наибольшая интенсивность максимума у раствора с соотношением компонентов 2:1, наименьшая - 1:2. Второй максимум поглощения у раствора с соотношением компонентов 2:1 лежит в области 269-274 нм и значительно шире максимума при 275 нм в УФ-спектре тирозина В спектре раствора с соотношением компонентов 1:1 максимум поглощения в этой области также сдвинут в коротковолновую область, но уже, чем у раствора с соотношением компонентов 2:1 и находится в области 271-274 нм.

Максимум поглощения в этой области у раствора с соотношением компонентов 1:2 сдвинут в длинноволновую область и находится в области 275282 нм. Полученные данные свидетельствуют о том, что с использованием дифференциальной спектрофотометрии можно регистрировать процесс ионизации функциональных групп тирозина.

Таким образом, применение дифференциальной спектрофотометрии для установления состава координационных соединений, образованных ароматическими аминокислотами и бесцветными ионами металлов позволяет получить больше информации о функциональных группах, участвующих в координации и регистрировать процесс ионизации функциональных групп тирозина.

2.2. Изучение кояшлексообразунмцих свойств тирозина с ионом Си2*.

Для изучения взаимодействия тирозина с ионом меди готовили растворы тирозина и сульфата меди с концентрацией 0,02 моль/л, которые смешивали для получения растворов с соотношением компонентов 1:1, 2:1, 1:2 и снимали спектры поглощения в видимой области.

Результаты показали что, взаимодействие тирозина и иона меди приводит к сдвигу максимума поглощения иона меди при 795-810 нм в коротковолновую область. Величина сдвига зависела от соотношения иона меди и тирозина: при соотношении тирозин:медь равном 2:1 максимум сдвигается на 45-50 нм, при соотношении 1:1 - на 35-55 нм, при соотношении 1:2 - на 20-25 нм.

Этот факт свидетельствует о том, что при взаимодействии иона меди с тирозином образуются комплексные формы с различным соотношением компонентов, а также об образовании вокруг центрального атома комплексного иона при различных соотношениях металла и лиганда различных хромоформных групп.

Необходимо отметить, что рН растворов с соотношением меди и тирозина 1:1, 1:2 и 2:1 снижалось до 2,8, 2,86 и 2,82, соответственно, по сравнению с исходным раствором тирозина, рН которого составлял 5,91.

При повышении рН раствора образовывались нерастворимые координационные соединения, которые отфильтровывали, промывали спиртом и сушили на воздухе. Высушивание полученных соединений при температуре 180°С показало отсутствие в них кристаллизационной воды. После этого полученные соединения исследовали методом ПК-спектроскопии.

Отсутствие в ИК-спектре тирозина полосы поглощения в области 17001750 см"1, характерной для у(СОО") протонированной аминокислоты показывает, что в свободном тирозине карбоксильная группа не ионизирована.

Отсутствие в ИК-спектре координационных соединений полосы поглощения уСЫНз*) при 3132,5 см-1, характерной для свободных аминокислот в цвиттер-иоппой форме и присутствующей в ИК-спектре свободного тирозина свидетельствует о координации тирозина через атом азота. Появление в ИК-спектре координационного соединения полосы поглощения в области 16901700, характерной для у(СОО") протонированной аминокислоты, свидетельствует об участии в координации карбоксильной группы тирозина.

Таким образом, изменения в ИК-спектрах координационных соединений тирозина и иона меди свидетельствуют об ЪГ,0-типе координации лигаидов.

Элементный анализ показал, что комплекс имеет состав Си(Туг)2.

Полученные данные позволяют предложить следующую структурную формулу полученного координационного соединения.

23. Изучение комплсксообразующнх свойств аргинина с ионами Znz+ и

Си2+.

Для изучения комплексообразования аргинина с ионами меди и цинка получали растворы путем смешивания соответствующих растворов аргинина, сульфата меди и ацетата цинка с таким расчетом, чтобы концентрация конечного раствора равнялось 0,01 моль/л с соотношением металла и лиганда 2:1,1:1 и 1:2.

Результаты исследования методом спектрофотометрии в видимой области показали, что величина сдвига максимума поглощения отличается для различных соотношений металла и лиганда: наименьшая величина сдвига максимума поглощения отмечается при соотношении металла и аминокислоты 2:1 (50-55 им), наибольшая - при соотношении 1:2 (170-180 нм). При эквимолярном соотношении компонентов наблюдается средняя величина сдвига

максимума поглощения - 90-100 нм. Этот факт свидетельствует о том, что при взаимодействии иона меди с аминокислотами образуются комплексные формы с различным соотношением компонентов.

Для определения состава равновесной системы был использован метод рН-метрического титрования.

Первоначально этим методом были определены константы кислотной диссоциации аргинина: pKi = 2,1±0,08 (а-СООН), рК2 = 8,31 ±0,49 (a-NH2), рК3 = 12,13±0,03 (гуанидиновая группа). Полученные значения находятся в удовлетворительном согласии с литературными данными [188]: pKi = 2,17, рК2 = 9,04, рКэ = 12,84.

Анализ данных, полученных при рН-метрическом титровании показывает, что кривые титрования координационных соединений аргинина с ионом меди лежат ниже кривой титрования аргинина, что свидетельствует, на основе литературных данных о том, что в системе образуются средние и протояированн ые комплексы.

Анализ кривой распределения аргинина показал, что при рН = 5,5 и 10 в растворе присутствуют все диссоциированные формы аргинина, поэтому при расчете состава равновесной системы при комплексообразовании учитывали протекание следующих реакций:

1. -H+ + H3L = H2L+

2. -h++h2l+=hl±

3. -ïT + HL^L-

4. -Н" + Си + H3L = [Си (Н21/)]

5. -2 H* + Си + H3L = [Си (HL )]

6. -3 H* + Си + H3L = [Си (L")J

7. -2H+ + Cu + 2H3L = = [Cu(H2L+)2l

8. -4 H4 + Си + 2HjL = [Си (Ш/)2]

9. -бН' + Си + гНзЬ = [Си (L~)2]

10. -ЗН" + Си + 2Н3Ь = [Cu(H2L+)(HL±)]

11. -5 Н" + Си + 2Н3Ь = [Си (НЬА)(Ь1]

Для расчета констант образования комплексных форм использовали программу СЬГЫР 2.1.

Результаты расчетов приведены в табл. I.

Таблица 1.

Логарифмы констант устойчивости координационных соединений аргинина с

ионами меди и цинка

Комплексная форма

Arg+Cu Arg+Zn

[Me(H2L+)l 1,71 -13,85

[Me (HL*)! 1,20 -13,60

[Me (LU 13,30 -13,64

IMeiHjL^l 10,01 1,89

[MeiHL^l 10,03 1,73

|Me(Ll2] -5,67 1,70

ГМе(Н2Ь+)(Н1/)1 14,94 17,62

[Me (HL 1,45 17,35

Как видно из полученных результатов, медь образует более прочные комплексы с аргинином, чем цинк.

2.4. Изучение комплексообразующнх свойств триптофана с ионом Си2+

При изучении комплсксообразования триптофана с ионом меди координационные соединения получали смешиванием соответствующих растворов с таким расчетом, чтобы концентрация конечного раствора равнялось 0,01 моль/л с соотношением металла и лиганда 2:1,1:1 и 1:2.

Анализ электронных спектров показал, что при соотношениях медь:аминокислота 1:1 и 1:2 максимум поглощения сдвигался на 35-50 нм, при соотношении 2:1 - на 10-20 нм в коротковолновую область относительно максимума поглощения иона меди. Этот факт, как и в предыдущем случае, свидетельствует о том, что при взаимодействии иона меди с аминокислотами образуются комплексные формы с различным соотношением компонентов.

Для установления типа координации триптофана с ионом меди были сняты ИК-спектры триптофана и его координационных соединений с медью. Изменения в ИК-спектрах были аналогичными изменениям в ИК-спектрах тирозина при его координации с ионом меди и свидетельствовали об N,0-nme координации лигандов.

Результаты элементного анализа координационных соединений показали, что в составе комплекса отсутствует кристаллизационная вода и вода во внутренней сфере. Из полученных данных можно заключить, что координационное соединение имеет состав Cu(Trp)2 и структурную формулу:

2.5. Изучение комплексообразуннцих свойств низкомолекулярных тимических пенпщов с ионом Хп2*

Для изучения процесса комплексообразования ионов металлов с аминокислотами и низкомолекулярными пептидами используется метод рН-метрического титрования.

Поскольку аминокислоты и пептиды обладают как кислотными, так и основными свойствами, модель протонирования дипептида глицил-триптофан можно выразить следующими уравнениями:

Ш3+ Ш3+

I I

СН2-СО-МН-СН-СООН < А > сн2-со-ш-сн~соо <-1), гГ>

I. " I

я к

nh2 I

О CH2-CO-NH-CH-COO-

H

На первом этапе исследований были определены константы кислотной диссоциации дипептида: Ki = 6,17-Ю"4 (pKi = 3,21±0,27), К2 = 8,32-10"'° (рК2 = 9,08+0,11).

Координационные соединения получали смешиванием эквимолярных количеств растворов дипептида и ацетата цинка в концентрациях 0,001 моль/л с конечной концентрацией дипептида и иона цинка 0,0005 моль/л, и выдерживанием при 60°С в течение 30 мин. При рН-метрическом титровании координационных соединений концентрация МаОН составляла 0,01 моль/л. При расчетах учитывали протекание следующих процессов: Zn2+ + IT <-> ZnL+ ZnL+ + L- о- ZnL2° Zn2+ + HL1 -O- Zn(HL)2+ Zn(HL)2+ + HL± О Zn(HL)22f Zn2+ + L" + H20 о ZnL(OH)° + H* Zn2+ + HL* + H20 <-» Zn(HL)(OH)+ + H"

Для спектрофотометрического исследования был выбран метод пересечения кривых. Вследствие того, что при ионизации амино- и карбоксильной групп триптофана максимум поглощения при 278 нм сдвигается в длинноволновую и коротковолновую области, соответственно, на 1-1,5 им, для исследования была выбрана область 277-280 нм. Расчет проводили по формуле:

K=CK/[(CM-CK) (CR-nCK)"- м- £] где рк - константа устойчивости комплекса, CR - концентрация дипептида, См - концентрация иона цинка, Ск - равновесная концентрация комплекса, которую вычисляли по формуле:

где Апр - предельное значение оптической плотности раствора при См = const; АА - разница оптической плотности исследуемого раствора и рассчитанной оптической плотности при См = const.

Состав исследуемых растворов и полученные значения оптической плотности приведены в табл. 2.

В качестве Апр была выбрана оптическая плотность раствора триптофана с максимальной концентрацией для исследуемой серии растворов.

Результаты расчетов показали, что в растворе образуются координационные соединения с молярным соотношением цинка и дипептида, равным 1:1 и 1:2.

Для определения состава равновесной системы использовали метод рН-метрического титрования.

Таблица 2.

Концентрационный состав исследуемых растворов и полученные значения оптической плотности в области максимумов поглощения

№ Cl, MxlO"4 Czn> МхЮ" 5 Csum, МхЮ" 4 А277 А278 А279 А28®

1 2,0 2,0 2,2 0,929 0,936 0,938 0,933

2 1,8 2,0 2,0 0,857 0,863 0,864 0,86

3 1,6 2,0 1,8 0,756 0,764 0,764 0,762

4 1,4 2,0 1,6 0,657 0,662 0,664 0,661

5 1,2 2,0 1,4 0,559 0,564 0,566 0,563

6 1,0 2,0 1,2 0,476 0,48 0,48 0,479

7 0,8 2,0 1,0 0,387 0,391 0,392 0,391

8 0,6 2,0 0,8 0,276 0,279 0,28 0,28

9 0,4 2,0 0,6 0,185 0,187 0,188 0,188

10 0,2 2,0 0,4 0,093 0,094 0,095 0,095

По данным титрования рассчитывали функцию образования по уравнению:

См

где О, - общая концентрация лиганда, [Ь] - равновесная концентрация лиганда, См—общая концентрация иона металла-комплексообразователя.

Равновесную концентрацию лиганда рассчитывали по формуле:

Ш1_(си -[ОН1+РННРП2+к,(кг +рг])

(К,(Кг +РП).(1+РЛ/К2 + [Н+]2/К1-Кг) >

Для определения состава равновесной смеси использовали программу ЫеууПАЬБРЕК, в файл исходных данных которой подставляли рассчитанные значения [17].

При расчете были рассмотрены следующие варианты образующихся комплексных ионов: [гпЦ+, [гпЬ2]°, [гп(Н1.)]2+, [7л(НЦ2]2+, [гпЬ(ОН)1°, [гп2Ь(ОН)]2+, [1ъЦ3+, р^НЦТ, [гп2(НЬ)(ОН)2]°. Критерием правильности выбранной модели равновесной смеси служило совпадение рассчитанной кривой титрования с экспериментальными значениями.

Анализ полученных данных показал, что в растворе одновременно присутствуют координационные соединения с составом комплексного иона [ХпЦ+, [2пЬ2]° и [2п(НЬ)2]2+. Десятичные логарифмы констант устойчивости

равны: = 7,353,'8К1гл'1 = 13,908,'^р»'«-).! = 30,256.

рН-метрическое определение состава равновесной системы, образующейся при взаимодействии дипептвда валил-триптофан и иона цинка проводили аналогично дипептиду глицил-триптофан.

Расчет состава равновесной системы также проводили с использованием программы №иЯ)АЬ8РЕК.

Результаты расчета показали, что в системе присутствуют комплексные формы со следующими значениями логарифмов констант образования: ¡цКрпЩ] = 3,92, ^„(нед = 2,37, ^Кр^ = 10,9,1ёК,2п1Л] = 11,9, ^Криц^ = 10,2.

Таким образом, при взаимодействии триптофансодержащего дипептнда и иона цинка в водном растворе образуются как средние, так и протонированные комплексные формы.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что метод активированных эфиров является оптимальным для синтеза модельных дипептидов валил-триптофан и глицил-триптофан, гистидинсодержащего аналога тимомиметика Н-Шя-Пе-Тгр-ОН и тирозинсодержащих тетрапеппщов Н-Туг-Ьуз-РЬе-Иу-ОН и Н-Туг-Туг-Рго-Бег-ЫН2, являющихся модифицированными фрагментами дерморфина.

2. Применение метода активированных эфиров и формулирование остатка триптофана позволяет повысить выход защищенных триптофан содержащих дипептидов за счет снижения потерь при их очистке.

3. Показано, что при взаимодействии триптофана и тирозина с ионом меди в растворе присутствует несколько комплексных форм, из которых комплексные формы Си(Тгр)2 и Си(Туг)2 выпадают в осадок в кристаллическом виде, а аминокислоты координируются через атомы азота аминогруппы и кислорода карбоксильной группы.

4. Установлено, что при взаимодействии аргинина с ионами цинка и меди в растворе образуются следующие комплексные формы: ^Ррп(Агг +)] = -13,85, 1ёРрп(А1я ±)] = -13,60, ^РрЦАхг -)1 = -13,64, 1иР[2г,(Агв +)2] = 1,89, = 1,73, ^РряСАч-И = 1,70, 1§Ррп(Ач+ХАч ±» = 17,61, 1§Р[гп(Агг ±ХАГН -)1 = 17,35, 1^Р[Си(АГ2 +)] = 1,71, ^Р(Си(Агв ±)1 = 1,20, 1ёР[Си<А1В -)] = 13>30, 1§Р[С«(АГ8+)21 = ,0'°1' '^РюЧАгв ±)2] = 10,03,1ер[Си(АЧ-)2] = -5,67, ^[СчСАч+ХАчЧ] = 14,94,1еР[Си(Ач±)(Аг8-)1 = 1,45.

5. Спектрофотометрическим методом и методом рН-метрического титрования показано, что дипептид Н-01у-Тгр-0Н образует с цинком координационные соединения с составом комплексных ионов РпЬ]+, [ХпЬ2]° и

[2п(НЪ)2]г+. Десятичные логарифмы констант устойчивости равны: =

7,353, = 13,908, '^«над = 30,256.

6. Методом рН-метрического титрования установлено, что дипептид валил-триптофан в водном растворе образует с ионом цинка комплексные формы со следующими значениями логарифмов констант образования:

= 3,92, ^Кркнцц = 2,37, = 10,9, №2пи1 = 11,9, ^К^пщад = 10,2.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах: 1. Бобиев Г.М., Чариева СА., Бобиев Х.А., Бандаев С.Г. Синтез'бурсина и его аналогов с дипептидом Н-С1и-Тгр-ОН // Вестник педагогического университета.-1998.-№3.-С.101-108.

2. Бобиев Г.М., Чариева С.А., Бандаев С.Г. Использование активированных эфиров для синтеза триптофансодержагцих пептидов // Вестник педагогического университета,-1998.-№ 1.-C.3-1I.

3. Бобнев Г.М. Чариева С.А., Бандаев С.Г. Получение новых иммуностимулирующих препаратов пептидной природы // Материалы Международной науч.-практ.конф., посвященной 80-летию со дня рожд. одного из основателей Таджикского технического университета Сулейманова A.C. // Тез.докл.-Душанбе, 1998.-С.40.

4. Бобиев Г-М., Бобиев Х.А., Гиесов А.Ш., Чариева С.А. Новый подход к синтезу иммуноактивных триптофансодержащих пептидов // Информ.листок НПИЦснтра Республики Таджикистан.-Душанбе, 1998.-№ 69-98.

5. Чариева С.А., Шахматов A.H., Бандаев С.Г., Бобиев Г.М. Синтез дипептидного тимомиметика и его гистидинсодержащего аналога II Материалы Международной научно-практической конференции, поев. 60-летию ТаджНИВИ «Актуальные проблемы болезней животных в современных условиях».-Душанбе, 2003.-С.64-67.

6. Бобиев Г.М., Чариева С.А., Шахматов А.Н., Бандаев С.Г. Изучение возможности применения метода молярных отношений для исследования комплексообразования цинка и тирозина // Материалы 53-й годичной научно-практической конференции ТГМУ (с международным участием) «Лекарства и здоровье», посвященной 1025-летию со дня рождения Абуали ибни Сино. Душанбе, 2005 г.,.-С.82-84.

7. Бобиев Г.М., Чариева С.А., Шахматов А.Н., Бандаев С.Г. Применение метода дифференциальной спектрофотометрии для изучения состава координационных соединений цинка и тирозина // Там же.-С.87-89.

8. Бобиев Г.М., Чариева С.А., Шахматов А.Н., Юсупов З.Н., Бандаев С.Г. Моделирование комплексообразования иона Zn2+ и дипептида глицил-триптофан // Вестник педагогического университета.-2005.-№ 4.-С.65-70.

9. Бобиев Г.М., Чариева С.А., Шахматов А.Н., Бандаев С.Г. Спектрофотометрическое изучение комплексообразования цинка и тирозина // Вестник педагогического университета.-2005.-№ 3.-C.3-5.

10. Бобиев Г.М., Чариева С.А., Шахматов А.Н., Бандаев С.Г. Исследование комплексообразования цинка и тирозина с использованием УФ-спектрофотометрии // Тезисы докладов научно-теоретической конференции «Современные проблемы физики и астрофизики». Душанбе, 2005, С.-С.50-51.

11. Чариева С.А., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М., Юсупов З.Н., Хайдаров К.Х. О комплексообразовании иона цинка с дипептидом глицил-триптофан // Доклады АН Республики Таджикистан.-2006.-Т.49,-№ 2.-С.154-157.

12. Чариева С.А., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М., Юсупов З.Н., Хайдаров К.Х. Расчет равновесий комплексообразования в системе цинк(П)-дипептид глицил-триптофан-вода I/ Вестник Таджикского национального университета,- 2006.-№ 2.-С. 110-115. |

13. Чариева С.А., Шахматов А.И., Бобиев ПМ., Юсупов З.Н., Хайдаров К.Х. Комплексообразование цинка в растворах | глицил-триптофана // Вестник Таджикского национального университета,-2006.-№ 2.-С. 121-126.

14. Чариева С.А., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М., Бандаев С.Г.Синтез тирозинсодержащих пептидов потенциальны^ иммунотропных препаратов //

Материалы Международной конференции «Состояние и перспективы развития биохимии в Таджикистане ».-Душанбе, 2009.- С. 180-185.

15. Чариева С.А., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М., Бандаев С.Г. Методы изучения комплексообразующих свойств аргинина с ионами и Си2+ // Материалы республиканской научно-практической конференции «Проблемах,ои таълими тафрикавй» бахшида ба 70-солагии корманди шоисггаи Тоникистои, академики илмх,ок педагоги, доктори илмх,ои педагоги, профессор Убайд Зубайдов».-Душанбе, 2009,-С.229-233.

16. Холназаров Б.М., Саидов С.С., Чариева С.А., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М. Применение тактики максимальной защиты для синтеза тирозинсодержащих тетрапептидов // Вестник Таджикского национального университета.-2010.-№ 3(59).-С.228-231.

Сдано в набор 22.11.2010 г. Подписано в печать 24.11.2010 г. Формат 60x84 1/16. Тираж 100 экз.

Отпечатано в типографии ТНУ

Содержание о 2

Список использованных сокращений

Введение 5

1 Обзор литературы 10

1.1 Выделение и биологические свойства тимусных 10-15 пептидов

1.2 Синтез тимусных пептидов и их аналогов 15

1.3 Лекарственные средства на основе тимусных 17-23 пептидов

1.4 Биокоординационные соединения аминокислот и 23-33 низкомолекулярных пептидов с биометаллами

2 Обсуждение результатов 34

2.1. Синтез низкомолекулярных биологически активных 34-46 пептидов

2.1.1. Синтез дипептидов Н-Иу-Тгр-ОН и Н-Уа1-Тгр-ОН 34

2.1.2. Синтез дипептидного тимомиметика и его 37-40 гистидинсодержащего аналога

2.1.3. Синтез тирозинсодержащих пептидов 40

2.2. Изучение комплексообразующих свойств 47-67 биологически активных аминокислот с ионами биометаллов

2.2.1 Изучение комплексообразующих свойств тирозина с 47-53 ионом Ъх^

2.2.2. Изучение комплексообразующих свойств тирозина с 53-58 ионом Си2+

2.2.3. Изучение комплексообразующих свойств аргинина с 58-63 ионами Zn2+ и Си2+.

2.2.4. Изучение комплексообразующих свойств триптофана 63-67 с ионом Си2+

2.3. Изучение комплексообразующих свойств 67низкомолекулярных тимических пептидов с ионом

3 Экспериментальная часть 84

Выводы 97

Актуальность проблемы.

В последние десятилетия методы синтетической органической химии находят все более широкое применение при синтезе аналогов биологически активных веществ с целью создания новых высокоэффективных лекарственных препаратов. Перспективными соединениями для создания на их основе высокоэффективных и нетоксичных иммуномодулирующих препаратов являются низкомолекулярные иммуноактивные пептиды и их координационные соединения с биометаллами. Также одной из перспективных аминокислот является тирозин, входящий в состав биологически активных пептидов — лейцин- и метионин-энкефалинов, тимопентина, окситоцина и вазопрессина, гонадолиберина и целого ряда других, а также активных центров многих ферментов. Кроме этого, тирозин входит в состав активного центра тимусного гормона тимопоэтина и иммунологически активного пентапептида, представляющего собой активный центр тимопоэтина - тимопентина и применяемого в медицинской практике в качестве иммуностимулирующего препарата. Другой перспективной аминокислотой является триптофан, обладающий нейро- и иммунотропной активностью.

Одной из важнейших систем, обеспечивающих нормальную жизнедеятельность организма, является имммунная система, выполняющая свои функции в тесном взаимодействии с нервной и эндокринной системами. Из экстрактов тимуса, центрального органа иммунной системы, были выделены триптофансодержащие дипептиды Н-01и-Тгр-0Н и Н-11е-Тгр-ОН, обладающие не только иммунотропной, но и психотропной активностью.

Установлено, что биологическая активность пептидов определяется активностью составляющих их аминокислот. Многие процессы в организме, вызываемые короткими биологически активными пептидами, основаны на реакциях комплексообразования, в том числе и с ионами биологически активных металлов. Установлено, что при образовании координационных соединений биологически активных пептидов с ионами биологически важных металлов - железом, цинком происходит увеличение специфической активности пептидов. Биометаллами, имеющими важное значение для функционирования иммунной системы, являются медь и цинк. Вследствие этого координирующие свойства аминокислот с ионами различных металлов являются одними из наиболее интенсивно изучаемых и продолжение исследований в этом направлении имеет огромное практическое значение и является весьма актуальным

Важным этапом при этом является определение состава образующихся координационных соединений. Применение спектрофотометрических методов ограничено тем, что из 20 природных аминокислот только фенилаланин, тирозин и триптофан обладают собственным поглощением, а также тем, что при ионизации их функциональных групп максимумы поглощения смещаются в коротко- или в длинноволновую области на 1-2 нм, в результате чего перекрываются максимумы поглощения исходных аминокислот и образующихся координационных соединений. При изучении комплексообразования ионов бесцветных металлов применение спектрофотометрических методов вообще невозможно. Все это обуславливает необходимость поиска способов применения спектрофотометрических методов при изучении комплексообразования бесцветных ионов металлов с аминокислотами.

Все вышеизложенное обуславливает особую актуальность поиска путей синтеза низкомолекулярных пептидов и изучения их комплексообразующих свойств с ионами меди и цинка.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка оптимальных схем синтеза триптофансодержащих дипептидов Н-Уа1-Тгр-ОН и Н-01у-Тгр-0Н, гистидинсодержащего аналога дипептидного тимомиметика Н-НлБ-Пе-Тгр-ОН, тирозинсодержащих аналогов фрагментов дерморфина и изучение комплексообразующих свойств дипептидов Н-01у-Тгр-0Н и Н-Уа1-Тгр-ОН, биологически активных аминокислот тирозина, аргинина и триптофана при взаимодействии с биометаллами медью и цинком.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи: разработать оптимальные схемы синтеза дипептидов Н-Уа1-Тгр-ОН и ЬМу-Тгр-ОН; разработать оптимальную схему синтеза и синтезировать гистидинсодержащий аналог дипептида Н-11е-Тгр-ОН - Н-ШБ-Пе-Тгр-ОН; синтезировать тирозинсодержащие аналоги фрагментов дерморфина изучить комплексообразующис свойства тирозина, аргинина и триптофана при взаимодействии с ионами Си" и изучить границы применимости спектрофотометрических методов для определения состава координационных соединений, образующихся при взаимодействии тирозина и дипептида Н-Иу-Тгр-ОН с ионом методом рН-метрического титрования определить состав и константы образования координационных соединений, образующихся при взаимодействии дипептидов Н-С1у-Тгр-ОН и Н-Уа1-Тгр-ОН с ионом гп2+;

Научная новизна. Впервые синтезирован гистидинсодержащий аналог пептидного тимомиметика Н-Из-Не-Тгр-ОН. Определены состав и константы образования координационных соединений дипептидов Н-01у-Тгр-ОН и Н-Уа1-Тгр-ОН с ионом Zn~ . Впервые показана возможность применения спектрофотометрических методов для изучения процессов комплексообразования биологически активных аминокислот тирозина и триптофана с ионами Си2+ и Zn2+.

Практическая значимость. Разработаны оптимальные схемы синтеза триптофансодержащих дипептидов, гистидинсодержащего аналога пептидного тимомиметика — дипептида Н-Ие-Тгр-ОН, содержащего остаток гистидина на 1\[-конце пептидной цепи, тирозинсодержащих тетрапептидных аналогов дерморфина. Разработанные подходы к изучению состава координационных соединений тирозина, аргинина, триптофана, дипептидов Н-Уа1-Тгр-ОН и Н-С1у-Тгр-ОН с ионами Си2+ и могут найти применение при проведении подобных исследований с другими биологически активными низкомолекулярными пептидами и аминокислотами.

Положения, выносимые на защиту:

- применение метода активированных эфиров и формилирование остатка триптофана позволяет повысить выход защищенных триптофансодержащих дипептидов за счет снижения потерь при их очистке.

- синтез гистидинсодержащего аналога дипептида изолейцил-триптофан.

- синтез тирозинсодержащих тетрапептидных аналогов дерморфина.

- тирозин вступает во взаимодействие с ионом меди в цвиттер-ионной форме координируя через атомы азота аминогруппы и кислорода карбоксильной группы с образованием кристаллического комплекса Си(Туг)2.

- триптофан вступает во взаимодействие с ионом меди координируя через атомы азота аминогруппы и кислорода карбоксильной группы с образованием нескольких комплексных форм, из которых комплексная форма Си(Тгр)2 выпадает в осадок в кристаллическом виде.

- аргинин в растворе реагирует с ионами меди и цинка в катионной и цвиттер-ионной формах с образованием моно- и смешаннолигандных координационных соединений

- дипептиды H-Gly-Trp-OH и H-Val-Trp-OH в растворе вступают во взаимодействие с ионом цинка в протонированной и непротонированной формах с образованием моно- и смешаннолигандных комплексных форм.

Публикации. По материалам работы опубликовано 14 статей и 2 тезиса докладов, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 133 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающего 178 источников и приложений.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что метод активированных эфиров является оптимальным для синтеза модельных дипептидов валил-триптофан и глицил-триптофан, гистидинсодержащего аналога тимомиметика Н-Шэ-11е-Тгр-ОН и тирозинсодержащих тетрапептидов Н-Туг-Ьуз-РЬе-Иу-ОН и Н-Туг-Туг-Рго-Бег-КНг, являющихся модифицированными фрагментами дерморфина.

2. Применение метода активированных эфиров и формилирование остатка триптофана позволяет повысить выход защищенных триптофансодержащих дипептидов за счет снижения потерь при их очистке.

3. Показано, что при взаимодействии триптофана и тирозина с ионом меди в растворе присутствует несколько комплексных форм, из которых комплексные формы Си(Тгр)2 и Си(Туг)2 выпадают в осадок в кристаллическом виде, а аминокислоты координируются через атомы азота аминогруппы и кислорода карбоксильной группы.

4. Установлено, что при взаимодействии аргинина с ионами цинка и меди в растворе образуются следующие комплексные формы: 1§(Зрп(Агё+)] = -13,85, ^р[2п(Агё±)] = -13,60, 1ёР[гп(А1в-)] = -13,64, ^Р[2п(агЕ +)2] = 1,89, ^Р[2п(Аг§ ±)2] = 1»73, 1ёР[гп(Агй -)2] = 1,70, 1ЕР[гп(Агё+)(Агё ±)] - 17,61, ^Р[гп(Аге ±ХА^ -)] = 17,35, ^Р[Си(Агё+)] = 1,71, 1вР[Си(А1В±)] = 1,20, 1ёР[Си(А1®-)] = 13,30, 1§Р[Си(Аг8 +)2] = 10,01, 1ЕР[Си(Аге ±)2] = 10,03, ^Р[Си(Аг8 -)2] = "5,67, 1§Р[Си(Агё +)(Агё ±)] = 14,94, 1ёР[Си(Агв ±)(Лгв -)] =1,45.

5. Спектрофотометрическим методом и методом рН-метрического титрования показано, что дипептид Н-С1у-Тгр-ОН образует с цинком координационные соединения с составом комплексных ионов [2пЬ]+,

Л 04

Т,пЬ2] и [2п(НЬ)2] . Десятичные логарифмы констант устойчивости равны: = 7,353, = 13,908, =30,256.

6. Методом рН-метрического титрования установлено, что дипептид валил-триптофан в водном растворе образует с ионом цинка комплексные формы со следующими значениями логарифмов констант образования: ^К^пьн] = 3,92, 1ВК12п(Нь)2] = 2,37, ^К[2пц = 10,9, 1ЕК[2пЬ2] = 11,9, ^К^цнь)] = 10,2.

1. Авруцкий Г.Я., Мосолов С.Н. Руководство по психиатрии /под ред. А.С.Тиганова, М., 1999.-е. 202-206.

2. Алексеев В.Г., Самуйлова И.С. Комплексообразование в системах кобальт (П)-глицин-бета-лактамные антибиотики // Журнал неорганической химии.-2008.-Т.53, № 2.-С.370-372.

3. Алексеев В.Г., Самуйлова И.С. Комплексообразование в системах никель (Н)-глицин-р-лактамные антибиотики // Координационная химия.-2007.-Т.ЗЗ, № 12.-С.930-933.

4. Баделин В.Г., Межевой И.Н. Термохимия растворения L-цистеина И L-аспарагина в водных растворах 1,4-диоксана и ацетона // Журнал физической химии.-2009.-Т.83, № 7.-С. 1267-1270.

5. Балакаева Т.А., Чураков A.B., Езерницкая М.Г., Кузьмина Л.Г., Локшин Б.В., Ефименко И.А. Комплексы рутения (IV) с L-метионином. Кристаллическая структура RuNO(CH3S(CH2)2CHNH2COO)Cl2. // Координационная химия.-1999.-Т.25.-№ 8.-С.621-625.

6. Белокрылов Г.А., Попова О.Я., Сорочинская Е.И. Сходство иммуно-, фагоцитозстимулирующих и антитоксических свойств дипептидов и составляющих их аминокислот // Бюлл. эксперим. биол. мед. 1999. Т. 127. № 6. С. 674-676.

7. Бобиев Г.М., Бунятян Н.Д. Иммуноактивные пептиды и их координационные соединения в медицине. Москва, 2009.- 239 стр.

8. Бобиев Г.М., Шахматов А.Н., Исупов С.Д., Хайдаров К.Х. Синтез и иммуностимулирующая активность координационных соединенийнекоторых триптофансодержащих дипептидов с ионами металлов// Химико-фармацевтический журнал.-2000.-T.34.-JNo 5.-С.24-25

9. Бондарева Л.П., Овсянникова Д.В., Селеменев В.Ф. Энтальпия взаимодействия водного раствора метионина с карбоксильными катионитами в медной форме // Журнал физической химии.-2009.-Т.83, № 6.-С. 1021-1025.

10. Будников С.С., Ревенко М.Д., Ганя В.А., Гэрбэлэу Р.В., Додон М.И. Влияние алкилирования на строение и способ координации тиосемикарбазида: электронный подход//Координационная химия.-1999.-Т.25.-№ 2.-С.95-101

11. Булатов М.И., Калинкин И.П. Практическое руководство по фотометрическим методам анализа.-JI.: Химия, 1986.-432 с.

12. Бенедиктова М.Г. Применение Тактивина и иммунофана при лечении больных аденокарциномой эндометрия // Экспериментальная и клиническая фармакология.-2001.-№ 5

13. Ветлугина Т.П. Иммунная система при шизофрении. Томск: Раско, 2000.

14. Ветлугина Т.П., Иванова С.А. и др. Фармакологическая модель анализа взаимодействия нервной и иммунной систем // Бюл. эксп. биол. и мед.-2000.-Т. 129.-С. 47-50.

15. Владимирская Е.Б., Осипова Е.Ю., Иванова A.A., Дейгин В.И. Влияние тимодепрессина на пролиферацию кроветворных клеток-предшественников человека // X российский конгресс "Человек и лекарство" (10 апреля 2003).

16. Гагиева С.Ч., Таутиева М.А., Цалоев А.Т., Галимов Ю.Б., Гагиева Л.Ч., Беляева Т.Н. Координационные соединения рения V) с серосодержащими аминокислотами // Журнал неорганической химии.-2007.-Т.52, № 11.-С. 1836-1842.

17. Горболетова Г.Г., Кочергина Л.А. Термодинамические характеристики комплексообразования ионов

18. ИГ с D,L -треонином в водном растворе // Журнал физической химии.-2007.-Т.81, № 7.-С.1233-1238.

19. Григорьев Е.И., Хавинсон В.Х., Малинин В.В., Григорьев А.Е., Кудрявцева Т.А. О роли водной среды в механизмах действия иммуноактивных пептидов в сверхмалых дозах//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2003. - Т. 138, N 8. - С. 173178.

20. Гридчин С.Н., Горболетова Г.Г., Пырэу Д.Ф. Тепловые эффекты реакций кислотно-основного взаимодействия в водных растворах D,L-a-аланил-глицина // Журнал физической химии.-2007.-Т.81, № 12.-С.2165-2168.

21. Демидова E.H., Драчев А.И., Борщ H.A. Исследование комплексообразования Gd3+ с 4-дигидроксиборфенилаланином в водных растворах // Координационная химия.-2008.-Т.34, № 10.-С.797-800.

22. Демченко А.П. Ультрафиолетовая спектрофотометрия и структура белков.-Киев: Наукова думка, 1981.-208 с.

23. Добрынина H.A. Биокоординационная химия. Метод рН-метрического титрования в изучении комплексообразования биометалов с биолигандами // Координац. Химия. 1992. - Т. 18, вып. 7. - С. 760 - 767.

24. Долгих О.В., Ву Тхи Зуен, Соцкая Н.В. Влияние ионов никеля на буферную емкость водных растворов глицина // Журнал физической химии.-2009.-Т.83, № 3.-С.463-467.

25. Дударев И.В., Сизякина Л.П., Суханов И.А., Афонии A.A., Дюжиков A.A., Крайнова H.H., Афонин A.A. Способ профилактики сепсиса у детей после хирургического вмешательства. Патент Российской Федерации № 2202375. Опубликовано: 2003.04.20.

26. Евсеев A.B., Парфенов Э.А., Правдивцев В.А., Евсеева М.А. Влияние комплексного соединения К-ацетил-Ь-цистеина и цинка на биоэлектрическую активность коры мозга кошек при экзогенной гипоксии с гиперкапнией / Нейронауки, 2006, № 5(7), стр. 10-14.

27. Евсеев A.B., Правдивцев В.А., Яснецов В.В., Евсеева М.А. Изменение энергетического обмена у мышей на фоне антигипоксанта Q-901 // Новые медицинские технологии и квантовая медицина. Сб.трудов XI междунар.конф., М., 2005.-С. 199-200

28. Зеленин О.Ю. Влияние природы поддерживающего электролита на термодинамические характеристики образования цинк(И) аминоацетатов в водных растворах//Координационная химия, 2005, Т.31, № 5, с.333-337.

29. Зеленин О.Ю., Кочергина JT.A. Термохимия образования комплексов Ni2+ с глицил-Ь-аспарагином в водных растворах/ЛСоординационная химия, 2005, Т.31, № 2, с.143-148.i

30. Зеленин О.Ю., Кочергина JI.A., Ратников C.B. Термодинамика Ni(II) комплексообразования с L-аспарагином в водном растворе//Координационная химия, 2003, Т.29, № 7, 3.513-518.

31. Зеленин О.Ю., Кочергина JI.A., Смирнова H.JI., Манин Н.Г. Термодинамика образования Ni(II) валинатных комплексов в водном растворе/ЛСоординационная химия, 2004, Т.30, № 6, с.448-454.

32. Зеленин О.Ю., Кочергина JI.A., Васильев В.П. Оптимальные концентрационные условия определения тепловых эффектов реакции образования валинатных комплексов никеля (II) в водном растворе//Журнал физической химии, 2004, Т.78, № 7, с. 1245-1249.

33. Зяблов А.Н., Байдичева О.В., Калач A.B., Селеменев В.Ф. Энергии активации вязкого течения и коэффициенты диффузии дипептидов и аминокислот в водных растворах // Журнал физической химии.-2008.-Т.82, № 2.-С.384-386.

34. Игнатов П.Е. Иммунитет и инфекция.-М.: Время, 2002.-352 с.

35. Исаева В.А., Гессе Ж.Ф., Наумов В.В., Шарнин В.А. Изменение устойчивости глицинатных комплексов серебра (I) в водно-ацетоновых и водно-изопропанольных растворах // Журнал неорганической химии.-2007.-Т.52, № 7.-С. 1243-1246.

36. Исаева В.А., Наумов В.В., Гессе Ж.Ф., Шарнин В.А. Влияние водно-ацетонового растворителя на кислотно-основные свойства глицил-глицина // Журнал физической химии.-2009.-Т.83, № 3.-С.477-480.

37. Исаева В.А., Наумов В.В., Гессе Ж.Ф., Шарнин В.А. Комплексообразование серебра (I) с глицинат-ионом в водных растворах этанола и диметилсульфоксида // Координационная химия.-2008.-Т.34, № 8.-С.631-635.

38. Исаева В.А., Шарнин В.А., Шорманов В.А. Влияние водно-этанольного и водно-ацетонового растворителей на устойчивость глицинатных комплексов никеля (И)//Координационная химия.-1999.-Т.25.-№ 12.-С.912-914.

39. Исупов С.Д., Шахматов А.Н., Юсупов З.Н., Хайдаров К.Х. Иммуностимулирующая активность координационных соединений дипептида изолейцил-триптофан с ионом цинка// Химико-фармацевтический журнал.-2001 .-Т.35.-№ 7.-С.9-11.

40. Калинина Н.М., Кетлинский С.А., Оковитый C.B., Шуленин С.Н. Заболевания иммунной системы. Диагностика и фармакотерапия.-М.: Эксмо, 2008.-496 с.

41. Калинников В.Т., Ежова Ж.А., Захаров H.A., Коваль Е.М. Синтез и физико-химическое исследование лизинсодержащего гидроксиапатита кальция // Журнал неорганической химии.-2007.-Т.52, № 1.-С. 118-121.

42. Карасев В.Е., Бабий А.П., Куликов А.П. Спектроскопическое исследование комплексов Cu(II) с нативной ДНК // Электронный журнал «Исследовано в России» http://zhurnal.ape.relam.ru/articles/2002/ р. 1947-1955/176.pdf

43. Караулов A.B. Молекулярно-биологическое обоснование применения имунофана в клинической практике // Лечащий врач.-2000.-№ 4 / http://lvrach.ru/doctore/2000/04/.

44. Качоровская О.П., Степаненко О.Н. Синтез, изомерия и свойства разнолигандных комплексных соединений кобальта (III) с ß-аминоэтанолом, норвалином и валином/ЯСоординационная химия.-2000.-Т.26.-№ 4.-С.271-277.

45. Кветной И.М., Ярилин A.A., Полякова В.О., Князькин И.В. Нейроиммуноэндокринология тимуса.-СПб.: Деан, 2005.-160 с.

46. Ким К.Ф., Климова C.B., Дьяконова В.А., Никонова М.Ф., Григорьева Т.Ю., Дейгин В.И., Пинегин Б.В., Ярилин A.A. Влияние тимических пептидов на синтез и внутриклеточное содержание некоторых цитокинов//Иммунология.- 2002.-№5

47. Клиническая иммунология / Под ред. A.B.Караулова.-М.: Медицинское информационное агентство, 1999.-604 с.

48. Клиническая фармакология тимогена / Ред. B.C. Смирнов. СПб:, 2003. 106 с.

49. Князева Н.Е., Никольский В.М., Горелов ■ И.П. pH- и редокспотенциометрическое изучение равновесия между Fe(II), Fe(III) и N-(карбоксиметил)аспарагиновой кислотой// Координационная химия.-2002.-Т.29.-№ 2.-С.135-139.

50. Копылова В.Д., Перегудов Ю.С., Астапов A.B. Энтальпии взаимодействия гидроксида поливинилбензилтриметиламмония с аминокислотами в водных растворах // Журнал физической химии.-2007.-Т.81, № 5.-С.848-851.

51. Корнев В.И., Кардапольцев A.A. Гомо- и гетеролигандные аспарагинаты ртути (II) с иминодиуксусной кислотой и ее производными // Журнал неорганической химии.-2008б.-Т.53, № 11.-С. 1875-1879.

52. Корнев В.И., Кардапольцев A.A. Смешаннолигандные соединения ртути(П) с аспарагиновой, винной и лимонной кислотами // Координационная химия.-2008а.-Т.34, № 12.-С.908-912.

53. Короткий Н.Г., Урджужу В.Ю. Терапевтические возможности тимодепрессина у больных псориазом и механизмы его лечебного< действия//Вестн. дерматол. и венерол.-2002.-№4.-с.58-60.

54. Коротченко Н.М. Соединения железа (III, II), кобальта (II), меди(П) с рядом барбитуровых кислот и некоторыми витаминами. Автореф. дис. .канд. хим. наук.- Красноярск-2007.-21 с.

55. Котова Д.Л., Крысанова Т.А., Домарева Н.В., Черенкова Ю.А. Равновесие обмена в системе н-сульфокатионообменник КУ2х8-фенилаланин-гистидин // Журнал физической химии.-2007.-Т.81, № 1.-С.113-116:

56. Кочергина Л.А., Васильев В.П., Крутова О.Н. Теплоты смешения водных растворов дипептидов с растворами азотной кислоты и гидроксида калия в интервале температур 288.15-308.15 К // Журнал физической химии.-2008.-Т.82, № 3.-С.426-432.

57. Кочергина Л;А., Дробилова О.М. Термодинамические параметры реакций комплексообразования иона меди (II) с ß-аланином в водном растворе // Журнал физической химии.-2008.-Т.82, № 9.-С.1729-1733.

58. Кочергина Л.А., Дробилова О.М. Термодинамические характеристики реакций, образования комплексов Zn2+ с DjL-триптофаном в водном растворе // Журнал физической химии.-2009.-Т.83, № 3.-С.481-485.

59. Кочергина Л. А., Дробилова О.М., Дробилов С .С. Термохимическое исследование координационных равновесий в системе цинк(И)-р-аланин-вода // Координационная химия.-2009.-Т.35, № 5.-С.394-400.

60. Кочергина Л.А., Емельянов A.B., Крутова О.Н. Влияние температуры на тепловые эффекты реакций комплексообразования иона меди (II) С Lфенилаланином в водном растворе // Журнал неорганической химии.-2008.-Т.53, № 9.-С.1628-1632.

61. Кочергина Л. А., Емельянов A.B., Крутова О.Н., Горболетова Г.Г. Термодинамические параметры ступенчатой диссоциации L-фенилаланина в водном растворе // Журнал физической химии.-2007.-Т.81, № 10.-С.1829-1835.

62. Кочергина JI.A., Платонычева О.В., Дробилова О.М., Черников В.В. Термодинамические характеристики процессов комплексообразования в системе ион никеля (П)-р-аланин в водном растворе // Журнал неорганической химии.-2009.-Т.54, № 2.-С.377-384.

63. Кочергина JI.A., Раткова E.JI. Термодинамические характеристики процессов образования комплексов ионов кобальта (II) с DjL-треонином в водном растворе //Журнал физической химии.-2009.-Т.83, № 1.-С.43-50.

64. Кочергина Л.А., Раткова Е.Л. Термодинамические характеристики процессов комплексообразования ионов Си с L-фенилаланином в водном растворе // Координационная химия 2008a.-T.34, № 8.-С.619-625.

65. Кочергина Л.А., Раткова Е.Л. Термохимическое исследование равновесий в системе ион Си" -D,L-TpeoHHH в водном растворе // Координационная химия.-2008в.-Т.34, № 6.-С.415-420.

66. Кочергина Л.А., Раткова Е.Л., Горболетова Г.Г. Термодинамические характеристики комплексообразования в системе ион цинка (II)-D,L-треонин в водном растворе // Журнал физической химии.2007.-Т.81, № 4.-С.643-650.

67. Кратенок Б.В. Особенности влияния лизил-глутамата на гуморальный иммунный ответ у мышей // Белорусский медицинский журнал.-2006.-3(17).-С.

68. Куваева З.И., Лопатик Д.В., Попова О.П., Покровская А.И., Лысенко Г.Н., Маркович М.М. Селенсодержащие комплексы аргинина и лизина // Химико-фармацевтический журнал.-2007а.-№ 3

69. Куваева З.И., Лопатик Д.В., Прокопович Т.М., Маркович М.М., Покровская А.И. Синтез железа(П) диаспарагината // Химико-фармацевтический журнал.-20076.-№ 5

70. Кудрявцева Т.А., Зайченко И.Н., Ефремов О.М., Байрамов A.A., Григорьев Е.И., Рыжак Г. А. Действие вил она на нейроэндокринный статус и поведение старых самцов крыс / Успехи геронтол.-2006.-Вып. 19.-С.97-101.

71. Кузнецов С.М., Голованов В.И. Исследование матрицы Гессе как способ решения проблемы «плохих» приближений обратных задач химических равновесий//Журнал физической химии.-2002.-Т.76.-№ 6.-С.1009-1015.

72. Кузник Б.И., Гаймоленко И.Н., Цыбенова Б.Ц. Влияние вилона на иммунитет у детей с хроническими заболеваниями легких // Цитокины и воспаление.-2003.-Т. 2, № 4.-е. 21-26.

73. Куликов С.В., Смирнов B.C., Стукань И.А. Способ получения L-глутамил-Ьтриптофанаор и его солей. Патент РФ № 2120446. 2000

74. Кустов A.B., Королев В.П. Термодинамика растворения L-a-гистидина и L-a-фенилаланина в воде при 273-373 К // Журнал физической химии.-2008.-Т.82, №» 11.-С.2039-2043.;

75. Кустов A.B., Королев В.П. Термодинамические параметры растворения L-фенилаланина в воде // Журнал физической химии.-2007.-Т.81, № 2.-С.245-248.

76. Леглер Е.В., Казбанов В.И., Казаченко A.C. Изучение равновесия комплексообразования в системе Ag(I)-гиcтидин//Жypнал неорганической химии, 2002, т.47, № 1, с.158-161.

77. Леглер Е.В., Казбанов В.И., Казаченко A.C. Комплексообразование в системе А§(1)-триптофан//Журнал неорганической химии, 2002, Т.47, № 2, с.341-343.

78. Лыткин А.И., Чернявская Н.В., Волков A.B., Никольский В.М. Стандартные энтальпии образования кристаллической N-(карбоксиметил)аспарагиновой кислоты и ее водных растворов // Журнал физической химии.-2007.-Т.81, № 7.-С.1175-1179.

79. Лыткин А.И., Чернявская Н.В., Никольский В.М. Состав и устойчивость соединений Pb(II) С Ы-(карбоксиметил)аспарагиновой и N,N-еже(карбоксиметил)аспарагиновой кислотами в водных растворах // Координационная химия.-2007.-Т.ЗЗ, № 6.-С.411-413.

80. Малашенкова И.К. Принципы иммунокорригирующей терапии вторичных иммунодефицитов, ассоциированных с хронической вирусно-бактериальной инфекцией // Российский медицинский журнал.-2002.-Т.10.-№21.

81. Малашенкова И.К., Ледов A.B., Зуйкова И.Н., Сарасания Ж.Ш., Дидковский H.A. Индивидуальная иммунокоррекция в комплексном лечении вторичного бесплодия // Лечащий врач.-2006.-№ 3 // http://lvrach.ru/ doctore/2006/03/4533582/

82. Межевой И.Н., Баделин В.Г. Сольватация L-серина в смесях воды с некоторыми апротонными растворителями при 298.15 К // Журнал физической химии.-2009.-Т.83, № 3.-С.468-472.

83. Межевой И.Н., Баделин В.Г. Энтальпии растворения и сольватации L-серина в водно-спиртовых растворах при 298.15 К // Журнал физической химии.-2008.-Т.82, № 4.-С.789-791.

84. Мишустин А.И. Расчет констант комплексообразования катионов переходных металлов с О- и N-донорными лигандами в водных растворах // Журнал неорганической химии.-2007.-Т.52, № 2.-С.326-331.

85. Мокшина Н.Я., Пахомова O.A., Нифталиев С.И. Закономерности экстракции ароматических аминокислот двойными и тройными смесями гидрофильных растворителей // Журнал физической химии.-2007.-Т.81, № 11.-С.2063-2066.

86. Молодкин А.К., Есина H .Я., Андреева О.И. Разнолигандные комплексные соединения Pt(IV) с аминокислотами и аденином // Журнал неорганической химии.-2008.-Т.53, № 11.-С.1861-1867.

87. Молодкин А.К., Есина Н.Я., Андреева О.И., Конде М. Разнолигандные комплексные соединения Pt(IV) с аминокислотами и цитозином // Журнал неорганической химии.-2008.-Т.53, № 8.-С. 1295-1303.

88. Молодкин А.К., Есина Н.Я., Тачаев М.В., Курасова М.Н. Разнолигандные комплексные соединения палладия (II) с аминокислотами, цитозином и аденином // Журнал неорганической химии.-2007.-Т.52, № 10.-С.1669-1671.

89. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., Малинин В.В. Пептидные тимомиметики. СПб.: Наука, 2000. - 158 с.

90. Мясоедов Н.Ф. Пептиды и новые возможности лечения ряда заболеваний // Всероссийская конференция «Фундаментальные науки -медицине».-Новосибирск, 2005.-С.55

91. Найденова H.H., Семке В.Я., Невидимова Т.И. и др. Интерферон и другие цитокины при основной нервно-психической патологии // Бюл. экспер. биол. и мед.-2001.-Т.85.-№ 7

92. Овсянникова Д.В., Бондарева Л.П., Селеменев В.Ф. Энтальпия сорбции глицина из водных растворов на карбоксильных катеонитах: в= медной и смешанной формах // Журнал физической химии.-2008.-Т.82, № 8.-G.1552-1555.

93. Овсянникова Д.В., Селеменев В.Ф., Бондарева Л.П., Амелин A.H. Энтальпии; сорбции, глицина из водных растворов карбоксильными катеонитами // Журнал физическошхимии:-2007.-Т.81, № 10.-С. 1887-1890.

94. Оковитый C.B., Гайворонская В.В: Иммунные механизмы реализации: гепатопротекторных эффектов этомерзола и тимогена//Экспериментальная и клиническая фармакология.-2002.-№ 3

95. ЮЗ.Паладе Д.М., Ганнова Ю.Н. комплексообразование кобальта(П) с некоторыми глициловыми дипептидами< в инертной? атмосфере//Координационная химия, 2003 ■ Т.29, № 2, с. 113-116. 104. Панюшкин В.Т., Стороженко Т.П^, Бунклинский В.Д.11 2ч*

96. Позняк А.Л., Павловский В.И., Цабель М. Синтез, строение и фотодекарбоксилирование комплексов кобальта (III) с диэтилентриамином' и L-орнитином или DL-гистидином, Co(Dien)(Orn).(C104)2: • 0.5Н20 И

97. Со(В1еп)(Н1з).(СЮ4)2 // Журнал неорганической химии.-2009.-Т.54, № 5.-С.745-750

98. Полякова В.О., Бенберин В.В. Экспрессия ключевых регуляторных белков апоптоза. Их роль в возрастной инволюции тимуса человека // Успехи геронтол.-2006.-Вып. 19.-С. 28-32

99. Розанцев Г.М., Доценко О.И., Тарадина Г.В. Математическое моделирование и анализ равновесий в растворах Мэ(У)//Координационная химия.-2000.-Т.26.-№ 4.-С.264-270.

100. ПЗ.Рушковский С.Р., Чегринец С.Е., Безруков В., Храпунов С.Н. Влияние модификации структуры интерлейкина-1 (3 на его физиологическую активность//Российский физиолог. Журнал.-1999.- Т.85, №11.-С. 1420-1427.

101. Ряховский В.В., Малекин С.И., Носова В.М., и др. Коньюгаты 2',3'-дидегидро-З'-дезокситимидина с тимогеном. Синтез, анти-ВИЧ-активность.// Биоорганическая химия.-1999.-Т. 25.-№ 7.-С.499-504.

102. Смирнов В.И., Баделин В.Г. Зависимость энтальпии растворения БЬ-а-аланил-ОЬ-а-валина от состава бинарных растворителей вода-спирты при 298.15 К // Журнал физической химии.-2008а.-Т.82, № 12.-С.2296-2300.

103. Смирнов В.И., Баделин В.Г. Термохимия растворения Ь-о-аланил-Ь-с-аланина в смесях вода-спирты при 298.15 К // Журнал физической химии.-2008.-Т.82, № 7.-С.1359-1363.

104. Смирнов В.И., Баделин В.Г. Энтальпии растворения Ь-а-аланил-Ь-о-аланина в смесях вода-органический растворитель при 298.15 К // Журнал физической химии.-2008.-Т.82, № 9.-С. 1744-1748.

105. Смирнов В.И., Межевой И.Н., Баделин В.Г. Термохимия растворения DL-a-аланилглицина и БЬ-а-аланил-БЬ-а-аланина в смесях вода-органический растворитель при 298.15 К // Журнал физической химии.-2007a.-T.81, № 8.-С.1414-1418.

106. Смирнов В.И., Межевой И.Н., Баделин В.Г. Термохимия растворения DL-a-аланилглицина и ВЬ-а-аланил-ВЬ-а-аланина в смесях вода-спирты при 298.15 К // Журнал физической химии.-2007б.-Т.81, № 5.-С.843-847.

107. Торопов A.A., Торопова А.П. QSPR-моделирование констант устойчивости комплексов биометаллов с фосфат-производными аденозина// Координационная химия.-2000.-Т.26.-№ 11 .-С.842-847.

108. Торопов A.A., Торопова А.П. QSPR-моделирование констант устойчивости комплексов на основе графа атомных орбиталей// Координационная химия.-2000.-Т.26.-№ 6.-С.423-430.

109. Торопов A.A., Торопова А.П. QSPR-моделирование устойчивости комплексов коореляцией весов индекса водородной связи и локальных графов инвариант//Координациопная химия.-2002.-Т.28.-№ 12.-С.938-942.

110. Тутельян A.B., Клебанов Г.И:, Ильина С.Е., Любицкий О.Б. Сравнительная оценка антиоксидантных свойств иммунорегуляторных препаратов//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-2003.-Т.138, № 8. С. 179-183.

111. Феденко Е.С. Принципы патогенетической терапии атопического дерматита // Лечащий Врач.-2001.-№ 4.

112. Хавинсон В.Х., Анисимов B.H., Заварзина Н.Ю. Влияние вилона на показатели биологического возраста и продолжительность жизни мышей //

113. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2000. - Т. 130. -№7.-С. 88-91.

114. Хавинсон В.Х., Морозов В.Г., Малинин В.В., Серый C.B. Средство, стимулирующее репаративные процессы, и способ его применения /Патент РФ №2139085, 1999.

115. Холин Ю.В. Количественный физико-химический анализ комплексообразования в растворах и на поверхности химически модифицированных кремнеземов: содержательные модели, математические методы и их приложения. — Харьков: Фолио, 2000 — 288 с.

116. Хохлова О.Н., Селеменев В.Ф., Бадичка О.Н. Необменное поглощение гистидина низкоосновными анионообменниками // Журнал физической химии.-2007.-Т.81, № 11.-С.2067-2072.

117. Цветкова Г.М., Мордовцева В.В., Вавилов A.M. Патоморфология болезней кожи: руководство для врачей. М. Медицина, 2003.-496 с.

118. Цепелев B.JL, Цепелев С.Л., Курупанов С.И. Изучение активности синтетических бурсопептидов при иммунодефиците, вызванном циклофосфамидом // Бюллетень СО РАМН.-2003.-Т.107, № 1.-С.84-86.

119. Цепелев В.Л., Цепелев С.Л., Цыбиков H.H. Способ получения вещества, обладающего иммуностимулирующей активностью. Патент РФ №2177325 от 27.12.2001 г.

120. Цепелев С.Л., Цепелев В.Л., Цыбиков H.H. Способ получения вещества, стимулирующего антигеннезависимую дифференцировку В-лимфоцитов. Патент РФ № 2155068 от 27.08.2000 г.

121. Шаров C.B. Физико-химическое исследование комплексообразования металлов IIIA подгруппы с комплексонами смешанного типа. Автореф. Дис.канд. хим. наук, Тверь, 2006, 21 стр.

122. Шатаева Л.К., Хавинсон В.Х., Ряднова И.Ю. Пептидная саморегуляция живых систем (факты и гипотезы).Санкт-Петербург, Наука, 2003.-222 с.

123. Юсупов З.Н. Способ определения состава и констант образования координационных соединений. Патент Республики Таджикистан № TJ 295. Заявка № 37000501. Опубл. в бюл. № 21, 2001

124. Akat'eva М.Е., Erofeeva O.S., Dobrynina N.A., Ivanova N.A., Efimenko I.A. Interaction of Pd(II) with glutamic acid// Russian Journal of Coordination Chemistry, 2004, Vol.30, № 8, pp.584-590.

125. Aspinal R., Andrew D. Thymic atrophy in the mouse is a soluble problem of the thymic environment //J. Vaccine.-2000.-vol. 18.-p. 1629-1637.

126. Bodey В., Bodey B.Jr., Siegel S.E., Kaiser H.E. Review of thymic hormones in cancer diagnosis and treatment. // Int J Immunopharmacol.-2000.-vol.22, № 4.-pp.261-73.

127. Chimatadar S.A., Basavaraj Т., Nandibewoor S.T. Kinetics and mechanism of oxidation of L-tryptophan by diperiodatonickelate (IV) in aqueous alkaline medium // Журнал физической химии.-2007.-Т.81, № 7.-C.1197-1203.

128. Choi S.Y., Kim D.K., Eun D., Kim K., Sun W., Kim H. Anti-apoptotic function of thymosin-beta in developing chick spinal motoneurons // Biochemical Biophysical Research Communications.-2006.-vol.346.-Issue 3,-p.872-878.

129. COPE. Cytokines & Cells Online Pathfinder Encyclopaedia Version 22.6 (Winter 2008/Spring 2009)) //

130. Davidovich R.L. Stereochemistry of Pb(II) complexes with aminopolycarboxylic ligands. The role of a lone electron pair// Russian Journal of Coordination chemistry.-2005.-V.31.-№ 7.-pp.455-466.

131. Donovan J.W. Ultraviolet absorption.-In: Physical principles and techniques of protein chemistry.-London; New York: Acad. Press, 1969.-p.101-170.

132. Fabrizi F., Dixit V.M. Meta-analysis: the adjuvant role of thymopentin on immunological response to hepatitis В virus vaccine in end-stage renal disease // Alimentary Pharmacology & Therapeutics/-2006.-Vol. 23, № l.-p. 1559-1566

133. Fan Y.H., Bi S.Y., Li Y.Y., Bi C.F., Xie S.T. Synthesis, characterization and prohibitive action on free radical Ch OF р-phenylalanone Schiff base binuclear complexes // Координационная химия.-2008.-T.34, № 10.-C.780-782.

134. Gao E.J., Liu Q.T., Duan L.Y. Crystal structure and anti-cancer activity of a novel mixed-ligand complex: Pd(Phen)(Phe).Cl A H20 // Координационная ХИМИЯ.-2007.-Т.ЗЗ, № 2.-C. 125-128.

135. Gharib F., Aghael H., Taghvamanesh A., Shaflee G. lone strength of formation constants and complexation of glutamine with dioxovanadium(V)//Russian Journal of Coordination Chemistry, 2003, Vol.29, № 6, pp.408-413.

136. Guseva G.V., Fntina E.V. Complexation in Cobalt(II) Valinate-a,a-dipyrrolylmethene system//Russian Journal of Coordination Chemistry, 2005, v.31, № 3, pp.164-165.

137. Handbook of Chemistry and Physics, 66th ed., CRC Press, Boca Raton, Florida (1985)

138. Hsu H.-C. Genetic regulation of thymic involution // Mechanisms of ageing and development.-2005.-vol. 126.-p. 87-97.

139. Khavinson V.Kh., Ashmarin I.P., Malinin V.V. Age dynamics of regulatory peptides // Science of Longevity, No 1, 200 l.-p. 18-22

140. Kvetnoy I.M., Polyakova V.O., Trofimov A.V. et al. Hormonal function and proliferative activity of thymic cells in humans: immunocytochemical correlations//Neuroendocrinol. Lett.-2003.-vol. 24, № 3-4.-p. 157-162.

141. Liu Z., Zheng X., Wang J., Wang E. Molecular Analysis of Thymopentin Binding to HLA-DR Molecules // PLoS ONE.-2007.-vol.2, №12.-el348.

142. Poulin J.-F., Viswanathan M.N., Harris J.M., Komanduri K.V., Wieder E., Ringuette N., Jenkins M., McCune J.M., Sekaly R.-P. Direct Evidence for Thymic Function in Adult Humans // J. Exp. Med.-1999.-Vol. 190, № 4.-p. 479486

143. Qin X.-M., Duan M.-X., Deng B., Liu X.-C., Zhang Q.-Z., Liu Z., He H.-X. Isolation and Identification of a New Thymic Peptide from Calf Thymus // Biochemistry (Moscow).-2004.-vol. 69, № 8.-p.921-1133

144. Raman N., Ravichandran S., Thangaraja C. Copper(II), cobalt(II), nickel(II) and zinc(II) complexes of Schiff base derived from benzil-2,4-dinitrophenylhydrazone with aniline//J. Chem. Sci., Vol. 116, No. 4, July 2004, pp. 215-219

145. Singh M., Singh D.P. The energy dispersive polarized X-ray fluorescence spectra of alkali ana alkali earth metal chloride salts with amino acids at 25°C // Журнал физической химии.-2009.-Т.83, № 3.-C.450-462.

146. Slyudkin O.P., Tulupov A.A. Chiral complexes of Pt with amino acids: synthesis, structure, properties/ZRussian Journal of Coordination chemistry. -2005.-V.31.-№ 2.-pp.77-85.

147. Stepanenko O.N., Potaskalov V.A., Trachtvskii V.V. Heteroligand complexes with triethanolamine and aminoacetic acid//Russian Journal of Coordination Chemistry, 2001, v.27, № 1, pp.51-56.

148. Stephen C., Land S.C., Darakhshan F. Thymulin evokes IL-6-C/EBP regenerative repair and TNF- silencing during endotoxin exposure in fetal lung explants // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.-2004.-vol.286.-L473-L487.

149. Tahan A., Mollaamin F., Monajjemi M. Thermochemistry and NBO analysis of peptide bond: investigation of basis sets and binding energy // Журнал физической химии.-2009.-Т.83, № 4.-C.686-696.

150. Tewari В.В. Determination of stability constants of metal (II) methionine ana metal (II) - methionine-cysteine (binary & mixed) complexes an paper ionophoretic technique // Журнал неорганической химии.-2007.-Т.52, № 5.-C.878-881.

151. Tewari B.B. Determination of stability constants of metal (Il)-methionine and metal (II)-methionine-cysteine (binary & mixed) complexes an paper ionophoretic technique // Журнал неорганической химии.-2008.-Т.53, № 3.-C.541-544.

152. Tewari B.B. Determination of stability constants of metal (Dimethyl cysteine and metal (Il)-nitrilotriacetate-methylcysteine complexes with using a paper electrophoretic method // Журнал неорганической химии.-2009.-T.54, № 1.-C.151-155.

153. Tsoumakidou M., Tzanakis N., Siafakas N.M. Induced sputum in the investigation of airway inflammation of COPD // Respir. Med.-2003.-vol. 97, № 8.-p. 863-871.

154. Udovenko A.A., Zemnukhova L.A., Kovaleva E.V., Davidovich R.L. Crystal structure of monohydrate and (3-alaninum tetrafluoroantimonates (III)//Russian Journal of Coordination Chemistry, 2005, v.31, № 4, pp.225-229.

155. Vadi M., Zare Z., Nasiri K. Ionic strengthdependence of formation constants, protonation and complexation of aspartic acid with dioxovanadium (V) // Журнал неорганической химии/-2007.-Т.52, № 5.-C.882-884.

156. Vinokurov E.G., Bondar' V.V. Prediction of stability constants for Cr(III) and Cr(II) complexes//Russian Journal of Coordination Chemistry, 2003, Vol.29, № 1, pp.66-72.

157. Yarilin A.A. Cytocines in the thymus production and reception of cytocines // Journal 'Cytokines & inflammation1, 2003, No. 1

158. Zavaglia C., Severini R, Tinelli C, Franzone JS, Airoldi A, Tempini S, et al. A randomized, controlled study of thymosin-alphal therapy in patients with anti-HBe, HBV-DNA-positive chronic hepatitis В // Dig Dis Sci 2000.-vol.45.-p.690-696.

159. Zemnukhova L.A., Davidovich R.L., Udovenko A.A., Kovaleva E.V. Sb(III) fluoride complexes with DL-valine. Crystal structure of molecular complex SbF3{(CH3)2CHCH(4Wl3)COO"}//Russian Journal of Coordination Chemistry, 2005, v.31, № 2, pp.l 15-120.