Новые подходы к определению первичной структуры белков тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

московский государственный университет им.М.В.ЛОМОНОСОВА --------------_____ химический факультет

ЕГОРОВ Цезий Алексеевич

На правах рукописи

УД{ 577.112

НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ОПРЕДЕЛЕНИЮ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук (научный доклад)

Москва - 1988

Работа выполнена в Институте общей генетики им.Н.И.Вавилова АН СССР и в Институте биоорганической химии им.М.М.Шемякина АН СССР

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор АНТОНОВ В.К. доктор химических наук, профессор АЛАХОВ Ю.Б. доктор химических наук, профессор КАТРУХА Г.С.

Ведущая организация - Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Минмедбиопрома СССР /

Защита состоится " "2-1 " Х9Ь9 г. в

часов

на заседании Специализированного совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете им.М.В.Ломоносова.. """ " ' Ленинские

С авторефератом ! химического

факультета.

горы, МГУ, лаборат

.Автореферат

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук, доцент

Г.И.ЛАВРЕНОВА

------------Актуальность-проблемы^"Установление~первичной структуры

белков имеет большое значение как с теоретической, так и с практической точек зрения в современной химии, биологии и медицине, в генной и белковой инженерии и биотехнологии. В настоящее время определение аминокислотной последовательности белков более эффективно достигается секвенированием первичной нуклеотидной последовательности соответствующих структурных генов, чем прямым анализом белка традиционными методами белковой химии. Однако первичная структура не всех белков может быть определена таким путем. ¿Многие гены имеют сложное экзон-интронное строение и существуют в геноме не в виде единичных копий, а в виде кластеров, число генов в которых сильно варьирует от кластера к кластеру. Не все гены могут быть клонированы в виде полноразмерных копий, а многие белки подвергаются в процессе биосинтеза пост-трансляционной модификации (метилирование, фосфорилирование, гликозилирование, образование дисульфвдных мостиков и т.п.), что может быть установлено только путем исследования нативного белка. Кроме того в генной инженерии часто необходимо знание структуры определенных фрагментов белка для синтеза праймеров, знание Ы- и С-концевых аминокислотных последовательностей для определения начала и конца полипептидной цепи белка и т.п. В целом, в настоящее время стратегия и тактика определения аминокислотной последовательности белков сложилась таким образом, что наряду с секвенированием соответствующих кДНК или геномной ДНК осуществляется также прямое секвенирование полипептидов. Это дает возможность поеысить надежность результатов и эффективность исследований. Однако традиционные методы определения первичной структуры белков имеют ряд недостатков. Особые трудности возникают при изучении сложных белков, содержащих в своем составе липиды, углеводы, кофакторы, остатки цистеина или цистина и т.п., а также при изучении растительных белков. Особенность изучения тиоловых белков заключается в высокой реакционной способности сульфгидриль-ных групп, в сложности определения дисульфидных мостиков. Существующие методы анализа тиоловых белков далеки от совершенства. Как правило, пептиды, содержащие остатки цистеина, получаются с низким выходом или теряются при их выделении, с чем и связаны ошибки в структурно-функциональном анализе тиоловых

белков. Растительные белки, а особенности проламины, отличают. ся исключительно большим полиморфизмом и гидрофобным характером. Поэтому разработка новых подходов к определению первичной структуры белков также как и методов их вцделения и характеристики представляет собой актуальную проблем.

Дель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в разработке новых подходов к определению первичной структуры белков. Основное внимание уделялось изучению цисте-ин- и цистинсодержащих белков, сложных белков, содержащих в своем составе кофакторы или простетические группы, гидрофобных и растительных белков семян злаков. В качестве основных объектов исследования были выбраны аспартат-аминотрансфераза (КФ 2.6.1.IJ из цитозоля сердца свиньи; леггемоглобин из клубеньков желтого люпина ( Lupiaus luteus L. ), основные запасные белки семян пшеницы (Triticum aestivum )-глиадины, И овса (Avena sativa ь. )-авенины, и некоторые другие белки. Эти белки относятся к разным классам и их изучение классическими методами вызывает большие трудности', связанные как с получением чистых белков, особенно растительного происхождения, так и с их структурным анализом. Поэтому в задачи исследования входило:разработка методов получения чистых белков, а также повышение эффективности методов разделения и анализа пептидов.

Научная новизна и практическая,ценность. Предложена принципиально новая стратегия определения первичной структуры и структурно-функционального анализа цистеин- и цистинсодержащих белков. Она отличается от классического подхода тем,что фрагментация и(или) химическая модификация белков осуществляется после их предварительной иммобилизации по остаткам ци-. стеина на нерастворимых носителях на основе реакции тиол-ди-сульфидного обмена. Таким путем могут быть иммобилизованы не только водорастворимые, но и гидрофобные белки, в том числе мембранные белки, в присутствии различных денатурирующих агентов и детергентов, а также цистинсодержащие белки после их предварительного восстановления.

Для фрагментации могут быть использованы все известные ферменты, а также химические агенты в широком интервале рН среды (от 2 до 8), которые не затрагивают дисульфидные связи. При этом было показано, что происходит расщепление пеп-

тидных связей, образованных аминокислотными остатками, находящимися в непосредственной близости от остатков цистеина.

Одновременно разработаны условия "снятия" цистеиксодержащих________

фрагментов с кожки носителя и их алкилирования 4-винилпири-дином после удаления обращенно-фазовой хроматографией избытков восстанавливающего агента и 2-тиопиридона, образующегося на этой стадии.

На примере ряда цистин- и цистеинсодержащих белков показана эффективность предложенного подхода для сравнительного анализа белков и локализации существенных остатков цистеина в ферментах.

Принципиально вакнш является тот факт, что белки,иммобилизованные по остаткам цистеина,могут быть подвергнуты твердофазному секвенированию, а также расщеплению химическими способами или химической модификации с целью ограничения действия ферментов и получения необходимых фрагментов. При этом возможно последовательное применение разных ферментов или комбинация ферментативных и химических способов расщепления белков. Показано, что за ходом расщепления иммобилизованного белка можно судить как путем определения Ш-концевых аминокислот у образующихся фрагментов на носителе и у пептидов, уходящих э раствор, так и путем ВЭНХ этих же фракций.

Существенным преимуществом предложенного подхода по сравнению с классическими методами является как простота иммобилизации белков, так и простота удаления липидов, избытков реагентов или побочных продуктов реакции, образующихся при химической модификации иммобилизованных белков, что особенно важно при работе с микроколичествами исходного материала.

Дяя изучения ряда растительных белков, состоящих из множества гомологичных компонентов (до нескольких десятков).разработаны методы их разделения и очистки с использованием ионообменной, обращенно-фазовой и ковалентной хроматографии.

В результате определены полные аминокислотные последовательности следующих белков: аспартат-аминотрансферазы из цито-золя сердца свиньи, растительных гемопротеидов - дегтемогло-бина I и леггемоглобина П из клубеньков желтого люпина и "бы-строподвижного" компонента авенина (н 9).

На основе выполненной работы можно считать доказанным,что обе субъединицы аспартат-аминотрансферазы идентичны, каздая

из которых состоит из 412 аминокислотных остатков, молекулярная масса холофермента с учетом двух моделей пиридоксальфосфата равна 93147 дальтон, а кофермент связан с остатком лизина №258. Результаты этой работы позволили перейти к углубленному выяснению особенностей строения и каталитических свойств данного фермента.

Впервые осуществлено прямое секвенирование запасного белка семян злаков - "быстроподвижного" компонента авенина ( N9). Он состоит из 182 аминокислотных остатков и отличается высоким содержанием глутамина, пролина и гидрофобных аминокислот, имеет уникальную Ы-концевую аминокислотную последовательность и содержит три консервативных участка, которые свойственны всем запасным белкам семян злаков. Но в отличие от белков других злаков авенин M 9 имеет повторяющиеся олигопептиды типа WVQ^, где п =3-5.

Леггемоглобин I и леггемоглобин П не содержат остатков цистеина или.цистина. Для определения их первичной структуры наряду с обычными приемами был предложен специфически^ гидролиз трипсином по единственному остатку аргинина после предварительного ацилирования белка с последующим автоматическим секвенированием смеси без разделения образовавшихся фрагментов. Это дало возможность определись первичные структуры обоих компонентов леггемоглобина, построить трехмерную модель леггемоглобина П и выявить особенности строения этих гидрофобных белков. Каждый из изученных компонентов леггемоглобина состоит из 153 аминокислотных остатков, которые отличаются между собой заменой 20 аминокислот. Леггемоглобин П имеет укладку полипептидной цепи в пространстве миоглобинового типа. Инвариантными оказываются дистальный и проксимальный остатки гистидина, а также, так называемый, Pbe cm , которые взаимодействуют с гемом, и обнаружены во всех гемопро-теидах миоглобинового типа.

Полученные результаты дают новую информацию об эволюции белков и могут быть использованы в генетической и белковой инженерии и биотехнологии.

Предложенная новая стратегия структурно-функционального анализа тиоловых белков и методические разработки нашли широкое практическое применение при изучении большой группы белков: нейротоксинов, ферментов (ДНК-зависимая РНК-полимера-

за, формиатдегидрогеназа), мембранных белков (родопсин, бак-

териородопсин,-Ыа~, К*—АТФаза) ,-а-также рибосомного-факто------------------

ра элонгации С и других белков. Эти исследования осуществлялись в ряде институтов Академии наук СССР (Институт биоорганической химии им.М..4 .Шемякина, Институт молекулярной биологии, Институт белка, Институт биохимии им.А.Н.Баха).

I. ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ АНАЛИТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ХИМИИ БЕЛКА. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1.1. Выделение белков.

Многие белки, в особенности растительные, синтезируются в клетках в виде множественных генетически детерминированных форм (компонентов), которые, обладая общими свойствами, незначительно отличаются друг от друга,с чем и связаны трудности их выделения.

Леггемоглобины. В клубеньках люпина содержится несколько компонентов, которые не различаются по молекулярной массе и мало отличаются по заряду. Для их выделения была разработана следующая схема. После дробного высаливания и ионообменной хроматографии на 1>ЕАЕ-целлюлозе компоненты леггемоглобина разделяли на Х>ЕАЕ-сефадексе в тонком градиенте рН трис-БС1-бу-феров (от 7,9 до 7,1). Таким путем были выделены два основных (по содержанию) компонента - леггемоглобин I и леггемоглобин П. Анализ Ы-концевых ашнокислотных последовательностей, аминокислотного состава и пептидных карт компонентов показал, что выделены в гомогенном состоянии два малоразличающихся гидрофобных белка.

Авенины отличаются гораздо большей гетерогенностью, чем леггемоглобин. У различных сортов овса насчитывается более десятка компонентов, различающихся как по заряду, так и по молекулярной массе. По своему составу авенины являются неполярными гидрофобными белками, которые не растворимы в водных буферных системах, но хорошо;растворимы в 70%-ом этаноле и в концентрированных растворах детергентов. Они крайне мало содержат основных аминокислот, а дикарбоновые аминокислоты практически полностью амидарованы. Основываясь на этих свойствах, авенины вначале разделяли ионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) на сильнокислом катионите типа

Mono s (Фармация, Швеция) в 4М мочевине (рН 3»5)» элшруя белки с помощью тонкого градиента концентрации хлористого натрия (рис.1).

Дальнейщую очистку отдельных фракций осуществляли обратно-фазовой ВЭЖХ с дарокопористыми фазами (30 нм) в градиенте аце-тонитрила. Таким путем из овса сорта "Нарымский 943", который имеет широкий спектр компонентов авенина, были ввделены II компонентов, один из которых "быстроподвижный" (по электрофорезу) авенин N9, был выбран для определения его первичной структуры. Гомогенность авенина Ы9 была показана анализом К-концевой аминокислотной последовательности и электрофорезом в двух системах. Он имеет молекулярный вес около 22 кДа.

Глиадины - спирторастворимые запасные белки пшеницы, представляют собой наиболее полиморфную белковую систему из всех известных до сих пор в природе. В семени пшеницы имеется свыше 50 гомологичных глиадинов, различающихся по заряду и молекулярной массе. В ходе генетических исследований возникла проблема характеристики совершенно определенных компонентов о- и -¿"-глиадинов. Для их выделения была разработана следующая схема. Вначале их разделяли на две группы путем иммобилизации смеси белков по остаткам цистеина на тиопропил-сефарозе 6В (Фармация) после их предварительного восстановления, т.к. запасные белки не содержат свободных сульфгидрильных групп (условия иммобилизации см.ниже). Таким способом отделяли одну группу белков - ia -глиадины от всех остальных глиадинов и далее разделяли ионообменной и обращенно-фазовой хроматографией.

Выделение и очистку интересующих ^-глиадинов из второй группы осуществляли ионообменной и обращенно-фазовой ВЭЖХ.

1.2. Выделение и очистка пептидов

Выделение пептидов является наиболее трудоемкой и сложной задачей, от решения которой во многом зависит успех работы по реконструкции полипептидной цепи изучаемого белка. На начальных этапах работы с целью повышения эффективности исследований была разработана высокоэффективная ионообменная жидкостная хроматография на синтетических смолах. Для этих целей был использован синтетический сильнокислый катионообменник аминекс Q-I50S , который представляет собой сополимер стирола с диви-

»-1 »-2

>-9 -10

-•91. •Л 67

т а

л 30

— 20.1 ЛЧ.!-

б В

о 20 40 60 мин.

Рис. I. Ионообменная ВЭЖХ авенинов на колонке Мои о ^

(Фармация) в 4 М мочевине (рНЗ,5) и градиенте НаС1. Справа: (а) электрофорез в ПААГ (рН 3,1) суммарных авенинов, (б) электрофорез компонента Я9 в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия, (в) молекулярные маркеры.

мбензолом (8$ поперечной сшивки) и имеет средний размер зер-I 25-35 мк. Для разделения пептидов использовали колонки разгром 2,5x95 см и 3,7x150 см. Для элюирования использовали эадиент пиридин-ацетатных буферов с рН от 3,1 до 5,0 и с твнкм изменением молярности от 0,2 М до 0,5 М и от 0,5 М ) 2,0 М со скоростью потока порядка 47 мл/час/см^ при темпе-1туре колонки от 35° до 50°. Таким путем разделяли все раст->римые пептидные смеси, которые получались при фрагментации :партат-аминотрансферазы ферментами (трипсин, химотрипсин, грыолизин) и при ее частичном кислотном гидролизе.

Но несмотря на то, что при использовании описанной мето->логш время, затрачиваемое на разделение пептидов(Сократись с 3-4 недель до 8-10 дней (по классическим методам), все 1ено она не решала многих проблем определения первичной струк-гры белков »особенно доступных в малых количествах. Поэтому для

повышения как скорости разделения пептидов, так и чувствител ности анализа было предпринято исследование по оптимизации параметров колонок, выбору ионообменников с более мелким и небольшим разбросом размеров зерна, уменьшению экстраколоноч ного размывания и т.п. Были использованы катионообменники ти па Хромобидс Р-4 (22 -и), Аминекс А-6 (17,5 л* ) и другие.Раз витие лабораторной техники также позволило перейти к использованию колонок для работы под повышенным давлением. Так,при разделении пептидов леггемоглобинов I и П были использованы колонки размером 0,6 х 60 см, заполненные смолой Аминекс А-6 что дало возможность осуществлять разделение в пределах 2030 ч при общем расходе буфера порядка 400 мл и количестве фракций порядка 200-300 против 50-100 ч, 11-30 л буфера и 750-1500 фракций в предыдущем случае. В совокупности все это позволило снизить количество разделяемой смеси пептидов до 1 мкмоль и менее.

Для разделения и очистки крупных нерастворимых агрегиру ющих пептидов использовали традиционные методы гель-фильтрации и ионообменной хроматографии в растворах 6-8 М мочевины.

В дальнейшем, кроме указанных методов для разделения и очистки пептидов использовали также обращенно-фазовую ВЭЖХ н колонках с широкопористыми фазами (30 нм) в градиенте ацето-нитрила.

' Однако, несмотря на разнообразие методов разделения и очистки пептидов, их разделение все еще остается трудной зад чей. Методы разделения пептидов, основанные на заряде , размере или гидрофобном характере молекул, подчас оказываются к лоэффективными. Поэтому было предпринято исследование, котор привело к разработке метода селективного выделения цистеинсо держащих пептидов (см. раздел Ш.1). Этот метод позволяет не только получать цистеинсодержащие пептиды, с выделением кото рых до сих пор также были определенные трудности. В целом уя рощается задача разделения сложных смесей пептидов, образующихся при фрагментации особенно крупных и гидрофобных белкоЕ т.к. происходит селективное разделение фрагментов на две грз пы.

1.3. Аминокислотный анализ

' Эффективность аминокислотного анализа определяется в основном двумя параметрами - скоростью и чувствительностью анализа, которые могут быть повышены путем оптимизации параметров аналитической колонки, уменьшения экстраколоночного размывания элшента, подбора ионообменных смол и режима анализа. Благодаря уменьшению длины реактора заметно улучшилось разрешение наиболее трудноразделяемой пары аминокислот треонин-се-рин до 95% (против 80$ в стандартном реакторе). Оптимизация параметров колонок (уменьшение внутреннего диаметра до 4-6 мм, и длины до 25-35 см, использование смолы с размером частиц 8 или Ир), позволила, не ухудшая качества и точности анализа, сократить время анализа с 6-8 ч до 1,5-4 ч, повысить чувствительность в 2-3 раза и дала возможность выполнять анализы на уровне 5 нмоль.

Дальнейшее повышение чувствительности аминокислотного анализа бьшо достигнуто путем использования реагентов, которые образуют с первичными аминами флуоресцирующие производные. Для этих целей различными авторами были предложены дна реагента -флуорескамин и о-фталевый диальдегид (ОФА). Из них ОМ оказался наиболее практичным. В отличие от флуорескамина он хорошо растворим в водных средах, что существенно для хроматографического анализа аминокислот на ионообменных смолах. Но условия анализа с помощью ОФА были еще недостаточно изучены в динамических условиях анализатора аминокислот. Прежде всего выявилась сильная зависимость интенсивности флуоресценции от рН среды при соотношении скорости потоков элюат-реагент 2:1, которое обычно используется во многих анализаторах. Для той группы аминокислот, которые элюируются кислым буфером, буферной емкости раствора реагента оказывается явно недостаточно. Однако увеличение молярности буфера в два раза позволяет при времени реакции 30 сек достичь практически одинаковой интенсивности флуоресценции для всех аминокислот. Лимитирующим фактором при количественном анализе аминокислот с помощью ОФА является чистота буферных растворов. Яри использовании реактивов марки о.с.ч. можно анализировать кроме пролина все аминокислоты на уровне 0,25-0,5 нмоль.

1.4. Секвенирование пептидов и белков

В начале работы аминокислотную последовательность пептидов определяли ручными методами. Однако в дальнейшем с развитием техники автоматического секвенирования определение аминокислотной последовательности белков осуществляли с помощью кидкофаз-ного, твердофазного и газофазного секвенаторов с идентификацией ФТГ-аминокислот ТСХ, ГЖХ и ВЭЖХ. Использование автоматического секвенирования позволило изменить тактику определения первичной структуры белков. Стало выгоднее получать и секвенировать крупные фрагменты белка. Такая тактика была использована при изучении леггемоглобинов и авенина. Например, в последнем случае был полностью секвенирован 52-членный триптический пептид Т7 (см. раздел 1У.2). Совершенно новые возможности открываются при сек-венировании белков, иммобилизованных по остаткам цистеина на пористом стекле. На примере ¡Ъ-цепи гемоглобина крупного рогатого . скота было показано, что наряду с определением N-концевой аминокислотной последовательности удается идентифицировать еще два участка цепи после расщепления остатка конъюгата трипсином и бромцианом (рис.2).

Недостатком этого метода является то, что нельзя идентифицировать остатки цистеина, которые связаны с носителем. Однако при последовательном расщеплении и секвенировании иммобилизованного белка, исходя из одной пробы, могут быть выделены и использованы для анализа фрагменты, которые уходят в раствор, что ваяно при изучении больших белков,доступных в ограниченных количествах.

П. СТРУКТУРА ЛЕГГЕЫОГЛОБИНА

Леггемоглобин (ьъ ), растительный геыопротеид, состоит из одной цепи и имеет в качестве простатической группы железо-протопорфирин IX. Он является.важным компонентом симбиотичес-кой системы фиксации молекулярного азота у бобовых растений.

Для определения первичной структуры выделенных двух компонентов леггемоглобина была использована фрагментация их полипептидных цепей трипсином, химотрипсином, теркслизином.

Изучение продуктов фрагментации леггемоглобинов I и П

А. рвАни' ; ' , ' \ '

-----------М---------1* и м м с и

чтЬ?-

с

чЬя

В* Т/И11 УУ,1Д ^ 1

с

Рис.2. Стратегия твердофазного анализа аминокислотной последовательности -цепи гемоглобина крупного рогатого скота. Черными прямоугольниками • показаны участки цепи,определенные путем: (А) анализа Ы-концевой последовательности иммобилизованного белка (18 остатков), (Б) анализа остатка цепи после гидролиза трипсином (12 остатков) и (В) анализа остатка цепи после расщепления бромцианом (15 остатков)

и определение юс М-концевых аминокислотных последовательностей показал, что из каждого гидролизата исследованных белков не был выделен сильно гидрофобный триптический пептид Т-4 (остатки № 29-40, рис. 3). Для определения аминокислотной последовательности этого участка цепи было использовано специфическое расщепление полипептидной цепи трипсином по единственному остатку аргинина с последующим анализом аминокислотной последовательности на секвенаторе без разделения смеси. Таким путем, в случае леггемоглобина I удалось идентифицировать 30, а в случае леггемоглобина П - 35 аминокислотных остатков. Всего для леггемоглобина Я, как видно на рис. 3, с помощью секвенатора бьш определен с Ы-конца молекулы 71 аминокислотный остаток. Для полной реконструкции полипептидных цепей леггемоглобинов I и П потребовалось изучить химотриптические и термолитические пептиды. В результате были определены полные аминокислотные последовательности обоих компонентов леггемоглобина люпина, которые различаются между собой заменой 20 аминокислот. Таким образом, впервые был изучен полиморфизм

10

20

вШь*

30

1ПП<зПЛа ьукг б^Лв е р м а n i р кГЙ]т нерр в ш ш ш •

Т1-X-:—Т2-Х-ТЗ —*-

Секвенатор 1 (ЬЫ) ■ Секвенатор 1 (ьъи)

40 50 бо

ь v ъ е i а рппа кпрзпк 0 г§1 э е v р() пк ргщь

Щ Ы ш

—--Т4 ->е-15 -X-16-

70

чанаскур кь -*Т7 —X-

Секвенатор2 (ЬЪ1) ■ Секвенатор 2 (ЬЪИ) ■

80

-Т8 -

и 11 v А

12. щ [v

90

3 I) А I I

тР-

К Б Ъ й £

Л

27-5

Т9

100

110 • 120 с а е ? р у ук еа1ькт1ее

Т10

с-16-5

-X— 111—*Т12 — -С-22-3-

V 7

— т13—

<— ть-22-4

с а а <—

-Т'17-> <-

->■

ьы ьъи

130 140 150 АВ11АТВЕ1А 1x11 I К К Е № [к]

Щ 1д|

-Т14-*Т*-Т1б->

15 «-118-<-ТЬ-26-1 -

3 е е ь н i

Рис.3. Полные аминокислотные последовательности лег-гемоглобмна I и леггемоглобина II люпина.

' Секвенатор 1 - анализ Ы-концевых аминокислотных последовательностей; секвенатор 2 - после гидролиза по остатку Аг£-28 ; - пептиды

триптического, химотрштического и термолиза-, нового гидролиза, соответственно.

леггемоглобина на молекулярном уровне. Сравнение аминокислотных последовательностей леггешглобинов_1_1гД,_с учетом тре-— — тичной структуры последнего, показало следущее. Ни одна из замен не затрагивает участков окружения гема. Причем, с точки зрения химической природы аминокислотных остатков, подавляющая часть замен носит "нейтральный" характер. Например, глутаминовая кислота заменяется на аспаргиновую, треонин на серии, гидрофобные аминокислоты заменяются на гидрофобные. Все это хорошо согласуется с нейтралистской теорией Кимуры, согласно которой большинство аминокислотных замещений и полиморфизм белков вызваны нейтральными мутациями и случайным дрейфом генов (Ли, Верма, 1984).

Определение первичной структуры леггемоглобинов I и П люпина в значительной степени помогло построению трехмерной модели леггемоглобина П на основе рентгено структурно го анализа этого белка, который был выполнен в Институте кристаллографии АН СССР коллективом авторов под руководством академика Б.К.Вайнштейна. Оказалось, что третичная структура леггемоглобина П имеет укладку полипептидной цепи миоглобинового типа, различаясь в некоторых деталях. В отличие от миоглобина кашалота леггемоглобин П имеет 7 спиралей (А, В, С, Е, F, G, Н), спираль D практически отсутствует. Спирали Е и F удлинены на 5 и 4 остатков,соответственно, а все неспиральные участки укорочены, за исключением участка CD , который удлинен на 2 остатка. При сопоставлении аминокислотных последовательностей леггемоглобина П и миоглобина кашалота с учетом этих данных вырисовывается следующая картина (рис.4). Инвариантными оказываются 26 аминокислотных остатков, включая дистальный Е7 и проксимальный FIO (F 8 у миоглобина) остатки гистидина, Fhe CD1 , а также ряд других аминокислот, которые,за исключением His В5 , Пе В11 и Lya CD5 , участвуют в обеих молекулах в одной и той же системе контактов. Гем находится в окружении гидрофобных аминокислот, которые как и в миоглобине образуют три кластера, сходных по строению,но отличающихся некоторыми деталями.

На основании выполненного совместно с Арутюнян Э.Г. и Курановой И.П. сравнения можно сделать следующие выводы. Несмотря на большие различия в аминокислотных последовательностях (они имеют 17% инвариантных аминокислот), леггемоглобин П и миоглобин имеют сходную третичную структуру. Оба белка имеют

мъ - V ь в е с е v/ <3 i v ь н V iv А к V е А

ъъи в А Ъ т е 8 (5 А А ь V ъ э 3 VI е е р и А

20 * о v а с ЧЛс о и птиикэн „ . _ „1„1_ Г.___I , „ , „ .

ЬиаЧЬ

-1ав

40 Е11

а а к

60*

Е К Р 0 И р|"к]н ь к - - Т Е А Е М К А 3 Б С Г к к н с V I V

Б Р Б Р ь^а т 3 Е V Р <3 N - ---N Р Е ь а А Я А 0 к V

ьтсАПк--ГК1ТУБАА1«1

со

80

100

---к к С н н Е А Е _ - Ь к р ь А <5 Н А X - - К Н К I Р I К У ь Е Р I в Е А I

Е V Т - - С V V V Б I) А 'Г ь к II ь С Э V Н V Б К С V А - --0 А н р Р V V к Е А I

ер ■

120

■ Рв —} I

140

I н V I н к - Н Р А 0 р 0 А 0 А 0 й А М И к А I» Е Ь Р И К Б Т А А К У К Е Ь Й уд в

I. к т I к в V V - 0 А К У/ 5 Е Е Ь N 3 А И г I А. У В Е ь- А I V I К Е Е М 0 V А А---

•он

•но

Рис.4. Сравнение аминокислотных последовательностей миоглобина кашалота и леггемогдо-бина II люпина. В рамках показаны инвариантные остатки. Звездочками отмечены аминокислоты, выполняющие одинаковую роль в обоих белках; в пунктирных рамках-аминокислоты, участвующие в различной системе контактов.

I

в

*

*

*

*

н

высокий процент аминокислотных остатков, вовлеченных в образование oi-спиралей (77% в леггемоглобине П и почти з мио-глобине). Следовательно, для укладки полипептидаой цепи важна не природа остатка, а порядок чередования полярных и неполярных аминокислот, характер распределения гидрофильных и гидрофобных аминокислот и т.п. Важно, чтобы сохранились условия для свертывания спиралей и их взаимодействия мевду собой и с гемом. В этом отношении характерным примером является одаовре-менное изменение полярности взаимодействующих остатков аминокислот. У всех миоглобинов и гемоглобинов конфигурация полипептидной цепи на участке GH поддерживается водородной связью менду остатками Asp GH4 и Lys At 4 .В леггемо глобине П полярные остатки поменялись местами, т.е. место Asp GH4 занимает Lys GH3, а место Lys Al 4 занимает Glu А14 . Однако положение контакта в молекуле леггемоглобина П не изменилось.

Открытие и анализ структуры гемоглобина у небобовых растений (С.Е.Эплбай, 1965) подтверждает важность всестороннего изучения этой группы белков, как для развития общих представлений в современной биологии, так и для генетической инженерии растений.

Щ. СТРАТЕГИЯ СТРУКГУРНО-ФУНКШЮНАЛЬНОГО АНАЛИЗА ЦИСТЕИН- И ЦИСТИШОДЕРЖАЩИХ БЕЛКОВ

Особенность изучения белков, содержащих остатки цистеина и(или) цистина, заключается з высокой реакционной способности сульфгидрилъных групп. Поэтому их предварительно блокируют различными алкилирующими агентами. Однако вследствие различной реакционной способности и доступности часть сульфгидриль-ных групп модифицируется не полностью. В результате цистеин-содер&адцие пептиды, как правило, выделяются с малым выходом или теряются при их выделении. Кроме того при алкилировании могут затрагиваться остатки других аминокислот (лизин, метио-нин, гистидин).

Поэтому для решения вышеупомянутых проблем химии белка было проведено исследование по селективному выделению цистеин-содеряащих пептидов и выработке стратегии анализа первичной структуры тиоловьк белков.

111.1. Метод селективного- выделения цистеинсодеркадих пептидов

В результате выполненной работы был разработан метод селективного ввделения цистеинсодернащих пептидов и на его основе предложена стратегия структурно-функционального анализа цистеин- и цистинсодержащих белков. В общих чертах она заключается в том, что такие белки предварительно иммобилизуют по остаткам цистеина на нерастворимых носителях на основе реакции тиол-дисульфидаого обмена, в результате которой между белком и ножкой носителя образуется устойчивая ковалентная связь. Затем иммобилизованный на носителе белок (конъюгат) подвергают расщеплению ферментами или химическими агентами (рис.5). При этом пептиды, не содержащие остатков цистеина, уходят в раствор (фракция I). Цистеинсодержащие пептида (фракция П) выделяют путем восстановления дисульфидных связей с последующим

\

|рн 8 Белок

\ * V

%

Б—Э—^

1 2-Тиопиридон

' (Фериеят илн (химический 1'геыт

Промыаяа

+

рН 8

вен

Л

Смесь пептидов (фракция I)

+ Н—Э—

БН + НЭ

Цистеин содержащий фрагмент (фракция II)

Э—Н

Рис.5. Принципиальная схема селективного выделения цистеинсодераащих пептидов с помощью реакции тиол-дисульфидаого обмена на нерастворимых носителях. Структура активированного носителя показана условно.

алкилированием сульфгидрильных групп. Затем в зависимости от целей каждую группу пептидов разделяют обычными методами.

В"качестве носителя использовали активированную тиопро-пилсефарозу 6В (Фармация, Швеция), которая имеет емкость 20 мкмоль/мл геля. Следует отметить, что носители на основе ага-розы обладают малой химической устойчивостью. Поэтому в случае жестких условий расщепления иммобилизованных белков использовали активированный тиол-кремнезем следующей частичной . структуры:

\

0 - ьи- (СН, ) - Ш- С О-С Н2 - Б-3-((3)

Этот носитель был синтезирован в лаборатории С.В.Рогожина и имел следующие характеристики: диаметр пор 68-70 нм, рабочая поверхность 60,8 м^/г, внутренний объем 1,8 смэ/г, емкость активных тиоловых групп около -40 мкмоль/г сухого веса.

В последующем активированный носитель получали из продаж-* ного препарата фирмы Пирс (США) путем его обработки 2,2'-дигаь. ридисульфидом:

р-со-сн, „^

|-0-За-(СН2)3-ИН-С0-СН-СН2-ЗН +

■о ЯН-СО-СН3

■0-31-(СН2)3-МН-С0-СН-СН2-3-3-{^> +

I

н

Он имел размер пор 55 нм, рабочую поверхность 70 иг/г, внутренний объем 1,0 см3/г и емкость после активации около 15 мкмоль/ г сухого веса.

Ш.2. Иммобилизация цистеин- и цистинсодержадщх белков

Цистеинс9держащие белки. В нативных белках сульфгидриль-ные группы могут находиться как на поверхности, так и внутри глобулы. Поэтому белки иммобилизовали в денатурирующих условиях (гуанидингидрохлорид) при комнатной температуре. Реакция тиолдисульфадного обмена происходит в широком интервале рН среды быстро в щелочной среде и гораздо медленнее в кислой.

Экспериментально было найдено, что белки могут быть иммобилизованы при рН 4 в-течение 15 ч или при рН 8 в течение 4-6 ч. Время реакции также зависит от того, насколько быстро денатурирует белок. Во избежание нежелательного тиол-дисульфидного обмена иммобилизация в кислой среде более предпочтительна. Степень иммобилизации определяли по измерению высвобождающего« 2-тиопиридона, который имеет максимум поглощения при 343 нм или с помощью аминокислотного анализа после кислотного гидролиза конъюгата, когда в качестве носителя использовали пористое стекло. Выход в среднем для различных белков составлял 80-90% и выше.

Иммобилизация цистинсодержаиих белков. Белки, содержащие дисульфидаые мостики должны быть предварительно восстановлены, а избыток восстанавливающего агента должен быть полностью удален до стадии иммобилизации. Гель-фильтрация, обессоливание и концентрация белков на селективных мембранах здесь мало подходят как в силу разбавления образца, так и риска реокисления дисульфидных связей. Поэтому для удаления избытков восстанавливающего агента была предложена методика его удаления с помощью обратно-фазовой хроматографии на'коротких колонках или патронах в градиенте ацетонитрила в присутствии 0,1%-ой три-фторуксусной кислоты (ТШУ), которая является хорошим солюби-лизирующим агентом для белков, в том числе гидрофобных. После упаривания фракции белка он может быть растворен в соответствующем буфере, содержащем денатурирующий агент, для последующей иммобилизации. Таким путем иммобилизовали с выходом около 90% и более ряд цистинсодержащих белков: так называемые лейцин изолейцин-валин(ыу)- и лейцин-специфичные (ьз) белки, авени-ны и глиадины.

Иммобилизация мембранных белков. Особый интерес представляла иммобилизация мембранных белков, которая могла бы решить такие проблемы структурно-функционального анализа этой важной группы белков как удаление липидов и фрагментация гидро фобных белков. Известно несколько способов освобождения липидов от белков. Однако все они имеют ряд недостатков, главным из которых является то, что в процессе удаления липидов и детергентов, которые используются для солюбилизации мембранных белков, могут затрагиваться сульфгидрильные группы белков. -

Для солюбилизации мембранных белков обычно используют различные поверхностно-активные вещества как додецилсульфат натрия и др. На примере бычьего сывороточного альбумйна~бш1а~показа-на возможность иммобилизации белка по остаткам цистеина на активированном пористом стекле и полного удаления детергента.

Родопсин из сетчатки хрусталика глаза является интегральным мембранным белком. Для его иммобилизации очищенные фото-рецепторные мембраны солкбилизировали в растворе додецилсуль-фата натрия (рН 4) и эффективно перемешивали с активированным носителем. Затем конъюгат промывали на фильтре водой и растворителями до полного удаления детергента и липидов. Выход, определенный по аминокислотному анализу, был количественным. Таким образом был найден простой способ иммобилизации мембранных цистеинсодержащих белков и удаления липидов.

Ш.З. Химическая модификация иммобилизованных белков

Дансилирование. Дансилирование иммобилизованного белка или продуктов его фрагментации на носителе осуществляли по

классической методике с той лишь разницей, что после окончания реакции избыток реагента и буфер удаляли промыванием конъюгата водой и ацетоном. Высуженный конъюгат далее. гидроли-зовали соляной кислотой, упаривали досуха и после экстракции остатка ацетоном дансилпроизводные аминокислот определяли тонкослойной хроматографией. Дансилирование иммобилизованных белков имеет ряд преимуществ. Во-перзьк, значительно уменьшается фон посторонних аминокислот, которые обычно присутствуют в водных буферах, и удаляется избыток реагента и побочные продукты реакции, которые затрудняют интерпретацию результатов анализа особенно при работе с микроколичествами. Во-вторых, для растворения белка можно использовать практически любые буферы, содержащие амины и различные солюбилизирующие реагенты (мочевина, гуанидингидрохлорид, додецилсульфат натрия и т.п.), что недопустимо при использовании классической методики и важно при характеристике мембранных и других трудао-растворимых белков. Безусловно»новый способ дансилирования ци-стеин- и(или) цистинсодержащих белков будет особенно полезен при идентификации дансиламинокислот методами ВЭЖХ на уровне пико- или фемтомолей, где уровень фона и побочные продукты в реакции являются лимитирующим фактором.

Ацилирование. Ацилирование (обратимое или необратимое) широко используется в структурно-функциональном анализе белков для ограничения действия трипсина. Методическая особенность ацилирования иммобилизованных белков заключается в том, чтобы при условии достаточно быстрого гидролиза ангидридов в водной среде в гетерогенной фазе полностью модифицировать остатки лизина. Решить эту задачу оказалось возможно путем использования большого избытка (300-кратного) реагента и интенсивного перемешивания реакционной смеси. Полноту ацилирования аминогрупп иммобилизованного белна определяли дансилированием, как описано выше. На примере ^-цепи гемоглобина, которая содержит II остатков лизина, было продемонстрированы преимущества аци_ лирования белков в иммобилизованном виде.Это-простота и легкость удаления избытков реагентов и солей, удобный способ контроля за полнотой реакции.

Совершенно очевидно, что для модификации аминогрупп иммобилизованного белка могут быть использованы другие реагенты? например, фенилизотиоцианат, что и было показано на примере -цепи гемоглобина.

Ш.4. Фрагментация.иммобилизованных' белков ферментами

Ферментативный -гидролиз иммобилизованных белков принципиально ничем не отличается от обычного переваривания белков с той лишь разницей, что необходимо эффективное перемешивание суспензии при соотношении объемов носитель-буфер от 1:1 до 1:3. Для гидролиза использовали, как правило, такое же соотношение фермента к субстрату, что и при традиционном способе. Для гидролиза иммобилизованных белков были апробированы пепсин и трипсин, которые сильно отличаются по специфичности и по оптиму рН действия (соответственно рН 2 и рН 8). По окончании гидролиза пептиды, уходящие в раствор, тщательно отделяли промыванием остатка коньюгата. Цистеинсодержащие пептиды "снимали" с носителя и алкилировали. Условия "снятия" и алки-лирования см. в разделе Ш.6.

Гидролиз пепсином. Для гидролиза пепсином использовали два белка известной структуры: основной парвальбумин из мышцы мерлузы, который содержит 108 аминокислотных остатков, включая I остаток цистеина; бычий сывороточный альбумин, который со-

держит 565 аминокислотных остатков, включая I остаток цистеина и несколько_остатков-цистина.-Исчерпывающий-гидролиз-пеп- "" сином осуществляли при соотношении фермента к субстрату 1:25 (по весу) при 37° в течение 15 ч.

В результате из парвальбумина .был выделен цистеинсодержа-щий пептид с выходом 40%, который отвечает остаткам $16-29 в белке. Этот пептид описан в литературе при переваривании данного белка пепсином. Из альбумина, который иммобилизовали без восстановления по единственному остатку цистеина, с выходом 11% бьш вцделен искомый пептид, который занимает позицию ,'Х31-38 в полипептидной цепи белка. Из этого следует, что гидролиз иммобилизованных белков пепсином происходит так же как и в растворе.

Исчерпывающий.гидролиз трипсином. Для оценки возможностей триптического гидролиза иммобилизованных белков в качестве субстрата использовали аспартат-аминотрансферазы из цитозоля сердца свиньи и курицы, которые содержат 5 и 4 остатка цистеинов, соответственно. В обоих случаях были выделены все цистеинил-пептиды в среднем с выходом 50% длиной от 5 до 40 остатков.Их расположение в полипептидных цепях обоих белков показано на

рКС'6' 100 • 200 300 400

(13) (5) (40) (17) (9)

А. 1--П—I —Ег^-я 1 -и?я-1 " - 1 и 1 1

Суз- &уз-82 Суэ-192 Суз-252 Суз-390

45

(27) (20)(17) (9)

Б. - Г '" ' митаиш ' ■ I

Суз-1 Суз-252 Суз-390

192 Суз-21б

Рис.6. Схематическое изображение полипептидаых цепей аспартаташнотрансферазы из сердца свиньи (А) и сердца курицы (Б). Расположение цистеинилпел-тидов показано черными прямоугольниками; в скобках показано число остатков.

Сравнительный анализ цистеинсодэржащих пептидов позволил классифицировать вса остатки цистеина в молекуле аспартат-ами-нотрансферазы. В ферменте из сердца курицы отсутствуют остатки цистеина № 45 и № 82, но имеется остаток цистеина № 216. Отсю-» да можно заключить, что эти остатки не существенны для функци-. онирования данного фермента.

На примере формиатдегидрогеназы было показано,что иммобилизованный белок гидролизуется трипсином достаточно быстро. Уже после 40 мин гидролиза не происходит заметного увеличения количества цистеинсодержащих пептидов, по которым осуществлялась оценка методами ВЭЙХ.

Полученные результаты позволяют сделать вывод, что трип-тический гидролиз иммобилизованных белков протекает специфично и достаточно полно.

Специфический гидролиз,трипсином по остаткам аргинина. Этот тип гидролиза часто используется при изучении белков. Однако разделение получающихся крупных фрагментов связано с известными трудностями. Поэтому здесь техника селективного разделения могла оказаться наиболее полезной. Возможность выделения крупного фрагмента была показана на примере £-цепи гемоглобина крупного рогатого скота. Белок вначале иммобилизовали на носителе, затем ацилировали малеиновым ангидридом о (см.выше) и гидролизовали трипсином при,соотношении фермента к субстрату 1:100.Таким путем из ^-цепи гемоглобина,которая соо-тоитиз i45 аминокислотных остатков и содержит один остаток цистеина и 4 остатка аргинина, был выделен 76-членный фрагмент, соответствующий специфичности трипсина.

Чрезвычайно интересные перспективы открываются при изучении белков, содержащих дисульфидные мостики. Так, в случае ЫУ- и ЬБ-белков, каждый из которых содержит по одному дисуль-фидному мостику, были выделены путем гидролиза трипсином иммобилизованного белка по два пептида длиной 3 и 38, 13 и 36 остатков, соответственно. Другая возможность заключается в выделении более крупных фрагментов. Вначале белок ацилировали,а затем после восстановления его иммобилизовали на носителе и гидролизовали трипсином. Таким образом из ЫУ- и ьз- белков были ввделены цистеинсодержащие фрагменты длиной 109 и 62 остатка,-соответственно, с выходом 58 и 64$ (рис.7)^ для очистки которых потребовалась только гель-фильтрация.

Изучение структуры этих фрагментов показало, что размер "петли", образующейся за счет дисульфида) й связи, одинаков в обоих белках.

Таким образом,селективное выделение триптических цистежои пептвдов позволяет также осуществлять сравнительный анализ соо' ведствующих участков полипептидных цепей гомологичных белков.

LIT

IS

>9 OCT.)100 200 300

RR R R R RR

(82 OCT.)

3 _S RR RR RRR

Рис.7. Схематическое изображение LIT- и LS- белков. Цистеинсодержащие пептиды показаны черныш прямоугольниками.

111.5. Химические способы Фрагментации иммобилизованных белков

Частичный кислотный гидролиз.и.расщепление по связи,аспартил-пролин .В ходе настоящего исследования и по литературным данным было установлено, что связь аспартил-пролин достаточно легко расщепляется в кислой среде при повышенной температуре без заметного разрыва других пептидных связей. Поэтоьгу было интересно использовать такой способ фрагментации белков .предварительно иммобилизованных на нерастворимых носителях по остаткам цистеина с целью Еыделения крупных фрагментов. В качестве модельного объекта была выбрана £,-цепь гемоглобина, которая наряду с единственным остатком цистеина содержит одну связь аспартил-пролин. Иммобилизованную р-цепь расщепляли при рН 2,2 в течение 36 ч при 37°С. При этом за ходом расщепления следили по анализу Ы-концевых аминокислот. В результате был выделен одан JM-концевой фрагмент, содержащий 98 остатков (рис.8).

Asp-Pro

I--'-1-1-'-1-1-1-1_■ T^ ' '

r i i i i-1-—i--—V

M RRMMC R R

t—

Рис.8. Схематическое изображение К>-цепи гемоглобина и продуктов ее расщепления кислотой и бромцианом.

Расщепление бромтдканом. Устойчивость ковалентной связи остатков цистеина с носителем как и самого носителя позволила также использовать для фрагментации иммобилизованных белков расщепление бромцианом. Для этих целей коньюгат обычно подвергали воздействию 100-200-кратного избытка реагента в ОД н.Ш1 или 70-80% НСООН. В результате расщепления иммобилизованной (!, -цепи гемоглобина в одан прием, удалось выделить 71-членный

цистеинсодержащий фрагмент (рис.8).

Этот способ был использован при расщеплении аспартат-ами-нотрансфераэы из цитоэоля сердца свиньи броыцианом. В результате были ввделены все три искомые фрагмента СВ1, СВ2 и СВ7 (212, 75 и 23 остатков, соответственно). При этом было найдено, что происходит также эффективное расщепление белка по связи метионил-цистеин (остатки $ 391-392), когда остаток цистеина

связан с ножкой носителя.(рис.9).

100 200 300 400

С С С Ы С М 1Ш М ЫС

СВ1 СВ2 СВЗ

Рис.9. Схематическое изображение аспартат-аминотрансфе-разы и ее бромциановых фрагментов.

Расщепление бромцианом было успешно использовано в структурно-функциональном анализе родопсина.

Селективное разделение продуктов бромцианового расщепления больших и гидрофобных белков существенно облегчает задачу выделения и очистки крупных фрагментов.

Ш.б. "Снятие"|цистеинсодержащих пептидов с носителя

Существенным моментом при выделении цистеинсодержащих фрагментов является "снятие"е пептидов с носителя и последующее алкилирование. Собственно "снятие" пептидов с носителя не вызывает особых проблем. Обычно восстановление осуществляли избытком 2-меркаптоэтанола в растворе 5 М гуанидингидрохлорида рН 8. Но возможно восстановление и без денатурирующего агента с последующим последовательным промыванием конъюгата рядом буферов и растворителей. Таким путем иногда удается разделить фрагменты только на основании растворимости. До определенного времени были трудности, связанные с алкилированием цистеинсодержащих- пептидов. Поскольку при иммобилизации используются 50-100-кратные избытки носителя, то при "снятии" пептидов образуются большие избытки 2-тиопиридона, который затрудняет реакцию алкилирования.

Из всех возможных методов наиболее быстрым и удобным оказалось обессоливание обратно-фазовой хроматографией, что первоначально было предложено для иммобилизации цистинсодержащих • белков (см. раздел 1И.2).

Риск окисления сульфгидрильных групп при таком способе обессоливания минимален, поскольку оно происходит в кислой среде", не~содержащей~кислорода.~ После нанесения реакционной смеси на колонку и вымывания солей и побочных продуктов реакции 0,1%-ой ТФУ пептиды десорбировали 40-60%-ным ацетонитри-лом, содержащем 0,1%-ую ТФУ. фракцию пептидов упаривали досуха и растворяли в буфере рН В.О, содержащем 5М гуанидингидро-хлорид, ЕДТА и 5%-ый 2-меркаптоэтанол. После 30-минутной инкубации к смеси добавляли 1,5-кратный (по объему) по отношению к меркаптоэтанолу избыток 4-винилпиридина и оставляли стоять на 2,5 ч в атмосфере аргона. По окончании реакции смесь разделяли обычно обратно-фазовой ВЭЖХ. Недостатком такого способа удаления избытков реагента и побочных продуктов реакции является риск потери коротких и гидрофильных пептидов, которые не удерживаются на колонке. Для проверки их наличия рекомендуется предварительно проанализировать неизвестную смесь другими методами.

Ш.7. Локализация существенных остатков цистеина в

ферментах

Важное место при изучении структуры и функции ферментов занимает задача локализации функционально важных аминокислот. При этом трудности часто возникают не столько с введением метки, сколько с наделением необходимого фрагмента из сложной смеси пептидов. В этом отношении метод селективного выделения ци-стеннсодеркащих пептидов мог оказаться полезным для выявления существенных остатков цистеина в ферментах.

HAD -зависимая формиатдегидрогеназа из метилотрофных бактерий состоит из двух субъединиц, каждая из которых содержит 393 аминокислотных остатка, включая шесть остатков цистеина, различающихся своей доступностью и реакционной способностью. Причем один из шести остатков цистеина в субъединице фермента обладает аномально высокой реакционной способностью. Его избирательное блокирование приводит к полной потере ферментативной активности. Сначала вышеописанным методом были выделены и секвенированы все цистеинсодержащие пептиды. Их оказалось пять, один из которых содержит два остатка цистеина. В отдельном эксперименте провели избирательное блокирование реакционно-

способного остатка цистеина .в нативном ферменте с помощью иод ацетамида. Затем белок иммобилизовали на носителе

в денатурирующих условиях и гидролизовали трипсином. Фракцию цистеинсодержащих пептидов после "снятия" с носителя алкили-ровали 4-винилпиридином. Результаты сравнительного анализа пептидов показали, что число цистеинсодержащих пептидов не уменьшалось. При секвенировалии одного пептида, содержащего метку и два остатка цистеина, было .определено положение карбо-

ксамидометилцистеина и пиридилэтилцистеина: ** *

(*) г - [14С] -карбоксамидометилцистеин (**) з -пиридилэтилцистеин

Таким образом, с помощью предложенного метода локализован существенный остаток цистеина в формиатдегидрогеназе, выделены все цистеинсодержащие триптические пептиды, которые в сумме содержат 103 аминокислотных остатка, и изучено их строение.

1У. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ НЕКОТОРЫХ ЦИСТЕИН- И ВДСТИНСОДЕРМЩИХ БЕЛКОВ

1У.1. Первичная структура аспартат-аминотрансферазы из цитозоля сердйа свиньи

Аспартат-аминотрансфераза является сложным белком. Она состоит из двух субъединиц не связанных внутри- или межцепочечными дисульфидным связями, каждая из которых содержит около 400 аминокислотных остатков и один моль пиридоксальфос-фата, связанный альдиминной связью с £-аминогруппой одного из остатков лизина.

На основании определения зм-концевой аминокислотной последовательности фермента и анализа ее пептидных карт было сделано предложение, что обе субъединицы, по-видимому, сходны. Однако для окончательного суэдения были необходимы более строгие доказательства.

Для реконструкции полипептидной цепи аспартат-аминотрансфе-разы были использованы следующие способы фрагментации: исчерпывающий гидролиз трипсином, гидролиз трипсином по остаткам аргинина, гидролиз химотрипсином, гидролиз термолизином, расщепление бромцианом, частичный кислотный гидролиз. Всего было вццелено и изучено строение около 300 пептидов, которые

в сумме содержат более 2000 аминокислотных остатков. Выход пептидов-колебался от 0,5% до 87% независимо от длины пептида, хотя с наименьшим выходом были получены большие нерастворимые пептиды, выделение которых осуществлялось в концентрированных растворах мочевины.

Из продуктов триптического гидролиза белка были выделены, за исключением одного, все пептиды и изучено их строение. Для расстановки этих пептидов в нужной последовательности белок гидролизовали трипсином по остаткам аргинина с предварительным обратимым блокированием остатков лизина малеиновш ангидридом. В результате было выделено и установлено строение 36 пептидов. Различие числа пептидов от теоретически ожидаемого объясняется рядом причин: наличием химотриптической активности в препаратах трипсина и неполнотой гидролиза пептидных связей трипсином, когда рядом находятся остатки дикарбоновых кислот. При снятии малеильной защиты 1рН 3,40°, 40 ч) было обнаружено специфическое расщепление пептидной связи аспартюг-пролин. Так, наряду с основным пептидом были выделены его четыре фрагмента:

Йи-Аэр-Ето-Азр-Рго-А^ -»■ <->

18% 30% --*

9%

<->

а%

->

9%

В результате выделенные пептиды были расположены з 24 фрагмента.

Для их расстановки в нужной последовательности был предпринят гидролиз белка химотрипсином. Из химотриптического гид-ролизата было выделено и установлено строение 67 пептидов.Однако информативными оказались только И пептидов. Поэтому белок ещё* гидролизовали термолизином. Но и в этом случае информативными оказалось только 5 пептидов, хотя выделено их было в два раза больше, чем химотриптических пептидов. Такая малая информативность химотриптических и термолизиновых пептидов объясняется с одной стороны большим числом повторяющихся последовательностей в полипептидной цепи аспартат-аминотрансфе-разы, а с другой стороны широкой специфичностью обоих фермен-

тов. Поэтому использование химотрипсина и термолизина при реконструкции больших полипептидных цепей не целесообразно. В этом же смысле следует считать и частичный кислотный гидролиз, который был использован в данной работе. Только три пептида оказались полезными.

В полипептидной цепи аспартат-аминотиансферазы содержится 6 остатков метионина. Поэтов большие надежды были связаны с получением крупных фрагментов при расщеплении белка. Но здесь основная трудность заключалась в разделении и очистке образующихся фрагментов. Традиционные методы оказались малоэффективными. Применение ковалентной хроматографии позволило существенно повысить эффективность очистки крупных бромциановых фрагментов (см.'раздел Ш.5).

Таким образом, полученные данные позволили полностью реконструировать полипептидную цепь субъединицы аспартат-амино-трансферазы (рис.10), которая состоит из 412 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу равную 46344 дальтон. 3 Соответственно этому молекулярная масса -холофермента с учетом двух молей пиридоксальфосфата равна 93147 дальтон.

На основании выполненного анализа аминокислотной последовательности можно считать доказанным, что обе субъединицы фермента идентичны. В результате изучения продуктов фрагментации трансаминазы различны:.:» способами ее полипептидная цепь была проанализирована, как минимум, два раза.

Только в результате выполненного анализа первичной структуры аспартат-аминотрансферазы из цитоплазмы сердца свиньи стало возможным локализовать некоторые функционально важные остатки аминокислот фермента, приступить к изучению топографии его активного центра и реакционной способности других аминокислот. Прежде всего выяснилось, что тем остатком лизина, который образует альщшиную связь с пиридоксальфосфатом, является остаток лизина № 258.

1У.2.Полная аминокислотная последовательность авенинаКЭ

По результатам аминокислотного анализа компонент II9 содержит три остатка метионина, шесть остатков аргинина, один остаток лизина и восемь остатков цистеина, которые образуют

10 20- 30 ------1 A P P S VFA3VPQA Q Р V ГУ Í К LXADPREDPD Р

31RKVIÍLGVGAYRTDDCQP.WVLPVVHKVEQRI

SlANDSSLNHEYLPILGLAEFRTCASRLAIiGD

91DSPALQEKRVGGVQSLGGTGALRIGAE?bA

121 RWYNG2NNKDTPVYVSS PTV/ENHDGVFTTA 151 G Р К D I Н S Y Е Y ií D Т Е К Н G I D L Q G Р L 5 D L К I А 181 PEPS IPVIiHACAHKPTGTDPTPEQi/KQ IAS

211V1IKRRPLPPPPD3AYQGPASGNLEKDAWAI

241RYPV3EGPELPCAQSPGKHPGLYNERVGNL

271 Г V V А К E P D S I L R V L S Q I.i E К X V R V Г V,' 5 fí P P A

301 Q G A R I V A R T L S D P E L P H E W T G И V К T Ы A D R I

331 L S К S S U R А П £ А 1 К I Р G I í¡ ÍI Н I Т í Q I G lí Р

361SPTGLIÍPKQVEYLINEKHIYLLPSGRINMC

391 GLIIKHDÍTAIS IHEAVIKIQ

Рис. 1С. Полная аминокислотная последовательность аспартат-аминотрапсферазы из цктозоля скрдда свиньи. Lys-258-остаток лизина, образующий альдишшную связь с гшридоксальфосфатом.

четыре дисульфидных мостика. Поэтому авенин ы9 предварительно восстанавливали, а остатки цистеина модифицировали 4-винил-пиридином. Модифицированный таким образом белок использовали душ определения Ы-концевой аминокислотной последовательности и расщепления бромцианом. Анализ Ы-концевой аминокислотной последовательности позволил идентифицировать 47 аминокислотных остатков. В результате расщепления авенина N9 бромцианом были получены все четыре ожидаемых фрагмента, структура которых была определена частично (СВ1 , 36 остатков, СВ2; 51 остаток) или полностью. Для реконструкции полипептидаой цепи белка использовали триптический гидролиз авенина иммобилизованного на тиопро-пил-Сефарозе 6В. Этот гидрофобный белок плохо гидролизуется трипсином в растворе даже в присутствии 4M мочевины, но легко атакуется ферментом в иммобилизованном виде. В результате трип-тического гидролиза иммобилизованного белка было выделено и секвенировано полностью семь пептидов, включая 52-членный пептид Т7. Не был ввделен пептид ТЗ. Однако этот участок цепи был определен путем секвенирования бромцианового фрагмента СВ2, структура которого была установлена на основании его расщепления трипсином и секвенирования образующихся пептидов.

Таким образом, впервые путем прямого секвенирования белка определена полная аминокислотная последовательность авенина у9 (рис.И) и разработана методология структурного анализа основных запасных белков семян злаков.

На основании выполненной работы можно сделать следующие выводы. Авенин ы9 состоит из 182 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 20990 дальтон, что хорошо согласуется с результатами аминокислотного и электрофоретического анализов этого белка.Он имеет характерные для проламинов состав и аминокислотную последовательность. Он содержит много глута-мина (30,7%), пролина (11,50%) и гидрофобных аминокислот (60%). Авенин К9 имеет уникальную Ы-концевую аминокислотную последовательность (остатки 1-10) и содержит три консервативных участков"А"(остатки 43-67),"В" (остатки 86-121) и "С" (остатки 150-174), которые свойственны всем до сих пор изученным проламинам. В отличие от других проламинов, авенин N9 не имеет больших полиглутаминовых участков и содержит повторяющиеся последовательности типа pfvc^ , где п=3-5.

¿и зо 40

гп' V в V N р з е д у д г ! г в о о е р р у й с (3 р у у с д д о р р у д с д

-ч----— 14 ~--~

50

св1 60

70 80 £ ь'|рьд рььдддьнРскдрьуддсБРУА[у УРРЬЯЗС111,КС}А

св2 ■

Т2

■гз

90

100

110

120

I с д V А|пддссндьАд1Г£д].всРЛНЗУУдА11ьддд(}дд -Т4 ———— Т5 —-тб-■—--Т7 •

св2

130 140 150 160

р (5 р д ь д д д V р д р д ь д д V р и д р д д д а д р|в о м л а р а~1 о а ь

----.Г7-__-т8-

СВ2

СВЗ

170

180

р а М С И У У V р р д о р у|а гарюор

--- та-~

СВ4

Рис.И. Полная аминокислотная последовательность авошша И9.В рамках показаны

консервативные участки "А" (остатки 43-67), "В" (86-121) и "С" (150-174); повторяющиеся последовательности подчеркнуты двойной линией.

I

со

1У.З. Сравнительный анализ проламинов различных глиадинкодирующих локусов пшеницы

На основании разработанного метода из пшеницы сорта "Безостая I" вццелены несколько компонентов и- и ^ -глиадинов, кодируемых одним кластером генов, а также кластерами генов гомео-логических хромосом: "о, м^, и ^.кодируемые кластером генов хромосомы (блок 1Б1 по генетической классификации), "с и тС3, кодируемые кластером генов хромосомы 1В. Впервые выделены ^-глиадин, контролируемый хромосомой 1к и х^-глиадин, контролируемый хромосомой 6В (блок 6В1). Анализ Ы-концевых аминокислотных последовательностей, выделенных глиадинов (рис. 12), позволяет сделать следующие выводы.

1D1 U..U, llElQimSUl QQQPPPaQPYPa

1D1 U, ARE L»PSSKElQSPQaS»SHQQQP7P 1B1 U5 Sit ISIIEIll

4 T D P S G Q T Q *[3 1J Q O[L]T P q

Q»DP50QVQ»iSQQL7PQPQQPLQQgQ «VDPSGQVQKPqQQ P ?jp Q

6bi Y iiviiigitHiistttiaiHiii(t«gii

Рис. 12. Ы-концевые аминокислотные последовательности u-и V-глиадинов пшеницы "Безостая 1". Слева показана принадлежность каждого компонента к определенному блоку.

Все изученные u-глиаданы имеют три типа JS-концевых аминокислотных последовательностей ( kel, ahs и srl ) и имеют одан участок гомологии. N-концевые участки ы -глиадинов, кодируемые геномом d, заметно дивергировали от таковых генома В. Показано, что среди множества глиадинов ¿о -глиадины представляют собой особую группу, которые не содержат в своем составе остатков ци-стеина или цистина. Среда X-глиадинов наблюдается больший кон-

QQaPPQQQ?P5QQPPXSP*Xwi>

Н Т

Р Q

101 Хг в i 1В1 su

U4 Г, Я I

серватизм. Однако яг-глиадин, кодируемый хромосомой 6В, сущест-______

венно отличается от ^-глиаддаов, кодируемых хромосомами пер----вой гомеологической группы.

На основании полученных результатов можно заключить, что белки, контролируемые одним кластером генов, являются химически различными.

ВЫВОДЫ

1. Разработана методология разделения ряда многокомпонентных смесей гомологичных растительных белков (леггемоглобин, гли-адины, азенины) путем использования ионообменной, обращенно-фа-зовой и ковалентной хроматографии в результате чего выделены основные компоненты леггемоглобина из клубеньков желтого люпина, авенина из овса-и ряд проламинов пшеницы (кодируемых различными глиадинкодирующими локусами).

2. Разработаны и внедрены в практику исследований методические приемы ускоренного аминокислотного анализа и разделения пептидов на синтетических ионообменных смолах. Изучены оптимальные условия и внедрен в практику исследований флуоресцентный метод аминокислотного анализа с использованием о-фталевого диальдегида.

3. Предложен метод селективного выделения цистеинсодержащих пептидов, з основе которого лежит иммобилизация цистеин- и ци-стинсодержапжх белков на нерастворимых активированных носителях путем реакции тиол-дисульфидного обмена с последующим расщеплением образовавшегося кснъюгата ферментами или химическими агентам. Там самым разработана принципиально новая стратегия структурно-функционального анализа тиоловых белков, которая была апробирована и использована при изучении ряда цистеин- и цистин-содержащих белков, включая ферменты, мембранные белки, запасные белки (проламины), металлопротеины.

а) Показано, что белки, в том числе мембранные, могут быть успешно иммобилизованы в присутствии денатурирующих и солюбилизи-рующих агентов с последующим удалением всех не козалектно связанны;': соединений (липиды, кофакторы, ионы металлов и т.п.) путем промывания конъюгзта соответствующими растворителями (без использования дорогостояаей техники).

б) Показано, что фрагментация иммобилизованных белков,включая гидрзфос.ч!:-:-, . ли "-"'¿гческими агентами в широком

интервале рН среды происходит эффективно и с такой же специфичностью, что и в растворе. При этом происходит также расщепление пептидных связей типа х-Суз-х , где х и у - аминокислоты, по которым происходит гидролиз, а Суа -остаток цистеина, связанный с ножкой носителя дасульфидной связью.

в) Разработаны условия алкилирования цистеинсодержащих пептидов 4-винилдиридином после "снятия" последних с носителя,которые заключаются в удалении избытков восстанавливающего агента и побочных продуктов реакции обратно-фазовой хроматографией.

г) Продемонстрировано, что с помощью метода селективного выделения цистеинсодержащих пептидов существенно упрощается задача разделения сложных пептидных смесей, благодаря чему заметно повышается эффективность структурно-функционального анализа тио-ловых белков.

д) На примере ряда белков (ИАО-зависимой формиатдегидроге-назы, аслартат-аминотрансферазы, лейцин-изолейцин-валин-специфи-чных и изолейцил-специфичных белков) показана высокая эффективность предложенного подхода для локализации существенных остатков цистеина в ферментах и сравнительного анализа цистеин- и ци-стинсодержащих белков.

е) Показано, что белки иммобилизованные на пористом стекле могут быть подвергнуты химической модификации (например, ацили-рованию для последующего гидролиза трипсином) и определения Ы-концевых аминокислот в образовавшихся фрагментах непосредственно на носителе, а также прямому секвенированию на твердофазном сек-венаторе.

4. На основе разработанных подходов и методов повышения эффективности исследований структуры белков впервые выделены и определены полные первичные структуры следующих белков: аспартат-аминотрансферазы из цитозоля сердца свиньи, состоящей из 412 аминокислотных остатков; леггемоглобина I и леггемоглобина П из клубеньков желтого люпина, каждый из которых состоит из 153 аминокислотных остатков; компонента н9 авенина - запасного белка овса, состоящего из 182 аминокислотных остатков и изучены особенности их строения. Выделены и охарактеризованы проламины различных глиаддакодирующих локусов пшеницы. Показано, что белки, входящие в один кластер, различаются по структуре, а -глиадины не содержат в своем составе остатков цистеина и цистина.

Основные результаты диссертации .изложены в следующих работах:

~1гПолнаяпервичная^ структура аспартат-аминотрансферазы / Ю.А. Овчинников, А.Е.Браунштейн, Ц.А.Егоров и др. - Докл.АН СССР

1972, т.207, Ю, с.728-731.

2. Полная первичная структура цитоплазматической аспартат-ами-нотрансферазы из сердечной мышцы свиньи / Ю.А.Овчинников, Ц.А.Егоров, Н.А.Алданова и др. - Изв.АН СССР, сер.хим.,1974, .455, с.1189-1196.

3. Первичная структура цитоплазматической аспартат-аминотранс-фераэы из сердечной мышцы свиньи. Выделение и характеристика пептидов триптического гидролиза / Ю.А.Овчинников, А.А.Киргап-кин, Ц.А.Егоров и др. - Биохимия 1972, т.37, в.З, с.452-460.

4. Первичная структура цитоплазматической аспартат-аминотранс-феразы из сердечной мышцы свиньи. Выделение, очистка и характеристика растворимых триптических пептидов ограниченного гидролиза / Ю.А.Овчинников, А.А.Киршкин, Ц.А.Егоров

и др. - Биохимия 1972, т.37, с.461-468.'

5. Первичная структура цитоплазматической аспартат-аминотранс-феразы из сердечной мышцы свиньи. Аминокислотная последовательность растворимых пептидов триптического гидролиза / Е.И.Виноградова, М.Ю.Шейгина, Н.А.Алданова и др. - Биохимия

1973, т.38, б.1, с.3-21.

5. Первичная структура цитоплазматической аспартат-шяшотранс-феразы из сердечной мышцы свиньи. Аминокислотная последовательность пептидов ограниченного триптического гидролиза / Е.И.Виноградова, Н.А.Алданова, М.Ю.Фейгина и др. - Биохимия 1973, т.38, в.2, с.263-269.

7. Первичная структура цитоплазматической аспартат-аминотранс-феразы из сердечной мышцы свиньи. Выделение, очистка и аминокислотный состав пептидов химотриптического гидролиза / Ю.А. Овчинников, Ц.А.Егоров, Е.В.Гришин и др. - Биохимия 1973, т.38, в.5, с.1020-1027.

3. Первичная структура цитоплазматической аспартат-аминотранс-феразы из сердечной мышцы свиньи. Аминокислотная последовательность пептидов химотриптического гидролиза / Н.А.Алданова, М.й.аейгина, В.М.Липкин и др. - Биохимия 1973, т.38, в.5, с.1028-1037.

9. Первичная структура цитоплазматической аспартат-аминотранс-феразы из сердечной мышцы свиньи. Выделение, очистка и характеристика нерастворимых пептидов трипсинового гидролизата/ Ю.А.Овчинников, Д.А.Егоров, Н.Г.Абдулаев и др. - Биохимия 1974, т.39, в.5, с.1075-1080.

10.Первичная структура цитоплазматической аспартат-аминотранс-феразы из сердечной мышцы свиньи. Аминокислотная последовательность нерастворимых пептидов трипсинового гидролизата / Ц.А.Егоров, Н.А.Алданова, В.М.Липкин и др. - Биохимия 1974, т.39, в.6, с.1203-1211.

IX.Первичная структура цитоплазматической аспартат-аминотранс-феразы из сердечной мышцы свиньи. Аминокислотная последовательность пептидов бромцианового расщепления / Н.А.Алданова, М.Ю.Фейгина, В.М.Липкин и др. - Биохимия 1975, т.40, в.2, с.235-240.

12.Первичная структура цитоплазматической аспартат-аминотранс-феразы из сердечной мышцы свиньи. Выделение, очистка и характеристика пептидов термолизинового гидролиза / Ю.А.Овчинников, Ц.А.Егоров, Н.Г.Абдулаев и др. - Биохимия 1975, т.40, в.З, с.634-644.

13.Первичная структура цитоплазматической аспартат-аминотранс-феразы из сердечной мышцы свиньи. Аминокислотная последовательность пептидов термолизинового гидролиза / М.Ю.Рейгана, Н.А.Алданова, В.М.Липкин и др. - Биохимия 1975, т.40, в.4, с.802-806.

14.Тиоловые пептиды из цитоплазматической аспартат-аыинотранс-феразы сердца кур / Ц.А.Егоров, М.И.Шахпаронов, Т.В.Демидкина и др. - Биохимия 1977, т.42, в.12, с.2253-2256.

15.Получение нерастворимого носителя с активированной £Н-груп-пой и его использование в химии белка / Ц.А.Егоров, М.И.Шахпаронов, Ю.А.Давидович и др. - Биоорган.хим. 1977, т.З, №8, с.1111-1115.

16.Освобождение белков от поверхностноактивных веществ методом обратимой иммобилизации на нерастворимом носителе / В.И.Лозинский, Ю.А.Давидович, Б.Ю.Заславский и др. - Биохимия 1978, т.43, в.2, с.257-259.

17.Выделение леггемоглобинов I и Я из клубеньков желтого люпина. Их характеристика / Ц.А.Егоров, В.К.Казаков, М.И.Шахпаронов и др. - Биоорган.хим. 1980, т.6, №3, с.366-371.

18. Полная аминокислотная последовательность леггемоглобина I

из клубеньков желтого люпина / Ц,А.Егоров., М.Ю.Фейгина, 'В.К.Казаков и др. - Биоорган.хим. 1976, т.2,№1, с.125-128.----------------------

^¿-Первивдая""структу^~лёггёмогяобина П из клубеньков желтого люпина ( Lupinua luteus L. ) / Ц.А.Егоров, В.К.Казанов, M.M.iiiaxnapoHOB и др. - Биоорган, хим. 1978, т.4, №4,с.476-480.

20. Аминокислотная последовательность леггемоглобинов I и П из клубеньков желтого люпина / Ц.А.Егоров, В.К.Казаков, М.И. Шахпаронов и др. - Биоорган.хим. 1980, т.6, № 5, с.666-683.

21. Леггемоглобин П желтого люпина. Особенности его структуры в сравнении с миоглобином нашалота / Б.К.Вайнштейн, ИЛ. Куранова, Э.Г.Аргутшян и др. - Биоорган.хим. 1980, т.6, №5, с.684-699.

22. Изучение первичной структуры бактериальной формиатдегидро-геназы. Определение Ы-концевой аминокислотной последовательности и выделение' цистеинсодержащих пептидов / Т.Б.Устинни-кова, В.О.Попов, A.M.Его ров и др. - Биополимеры и.клетки 1986, т.2, Ш, с.129-135.

23. Селективное выделение ы-глиадинов / Ц.А.Егоров, Т.И.Одинцова, А.А.Созинов - Биоорган.хим. 1986, т.12, ЖЗ, с.599-605.

24. Ы-концевые последовательности проламинов различных глиадин-кодирующих локусов пшеницы / Т.И.Одинцова, А.Н.Овчинников, Ц.А.Егоров и др. - Докл. АН СССР 1987, т.296, Ji6,c.I262-I265.

15. Структурные исследования ЫАЬ-зависимой формиатдегидрогеназы метилотрофных бактерий. Локализация существенного остатка цистеина / Т.Б.Устинникова, В.О.Попов, Ц.А.Егоров - Биоорг. хим. 1988, т.14, №7, с.905-909.

й. Первичная структура "быстроподвяжного" компонента авенина. ( Arena sativa L. ) / Ц.А.Егоров - Биоорган.хим. 1988, т.14, №7, с.959-962.

7. A rapid and specific method for isolation of thiol-contai-

«

ning peptides by thiol-disulfide exchange on a solid support/ Ts.A.Egorov, A.Svenson, L.iiyden, J.Karlsson - Proc.Hat.Acad. Sci.USA 1975, v.72, Wo.8, p.3Q29-3033.

8. Strategy of thiol protein sequence analysis / Is.A.jEgorov, M.I.Schakhparonov - in Methods in peptide and protein sequence analysis 1920J, p. 395-405 (Cbr.3irr ad., Elsevier/ Worth-Holland Biomedical Press).

Материалы диссертации были доложены на:

УП-ой конференции ФЕБО (Варна, 1971), УП-ом международном симпозиуме по химии природных соединений (Рига, 1970), советско-американском симпозиуме по пиридоксалевому катализу (Ленинград, 1974), 1-ом советско-западаогерманском симпозиуме по химии пептидов и белков (Душанбе, 1976), 1У-ом всесоюзном симпозиуме по химии пептидов и белков (Минск, 1977), П-ом западногермано-со-ветском симпозиуме по химии пептидов и белков (Мюнхен, 1978), У-ом советско-индийском симпозиуме (Ереван, 1978), на 16-ой конференции ФЕБО (Москва, 1984), У1-ом всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1987), на Ш-ей международной школе по белкам клейковины (Будапешт, 1987), УП-ом всесоюзном симпозиуме по химии.пептидов и белков (Таллин, 1987).

/

1-74296,подп.к печ.11/Х-58; Зак.!;> 977, г к р. IО С. ОРТП ОТ

'Х~58г,