Выделение и характеризация цитотоксических белков лимфокин-активированных киллеров тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Российская академия наук Институт биоорганической химии ем. М.М. Вгмякина

На правах рукописи

БЛИЩЕНКО ЕЛЕН4 ШРБЕВН4

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ ЦИТОТОКСШЕСМЕ БЕЛКОВ ЛИШЖШ-МТИВИРОВАННЫХ ЮЕШРОВ

Специальность 02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Мбсква-1992

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина Р1Н

Научный руководитель - кандидат химических наук Чертов О.Ю.

Официальные оппоненты : доктор медицинских наук Быковская С.Н., доктор бкагогических наук Василов Р.Г. Ведущая организация - Институт биологии гена РАН

Защита состоится (7.06 1992 г.

в Ю часов на заседании специализированного совета Д 002.35.01 при Институте Сиоорганической химии им. М.М. Шемякина РАН, го адресу : 117871, ГСП-7, Москва, В-437; ул. Ыиклухо-Ыаыая, 16/10.

С диссертацией вшо ознакомиться в библиотеке института биоорганической химии им. М.М. Шемякина РАН.

Автореферат разослан /З-^У 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

В.А. НЕСМЕЯНОВ

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Сообщение ó положительном результате лечения злокачественных новобразований методом адоптивной иммунотерапии впервые появилось в 1982 году и с тех пор привлекает пристальное внимание ученых. Стимуляция лимфоцитов периферической крови интерлейкином-2 (1Ъ-2) приводит к образовании так называемых лим&жин-активированных киллеров (LAK-клеток), обладающих высокой противоопухолевой активностью как in vitro, так и in vivo. Клинические испытания этого метода проходили в Национальном Институте рака (США) под руководством д-ра С.А.Розен-берга. Было показано, что сам по себе JL- 2 цитотоксической активностью не обладает и очень быстро разрушается в организме. Поэтому лимфоциты стимулировали In vitro, а затем вводи- . ли в организм больного. Однако, и таким образом нэ удалось получить существенного результата. Только совместное введение LAK-клеток и Пг-2 (последний - 2-3 раза в день в течение нескольких суток) позволило добиться заметного терапевтического эффекта. В клинике д-ра Розенберга получены убедительные результаты по лечению опухолевых заболеваний различных органов, однако наиболее успешно иммунотерапия применяется в отношении ограниченного числа раковых заболеваний (меланома, рак почек, рак легкого). '

Существует ряд серьезных проблем в исследовании и в клиническом применении иммунотерапии рака. Тот факт, что некоторые пациенты фактически нечувствительны к иммунотерапии, подчеркивает, что в реакцию иммунной системы организма на злокачественное новообразование могут быть вовлечены различные механизмы.

В этой связи особое значение приобретает выделение и определение структуры цитотоксических белков с целы) установления механизма противоопухолевого действия цитотоксиче ских лимфоцитов с последующим применением рекомбинантннх белков в терапии злокачественных заболеваний.

Цель работы. Целью работы было изучение механизма противоопухолевой активности лимфокин-активированных киллеров (LAK)

путем выявления и характеризации белков, определяющих цито-токсическую активность Ь&К-клеток и установления зависимости между характеристиками ЬДК-клеток и присутствием различных цитотоксических белков. В связи с этим, была проведена харак-теризация измешвий популяции Т.АК-клеток (фенотип, специфяч-ность по отношению к различным трансформированным линиям клеток, содержание различных цитотоксических белков) в зависимости от продолжительности стимуляции интерлейкином-2, а также внделеление, установление структуры и изучение биологических свойств цитотоксических Оелков.

Научная новизна н практическая ценность работы. Проведена ха-рактеризация цитотоксических белков лимфокин-акчивированных киллеров с различным фенотипом. Разработана методика выделения этих белков, включащая ионнообменную хроматографию, хроматографию на обращенной фазе и электрофорез в полиакрила-мидном геле. Из 1АК-кдг>так с фенотипом, подобным цитотокси-ческим Т-лимфоцдгаи, якгулзн белок с молекулярной массой 30 кДа. Установлена И-концелая аминокислотная последовательность данного цнтотоксического бежа (рЗО). Объем работы. Диссертационная работа изложена на 92 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части и списка цитируемой литературе.

СОДЕРХАНИЕ РАБОТЫ

1. Изменение содержания секретируеыых и ненбрано-ассоциирован-ных цитотоксических белков Т.АК- клеток в зависимости от продолжительности .стимуляции ЗХ-2.

Для изучения изменения цитотоксической активности лимфо-кин активированных киллеров в процессе их стимуляции IL-2, фракция мононукле арных клеток •периферической крови человека инкубировалась в присутствии IL-2 в течение 8 суток. Активность LAK-клеток изменялась в процессе стимуляции IL-2, образуя два максимума: на 3-4 и 6-7 сутки, с падением цитото-ксичности на 5 сутки (Рис.1). Изменение цитотоксической активности супернатанта, а так же фракции мембран LAK-клеток, имело характер, аналогичный активности самих LAK-клеток: наличие двух максимумов цитотоксичности на 3-4 и 6-7 сутки с падением активности на 5 сутки. Следовательно, активность цитотоксических лимфоцитов была обусловлена как секретируемы-ми растворимыми белками, так и белками, ассоциированными с клеточной поверхностью.

CDT6+ CD8* CD3-

Цгтотокстчность (i) : 100

75

50

25

CD3* CD8+ CD16-

Т"

"Г

-г

т

и 1 2 3 4 5 6 7 8 слзш

Рисунок I. Цитотоксическая активность ЬАК-клеток, стимулированных в присутствии Иг-2 в течение 8 суток по отношению к клеткам линии L929.

ХЖ-клетки (-), Фракция Ф1(.......),

Ф2 (-----).

ЬАК-клетки представляют собой популяцию цитотоксических лимфоцитов, Нбсдах на клеточной поверхности антигены, характерные как для естественных киллеров (Ж), так и для цито токсических Т-лимфоциов (CIL). Методом проточной цитофлуоримет-рии было проведаю определение уровня экспрессии маркеров CD3, CD8 и CD16 в зависимости от времени стимуляции ЬАК-кле-ток И-«'. Было швазано, что на 3-4 день культивирования клэ- -ток с II-2, популяция, в основном, представлена клетками с фенотипом CD16+, CD8+, СВЗ-, что характерно для естественных киллеров, а на 6-7 день - клетками с фенотипом CD3+, СЮ8+, GD16-, что характерно для цитотоксических Т-лимфоцитов (Рис. I).' На S день инзубацзи отмечено уменьшение количества клеток, несущих эти ааркеры. Таким образом, было показано, что в процессе стимуляции лейкоцитов периферической 1фОви И-2 происходит изменеааа состава популяции LAK-клеток.

Получение LAK-kestok и определение цитотоксической активности проводилось в лаборатории молекулярной биологии рака (ИБГ РАН) и грунт общих методов анализа первичной структуры белков Ермолаевой М.В. (ИВХ РАН), флуориметрический анализ фенотипа LAK-ааеток- Хайдуковым С.В.в группе иммунохимии (ИБХ РАН).

Для разделен» цитотоксических белков супернатанта LAK-клеток, получанного на 5 сутки стимуляции Пг-2, была использована ионообменная хроматография на ВЕА£-Тоуореаг1(Рис. 2). Были идентифицированы две Зракции, проявляющие активность в отношениии клеток линии 1929: Ф1 и Ф2. Для того, чтобы установить вклад в суммарную цитотоксичность LAK-клеток фракций Ф1 и Ф2 на каждые сутки стимуляции iL-г, было проведено разделение соответствующих супарнатантов в вдентичных условиях. Цитотоксичность 52 достигает максимума на 3-4 сутки, а Ф1 -на 6-7 сутки (Рис. I), что коррелирует с максимумами суммарной цитотоксической активности супернатанта. Данный эксперимент позволил также подобрать оптимальные условия для получения супернатанта, обогащенного цитотоксическими белками с целью их препаративного выделения. В присутствии EGTA (зти-ленгликоль бис (2-аминоэталовый эфир) N.N.N'.N'- тетрауксус-ной кислоты - реагент, ингибируищий экзоцитоз) блокировалось высвовобовдение цнтотохсичэских белков Ф1, но не Ф2, что

А(280) NaCI (М)

Цатотоксичность (S) 100

в отсутствии EGTA в присутствии EGTA

90 ил.

Рисунок 2. Хроматографяческов разделение супернатанта LAK-клеток, полученного после 5 суток стимуляции IL-2 на колонке DEAE-Toyopearl 650 S (1x4 см), уравновешенной О.01 М Трис-HCI, рН 8.0 в градиенте

l. 1 (280 нм) ' ' ---------

feci (----) (А).

концентрации Nací, рация КаС

(-

-), концент-

атотоксическая активность (% мертвых клеток) полученных фр-тций (В).

говорит о Ca -независимом механизме секреции белков этой фракции.

Для идентификации цитототоксических белков Ф1 и Ф2, использовали электрофорез в 12 % шли акрил амидном геле в присутствии додецилсульфата натрия с последующим электропереносом на мембрану из шливинилидендифторида (Immobilon). Элю-цию белков с мембраны проводили раствором, содержащим 0.05 М ННдНСОд, 0.5 мг/мл бычьего сывороточного альбу(Лша и 50 % (V/V) ацетонитрила в течении 3 часов при интенсивном перемешивании. Предложенные ранее растворы для элшрования с мембраны 1шоЪ11оп содержат трифторуксусную кислоту или детергенты. Трифторуксусная кислота в высокой концентрации зачастую вызывает инактивацию белков, а присутствие детергентов требует дополнительней обработки образцов перед тестированием. Сочетание элюирулцего раствора, содержащего органический растворитель (ацетонитрш;) к бычьего сывороточного альбумина в качестве слабого детергента позволяло добиться сравнительно высокого выхода элшруемого белка (до 90") с сохранением 30-40% биологической активности. Полоски мембраны были разрезаны на участки по 5 мм, с которых элшровали белки для тестирования цитотокгагаеской активности. Максимальный вклад в активность фракции Ф1 вносят два белка с молекулярной массой 40 (р40) и 30 (рЗО) кДа (Рис. ЗА). Цитотоксическая активность Ф2 (Рис. ЗВ) обусловлена присутствием белков с молекулярной массой 75 (р75), 38 (р38) и 22 (р22) кДа. Обработка -цитотоксических белков 5 % ß-меркаптоэтанолом не влияла на их биологическую активность. Математическая обработка результатов тестирования (критерий Стыодента: Р<=0.01) позволяет с достоверностью говорить о присутствии идентифицированию: сек-ретируемых и ассоциированных с мембраной цитотоксических белков, однако, не исключает наличия других белков, обладающих менее выраженной цитоксической активностью в используемой системе тестирования. Активность супернатанта LAK-клеток до 5-ых суток стимуляции IL-2 коррелирует с присутствием белков фракции Ф2; после 5 суток- белков фракции Ф1 (Табл. I).

По литературным данным, активность LAK-клеток обусловлена, в значительной степени, присутствием фактора некроза опухо-

Цитотоксичность (%)

30

ГО

20

10

И

I

о 5 10 15 20 N

94К-57К ■

ак-

30К-"

гож-«

о о ч

10 о

а,

ш О

а

15

20

Цитотоксичность {%)

30

20

10

I

67К—

¡.ж-Шь

2ШК--ИЛК^

гО

10

и о ч о с

о,

а> §

15 И

20

10 15 20 N

Рисунок 3. Анализ цитотоксической активности белков фракций Ф1(А) и Ф2(В) по результатам электрофореза в поли-акриламидном геле с последупцим переносом на мембрану 1гатоЫ1оп и олюцией.

лей (THF) и 7-штерферона. Мы исследовали действие этих белков на клетки линии L929 и показали, что эти клетки резистентны к действию 1000 Ед- активности 7-интерферона. Следова-ельно, цитотоксичность, проявляемая 1АК-клетками в данном тесте не опосредуется этим белком.

Таблица I. Изменение состава цитотоксических белков ЬАК-кле-ток в зависимости от времени стимуляции IL-2 .

Сроки инкубации фракция Ф1 Ф2

с IL-2 (сутки) и «ЭЛ. масса цитоток- мол. масса цитоток-

сичность (%) сичность(%

- 75 25

4 - 38 45

- 22" 20

40 16 75 14

5 30 28 38 30

22 15-

6 40 22 -

30 38 —

Для определения присутствия THF в супернатанте LAK-клеток с 3 по 6 сутки стимуляции, балки всех фракций, полученных после хроматографии на DEAE-Toyopearl, были разделены электрофорезом в полиакриламидном геле с последующим электроблот-тингом и иммуноферментным анализом иммобилизованных на мембране белков с использованием поликлональных антител к TNF. Зона иммунореактивного материала с молекулярной массой 17 кДа, соответствующая TNF отсутствовала в данных экспериментах. Следовательно, цитотоксическая активность супернатанта LAK-клеток опосредована не TNF, а другими, неизвестными ранее белками.

Анализ цитотоксической активности мембран LAK-клеток позволил предположить, что цитотоксическая активность LAK-клэток

связана не только с секретируемыми, но и с кембрано-ассоции-рованными белками. Препараты мембран ЬАК-клеток, полученные . на 3 и 6 сутки инкубации были последовательно обобработаны I М Ыа-фосфатным буфером (рН 7.4) и 0.1 М НаШ, для удаления периферических мембранных белков по методике, описанной Дж. Д. Яягом. Мембранные препараты, полученные как на 3, так и на 6 сутки стимуляции 1Ь-2 проявляли цитотоксическув активность в отношении линии 1929. Активность препаратов нембран, полученных на 3 сутки стимуляции была выше, чем на в сутки.

Таблица 2 Цитотоксическая активность фракции мембран 1АК-клеток.

Сроки стимуляции Цитотоксическая Количество Удельная 1Ь-2 (сутки) активность (ЕД.) белка (мкг) активность

(Ед/мг)

3 0-5 32 15

б 0.4 64 4.4

За I Ед- цитотоксической активности принималось количество активного материала, вызывающее 50 % лизис 2-3 X 10 клеток 1929 в 200 мкл культуральной среда за 48 ч.

Эти результаты коррелируют с результатами электрофо-форетического анализа мембранных белков (Рис. 4). Мембранные белки были солюбилизированы в буферном растворе, содержащем 2% БЕЙ. После электрофореза, блоттинга и элщии, проведенных в описанных выше условиях,, определяли цитотоксичвость полученных фракций. Активность мембранной фракции, полученной из ьдк-клаток, стимулированных Нг-2 в течение 4 суток обусловлена присутствием белков с молекулярной массой 70-90 , 38-42, 30-32 и 20-22 кДа (Рис. 4А), а на 6 сутки - белков с молекулярной массой 32-35 и 20-22 кДа (Рис. 4Б). Эти белки не удавалось десорбировать с мембран буфером с высокими значениями

Рисунок 4. Анализ цитотоксической активности ассоциированных с мембраной белков ЬАК-клеток с помощью электрофореза с последующим блоттингом и элюцией. Анали-. зироваяисъ белки фракции мембран, полученные на 4 на 4 (А) и 6 (В) сутки стимуляции 11.-2. Указаны положения белков-матзкероз молекулярной массы.

ионной силы и .рН, из чего можно предположить, что это интегральнее мембранные белки. _

Описанные в литературе мембраносвязанные цитотоксические белки - это предшественники 1Ь-1 с молекулярной массой 30-33 кДа и ТЫР (26 кДа), цитотоксический белок с молекулярной массой 50 кДа, детектируемый антителами к ЮТ и белки 31 и 62 кДа, реагирующие с антителами к лимфотоксину. Иммунофермент-ный анализ мембранных белков с поликлональной сывороткой к ТЮ" показал отсутствие иммунореактивного материала. Следовательно, среди идентифицированных цитотоксических мембранных белков ЬАК-клеток, отсутствуют ТНР-подоОные иммунореактивные белки.

Определение цитотоксической активности супернатанта ЬАК-клеток на 5 сутки стимуляции Н<-2 показало, что она изменяется в широких пределах в зависимости от исходного препарата (Табл. 3). Активность фракций была рассчитана на 300 мл

Таблица 3. Цитотоксичность белков фракций Ф1 и Ф2 в суперно-танте ЬАК-клеток на 5 сутки стимуляции 1Ь-2.

N эксперимента Цитотоксическая активность (Ед.)

Супернатант Ф1 Ф2

I 0 1.8 0.66

2 62.5 7.2 0.54

3 137.5 2.0 0.66

4 50.0 2-2 0.96

5 0 2.2 1.8

6 135.0 . 10.0 5.4

7 180.0 10.0 13.0

супернатанта ЬАК-клеток, полученных из 3 XIО® мононуклеарных клеток периферической крови человека. Хроматографическое раз-

деление супернатанта ЬАК-клеток на колонке с БЕАЕ-Тоуореаг1 (Рис.2).позволило определить, что при значительном различии исходной активности супернатанта ЬАК-клеток, цитотоксические активности фракций Ф1 и Ф2 имеют сравнимые значения (Табл. 3). Различия в исходной активности супёрнатантов могут быть связаны с различиями в количествах секретируемых цитотоксичес-ких белков в препаратах лимфоцитов у различных доноров и с присутствием веществ, ингибирующих цитолиз и отделяющихся при хроматографии.

Из супернатанта ЬАК-клеток нами был выделен белок, инги-бирухщий цитотоксичность и определена его К-концевая аминокислотная последовательность:

1 10 Ие-Рго-Ъеи-АБр-Рго-'УаХ-Иу-Туг-ЬуБ-Еег-

Н-концевая аминокислотная последовательность фетуина из сыворотки крови крупного рогатого скота

Сравнение с банком первичных структур показало его идентичность с фетуином. Коммерческий препарат фетуина фетальной сыворотки телят также обладал способностью ингибировать цитото-ксическую активность супёрнатантов ЬАК-клеток вне зависимости от продолжительности стимуляции этих ¿слеток 1Ь-2.

-- Ингибирование (X) 70_

60"

50" 40_

30_ 20ч

О 25 50 75 ^о'нанограш

Рисунок 5. Ингибирозание цитотоксической активности ЬАК-клеток коммерческим препаратом фетуина.

Таким образом, различным уровнем содержания фетуина в супернатантах можно объяснить расхождения-исходной цитотокси-ческой активности в экспериментах.

Фетуин, один из основных белков фетальной сыворотки крупного рогатого скота, используемой при культивировании ЬАК-клеток, обладает высоким сродством к поверхностным мембранам лимфоцитов и сорбируется на них в процессе культивирования. Отмывка лимфоцитов бессывороточной средой не позволяет провести полную очистку от этого белка, прочно ассоциированного с клетками. В процессе стимуляции фетуин продолжает десорбиро-ваться с мембран лимфоцитов, что обуславливает его присутствие в составе суперяатанта ЬАК-клеток в значительных, по сра-сравйеншо с другими белками, количествах.

Из таблицы 3 также видно, что цитотоксические белки фракций ФГи Ф2 дают сравнительно низкий вклад в суммарную активность супернатанта. Эти результаты можно, в первую очередь, объяснить присутствием модуляторов цитотоксической активности, т.е. белкоЕ, не обладающих собственной цитотоксич-ностью, но способных усиливать действие эффэкторных белков. Способность активировать цитолиз описана в литературе для целого ряда секретирумых белков лимфоцитов - лейкорегулина, перфорина, 7-интерферона, протеиназ серинового типа. В лаборатории молекулярной биологии рака ИБГ РАН показано наличие в супернатанте активности протеиназ серинового типа (по гидролизу И,а-бензилокарбонил-Ъ-лизин-тиобензилового эфира), характерных для секреторных гранул цитотоксических лимфоцитов. Показано также присутствие белков, способных вызывать обратимое повышение проницаемости мембраны клеток-мишеней (К562) для трипанового синего, что характерно для белков, осуществ-лявдих положительную модуляцию цитолиза- перфорина и лейкорегулина. Не исключена также возможность кооперативного действия различных цитотоксических белков.

2. Анализ секретафуеыых цитотоксических белков.

Секретируемые белки, вероятно, играют ключевую роль в процессе цитолиза. Для характеризацш секретируешх цятото-

в

6

20.1 К

4

1

рЗО (30-32 К)

3

0 0.1 ОЛ 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 ОЛ 0.9 1

Электрофореткческая иоднихносгь

Рисунок 6. Определение молекулярной массы цитотоксических белков (рЗО).

2.1 Анализ цитотоксических белков СП.

Фракцию Ф1, полученную после разделения на БКАУ-Тоуореаг! доводили уксусной кислотой до рН 6.5, наносили на колонку СМ-Тоуореаг1 и элюцировали градиентом концентрации • ацетата аммония от 0.05 М (рН 6.5 ) до III (рН 7.5). Цитотоксичес-кой активностью обладали две фракции ФА и ФВ (Рис. 7). На этой стадии разделения удалось добиться значительной степени очистки и повышения удельной активности (Табл. 4).

Фракции ФА и ФВ были подвергнуты обращеннофазной хромато- ■ графии на колонке \Jltrapore НРВС. Разделение ФА позволило подучить две фракции, обладающие цитотоксической активностью: ФА1 и ФАН (Рис. 8А). При разделении в аналогичных условиях ФВ был получен максимум цитотоксической активности, соответствующий ФВ1 (Рис. 8В). Анализ обеих'фракций с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующим электроблот-тингом и элюцией белков показал, что цитотоксическая активность ФА1 связана с белком 30 кДа (рЗО), а ФАII и ФВ1 - с белком с молекулярной массой 40 кДа (р40). Этот белок не

АЦЕТАТ

О 50® 100 мл.

Рисунок 7.Хроматография на СМ-Тоуореаг1. Супернатант дня выделения щтотоксического материала получали на 6 сутки стимуляции ЬАК-клеток 1Ъ-2. А280(-),

цитотоксическая активность (.........). Отмечены

активные фракции.

удалость получить в гомогенном состоянии при электрофорети-ческом разделении.

В таблице 4 предстазлены усредненные значения цитоток-сической активности белков рЗО и р40 на различных стадиях выделения. В каздом из экспериментов для выделения использовалось 300 мл супернатанта ЬАК-клеток. Определение удельных ак-' тивностей фракций затруднено возможным присутствием модуляторов цитотоксичности в супернатанте, поэтому на каждой стадии разделения проводили определение активности белков рЗО и р40 после электрофоретического разделения.

Для белка рЗО была рассчитана удельная цитотоксическая активность по отношению к клеткам линии 1929. Удельная активность гомогенного белка рЗО, после проведения всех стадий очистки, включая хроматографию на обращенной фазе и электрофорез в денатурирующих условиях на линии Ь929 составляла 3.6

В(%)

- цктоток— сичность,%

50

25

60 ыин.

А(223) В 0.02

В (%)

0.01

цитоток— сичность,%

Рисунок 8. ВЭЗКХ на колонке Ш-йгароге ЕРБС, фракции А (А) и В (В), полученных после хроматографии на СМ-Тоуореаг1. ¿223 (-), цитотоксическая активность (......),

градиент буфера В (80% ацетонитрила,20% воды)(—).

Таблица 4. Анализ активности белков фракции Ф1.

Стадии Анализи- Активность Удельная активность (Ед/мг) очистки руемые фракций фракции рЗО' р40

фракции (Ед.) (после электрофореза)

Исходный суперна-тант 80 66 - -

DEAE-Toyopearl Ф1 5 150 шо4 \ 600

СМ-' Toyopearl ФА ФВ 30 10 1500 1250 шо4

Ultrapore ФА1 RPSC ФА11+ФВ1 3.3 5 8Б0 1200 3.SXI03 2500

Г)

X 10 Ед./гс. Количество бежа определялось по интенсивости окраски Coomassie R250 при денситометрическом анализе мембраны Icinobilon, а так же по результатам аминокислотного анализа иммобилизованных на мембране белков и по количеству ФТГ-производннх аминокислот при секвенировании. Так как после проведения обращеннофазовой хроматографии и электрофореза происходит частичная инактивация белка, зависимость активности рЗО от его концентрации определяли с использованием фракции ФА, полученной после хроматографии на СМ-Toyopearl. Учитывая, что из 100 мл супернатанта в среднем удается получить 2 пмоль белка рЗО, было определено, что 502 лизис клеток вы-вызывает 0.3 пмоль белка. Удельная активность белка рЗО в

с

таком случае составляет I.I X 10 Ед./мг (Рис. 9А). Цитото-ксическая активность этой же фракции была определена в отношении IHF-чувствительной линии ШИ-3 (миеломоноциты мыши). Активность ФА в отношении этой линии соответствует активно-

А

Цитотоксичность (2) 100

0-5 Пмоль

Цитотоксичность (%)

30 К 20.1 К * I

10 20 м

Рисунок 9. Определение удельной активности рЗО во фракции А.

1929 (-), ТОШ-З (----) (А)

Электрофоретический анализ белков фракции А. (В)

ста в отношении L929. Белок рЗО проявлял цитотоксическую активность в отношении-TNF-чувствительных• линий клеток, однако, более низкую, чем ТКР (2.8XI05 Ед/мг). Часть этой не фракции была подвергнута электрофорезу, с последующим блот-тингом и элюцией. Цитотоксической активностью обладал только белок рЗО (Рис. 9В). Было рассчитано, что при проведении электрофореза произошла инактивация 60 % активного материала. Удельная активность, рассчитанная по данным электрофореза этой фракции (с учетом денатурации ) .составляла 1хЮ^Ед./мг. На основании анализа полученных результатов можно считать, что удельная активность рЗО (с учетом денатурации при проведении обращеннофазной хроматографии >70% и электрофореза с элюцией с мембраны Immobilon - > 60 %) составляет не менее IXI04 Ед./мг.

2.2 Анализ цитотоксических белков Ф2.

Белки фракции Ф2 разделяли при помощи обращеннофазной хроматографии на колонке Ultrapore KPSC (Рис.10). Цитотоксич-ность проявляли две фракции, электрофоретический анализ которых с последующим электропереносом и элюцией показал, что одна из фракгчй содержит цитотоксический белок с молекулярной массой 38 кДа (р38), а другая - два цитотоксических белка-р75 i; р22. Усредненная активность фракции Ф2 в этих экспе-периментах составляла 8-12 Ед. (Табл.5). (Результаты были рассчитаны для 150 мл исходного супернатанта). На этой стадии очистки потерь цитотоксической активности практически не было. Тестирование биологической активности белков после эле-ктрофоретического разделения показало значительное падение цитотоксичности, особенно белков р75 и р22. Получение гомогенных полос белков р38 и р22 в результате электрофореза позволило определить их удельную активность, составившую для р38 4x10® Ед/мг, а для р22 - не менее 1x1О3 Ед/мг (с учетом потерь активности в процессе электорофореза и элюции). Белок р75 не удалось получить в гомогенном состоянии, поэтому его удельная активность не определялась.

Экспресс-анализ цитотоксических белков LAX-клеток, включа-

А(223) 0.05

0.025

75 К 38 К 22 К

В (%)

цитоток-

'80

40

СИЧЕОСТЬ, %

50

25

01.

9 35 70 иш.

Рисунок Ю.ВЭЖХ белков фракции Ф2, полученной в "результате стимуляции ЬАК-клеток 1Ь-2 в течение 4 суток. Разделение проводилось на колонке с обращенной фазой ТШгароге НРБС. -Цит°токсическая активность (.....), градиент буфера-В (80% ацетонитрила,

20% вода)(- -)• Отмечены активные фракции. Над чертой обозначены молекулярные массы цитотоксичес-ких белков этих фракций.

Таблица Б..Анализ активности белков фракции Ф2.

Стадии очистки Цитотокси-ческие белки Цитотоксиче екая (Ед.) активность (Ед/мг)

ВЕАЕ-Тоуорег1 исходная фракция 6.4

тггароге ЕРЭС рЗЗ р75+р22 4.4 6.7

Электрофорез р38 р75 р22 0.9 0.6 0.2 4Х103 шо3

вдий ионообменную хроматографию и электрофорез с определением биологической активности на каздой стадии очистки позволил охарактеризовать основные секратирируеше белки, вносящие максимальный вклад в цитототоксичность по отношению к клеткам линии 1929. Этот подход позволяет не только охарактеризовать биологически активные белки, присутствующие в составе сложной смеси, но и детектировать изменение содержания различных белков, происходящее при изменении гомеостаза системы, например, способа стимуляции лимфоцитов или времени культивирования 1йК-клеток в присутствии Пг-2. Идентифицированные белки, по-видимому, не исчерпывают всего разнообразия как цитотоксических так и модуляторных белков, принимающих участие в лизисе опухолевых клеток, но, регулярно воспроизводимая цитотоксическая активность супернатанта ЬАК-клеток обусловлена, в основном, их присутствием.

3. Выделение и установление первичной структуры цитотоксиче ского белка рЗО.

Белок рЗО, входящий в состав фракции Ф1, был выделен в гомогенном остоянии после двух стадий ионобменной (Рис. 2,7), обращеннофззной .хроматографии (Рис. 8) и электрофореза. Для определения Я-концевой аминокислотной последовательности белка рЗО, материал, полученный из 1800 мл супернатанта ьлк-кле-ток, был поделен на 2 равные части и после электрофореза в 12 % полиакрил ашдном геле, перенесен с помощью электроблот-тинга на мембрану 1шоЫ1оп. Один из треков был окрашен Со-отазэ1е 11-250, другой был разрезан на полоски 2 мм, с которых элстровали белки для определения цитотоксической активности. Полосу белка, проявившую цитотоксиче скуй активность (20 пмоль), вырезали и использовали для определения аминокислотной последовательности с помощью газофазного секвенатора. Было определено 7 аминокислотных остатков (Рис. II). Сравнение полученной аминокислотной последовательности с банком первичных структур (РГО) показало, что Я-концевой фрагмент рЗО гомологичен участку белка СВ20 (228-235 а.к.о.) В-лимфоцитов

человека. CD20 представляет собой интегральный мембранный белок,. с молекулярной массой 30-33 кДа. Идентифицированный фрагмент рЗО также гомологичен белкам Р400 (2750 а.к.о.) и PCD6 (500 а.к.о.) мыши. Р400 представляет собой интегральный мембранный белок присутствующий в клетках Пуркинье. Первичная

рЗО Val-Xeu-Ieu-Pro-Ala-Gln-Gln- (1-7) человек

CD20 -Val-Leu-Leu-Ser-Ala-Gln-GIn- (228-235) человек Р400 -Glu-Leu-Leu-Pro-Ala-GIn-GIn- (2512-2518) мышь PCD6 -Glu-Ieu-Ieu-Pro-Ala-Gln-Gln- (163-169) мышь

Рисунок II.Сравнение установленного фрагмента последовательности белка рЗО с фрагментами известных белков.

структура Р400 была определена по последовательности кДНК, функция его неизвестна. Структура PCD6 была также определена по последовательности кДНК, и оказалась идентичной С-кон-цевому фрагменту Р400. Возможно, PCD6 является продуктом процессинга мРНК, кодирующей Р400.

рЗО может являться как продуктом неизвестного гена, так и результатом альтернативного процессинга мРНК ( или специфического протеолиза белкового продукта), соответствующего CD20 или Р400 человека.

Основные свойства нового цитотоксического белка рЗО:

1. Молекулярная масса восстановленного белка (определенная с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсулъфата натрия) составляет 30 кДа.

2. pi данного белка больше 8, т.к. данный белок не сорбируется при анионообменной хроматографии на DEAE-Toyopearl при рн 8.0, но прочно сорбируется при' катионообменной хроматографии на CM-Toyopearl при рн 6.5.

3. Активность бежа не изменяется при восстановлении р-мер-каптоэтанолом, следовательно, досульфидные связи в белке либо отсутствуют, либо не существенны для проявления активности.

4. Белок дает значительный вклад в цитотоксическую активность супернатанта LAS-клеток, имеющих фенотип CD3+, CD8+, •CD16-, характерный для цитотоксических Т-лимфоцитов.

5. Белок обладает цитотоксической активностью в отношении Ют-чувствительных клеточных линий Ь929 и.ЯИП-З.

6. Удельная цитотоксическая активность рЗО в отношении линии 1929 составляет не менее I X Ю4 Ед./мг..

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что цитотоксическая активность ЬАК-клеток определяется секретируемыми и ассоциированными с мембраной белками, а таете белками-модуляторами цитолиза.

2. Идентифицировано 7 цитотоксических белков, характерных для ЬАК-клеток с фенотипом Ж, и 4 цитотоксических белка ЬАК-клеток с фенотипом СТЬ.

3. Разработана методика выделения секретируемых цитотоксических белков ЬАК-клеток. Определены молекулярные массы этих белков, для трех из них установлена удельная активность.

4. Проведено сравнение идентифицированных белков с известными цитотоксическими белками и показана уникальность их свойств.

5. Проведека выделение цитотоксического белка с молекулярной массой 30 кДа, секретируекого ЬАК-клетками с фенотипом СТЬ. Установлена н-концевая аминснокислотная последовательность рЗО. Изучена его специфичность по отношению к клеткам-мишеням.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

1. Bllschento Е., Satpae? D-, СаЪапота 0., Reüchenko I., luklanova Т., Chertov 0., Saschenko I., Gnuchey N.. luka-nidln E., "A novel Junction of Xetuln", 8th Conference oi young scientists on organic and bloorganlc chemistry", Riga, 1991, стр.12

2. Блищенко Е.Ю., Чертов О.Ю., Сащенко Л.П., Гнучев Н.В., Лукьянова Т.И., Редченко И.В., Кабанова О.Д., Луканидин Е.М., "Цитотоксические белки лимфокин-активированнйх киллеров", Всесоюзный симпозиум химия белков, Тбилиси, 1990, стр.6

3. Блищенко ЕЛ)., Чертов О.Ю., Сащенко Л.П., Гнучев Н.В., Лукьянова Т.И., Редченко И.В., Кабанова О.Д., Луканидин Е.М., "Функциональные изменения лим£окин-активированных киллеров в зависимости от времени инкубации с интерлейкином-2", Доклады академии наук, 1992 т.324, N2 (в печати)

4. Блищенко E.D., Чертов O.D., Сащенко Л.П., Гнучев Н.В., Лукьянова Т.И., Редченко И.В., Кабанова О.Д., Луканидин Е.М.."Влияние интерлейкина-2 на цитотоксическую активность, экспрессию поверхностных маркеров и секрецию цитотоксических белков", Экспериментальная онкология, 1992, т.14, N5, стр.54-58

Материалы диссертации были доложены на 8 конференции молодых ученых (Рига,1991), Всесоюзном симпозиуме химия белков, (Тбилиси, 1990),на мездународном симпозиуме по молекулярной и клеточной онкологии (Львов,1990), на 4th Conference on lymphocyte activation and immune regulation ,(США, 1992).