Новые белки обонятельного эпителия млекопитающих. Структурно-функциональные исследования тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им академиков М М ШЕМЯКИНА и Ю А. ОВЧИННИКОВА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

ШУВАЕВА Татьяна Маратовна

НОВЫЕ БЕЛКИ ОБОНЯТЕЛЬНОГО ЭПИТЕЛИЯ МЛЕКОПИТАЮЩИХ. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

02 00.10-биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

МОСКВА-2008

003447777

Работа выполнена в лаборатории белков гормональной регуляции Института биоорганической химии им. академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова Российской академии наук

Научный консультант доктор химических наук, чл -корр РАН Липкин Валерий Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук,

академик РАН Островский Михаил Аркадьевич

доктор химических наук,

профессор Румш Лев Давыдович

доктор медицинских наук,

профессор Соодаева Светлана Келдибековна

Ведущая организация - ФГУП Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции микроорганизмов

Защита состоится « » октября 2008 г. в 10 час на заседании специализированного совета Д 002 01901 при Институте биоорганической химии им академиков М.М Шемякина и Ю А. Овчинникова РАН по адресу 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Автореферат разослан « гл, » сентября 2008 г.

Ученый секретарь специализированного совета,

доктор физ -мат наук -------в А. Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Обмен веществ между организмом и окружающей средой - основная функция эпителиальной ткани как пограничного образования Некоторые из этих тканей, такие как обонятельная выстилка, ткани респираторного эпителия и другие, непосредственно контактируют с атмосферой и в норме покрыты слизью, которая является первым барьером между ними и окружающим воздухом и, фактически, обеспечивает нормальное функционирование всех тканей дыхательной системы и, следовательно, всего организма в целом

Для поддержания жизнедеятельности организма через слизь осуществляется транспорт важных веществ, например, кислорода - в респираторном эпителии, пахучих стимулов - в обонятельной выстилке Но одновременно через этот секрет в эпителий поступают вещества, которые могут быть токсичными для клеток Действие этих факторов в органах и тканях респираторной системы нейтрализуется путем самоочищения дыхательной поверхности с помощью фагоцитоза, неспецифической бактерицидной защиты органов дыхания радикальными соединениями, генерируемыми активированными фагоцитами, специфической иммунной защитой от инфекционных возбудителей и чужеродных макромолекул, обезвреживанием токсичных веществ и липофильных эндогенных макромолекул Нарушение работы этих систем является причиной развития многих заболеваний различной этиологии

Большая физиологическая значимость понимания процессов регулировки механизмов защиты организма предопределяет интенсивность исследований самых различных структурно-функциональных аспектов этих систем, в частности, проводятся работы по поиску и характеризации белковых регуляторных компонентов обонятельной слизи, называемых (если пользоваться медицинской терминологией) «белками первой линии защиты» Несмотря на достигнутый прогресс в этой области в течение последних лет, многие молекулы, важные для поддержания гомеостаза в органах дыхания, все еще остаются неизвестными, т к выделение белковых компонентов в индивидуальном виде и их идентификация имеют свои специфические трудности Это обстоятельство сдерживает прогресс в изучении реально существующих защитных механизмов эпителиальных тканей воздухоносных путей, нормальное функционирование которых представляет собой основу естественной невосприимчивости организма к болезням Вышеизложенное позволяет заключить, что идентификация и структурно-функциональное исследование белков обонятельной выстилки является актуальной проблемой физико-химической биологии

Цель и задачи исследования. Основной целью настоящей работы является поиск, идентификация и исследование новых белковых компонентов, непосредственно контактирующих с окружающей средой клеток Для достижения поставленной цели потребовалось решить следующие задачи

1 Разработать методы очистки и выделить в индивидуальном состоянии новые, ранее неизвестные полипептиды из обонятельной выстилки крысы

2 Определить частичную аминокислотную последовательность этих полипептидов и отобрать белки, являющиеся потенциально значимыми для функционирования эпителиальных тканей

3 Клонировать структурные гены ранее неизвестных белков и определить их нуклеотидную последовательность, установить полную аминокислотную последовательность новых белков и идентифицировать участки цепей природных продуктов, имеющих пост-трансляционные модификации

4 Создать рекомбинантные аналоги новых белков и изучить особенности их функционирования

5 Выявить клеточную локализацию новых белков, изучить их функциональную роль в механизмах клеточной защиты эпителиальных тканей

В ходе данной работы был открыт основной антиоксидант респираторных тканей - ЬСуБ-содержащий пероксиредоксин (Ргх VI) В связи с этим была поставлена отдельная задача по разработке условий получения высокоактивных генно-инженерных аналогов пероксиредоксина VI человека и сравнения его антиоксидантных свойств с природным белком

Научная новизна работы. В процессе исследования разработана методика и осуществлено выделение в гомогенном виде двух новых, ранее не описанных белков респираторного эпителия крысы с молекулярными массами 28 и 45 кДа Впервые установлено, что в слизи обонятельного эпителия в значительных количествах (~2%) присутствует новый тип тиол-специфических пероксидаз и липид-переносящий белок, 8ес14р-подобный белок, несущий в своем составе СЯАЬ/ТЯЮ- или БесМр-подобный домен

На основе информации о частичной аминокислотной последовательности осуществлено клонирование кДНК этих белков По определенной нуклеотидной последовательности установлена полная первичная структура этих белков, состоящая из 223 и 400 аминокислотных остатков, соответственно Установлено, что тиол-специфическая пероксидаза принадлежит к семейству пероксиредоксинов VI и в ее составе идентифицирован домен, способный защищать белки от разрушения активными формами кислорода, подобно полноразмерному ферменту Изучены особенности химического строения Ргх VI и показано, что белок не гликозилирован, отсутствие постгрансляционной модификации имеет важное значение для проявления белком протекторной активности

Впервые показано, что наибольшая концентрация этих белков обнаруживается в тканях, имеющих непосредственный контакт с атмосферой и больше, чем другие, подверженных воздействию неблагоприятных внешних факторов На основании полученных данных сделано предположение, что эти белки входят в состав защитных систем эпителиальных тканей и обеспечивают их нормальный контакт с окружающей средой

Нами установлено, что ключевой посредник сигнальных путей фосфатидилинозит-3,4,5-трифосфат является специфическим липидным лигандом Бес 14р-подобного белка тканей респираторной системы Доказана

колокализация этих веществ в клетках млекопитающих и выявлено участие липид-связывающего Бес14р-подобного белка в секреторном процессе Впервые продемонстрирована транспортная активность Sec 14р-подобного белка млекопитающих и возможность переноса фосфатидилинозит-3,4,5-трифосфата во внеклеточную среду

Практическая ценность работы. На основе белка пероксиредоксина VI для тканей, контактирующих с внешней средой, предложен принципиально новый специализированный препарат антиоксидантного действия, направленный, в первую очередь, на восстановление редокс-баланса тканей органов дыхания В модельных экспериментах на животных показана высокая эффективность действия этого белка на восстановление эпителиальных тканей верхних дыхательных путей В связи с потенциальной практической важностью Prx VI на его использование оформлена международная заявка

Получены высокоактивные генно-инженерные аналоги пероксиредоксина VI человека и осуществлено сравнение их протекторных свойств с природным белком

В ходе определения липид-связывающей специфичности Sec 14р-подобного белка разработан новый простой и не требующий использования радиоактивных липидов метод изучения липид-белковых взаимодействий Метод позволяет исследовать транспортную активность белков по отношению к липидному лиганду и в случае, когда тип липидного соединения не известен

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях IV, VII и VIII Чтениях, посвященных памяти академика Ю А Овчинникова (Москва, 1998, 2004 и 2006 гг, соответственно), II Съезде биофизиков России (Москва, 1999 г), INTAS Симпозиуме «Микробные и клеточные системы для фармакологии, биотехнологии, медицины и экологии» (Москва, 1999 г), NATO-FEBS Конференции «Белки, липиды и мембранный транспорт» (Франция, Каргез, 1999 г), X Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине и экологии» (Украина, Гурзуф, 2002 г), 7 Международном симпозиуме «Биомолекулярные структуры» (Великобритания, Шеффилд, 2004), Московской конференции по компьютерной молекулярной биологии, (Москва, 2005 г), Международной конференции «Новые концепции липидологии» (Нидерланды, Нарвайкерхуд, 2006 г)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 33 работы, в том числе 2 обзорные статьи в книгах, 7 статей в рецензируемых российских журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией, 7 статей в иностранных журналах, входящих в систему цитирования Web of Science, и 3 патента

Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль в выборе направления исследований, разработке и проверке предложенных в работе экспериментальных подходов, обсуждении, оформлении и обобщении полученных результатов За исключением биомедицинских исследований по оценке лечебного действия пероксиредоксина VI (выполненных в Институте биофизики клетки под руководством проф, д б н Новоселова В И), экспериментальная работа выполнена автором, а также студентами, аспирантами

и сотрудниками (под руководством автора) В исследованиях, проведенных в соавторстве с зарубежными коллегами, личный вклад автора заключался в постановке задачи, непосредственном участии в руководстве при проведении экспериментальной работы, выполнении ряда экспериментов, в обсуждении полученных результатов и оформлении их в виде публикаций

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах печатного текста и включает в себя 4Л рисунков и таблиц Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, состоящего наименований

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

К началу настоящей работы было известно, что в слизи обонятельной выстилки крысы присутствуют два новых полипептида, проявляющиеся при электрофорезе в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (БОБ) в виде мономерных белков с молекулярными массами ~28 и ~ 45 кДа соответственно Оба полипептида (далее в тексте «р28» и «р45») не совпадали по молекулярным массам с уже ранее описанными белками этой ткани и в сумме составляли ~ 4 % всех белков слизи Р45 давал положительную реакцию с поликлональными антителами, полученными к синтетическому пептиду, соответствующему ОТР-связывающему участку аминокислотной последовательности, общему для а-субъединиц всех известных в-белков, однако субстратом для холерного или коклюшного токсинов не являлся

Поскольку аминокислотная последовательность р28 и р45 не была известна, идентифицировать эти белки и установить их биологическую роль в механизме функционирования эпителиальной ткани млекопитающих не представлялось возможным

1. Пероксиредоксин обонятельного эпителия крысы

1.1. Очистка, идентификация и определение частичной аминокислотной

последовательности белка р28, пероксиредоксина VI

В качестве источника для выделения р28 использовался изотонический экстракт обонятельных выстилок крыс линии Вистар Первоначальное фракционирование экстракта осуществляли с помощью ионообменной хроматографии на БЕАЕ-Сефацеле и Сефакриле 5-200 После 2-х стадийной хроматографии по данным электрофореза в ПААГ в присутствии БЭБ р28 оказывался уже в значительной мере гомогенным его чистота составляла ~95 % Но, во избежание осложнений с идентификацией молекулы с неизвестной функцией, обычно сопряженных с возможным присутствием в препарате примесных полипептидов, связанных с исследуемой молекулой спонтанно образующимися в процессе выделения дисульфидными мостиками, частично очищенный препарат белка дополнительно денатурировался, модифицировался

4-винилпиридином и наносился на колонку Нуклеосил 300-7 RP, уравновешенную 0,1 % трифторуксусной кислотой После продолжительной промывки, представляющей собой фактическое обессоливание алкилированного препарата р28, связавшиеся белки элюировали с колонки градиентом ацетонитрила в обычно принятых условиях Белок, выходящий с колонки отдельно стоящим доминирующим острым пиком, дающий при электрофоретическом анализе в ПААГ в присутствии SDS кажущуюся молекулярную массу ~ 28 кДа и имеющий остаток Pro в качестве N-концевого, использовался для дальнейших исследований

Первым шагом к идентификации р28 и выяснению его функции было определение N-концевой аминокислотной последовательности белка Pro-Gly-GIy-Leu-Leu При сравнении этой структуры с последовательностями, хранящимися в PIR и GenBank банках данных, был обнаружен белок - селен-несодержащая глутатионпероксидаза из цилиарного тела быка (PIR банк, А60604), N-концевая последовательность которого точно совпадала с определенной структурой (рис 1) Полная аминокислотная последовательность этой

глутатионпероксидазы на тот момент еще не была известна, но абсолютная идентичность N-концевых структур этих белков позволила сделать предположение о высокой гомологии этих белков, о принадлежности их к одному семейству и, как следствие, существовании пероксидазной активности и у р28

а . NH2- PGGLX. .

б . NН2 - PGGLLLGD*. Е . APNFEANTT,. I G^ G . I1. S . F* з s J

в. NH2- MPGGLLLGD . V. APNFEANTI, V <G . R J,. R . F

КЗ K1 K2

a .

б . .XXX LG.

в . .HDF.LG.

Рис. 1. Анализ частичной аминокислотной последовательности р28 Участки цепи, полученные при определении N-концевой структуры р28 и аминокислотной последовательности пептидов (К1-КЗ) его лизинспецифического гидролизата - (a), N-концевая последовательность глутатионпероксидазы из цилиарного тела быка - (б), фрагменты аминокислотной последовательности гипотетического белка человека ORF6 - (в)

Для установления полной аминокислотной последовательности очищенный препарат модифицированного р28 гидролизовался Lys-специфичной протеиназой При разделении полученного гидролизата с помощью офВЭЖХ был выделен ряд пептидов, причем установление последовательности уже для трех из них дало возможность найти в базах данных гипотетический белок из

. . КХ.АРЕ F . KDINAY.. .KGVFT..

56 64 204

KLAPEF. . . . KDINAY . . .KGVFT..

миелобластомы человека (ORF6), чья структура, предположительно, должна быть аналогична последовательности р28 (рис 1)

Поскольку аминокислотная последовательность гипотетического белка была выведена из нуклеотидной и данные о его функции отсутствовали, был проведен поиск гомологов ORF6 Было выявлено несколько белков с разной степенью подобия с последовательностью ORF6, но на тот момент наибольшим сходством (64%) обладал тиол-специфичный фермент -антиоксвдант («TSA») из нематоды Onchocerca volvulus (Chandrashekar R et all, GenBank 1995, U31052) Таким образом, было предположено, что р28 принадлежит к классу тиол-специфичных антиоксидантов или, согласно современной терминологии, пероксиредоксинов (Ргх)

Для того чтобы окончательно прояснить, является ли очищенный белок, имеющий N-концевой остаток Pro, тиол-специфическим антиоксидантом, была проверена его способность проявлять свою антиоксидантную активность в окислительной системе Fe3+/DTT/02, способной генерировать активные формы кислорода (АФК), в присутствии тиола

юо

12 3 4

Время инкубации (мин )

Рис. 2 Защита глутаминсинтетазы Е coli от АФК с помощью р28 в

металл/ОТТ/окислительной системе Инактивационная смесь содержала 5 мкг

глутаминсинтетазы, 3 мМ DTT, 3 мкМ FeCl3 в объеме 60 мкл В смесь дополнительно добавлялись (•) - 1 мМ EDTA, ( ■)- 0 мг/мл р28, ( о) - 0, 002 мг/мл р28, ("*■) - 0,010 мг/мл р28, (□)-0,1 мг/мл р28

На рис 2 представлена кривая защиты глутаминсинтетазы Echerwhia coli от окисления с помощью ^модифицированного р28 В отсутствие р28 в реакционной смеси уже после 5 мин инкубации падение активности фермента составляло величину 90 % (рис 2) Присутствие 10 мкг/мл р28 защищало глутаминсинтетазу уже на 50 % Когда концентрация р28 в реакционной смеси составляла 100 мкг/мл инактивации фермента практически не наблюдалось

Таким образом, было получено прямое подтверждение, что р28 действительно является Ргх и защищает в присутствии тиолов белки от действия АФК

1.2. Установление и анализ полной аминокислотной последовательности пероксиредоксина VI

В общей сложности была установлена последовательность 5 лизинспецифичных пептидов (К1 — К5) Эти сведения позволили обнаружить в базах данных еще два белка, первичные структуры которых содержали гомологичные р28 участки продукт регулируемого фактором роста кераноцитов мыши гена КИС-1, идентифицированный как селен-несодержащая глутатионпероксидаза (ЕМВЬ 1997, У12883), и гипотетический белок ЬТ\У4 из печени мыши (ОепВапк 1997, АБ 004670) Поскольку К1Ш-1 и ЬТ\У4 были полностью между собой идентичны, был сделан вывод, что все они, в том числе и изучаемый полипептид и гипотетический белок ОИР человека, являются видоспецифическими изоформами одного и того же белка

Благодаря тому, что были найдены изоформы р28, удалось определить последовательность расположения лизинспецифичных фрагментов в полипептидной цепи белка

— К5+ К1 —К2 —

На основе структуры пептидов, расположенных ближе к Ы-концу молекулы белка, были синтезированы прямые праймеры (1 и 2), а на основе структуры К2, расположенного ближе к С-концевому остатку, был синтезирован обратный праймер (3) (табл 1) Олигонуклеотидные праймеры (1) и (3) были использованы для получения фрагмента кДНК Ргх методом ПЦР с использованием в качестве матрицы амплифицированной фаговой библиотеки из обонятельного эпителия крысы, созданной на основе вектора ШМ1149 (клонирование кДНК по ЕсоК\-сашу)

Таблица 1. Олигонуклеотидные праймеры, использованные для получения фрагментов кДНК Ргх методом ПЦР

Шифр пептида, аминокислотная последовательность Нуклеотидная структура № праймера Степень вырожденности

КЗ АРЕРАК 5,СС(°/т)ССЮАСТТТСС(и/т)А А(А/0)3' 1 8

К5 К1 ШЫАУ 5ТССАСТААСОАТАТ1ААТС С(°/т)ТА(т/с)3' 2 4

К2 КвУРТК 5'ТТ1СТССАА(°/а/1/с)А С(с/А/Т/с)СС(т/с)ТТ3' 3 32

Эта библиотека была любезно предоставлена проф Н Бреером (Университет Гугенгейма, Штудгарт, Германия) Полученный после амплификации фрагмент кДНК («D») имел длину, соответствующую ожидаемой (рассчитанной на основе данных по структурам гомологичных белков), и гибридизовался с [у-32Р]-меченным олигонуклеотидным зондом (2) Амплифицированный фрагмент был клонирован в плазмиду pSp65 по сайту Hindil

Отбор рекомбинантных клонов проводили гибридизацией с [у-32Р]-меченным олигонуклеотидным зондом (2) В результате было получено два клона, определение нуклеотидной последовательности вставок которых показало их полную идентичность и высокую гомологию с кДНК белков, обнаруженных ранее при сравнении частичной аминокислотной последовательности Ргх со структурами, хранящимися в базах данных

АТС TAA

l) I II_Ш]_1414„ о

100п о

I—I

D

Рис. 3 Схема строения кДНК Ргх из обонятельного эпителия крысы клона Хз26 1 и относительное расположение ПЦР-фрагмента D Черный прямоугольник соответствует кодирующей области, белые - 5 - и 3 -нетранслируемым областям Стрелками обозначены положения на цепи олигонуклеотидных праймеров (1) и (3), использованных для синтеза ПЦР-фрагментов кДНК, и зонда (2) для отбора содержащих их клонов

Идентификацию клонов, содержащих кДНК Ргх, проводили гибридизацией in situ фаговых бляшек (5х105) с [а-32] -меченным ПЦР-фрагментом кДНК исследуемого белка В результате моноклонизации было получено несколько положительных клонов, среди которых был отобран клон (А.а26 1), содержащий вставку кДНК р28 с максимальной длиной (рис 3) EcoRI-EcoRI фрагмент кДНК из фага А.а26 1 был субклонирован для рестриктного и структурного анализов Полученная нуклеотидная последовательность и выведенная из нее полная первичная структура р28 представлены на рис 4 Открытая рамка считывания мезвду нуклеотидными основаниями 35 и 709 кодировала полную аминокислотную последовательность Ргх

Все частичные аминокислотные последовательности, выявленные при анализе целого белка и его лизинспецифического гидролизата, кодировались этой открытой рамкой считывания Анализ N-концевой структуры Ргх показал, что остаток Met, кодируемый инициирующим кодоном ATG, отщепляется в процессе пост-трансляционной модификации, и зрелый белок включает в себя 223 аминокислотных остатка, в том числе единственный остаток Cys46

Сравнение полной аминокислотной последовательности исследуемого белка со структурами, хранящимися в базах данных, подтвердило, что белок с

кажущейся молекулярной массой ~ 28 кДа, выделенный из обонятельного эпителия крысы и имеющий N-концевой остаток Pro, относится к семейству Ргх

GCGCCTCCTTGTTCCCAGCGTCACCACTGCCGCC -1

ATGCCCGGAGGGCTGCTTCTCGGGGACGAAGCCCCCAACTTTGAGGCCAATACCACCATCGGCCACATCCGCTTC 7 5

Р G G L L LGDEAPNFEANTTIGHIRF 24

CACGATTTCCTAGGACMTTCATGGGGCATTCTCTTTTCCCACCCACGGGACTTTACCCCAGTGTGCACCACAGAA 150

HDFLGDSWGILFSHPRDFTPVCTTE 49

CTTGGCAGAGCTGCAAAGCTGGCGCCAGAGTTTCCCAAGAGGAATGTTAAGTTGATTGCTCTTrCAATAGACTCT 225

L G R А А К L А Р Е F А К R N V К LIALSIDS 74

GTTGAGGACCATTTTGCCTGGAGCAAGGACATCAATGCTTACAATGGTGCAGCACCCACAGAAAAGCTACCATTT 3 00

VEDHFAWSK D I N A Y NGAAPTEKLPF 99

CCCATCATCGACGATAAGGACAGGG ACCTTGCCATCCTGTTGGGCATGTTGGATCCAGCAGAGAAGGATGAAAAA 375

PIIDDKDRDLAILLGMLDPAEKDEK 124

GGCATGCCCGTGACAGCCCGTGTGGTATTCATTTTTGGCCCTGACAAGAAACTAAAACTGTCCATCCTCTACCCA 450

GMPVTARVVFIFGPDKKLKLSILYP 149

GCCACCACGGGCAGAAACTTTGATGAGATTCTCAGAGTGGTTGACTCCCTCCAGCTGACAGCATCAAATCCAGTT 525

ATTGRNFDE ILRVVDSLQLTASNPV 174

GCCACTCCAGTTGACTGGAAGAAGGGAGAGAGTGTGATGGTCCTTCCCACCCTCCCTGAAGAGGAAGCCAAACAA 600

ATPVDWKKGESVMVLPTLPEEEAKQ 199

CTTTTCCCTAAAGGAGTCTTCACCAAAGAGCTCCCATCTGGCAAGAAATACCTCCGTTATACGCCCCAGCCTTAA 675

Ii F Р К G V F Т К Е L Р S G К К YLRYTPQP • 223

GTCTGCGGGAACTGGGGCTGCAACTGCTCGACCAGCACTGGGACCTGAGGATGACAGCTGACAGCTGCAGTTCCG 750 TAGAAAGATTGTGGCGTGGTCACAGCCGAAGTCGCGTAGGTCGCTCGCTATACTACTGGCTCATTAAATGGAAAT 825 GGCACCAAAACATTCTCGGGATTCTTTACTCTGTGCCTTCGCCAGCATTCTGCCCCTCCATCCATCACAGCGCCC 900 TGCTGACTGGCTTTCTTTGAAACGAATTATGTGTTCGTGACTGCAGGGTCTCTGCAGGGTCTGTGATCAGCAAGG 975 TAGTGTCAGTGTGGGCTCCATGCTAGAATGATAAACATCTTTTGTAGGTTTCCAAACTGAATCTTCTGTTACCCA 1050 TTGTGGAGAACCATAAAGTGGGGAGAAACTTTCAATTCTGTACTTTCAGTAAATAAAGCAGGGGAGGTGGGGGGG 1125 GGGGGAGAGTTCTCTATAGGAAATCCATGGTGAGTTTCTATCAAAGTGGGCTTCCAAGAATGTGTGGAAGACAGC 1200 ACATGTACTTCCTGGAGTTTCCAGGTCTGCTCTCTAGTGATCTGTGAATGTGAACTCGCCTTATGAAAGACAGGC 1275 AGTGACATTGTTTGCCACTAAATGTCCTAAAGGAGTGGGTTGCCATTTCTAAATTCTGCTGTGTGAGGTTCAACA 1350 ATAAAATCCTGATTAGAAAAAAAAAAAAAA 138 0

Рис 4. Нуклеотидная последовательность кДНК р28 из обонятельного эпителия крысы и реконструированная полная первичная структура белка Подчеркнуты последовательности, определенные методами белковой химии В 3 - нетранслируемой области подчеркнуты сайты полиаденилирования

В настоящее время известно уже более 200 представителей этого семейства, обнаруженных практически во всех организмах (от бактерий до человека) и отличающихся высокой консервативностью На рис 5 представлено сравнение первичной структуры р28 с последовательностями лишь некоторых из них

Р28 как и все пероксиредоксины в составе Ы-концевой части цепи содержит консервативную последовательность Р39хОРТРУСхТЕ49 с существенным остатком СуБ, представляющую собой активный центр фермента Поскольку у многих других представителей этого семейства в С-концевом фрагменте находится еще один функционально важный консервативный остаток СуБ, например, Сув173 у М8Р23, Сув172 у ЖЕР-А, СуБ170 у УТБА (рис 5), все пероксиредоксины, в зависимости от общего числа консервативных остатков СуБ

(вариабельных остатков Cys может быть значительно больше), делятся на два подсемейства 1-Cys- и 2-Cys- содержащие Ргх

р28

ORF б MPeG-J»M^v|PNFSANTiV- -О- - -RIRFJTOrWaJSWGILFSHPRDFTPVCTTBbGRA

PERI M|-p-|TX^TVFNLSL°STH- "-KZRimrVpiGYVfLFSHPGÇFTPVCTTBtJIAM

MSP23 MSSGM^Ii^Pj^N^^TAVMPDOQFKD^SLSEYKd-KYVVF^^fSLDF^FVCPTÄIIAF

NKEF-A h№SGNAQIGKS»J"DFTATAW-I^FKEIKLSDYRG-KYVDÍFFYPIJ3FTFyCPTBIIAF

SP-22 A---PAVTQHAPYFKGTAVV-SpEFKEÍSLDD?Kí3-KYLVbFFYPLDFTFyCPTBIIAF

YTSA V- --AEVQKQAPPFKKTAW-Dj3IFEEISLEirYKG-KYVvÍúAFvl>LAFSFyCPTEIVAF

AhpC MSglNTKIKP-gKNaAFK-NgEFIEVTEKtoEe-RjfSVFgFYÏAD^F^PyiCijDV

p2 8

orf6 akmpefakri^lialsidsn^hiaksiœinaïwceepteicbpfpixddrnrebaili.

peri inyàkpbkrgvçblgïsctdxqsfeelçrk^eaiijk- - - j^sjjvt^fpmpprsakqb

msp23 sdradefkklncqvigasvdshfchlXwintpkkq-g--glgp^iplîsdpkrtiaqdy

nkef-a sdhaedfrklrcevlgvsvdsqftjilakintprke-p--GLGPbNIPLLAbVTKSLSHNY

sp-22 SDKASEFHDVNCEWAVSVDSHFSHLAWIin'PRKN-b--GLGHMNIALLSpLTKQISRDY

ytsa sdaawcfedqgaqvlfastdseysllaktíílprkd-a--GbGPVKVf llabknhsssrdy

AhpC âdhyeelqklgtovysvstdthfthkkwhsss--e----TIA^ikyamigdptgaltrnf

p28 ВЦЩайЯШ1^^

orf 6 qíi»üpaekdkkgmpvtarwfvfgpdkkijclsh.ypattgrnfdei lrwiswjwaek -

peri mmtebœaqgq- lpsrtlhxvppdjçvyklsplypsctgrnmdevv^avdslltaakh-

msp23 bvëkadc-- - -il - - sf|gltalddkgi^qitindlpvg8ív|)KjllL^QAFpF|lDKH-

nkef-a рфип>|----bv--ayrglfíidasgvírqitvndlpvgrsvdealrlvqafqyideh-

SP-22 CJVbLEGP----GL--AWGLFIIDPNGVIKHLSVNDLPVGRSVEETLRLVKAFQFVEAH-

ytsa й1ек1- ---bx--alrgl»fld«gilíhitihdlsver^wí^l5ntofp^dkí¡-ahpc dnmrede----gl--ad^ty\n^pqgiiqaievtaeglbrdasdllrkikaaqyvxahp

p28

ORF6 RVATFVPWKI^ffVMVLI>XIPSSIШaЬI'î'KGV^TKEI,PSGKKTt.SÏTPOP 91.5%

PERI 52 0%

MSP23 GEVCI>AGWKPG-^DTIKPDVNK- -SfcEY^SKQK ~ " *"*"" * 31.4%

NKEF-A GEVCpAGWKPG-SDTIKPNVDD--SKEY^SKHN 31 4%

SP-22 GEVCpAKWTPE-fePTIKPHPTA--SREYFH^CVNQ 27.3%

YTSA GTVlicNm,PaA-ATIKiDVKD--SKEYFKNAiJN 25.1%

AhpC GEVaPAKKKEdg-ATLASSCD------gVGgl 24.7%

Рис. S Сравнение первичной структуры p28 с последовательностями некоторых представителей семейства пероксиредоксинов Условные обозначения p28-Prx VI из обонятельного эпителия крысы, Genbank Y17295, ORF6 - Ргх VI человека, GenBank D14662, PERI- гипотетический белок ячменя, GenBank Х96551, MSP22 - стрессовый белок мыши, SWISS-PROT Р35700, NKEF-A - белковый фактор человека, усиливающий активность естественных киллеров, SWISS-PROT Q06830, SP-22 - митохондриальная тиоредоксин-зависимая пероксиредуктаза быка, SWISS-PROT Р35705, YTSA- тиол-специфический акгиоксидант дрожжей Saccharomyces cerevisiae, SWISS-PROT Q04120, AhpC - субъединица С алкилгидроксипероксидазы бактерий Salmonella typhimurium, SWISS-PROT Р19479 Жирным шрифтом выделены аминокислотные остатки, инвариантные во всех последовательностях, серым цветом - остатки, идентичные у двух и более представителей семейства пероксиредоксинов Прочерки введены для оптимизации выравнивания Цифры справа соответствуют степени идентичности приведенных последовательностей относительно структуры р28

Учитывая наличие в полипептидной цепи р28 только одного остатка Cys, был сделан вывод, что белок, выделенный из обонятельного эпителия крысы и обладающий протекторным действием m vitro в тиол-окислительной системе,

относится к подсемейству l-Cys-содержащих Ргх и, согласно недавно предложенной номенклатуре для ферментов млекопитающих, называется Ргх VI

1.3. Локализация пероксиредоксина VI в тканях млекопитающих

Ферментативные антиоксиданты локализованы не только в определенных клеточных компартментах, но и специализированы в отношении отдельных форм АФК, поэтому после идентификации исследуемого белка сразу возник вопрос для жизнедеятельности каких органов и тканей может быть наиболее важно протекторное действие пероксиредоксина VI Совместно с д б н , проф В И Новоселовым (ИБК РАН, лаборатория механизмов рецепции, зав лаб чл -корр Фесенко ЕЕ) были выполнены эксперименты по исследованию локализации Ргх VI в различных тканях крысы

На рис 6 (lb) представлены данные по локализации Ргх VI в обонятельной выстилке, полученные с помощью световой иммуногистохимии Ргх VI интенсивно выявлялся во всех областях обонятельной выстилки (обонятельной и респираторной) Его максимальное содержание наблюдалось в апикальной части эпителия, в обонятельной слизи и клетках боуменовых желез Аналогичная картина наблюдалась и в случае трахеи (рис 6, 2b) - Ргх VI выявлялся в апикальной части ткани трахеи и слизи В случае легких Ргх VI обнаруживался только в бронхах (рис 6, ЗЬ), и его максимальная концентрация наблюдалась в апикальной части бронх Паренхима (альвеолы, кровеносные сосуды) легкого не проявляла иммунореактивности против поликлональных антител к Ргх VI В случае кожи иммуноокрашивание наблюдалось в слое гранулярных клеток эпидермиса (рис 6, 5Ь) В коже, содержащей волосяной покров, также интенсивно окрашивались клетки сальных желез волосяных фолликул В других исследованных тканях (печень, мышцы, почки, матка) наблюдалось только очень слабое диффузное распределение Ргх VI

Поскольку не всегда место локализации белков совпадает с местом синтеза (в частности, белки могут транспортироваться с током слизи) также были проведены эксперименты по in situ гибридизации этих срезов с антисенс пробой фрагмента мРНК Ргх VI (рис 6,1с-5с)

Из перечисленных выше тканей на радиоавтографах максимальный 33Р-сигнал выявлялся в обонятельном эпителии, и распределение сигнала вдоль эпителия показывало, что синтез белка идет в слое эпителия, содержащем тела обонятельных, опорных и стволовых клеток (рис 6, 1с) В то же время по данным иммуногистохимии максимальное содержание белка наблюдается в обонятельной слизи Аналогичные результаты получены и для трахеи и бронхов (рис 6, 2с, Зс) В коже распределение 33Р-сигнала точно совпадало с локализацией Ргх VI Таким образом, максимальное содержание Ргх VI мы наблюдали в определенных структурах эпителиальных тканей, а именно только в тех областях, которые непосредственно связаны с атмосферой

Рис. 6. Локализация пероксиредоксина VI и его мРНК в обонятельном эпителии (1), трахее (2), легком (3), коже со спины (4) и с подушек лапы (5) крысы; ( а ) - окрашивание гематоксилином и эозином; ( Ь ) - иммуногистохимическое выявление Ргх VI пероксидазным методом, краситель ДАБ; ( с ) - экспрессия мРНК Ргх VI, выявленная методом гибридизации. Срезы гибридизовались с 33Р-меченой антисенс РНК пробой, визуализация в «темном поле». Шкала 100 мкм.

В силу анатомического строения и особенностей функционирования, действию атмосферного воздуха в первую очередь подвержены ткани органов дыхания. И прямые биохимические эксперименты по истощению экстрактов тканей обонятельного эпителия, трахеи и бронхов по Ргх VI показали, что этот белок является основным антиоксидантом этих клеток, и его вклад в нейтрализацию АФК составляет более 70%.

Рис. 7. Процесс регенерации ран (1-3) и гистохимические исследования фибробластов грануляционной ткани через 8 дней после надреза (4, 5); 1 - сразу после надреза; 2- через 5 суток после надреза без обработки; 3- через 5 суток после надреза с применением Ргх VI; 4-регенерация раны в норме (»-участок рубца); 5- регенерация раны с применением Ргх VI.

Многочисленные патологии органов дыхания (астма, аллергия, тепловые и химические ожоги и т.д.) сопровождаются так называемым «респираторным взрывом», который характеризуется резким увеличением АФК в тканях органов дыхания. В медицинской практике для диагностики и лечения этих заболеваний применяются известные (ставшие уже классическими) ферменты-антиоксиданты: супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидазы. Тот факт, что основным антиоксидантом тканей, непосредственно контактирующих с внешней средой, является именно пероксиредоксин VI, изменил подход к данной ситуации и стимулировал большое число экспериментов по изучению его лечебных и защитных эффектов.

Исследование влияния аппликации Ргх VI на процесс регенерации раны и образование рубца продемонстрировано на рис. 7. Эти эксперименты показали, что заживление раны с аппликацией Ргх VI происходит в два раза быстрее, не переходит в длительную воспалительную фазу и, что особенно важно, сопровождается образованием рубца значительно уменьшенных размеров.

После получения такого рода результатов стало очевидно, что Ргх VI может являться новым лекарственным препаратом, способствующим регенерации поврежденных тканей и органов. Поэтому дальнейшие исследования были посвящены разработке методов получения функционально активных рекомбинантных препаратов Ргх VI.

1.4. Получение функционально активного рекомбинантного препарата Prx VI. Выделение и очистка рекомбинантных белков

Экспрессия кДНК пероксиредоксина VI в эукариотической системе Pichia

paitoris

Поскольку в состав молекулы Prx VI входит последовательность -Asn-Thr-Thr- (16-18, рис 4), представляющая собой потенциальный участок действия гликозилтрансфераз, было предположено, что остаток Asn16, входящий в эту структуру, может быть гликозилирован Более того, известно, что наличие остатка Thr в положении +1 от остатка Asn увеличивает эту вероятность до 90 % Поэтому для получения препаративных количеств биологически активного препарата белка биомедицинского назначения была первоначально выбрана система экспрессии в метилотрофных дрожжах Р pastoris, сочетающая в себе преимущества экспрессии в Е coli (высокий уровень синтеза белка и низкая стоимость работ) с преимуществами экспрессии в эукариотической системе («правильное» сворачивание полипептидной цепи и возможность получения постгрансляционно модифицированных продуктов)

Для экспрессии полноразмерного гена Prx VI крысы в Р pastoris был выбран вектор рР1С9, включающий в себя сигнальный 86-членный а -пептид кислой фосфатазы дрожжей, обеспечивающий секретируемый синтез продукта Трансформацию клеток GS115 (his4) предварительно линеаризованной (с помощью BglII рестриктазы) экспрессионной плазмидой pPIC9-28kD(rat), любезно предоставленной доктором JI Бриандом (Институт национальных агрономических исследований, г Жуи-Жуза, Франция), проводили методом электропорации Отобранные клоны с Н^Ми^-фенотипом использовали для культивирования в инкубаторе Aerotron (Infors, France). Культуральную среду осветляли центрифугированием, диализовали и анализировали с помощью анионообменной хроматографии (рис 8) Фракции, содержащие рекомбинантные белки, мигрирующие в ПААГ в присутствии SDS с кажущимися молекулярными массами ~ 28 кДа, обессоливали и лиофилизовали

В результате этого разделения было получено два образца (объединенные пробирки 3 и 4 и 7-10, рис 8) рекомбинантных препаратов белков, со следующими, соответственно, N-концевыми последовательностями

-9 -1 +1

(I) GluGluGlyValSerLeuGluLysArg/ProGlyGlyLeuLeuLeuGlyAspGlu... (И) ProGlyGlyLeuLeuLeuGlyAspGIuAlaProAsnPheGluAIa

Рис. 8. Анализ культурапьной среды дрожжевых клеток, трансформированных экспрессионной плазмидой рР1С9-28 кВ(гаЦ; ( а ) - хроматографическое разделение с помощью С>АЕ-Вайдека; (б) - электрофореграмма полученных фракций

При сравнении этих данных с аминокислотной последовательностью Prx VI стало очевидно, что препарат белка (II), имеющий N-концевой остаток Pro, скорее всего, является наиболее близким рекомбинантным аналогом Prx VI, а другой полипептид (I) - удлиненным вариантом Prx VI, который содержит на N-конце молекулы 9-членный неотщепленный фрагмент сигнальной последовательности.

Для подтверждения того, что наработанный белок (II) является генно-инженерным пероксиредоксином крысы, было проведено масс-спектрометрическое исследование продуктов расщепления этого белка трипсином и бромцианом. В этих экспериментах, проведенных совместно с Институтом национальных агрономических исследований (Франция, г. Жуи-Жуза, лаборатория структурных белковых исследований, зав. лаб. проф. Дж. Пернолетт), было установлено, что полученный препарат белка является аналогом пероксиредоксина VI крысы, и что в его составе присутствует гликозилированный остаток Asn16, причем количество гексозных остатков в его гликановой цепи варьируется от 9 до 14.

^ GlcNACjHexS-li PGGLLLGDEA PNFEANITXG HIR/FHDFLGO SWGILFSHPR/ DFTPVCTTEL SO

GR/AAK/IAPEF AK/R/NVK/LIAL SIDSVEDHFA WSK/DINAYNG AAPTEK/LPFP 100

IIDDK/DR/DLA ILLGMLDPA2 K/DEK/GMPVTA R/WFIFGPDK/ K/LK/LSILYPA 150

TTGR/tiFDEIL R/WDSLQLTA SSPVATPVDW K/K/GE5VMVLP TLPEEEAK/QL 200

FPX/GVFTK/EL PSGK/K/YLR/YT PQP <223)

Рис. 9 Схема анализа рекомбинантного препарата Ргх VI, полученного в эукариотичской системе дрожжей Р раБйгк Красным цветом отмечены фрагменты, выявленные с помощью масс-спектрометрического анализа в триптическом гидролизате белка, а зеленым - пептид, идентифицированный после расщепления белка бромцианом Участок гликозилирования отмечен стрелкой Для удобства выделения участков действия трипсина в первичную структуру Ргх введена косая черта Вертикальной стрелкой отмечен модифицированный остаток Абп16

' 1

„I___

Л—Л

Рис. 10 Масс-спектр природного Ргх VI, выделенного из обонятельного эпителия крысы

Схема анализа рекомбинантного Ргх VI крысы представлена на рис 9 В экспериментах т vitro ни пероксидазной, ни протекторной активностью этот препарат практически не обладал (-2- 5 % от природного)

Единственным существенным структурным отличием рекомбинантного препарата от природного, которое могло бы быть причиной резкого падения активности, может являться наличие гликозилированного остатка Asn16

Для подтверждения этого предположения был проведен масс-спектрометрический анализ природного Ргх VI, выделенного из обонятельной

выстилки крысы (рис. 10). Как видно из этого рисунка, молекулярная масса природного препарата (24680 Д) практически полностью совпадает с расчетной (24630 Д), т.е природный пероксиредоксин VI пост-трансляционно не модифицирован.

Рис. 11. Спектры КД в дальней УФ-области пероксиредоксинов VI: природного крысы (Nat), рекомбинантного крысы (Pichia) и рекомбинатного пероксиредоксина человека (Е. coli).

Только конформационными затруднениями, вызываемыми наличием гликановой цепи вблизи активного центра Prx (Cys 46), вряд ли можно объяснить почти полное отсутствие функциональной активности у рекомбинантного препарата. Поэтому было высказано предположение, что дополнительное введение гликановой цепи в процессе трансляции существенно изменяет пространственную организацию белка и препятствует правильному сворачиванию молекулы. Для подтверждения этого предположения были проведены сравнительные спектральные исследования конформационного состояния различных образцов Prx VI (рис. 11).

Даже простой визуальный анализ спектров КД исследуемых образцов белков, снятых в неденатурирующих условиях, показывает, что рекомбинантный полипептид, полученный с помощью эукариотичской дрожжевой системы Р. pastoris, деструктурирован, не имеет выраженной вторичной структуры и не находится в конформации, необходимой для проявления ферментативной активности белка. Поэтому дальнейшие эксперименты по получению функционально активного препарата Prx VI человека было решено проводить с помощью прокариотической системы экспрессии в Е. coli.

Экспрессия кДНК пероксиредоксина VI человека в прокариотической системе

Echerichia coli

Полноразмерная кДНК пероксиредоксина VI человека НА0683 (ORF6, любезно предоставлена С.И. Фейнстейн, США) была клонирована в вектор рЕТ23-а(+) по сайтам рестриктаз Ndel-EcoRl. Для последующей работы была отобрана плазмида pET23-a(hPrxVI), содержащая под контролем промотора фага Т7 открытую рамку считывания, включающую в себя инициаторный ATG -кодон, кДНК Prx VI человека и стоп кодон ТАА. Полученная плазмида была использована для трансформации клеток Е. coli BL21.

Рекомбинантный белок с молекулярной массой, соответствующей ожидаемой, был обнаружен во фракции водорастворимых белков, полученной после разрушения клеток с помощью ультразвука.

7-, г - не

J|| . -юг

j§ 7:

||1 ■ _gti

■Iis ш>.

Щ, — 2Ь

В ..... 14.4-

100

2

I

50 100 150

[Белок], мкг/мл

ЭОО

Рис. 12. Электрофореграмма (а), вестерн-блот (б) суммарных белков клеток Е. coli штамма BL21, содержащих плазмиду pET23-a(hPrxVI), через 4 ч после индукции IPTG (колонки 1) и препарата полноразмерного рекомбинантного белка (колонки 2) после двух стадий хроматографической очистки. Цифры в середине - молекулярная масса белков-маркеров. Стрелкой указано положение рекомбинантного Prx VI человека. Сравнение протекторных свойств природного («1») и рекомбинантного пероксиредоксинов VI («2») - (в).

Поскольку степень гомологии аминокислотных последовательностей крысы и человека составляет 92 %, вестерн-блот анализ очищенного рекомбинантного белка человека (рис. 12) с использованием поликлональных антител кролика к природному Prx VI крысы свидетельствовал о том, что белок, мигрирующий при электрофорезе в ПААГ в присутствии SDS с кажущейся молекулярной массой 28 кДа и концентрация которого резко возрастала в клетках Е. coli после индукции IPTG, является Prx VI человека (hPrx VI). Для дальнейшего изучения свойств рекомбинантного белка он был получен в препаративном количестве и очищен с

с помощью двухстадийной хроматографии согласно методике, разработанной ранее для выделения природного белка из обонятельного эпителия крысы (ЭЕАЕ-Сефацель и Сефакрил 8-200). Выход электрофоретически чистого белка достигал 60 мг из 1 л культуры.

о го *0 бо еа 1оо 120 чо Concentration of proteins ty/jiuMj

Рис. 13. Информационная структура Prx VI (а) и электрофореграмма суммарных белков клеток Е. coli штамма BL2I, трансфецированных плазмидами pET23-a(hPrxVI), pET23-a(hPrxVIA178) или pET23-a(hPrxVIA124) (б). Протекторные свойства полноразмерного рекомбинантного пероксиредоксина VI человека и его фрагментов по защите глутаминсинтетазы Е. coli от инактивации в модельной окислительной системе in vitro (в).

Для подтверждения того, что полученный в клетках Е. coli рекомбинантный Ргх находится в нативной конформации, было проведено сравнение его спектра КД со спектром природного белка крысы (рис. 11). Эти данные указывали на присутствие выраженной вторичной структуры в обоих полипептидах. Поскольку природный и полученный с помощью прокариотической системы экспрессии рекомбинантный пероксиредоксины содержат примерно одинаковое количество и сс-спиралей (-38%), и ß-структуры ( ~ 31%), конформационное состояние этих белков можно охарактеризовать как одинаковое, т.е. этот рекомбинантный белок , очевидно, находится в нативной конформации.

С использованием теста по защите от инактивации глутаминсинтетазы в модельной окислительной системе была проверена протекторная активность рекомбинантного препарата (рис. 12, в). В качестве положительного контроля в

этом эксперименте был использован природный Ргх VI крысы. Значительный протекторный эффект рекомбинантного Ргх VI человека был обнаружен уже при концентрации белка 25 мкг на 1 мл (сохранялось 40% активности глутаминсинтетазы), а при концентрации 100 мкг активность глутаминсинтетазы сохранялась практически полностью, что сравнимо с данными, полученными при исследовании природного белка крысы В настоящее время биологически активные препараты Ргх VI человека синтезируются только в прокариотической системе

Для усиления фармакологического воздействия лечебной композиции, в состав которой входит Ргх VI человека (увеличения клеточной проницаемости белка), было желательно укоротить его полипептидную цепь, те создать функционально активный делеционный мутант белка Мы воспользовались теоретическим расчетом «информационных структур» и выяснили, что Ргх VI условно можно разделить на 4 доменообразующие области («Ш1С»- ассоциации, рис 13, а) Учитывая тот факт, что активный центр белка расположен в >1-концевой области молекулы (отмечена красным на рис 13, а), в прокариотической системе Е соЬ были синтезированы фрагменты, укороченные как бы «подоменно» последовательно с С-конца полипептидной цепи ЬРгх VI ЬРп^1 Д178 - минус одна ГО1С- ассоциация (отмечена фиолетовым) и ЬРгхVI Д 124 - минус две ГО1С- ассоциации (фиолетовая и зеленая) На рис 13 (в) приведены также результаты анализа протекторной активности синтезированных препаратов Защитный эффект наблюдался только в случае использования ЬРгхVI Д178 Белок, кодируемый ИРгхУ1 А 124, пероксидазной активностью (и, как следствие, протекторной) не обладал Полученные данные ставят под сомнение имеющиеся в литературе данные о том, что для проявления ферментативной активности 1 -Суэ-содержащих пероксиредоксинов (те Ргх VI млекопитающих) необходимо существование димерной формы фермента, образованной по типу «голова к хвосту»

В настоящее время белок, соответствующий последовательности 1-177 полипептидной цепи Ргх VI человек, наряду с полноразмерным вариантом используется в составе композиций, разработанных в ИБК РАН для лечения ряда заболеваний, связанных с нарушениями редокс-баланса в органах дыхательной системы

2. 8ес14р-подобный белок обонятельного эпителия крысы 2.1. Очистка и идентификация в обонятельном эпителии крысы хитиназы УМ-1

Первым шагом в серии исследований по идентификации другого мажорного белка выстилки, составляющего значительную часть (~2%) всех водорастворимых белков этой ткани и дающего положительный сигнал к антителам против общего консервативного для всех О-белков участка

(CGAGESGKSTIVKQMK), было получение его в гомогенном состоянии После двух стадий хроматографической очистки (ионообменной и ситовой) при электрофоретическом анализе в ПААГ в присутствии SDS он выявлялся в виде индивидуальной полосы с кажущейся мол м ~45 кДа («р45») Эта полоса имела на N-конце остаток Туг После денатурации и обработки 4-винилпиридином была установлена ее N-концевая последовательность, содержащая 10 аминокислотных остатков

Tyr-GIn-Leu-Met-Cys-Tyr-Tyr-Ser-Trp-Ala-...

Для идентификации и выявления предполагаемой функции этого белка он был подвергнут расщеплению Glu- специфичной протеиназой из S aureus С помощью офВЭЖХ из стафилококкового гидролизата этой белковой материи был выделен ряд индивидуальных фрагментов Стафилококковые пептиды(С1-G4), чья аминокислотная последовательность была однозначно определена, представлены в таблице 2

Таблица 2. Аминокислотная последовательность пептидов, выделенных из стафилококкового гидролизата белка, мигрирующего с кажущейся массой 45 кДа

Шифр пептида Аминокислотная последовательность Местоположение в цепи белка YM-1

G1 (E)AMLRKYME

G2 (E)ITYTHE 44-50

G3 (E)MRKAFE 141-147

G4 (E)GATE 292-296

При сравнении полученных данных со структурами, хранящимися в базах данных, был обнаружен гипотетический белок, структура которого содержала 3 из 4 искомых участков (02-С4) и чья №концевая аминокислотная последовательность полностью совпадала с ранее определенной Этот полипептид был зарегистрирован под названием «УМ-1» (СепВапк М94584, рис 14) и включал в себя последовательность, характерную для хинолитических ферментов (хитиназ, гликогидролаз семейства 18)

Несмотря на отсутствие хитина в организмах млекопитающих, к настоящему времени у крысы, мыши и человека обнаружен целый ряд гомологичных ферментов, имеющих подобную УМ-1 аминокислотную последовательность и объединенных в семейство хитиназоподобных белков или «СЬРэ» Не все известные представители этого семейства обладают ферментативной активностью, и биологическая роль СЬРб в организмах млекопитающих неизвестна

1YQLMCYYTSWAKDRPIEGSFKPGNIDPCLCTHLIYAFAGMQNNEITYTHEQ

DLRDYEALNGLKDKNTELKTLLAIGGWKFGPASFSAMVSTPQNRQIFIQSV

1НРЬК0УНРПаьт^ВК0УРО8Еа8РРКСКНЬР8УЬУКЕМНКАГЕЕЕ8УЕКВ

1РКЬЬЬТЗТСАОИБУ1КЗСУК1РЕЬЗОЗЬВУЮУМТУВЬНВРКОСУТСЕН

8РЬУКЗРУБ1СК8АПЬКТО8118УККГНСАА8ЕКЬ1УСРРАУСНТР11.80Р

8КТС1САРТ18ТОРРСКУТСЕЗСЬЬАУУЕУСТЕШЕОАТЕУИВАР0ЕУРУА

ЬТвТЫССБЫЛИЗАБСКСРУ378

Рис 14 Аминокислотная последовательность хитиназы УМ-1 Красным цветом отмечены пептиды, идентифицированные в гидролизате препарата белка с молекулярной массой ~ 45 кДа, выделенного из обонятельного эпителия крысы

Важной причиной, обострившей в последние годы интерес исследователей к этой группе ферментов, является тот факт, что развитие многих видов С04+Т(ТЬ2)-зависимых воспалительных и аллергических заболеваний, проходящих с опосредованным участием 1Ь-4 или 1Ь-13, связано с накоплением в слизистых оболочках тех или иных представителей СЬРб

2.2. Установление и анализ полной аминокислотной последовательности р45 из обонятельного эпителия крысы

Поскольку предполагаемая аминокислотная последовательность хитиназы УМ-1 не включала в себя участок, даже отдаленно подобный вТР-связывающему, а выходы фрагментов С2-04 не превышали выхода 01, был сделан вывод, что белковая материя, проявляющаяся при электрофоретическом анализе в виде единичной полосы с молекулярной массой ~ 45 кДа, не является индивидуальным соединением, а представляет, скорее всего, смесь двух полипептидов с приблизительно одинаковыми значениями молекулярных масс и изоэлектрических точек Одним из компонентов смеси является УМ-1, другим (т е «истинным» р45) - неизвестный белок, имеющий, очевидно, закрытый Ы-концевой остаток и содержащий в своем составе участок, гомологичный ОТР-связывающим последовательностям

Удобным способом разделения этой двухкомпонентной белковой смеси оказалась экстракция 0,1 % раствором ТФУ в присутствии 5 % ацетонитрила В этих условиях УМ-1 полностью переходил в растворимую фазу, а выпавший осадок представлял собой другое индивидуальное соединение Гидролиз очищенного таким образом р45 лизинспецифичной протеиназой из ЬуьоЪаМег enzymogenes и разделение полученного гидролизата проводили в обычно принятых условиях В этих экспериментах однозначно было идентифицировано 5 фрагментов белка (Ы-Ь5), причем структура пептида Ы перекрывалась с последовательностью 01

На основе структур L1-L5 не удалось сконструировать достаточно специфичные олигонуклеотидные праймеры, необходимые для проведения следующих этапов работы Поэтому для получения дополнительных данных об аминокислотной последовательности р45 было проведено его расщепление Glu-специфичным ферментом из Bacillus intermedius, любезно предоставленной проф Руденской Г.Н. (МГУ, Москва) Согласно литературным данным, протеиназа из В intermedius сохраняет свою ферментативную активность даже в присутствии 2 М мочевины Это делает ее чрезвычайно удобным инструментом для изучения первичной структуры белков, свернутых в устойчивую глобулу с труднодоступными для гидролиза пептидными связями, хотя специфичность расщепления в этом случае заметно понижается

Полная аминокислотная последовательность двенадцати пептидов и частичная трех, полученных в результате фрагментации р45 протеиназами из L enzymogenes и В intermedius, составляющая в общей сложности более трети цепи р45 (140 а о), представлена в таблице 3

Таблица 3. Аминокислотная последовательность пептидов, полученных при протеолизе р45 протеиназой из L enzymogenes (LI -L5) и В intermedius (В1 - В7)

Шифр пептида Аминокислотная последовательность Местоположение в цепи белка

LI SEAMLRK 52-58

L2 INYGGEIPK 258-266

L3 LISPEELPAHFGGTLTDPD 231-249

L4 FRENVQD 19-25

L5 PLVEVYQEFF 166-175

В1-1 VLTSQR 236-241

В1-2 RYNAH 241-245

В2-1 GNSWK.E 221-226

В2-2 LISPEE 231-236

В2-3 VGDLSPK 5-11

ВЗ YVRDQVKTQYE 269-279

В4 WLR 41-43

В5 VLLPDEGMQKYDEE 383-396

Вб FFGLLEENYPE 174-184

В7 NVQDVLPALPNPDDYFLLR 22-40

Наиболее подходящими для синтеза олигонуклеотидных праймеров оказались пептид В2-1 и фрагменты пептидов ВЗ и В5 В связи с тем, что

взаимное расположение вышеуказанных фрагментов известно не было, на основе структуры каждого из них было синтезировано по паре соответствующих праймеров: прямой (гомологичный мРНК) и обратный (комплиментарный мРНК) (табл. 4). Все возможные сочетания праймеров (4)- (9) были использованы для получения фрагментов кДНК р45 методом ПЦР с использованием в качестве матрицы амплифицированной фаговой библиотеки кДНК на основе вектора ШМ1149 из обонятельного эпителия крысы.

Таблица 4. Олигонуклеотидные праймеры, использованные для получения фрагментов кДНК р45 методом ПЦР

Шифр пептида, № прай- Степень

аминокислотная Нуклеотидная структура мера вырожден-

последовательность ности

В5 5 САТСА0С01АТССА( А/0) 4 4

...БЕОМдКУ... АА( А/ 0)ТА3' 5'СТАТТТТТОСАТ1СС(т/с) ТС (А/о)ТС3 5 4

вз 5 САТСАОСТ1АА(а/0)АС1 6 8

...ОС^КТСЗУЕ СА(а/О)ТА (т/С)ОА3 5ТТСОТАТТОЮТ(т/с)ТТ1 АС(т/С)ТО(а/0) ТС3' 7 8

В2-1 5001АА(1/с)А0(|/С)Т00 8 8

GNSWKE АА(а/0)ОА3' 5ТТСТТТССАОСТ(а/О) ТТ(°/а/Т/С)СС3" 9 8

Воспроизводимые результаты были получены в случае использования для ПЦР праймеров: (5) -(8), которые на схеме строения кДНК исследуемого белка обозначены как I -IV (рис. 15).

>¿8 -

Рис. 15. Схема строения кДНК р45 из обонятельного эпителия крысы. Представлено относительное расположение клонированных фрагментов кДНК клонов Хг2.2, Ы.1, АлТ7.1, А.Г22.1, к35.2 и ПЦР-фрагментов А, В и С. Черный прямоугольник соответствует кодирующей области, белые - 5' и 3'-нетранслируемым областям. Стрелками обозначены положения на цепи олигонуклеотидных праймеров (I)- (IV), использованных для синтеза ПЦР-фрагментов кДНК.

Соответствующие продукты ПЦР были обозначены А, В и С (рис 15) Амплифицированные фрагменты кДНК А (~180 п о), В (~520 п о) и С (~360 п о) были клонированы в плазмиду pGEM-5Zf(+), выделены и отсеквенированы Открытая рамка считывания продукта ПЦР (А) кодировала аминокислотную последовательность, включающую в себя структуры пептидов В2-1, В2-2, L3, L2 и ВЗ, (В) - В2-1, В2-2, L3, L2, ВЗ, Bl-1, В1-2 и В5, (С)- ВЗ, Bl-1, В1-2 и В5 На основании этих данных был сделан вывод, что все три проанализированных продукта ПЦР представляют собой фрагменты кДНК р45

Идентификацию рекомбинантных бактериофагов A.NM1149, содержащих кДНК р45, проводили гибридизацией in situ фаговых бляшек со специфическим ДНК-зондом, в качестве которого использовали [а-32Р]-меченый ПЦР-фрагмент С кДНК р45 В результате моноклонизации было получено пять индивидуальных клонов Хг2 2, А.г41, 1.гП 1, Ъ221, Х.г35 2, вставки кДНК которых были отсеквенированы

Клон 1x2 2, содержащий вставку кДНК р45 с максимальной длиной, имел открытую рамку считывания, кодирующую полную структуру р45 (рис 15) Вставки остальных были короче, и в них отсутствовала последовательность, кодирующая N-концевую область белка Полученная нуклеотидная последовательность и выведенная из нее структура р45 представлена на рис 16

Триплет ATG, находящийся в положении 1-3, имеет окружение специфическое для точки инициации трансляции и является, по всей вероятности, инициирующим кодоном Открытая рамка считывания между нуклеотидными основаниями 1 и 1200 кодирует полную 400-членную аминокислотную последовательность р45 Все последовательности, выявленные при анализе протеолитических пептидов, кодируются этой открытой рамкой считывания Без учета возможной пост-трансляционной модификации N-концевого остатка Ser, следующего по цепи за остатком Met в молекуле р45, рассчитанная молекулярная масса белка, имеющего остаток Met в качестве N-концевого, составляет 46026 Да Эта величина соответствует подвижности белка, оцененной с помощью электрофореза в ПААГ в присутствии SDS

Белок характеризуется высоким содержанием отрицательно заряженных аминокислотных остатков, рассчитанное значение его изоэлектрической точки составляет 5,7 и в своем составе содержит участок (262-275), подобный GTP-связывающим участкам регуляторных G-белков

Семейство GTP-связывающих белков довольно многочисленно Помимо вышеупомянутых G-белков, наиболее изученными его членами являются транскрипционные факторы, участвующие в биосинтезе белков, протоонкогенные ras-белки, продукты генов rab, rho, гас, известные как «малые G-белки», тубулин и некоторые киназы

Поскольку функциональная роль р45 в клетке неизвестна, способность поликлональных антител (полученных против синтетического пептида, общего для альфа-субъединиц G-белков) взаимодействовать с р45 пока не может быть весомым аргументом в пользу отнесения этого белка к семейству GTP-связывающих

т0с<л10сстоттсастгастсстсатсл0тстсл<1са0с -i

атплотосххолаттоолсысс'юлскх-ссллс^аоск-ла^ 75

м s е к v: о: рt::*; г. ж. о а к тс а к f к к h..V..O.d S5

отоепххх-САХСТоссллАсесто^ i w

«.TU:. > * '« и i г f лзг : у • т' хге ■ * ь arnfdlo »

л^тслолг^<слтг^сспсллотаслтс«лсгггссс«ллплсслтсолслттс1а1слсатсс гталстоосла 21}

К l<t.M'altW.»,»l«r»C Y М К И К К Г М D 1 I)H t LOW«} 7S

ссссслслоа'шлтсх'лсь^лотлслтиссссоасялстчлх^ kxjciл гьлссоосасмхп «.ссюклш а ! h»l

г Р с Ч iqkymroolcoynsßcicfvwy Ii»

олслгслтсиосссастсйлессс^чалмюекхтгпстс 37s

0 1 larLOPKCt«,13Vr«CqOSJLKTKM ш

AGGGACTOTGAACGTATCCnraACGAOTGTGACCTGCACrtCAGAGCGCKra<»^ «ТО

RDCCRILH&CDLQrERL<fKK.IB 11 V 15l>

а10лтатпаастагоааскп«0<жас1х!аас.с^^ sji MlrDCCOLGLIinrwKPLVEVYQCrif

<х<сск,"^поааоа«аатгассса0аоассс голаштсатос! сатготолалосслсч; аллстог гсссс010 i.oo

О i. . t. e В Я -Г r.:t 71 К ► M l I VKATKL» »»V MO

<хкгтасаасстсатоаа(лссатт<^тоа<лхзаос1аса£а^с(<«а<юааоаттотаотйтгсюоааасаястпоааа 675

OYNLMKrFLSBDTRKIC I! .V U.t' »O.« I« .W ' К JM

а«асютггосто*аастсатс,у^с^ 75я

алтссса\ататпаассалоа1х.аастлсчхгг<аа>оаоаггсм^ гс>ало sj5

к, »,„m с t т к frytt,?ж>,r-t?..„.iü.,,e.....л,.....,г„.,„к ч м /*.»*.. л;.«, у.»к г»

АСХХА<тТЛТОАСКАСТХ:(ЮТОСАОАТТЛ<^ССХЧЛ>СТХ:СТ1ХХ-Л7САО(}ТСОЛАТАСаЛаЛТСС1 огтссслоас иш

f. ÄÄVfÄ н » V q i 3KOSSHQVEVE l i F f о ж»

тосот«лх:ааот*юслсгпстсатстоатгк5лссаоаслт1г«^^ 975

CVLRWQJSäUGADlCFÜVt-LKTKM« иs

CiAGAOGCAQAAtKJCACWCWAClATQACCOAOOTOCTAACCAGCCAOCOCTACAATGCCCACATGQTOCCTOAööAT <MÜ

M T E V L

q r y N a ii mv рг

GSllgTrAOVYVLRFDNTYSFVFlAK к V g Г г V L Г. ХчС. K^jJ. «.W.'.KwttV n с 1 т p i

ТА«5ТСЮЛССССССАСТТСТСАС!АаАС«Х;ЛСаС1 С!Г>ТГГТСССТСГГСТС1ГСТТТСАПССТАААССТО VTC

III! j7j

IJ®

■»1

1275

I»»

ЛТГлт-СС1аоСГ1АСТСТсиОАСАССА«ТГ,СЖ AATiTxrAAAATOACGAAAGOTIGGAG<^ATAAAGATlX3CAAAA(>AJ3AAAOAAGCACO\OCAAAAGACAGAAOATO H2S

«МО

1 ш

Рис 16 Нуклеотидная последовательность кДНК р45 из обонятельного эпителия крысы и реконструированная полная аминокислотная последовательность белка Участки, соответствующие пептидам с установленной структурой, подчеркнуты (Ь1-Ь5) или выделены серым цветом (В1-1-В7) В рамку заключены места отличий структуры ПЦР-фрагмента С и кДНК клона Хт22 1 от структуры кДНК других клонов и ПЦР-фрагментов А и В Стрелками обозначены положения нуклеотидных вставок в клоне Хт22 1 В З'-нетранслируемой области подчеркнут ГО элемент, сайт полиаденилирования обозначен ромбами

р4 5 1 *SGIfVGmi---fcï>KÔAETJJUCFRENVQD...........

hTAP 1 1К0ЩРPL --IjRgKEAtAISFKENVaD..........

RALBP " " jjSLU-EQÎJGADTI.

SEC14 22 LPÏjTPgNÊ---DSAQEKAiAELÎ!KLLEE)-..........A-GFIERÛ>ÔSTMtFlJUUUCWVQLAKE0FENCEKWI(-j<DYGTÇT|

a-TTP 10 VGKOLNEQPDHSfLVQPGUiELIlERAilEEG---......VPETPQPLTÇA>Ii*FL1UJiDïï>lDLAWRLHKKYYKWJiAECPELSAD

CRALBP 4 5 LOKAKDE£№KEETRE^VRELQËLVQAOAASGEELAIJ\^AERVQAR^SAIbti^FI|EASKrSVGRAYELl>KGYVNF|CLQYPELFDS

p45 72 £-|--W&PPE-%QKYMPG&Î^Rib<ÂPVtfYmi№

hTAP 72 I-S--f®PFE-VIQQYLSGaM»3YI)ÛD<KPVWÏDnGPIffiKG«JSASK<№L^

RALBP 13 IAE- -YTpPD-|/XÛKFMT(^D^HDKt>GSVLRIEPWQyl4DMKGIMY^CKlÇSDLEIÎSÎ(LLQCl!KHIjK DLEAQSËKVQKPCTGLTW SEC14 92 tQÔFHYDEKP-L^FYi'QYYHKTBKJXffiPVYFEEI^AVlMEfMKVTC^

a-TTP 87 b-H--PRSILGLLKAGYH!!VLRSRBPTOSRVLIYRÎSYWDP{(----VFÏAYDVFRVSLITS«LrvQ-g--VEÏQRWGVÂA.....|

CRALBP 131 g-S--MEALRCT|EAGYfev|,SSR5KYÇRVyMLFNJE[™HCE----EÄJFDEljQAYCFII^KL^E-N--EEJOINgFCl-----V

p4 5 153 fKS5t^®F«LVMQEFFGll£№PmXFMl3V№W

hTAP 153 raE(MOTMPAVEAÏGEFLCMFEE^m.mFTO»P^^ RALBP 95 pMENVgSßMWgGLDMILYLVQ^EDtTOEN^LFVI^

SEC14 177 mLKeiSISSAYS-VMSYVRÊASYISQN^PpMGKFY|lKAPFGFSTAFR|F10Pn,DPVjVSjaFI|^s5YQKEI^Q|PAENX4

a-TTP 158 ÇXLEdWQISSAFQITPSVAKKIAAVWDSFPLKWGIHLIÎffiPViyHAVFSMIICPPI(TËKIKGRJHLHGMNYKSSlJjQHF-l1DIIj^

CRALBP 202 ENFKGFTMQQAAGLRPSDLKKMVD^QDSF|»ARF^IHFIHQPWYI^TT|Î|V1^

a™ peptiâe G^SSGÔTIKK-M

p45 239

hTAP 239 VEYOGTfaBPDGrorCKSpNYG®IPRKYYVI^^QQY£H^

RALBP 181 gYUMKSE--GDEXÇSELS;CHGCEVplp:F^raT>DFETMETITrê^

SEC14 262 VKFBGKSEV--DES|GGLYLSDII|PWRDPKÎIGPEGEAPEAF|MK "" " "

a-TTP 243 LEYGGNESSMEDI-CQEWT-§F-£MKSEDYLSSISETl|i

CRALBP 287 |mFg^PKY^--jWAEQLF-$PRAEVENTAL

p4 5 325

hTAP 325 {етдаЬйаетэтЛфКЗДЕрЛГтХЩЛСЗООД

RALBP 260 --IraGDlWEÇ^IEgTDCSIMTU^IKgmPtMA&qaîSFSI^

Рис 17 Сравнение полной аминокислотной последовательности р45 со структурами, хранящимися в 5\¥188-Р1ЮТ и вепВапк базах данных Условные обозначения р45 -белок из обонятельного эпителия крысы с молекулярной массой 45 кДа, АЛ32352, RALBP -ретиналь-связывающий белок из японского кальмара, Р49193 , 8ЕС14 фосфатидилхолин/фосфатилинозит-транспортный белок дрожжей, Р24280, а-ТТР -а-токоферол-связывающий белок крысы, Р41034, СКАЬВР-ретиналь-связывающий белок мыши, АР084638 Жирным шрифтом выделены аминокислотные остатки, инвариантные в четырех и более последовательностях, серым - остатки, идентичные остаткам р45 Прочерки введены для оптимизации выравнивания Цифры слева обозначают номера первых остатков в строке последовательности р45

При сравнении полной аминокислотной последовательности исследуемого белка со структурами, хранящимися в базах данных, существенное сходство выявлено между р45 и белками-переносчиками гидрофобных лигандов, например, ретиналь- и a-токоферол-связывающими белками, фосфатидилхолин/фосфатилинозит-транспортным белком дрожжей (Secl4p) (рис 17)

У всех перечисленных на рис 17 белков, включая р45, присутствует консервативный фрагмент Lys-Pro-Phe-Leu (у р45 - в положении 206-209) Кроме того, большинство из этих белков имеет в составе лиганд-связывающих участков консервативные остатки Glu184, Phe198, Leu204, Lys216, lie217 (нумерация аминокислотных остатков приведена для первичной структуры р45) В настоящее время консервативный участок, занимающий ~ 76 - 246 положения полипептидной цепи р45 и характерный для многих липид-переносящих белков,

называют «5ЕС14»-доменом по названию дрожжевого белка Secl4p, в котором он впервые был обнаружен.

Белки, имеющий в своем составе этот домен, также часто называют Secl4p-подобными или «SFH» (Sec Fourteen Homology). Этот же домен, идентифицированный у ряда млекопитающих, иногда обозначают как «CRAL TRIO».

Исходя из полученных данных по аминокислотной последовательности, была рассчитана вторичная структура р45 из обонятельного эпителия крысы. Характерное чередование элементов вторичной структуры дало возможность идентифицировать участок 265-381 последовательности цепи белка как GOLD домен (рис. 18), определяющий, согласно литературным данным, белок-белковые взаимодействия.

5s

0

1 О О

■С

amino acid residue number Рис. 18. Профиль гидрофнльности и доменная организация р45 из обонятельного эпителия крысы.

Структура и функции некоторых представителей 8ес14р-подобных белков хорошо изучены. Но только состоящий из одного SECM-домена («истинный») дрожжевой Secl4p, является липид-транспортным. Многие белки этого семейства имеют мультидоменную структуру и эволюционно приспособлены для выполнения множества функций, таких как передача сигналов, регуляция секреции, взаимодействие клеточных компартментов.

2.3. Локализация места синтеза и поиск возможных биологических

партнеров р45

Для определения места локализации р45 был проведен иммуноблотинг водорастворимых белков различных тканей крысы (обонятельный эпителий, трахея, легкие, мозг, печень, мышца, кожа) с использованием кроличьих поликлональных антител против природного р45.

Как и ожидалось, максимальное содержание исследуемого полипептида обнаруживалось в обонятельном эпителии, несколько меньше - в трахее, легких

и коже. Эти ткани были использованы для проведения in situ гибридизации с целью выявления места синтеза р45. В качестве зондов для экспериментов по гибридизации были получены ["Р]-меченые фрагменты мРНК р45, гомологичные и комплементарные его мРНК (рис. 19).

Рис. 19. Экспрессия мРНК р45 в различных тканях крысы, выявленная методом in situ гибридизации. Визуализация в «темном поле» срезов тканей обонятельного эпителия (А), трахеи (В), легкого (С) и толстой кожи (D), обработанных меченой антисмысловой и смысловой рибонуклеотидной пробой (левая колонка и правая колонка фотографий, соответственно).

Масштабный отрезок 100 мкм.

Наиболее высокий уровень экспрессии был обнаружен в слое эпителия, содержащем тела обонятельных, опорных и стволовых клеток обонятельного эпителия, апикальном районе трахеи, поверхностном слое мерцательного эпителия бронхов и легких и эпидермисе кожи (рис. 19). Таким образом, было показано, что р45 синтезируется именно в тех тканях, где он выявляется иммуногистохимическими методами и, подобно пероксиредоксину VI (р28), является специфичным для эпителиальных тканей, имеющих контакт с окружающей средой. Высокое содержание 8ес14р-подобного белка в этих тканях говорит о его важной роли в обеспечении их нормального функционирования.

Для выяснения функциональной роли р45 в эукариотической клетке в качестве первого этапа исследований был применен один из протеомных подходов - поиск взаимодействующих белков с помощью двугибридной системы.

Наиболее высокое содержание белка было обнаружено в обонятельной выстилке, и, следовательно, исследовать библиотеку кДНК наиболее целесообразно было именно этого органа. Однако с учетом данных по высокому уровню синтеза р45 во всех тканях, контактирующих с кислородом воздуха (в

том числе и в легких), а также того, что библиотека кДНК обонятельной выстилки крысы, пригодная для поиска белков-партнеров, коммерчески недоступна, решено было применить для этих целей библиотеку кДНК легких крысы в составе вектора рАСТ2, специально сконструированную для двугибридной системы В качестве «приманки» при скрининге была использована плазмида рСВТ9(р45), содержащая кДНК р45 - полноразмерного 8ес14р-подобного белка обонятельного эпителия крысы

Предварительные эксперименты показали, что р45 сам по себе не активирует репортерные системы Я/53 и 1ас2, и поэтому поиск его партнеров может быть осуществлен с помощью двугибридного скрининга В результате была проанализирована библиотека кДНК из легких крысы представительностью 7x106 дрожжевых клонов, полученных в результате трансформации клеток 5 сегегшае У190 плазмидами рСВТ9(р45) и суммарной кДНК из легких крысы, клонированной в составе вектора рАСТ2 Дрожжевые позитивные корны (28 клонов), отобранные по способности активировать Я/53- и /яс2-репортерные системы, послужили источником кДНК белков, являющихся предположительными партнерами Бес 14р-подобного белка

Была определена частичная нуклеотидная последовательность отобранных кДНК в составе вектора рАСТ2 и проведен поиск гомологичных структур в базе данных ОепВапк Среди идентифицированных структур наиболее широко представлены белки, имеющие участки взаимодействия с нуклеиновыми кислотами (транскрипционные факторы, рибосомные, участвующие в транспорте нуклеотидов - всего 13 белков) и, в силу описанных их функциональных свойств, отнесенные нами к разряду «ложноположительных»

Шесть наиболее вероятных и отобранных после анализа их структуры, свойств и локализации, функциональных партнеров р45 представлены в таблице 5 Три из них являются секретируемыми, три - мембранными Остальные же белки, по-видимому, напрямую не взаимодействуют с р45 и в нашем случае активируют экспрессию репортерных генов напрямую или за счет непрямых метаболических эффектов

Появление таких «ложноположительных» сигналов является серьезным ограничением метода, и поэтому все обнаруженные взаимодействия должны быть подтверждены, по крайней мере, еще одним независимым экспериментальным подходом

Функции пяти из предполагаемых партнеров р45 достаточно хорошо изучены, а данные о свойствах трансмембранного белка «Тс1е1», который впервые был идентифицирован в неопластических клетках различных структур мозга, начинают только появляться

Из приведенных в таблице 5 белков наиболее интересным кандидатом на роль партнера по взаимодействию с р45 является сурфактантный белок С ^рС), имеющий в своем составе участок взаимодействия с липидом и находящийся подобно р45 в существенных количествах исключительно в тканях, непосредственно контактирующих с окружающей средой Путем понижения силы поверхностного натяжения на границе воздух-вода, БГрС обеспечивает стабильность легочных альвеол, и мутации в гене этого белка связаны с

серьезными легочными заболеваниями Как и БГрС и другие сурфактантные белки, БесМр-подобный белок возможно может принимать участие в формировании примембранного слоя имеющих контакт с окружающей средой клеток, выполняя тем самым их защитную функцию

Таблица 5. Белки - кандидаты на роль функциональных партнеров БесМр-подобного белка

Название белка Номер доступа соответ ствующей кДНК в базе данных GenBank и положе ние участка этой кДНК, идентифицированного программой BLAST Функции белка

Белки, секретирующиеся во внеклеточное пространство

Сурфактантный белок С NM_017342 8-587 Защитная, ассоциированный с липидами белок

Секретоглобин NM_013051 14-463 Защитная, модулятор воспалительных процессов

Хемокин, Сс15 NM_031116 1-278 Защитная, участвует в хемотаксисе, модулятор воспалительных процессов

Мембранные белки

Активатор 2 пресенилина человека, Реп2 NM_172341 194-510 Компонент у-секретазного комплекса, участвующего в протеолизе ряда мембранных белков

Эндоглин BC029080 2060-2551 Компонент рецепторного комплекса трансформирующего ростового фактора (3

Белок 1, дифференцированно экспрессирующийся в неопластических клетках различных мозговых структур мыши, Т(1е1 XM_215930 535-1013 Трансмембранный белок с антиапоптотическими функциями

Поскольку р45 локализован в обонятельном эпителии, который, контактируя с окружающей средой, является и органом периферической иммунной системы, и тканью, содержащей обонятельные нейроны, то не исключено специфическое участие исследуемого белка в иммунной или/и нервной системах Тем более, что уже идентифицированы белки, включающие в себя липид-связывающий БЕСМ-домен и участвующие в различных сигналпроводящих каскадах (тирозинфосфатаза РТР-МЕС2, нейрофибромин, кайтаксин, калирин)

2.4. Исследование липид-связывающей специфичности р45 из обонятельного эпителия крысы

Сравнение аминокислотной последовательности р45 с другими Secl4p-подобными белками (рис 17) позволяет отнести его к группе «ТАР» - белков Название группе было дано по первому открытому представителю - а-токоферол-связывающему белку человека (a-tocopherol-associated jjrotein) Геном человека содержит три ГЛР-подобных гена hTAP, ИТАР2 и ИТАРЗ Они расположены в пределах 100 кб друг от друга на хромосоме 22ql2 1, и сходство между ними составляет 80-90 % Изучаемый БесНр-подобный белок обонятельного эпителия крысы является ортологом ИТАР2

Несмотря на подобие липид-связывающих участков, ТАР-белки проявляют большое лигандное разнообразие Его причины не понятны, но в каждом конкретном случае специфичность связывания, и, следовательно, и механизм функционирования белка в целом, может определяться полярной частью липида, тканевой локализацией белка и его взаимодействием с другими регуляторными молекулами Помимо а-токоферола, для этой группы белков указываются такие лиганды как транс-ретиналь, фосфатидилхолин, сквален, фосфатидилсерин и различные фосфатидилинозитиды Поэтому следующий этап исследования был посвящен определению лигандной специфичности р45 - БесНр-подобного белка обонятельного эпителия крысы

Изучение р45-лигандного взаимодействия на нитроцеллюлозных пластинках

С помощью метода изучения белок-липидного взаимодействия на твердой подложке («PLO-assay») в предварительных экспериментах по изучению специфичности р45 было показано, что исследуемый полипептид не взаимодействует с а-токоферолом и по данным ТСХ связывается лишь с одной частью общего липидного экстракта выстилки, дающей положительную качественную реакцию на фосфолипиды

Идентификация фосфолипидного лиганда р45 осуществлялась с помощью PLO-assay на мембране PIP-Strips™ (Echelon, США) Она представляет собой специально армированную нитроцеллюлозную пластинку, на которую нанесены практически все встречающиеся в эукариотических клетках фосфолипиды в количестве по 100 пмоль на одну точку Обработку мембраны растворами р45 в концентрации 50 и 10 нмоль проводили в двух повторах (рис 20) Детекцию связавшегося с липидами белка осуществляли иммунохимической реакцией с использованием поликлональных антител к р45 с последующим проявлением комплекса методом хемилюминисценции

Q природный

50 «М

рекомбкнантиый р45 50iiM

IPA S1P LPA fip

LPC Pldbts{3,4)Pj LPC '* fjf: |PtdlrisC3,4)P.

Ptdta Ш Ptdfns(3.5)Pa Pidlns f> ♦ rPidM3.S)P2

Ptdins(3}P гйМг РиШв(4.5}Р2 PtdInsi3)P ■f j PUtov4.5;iP.

Р1сШк(4)Р Ptd?»s(S)P ' 1 Ptd]ns(3,4,S)P3 PtdA PtdIns(4)P ptdte(5)p i | Ptdbis(3,4,5)P3 ' PtdA

PttffitXib 1 PtdSer PtdEtKH. PtdSer

PtdCho blank Ptacho blank

пр»»родный р45 10 ИМ

релймбмнаиншй р45 10 иМ

ЬРА

lpc

PuttnsCJJP I pt<ais(4jp| Ptdtas(5)P | PriBiNlJ PtdCho

SIP LPA pip

И<)Ы$(3,4)Рг LPC : Ptdb.M.W.

Pldlns<3.5)Pj Ptdlns !PtdEns(3,55Pj

Ptdlns{4.5)Pj Ptdfas(3)P tj Pstltas(4.S)Pi

Ptdlmi.X4.5)P3 Ptdtas(4)P : Ф Ptdi»s(.V>.S>>)

J

PtdA PtdIns(5)P \ r.ps. PidA

PtdSer Itdl-tMl; ■;|.1i: PtdSer

blank PldChoI blank

Рис. 20. Исследование липид-связывающей специфичности 8ес14р-подобного белка из обонятельного эпителия крысы на нитроцеллюлозных мембранах. Мембраны с набором липидов были обработаны в двух повторах (по 50 (а) и 10 нМ (б)) растворами, содержащими природный или рекомбинантный белки. Использованы следующие сокращения названий фосфолипидов: фосфатидилинозит (Ptdlns), фосфатидилинозит-3-монофосфат (PtdIns(3)P), фосфатидилинозит-4-монофосфат (PtdIns(4)P), фосфатидилинозит-5-монофосфат (PtdIns(5)P), фосфатидилинозит-3,4-дифосфат (PtdIns(3,4)P2), фосфатидилинозит-3,5-дифосфат (PtdIns(3,5)P2), фосфатидилинозит-4,5-дифосфат (PtdIns(4,5)P2), фосфатидилинозит-3,4,5-трифосфат (PtdIns(3,4,5)P3), фосфатидилэтаноламин (PtdEtNH2), фосфатидилхолин (PtdCho), фосфатидилсерин (PtdSer), лизофосфатидовая кислота (LPA), лизофосфатидилхолин (LPC), сфингозин-1-фосфат (S1P), фосфатидовая кислота (PtdA). (blank) -место для нанесения дополнительного контрольного образца (в нашем случае не наносился).

Здесь необходимо заметить, что для большей убедительности в опытах по идентификации лиганда помимо природного белка использовались также препараты генно-инженерного, с аминокислотной последовательностью,

полностью идентичной природной, и специально синтезированного в клетках Е coli для этих целей

Как видно из рисунка 20 в обоих случаях самую высокую аффинность р45 проявлял к PtdIns(3,4,5)P3, хотя при большей концентрации белка положительный сигнал, хотя и в меньшей степени, давали и другие фосфолипиды При понижении концентрации р45 в инкубационном растворе специфичность взаимодействия возрастала (рис 20, б), и как выделенный из обонятельного эпителия белок, так и полученный генно-инженерным путем связывались практически только с PtdIns(3,4,5)P3

Изучение взаимодействия р45 с (ЬосФатидилинозит-3,4,5-трифосфатом

В биохимических исследованиях широко используются твердые подложки на основе нитроцеллюлозы как место образования липид-белковых или белок-белковых комплексов Но, учитывая возможность неспецифического взаимодействия белка с нитроцеллюлозой, а также литературные данные о выявлении других фосфолипидов в качестве лигандов SecMp-подобного семейства, было решено подтвердить взаимодействие р45 и PtdIns(3,4,5)P3 с помощью метода коседиментации

Липосомы были приготовлены из смеси PtdEtNH2 с PtdCho (4 1) в органических растворителях, добавлением к ней необходимого количества трифосфата К этим липосомам, содержащим 0, 0,25 или 0,5 % PtdIns(3,4,5)P3, добавляли водный раствор р45, специально выделенного для этих целей из обонятельного эпителия крысы Полученную суспензию энергично встряхивали, а затем с помощью центрифугирования разделяли на липидную (осадок) и водорастворимую (супернатант) фракции Анализ и идентификацию связавшегося с трифосфатом белка осуществляли с помощью иммуноблоттинга с хемилюминесцентным детектированием (рис 21) Для повышения достоверности анализа вьивление р45 в белок-липидном комплексе было проведено с помощью моноклональных антител (в частности, мАТ 1F4C1), специально полученных для этих целей

Как следует из рисунка 21, в случае отрицательного контроля, когда липосомы не содержали PtdIns(3,4,5)P3, белок обнаруживался только в супернатанте, т е связывания р45 с липосомами не наблюдалось При увеличении содержания трифосфата в липосомах до 0,5 % происходило явное образование комплекса белка с липидом, и после его осаждения центрифугированием р45 обнаруживался уже в осадке Таким образом, было получено еще одно доказательство специфического связывания р45 с PtdIns(3,4,5)P3

*тшт

р45 с_о с_о с_о

О % 0,25 % 0,50 %

Содержание PtdIns(3,4,5)P3 в липосомах

Рис. 21. Иммуноблот-анапиз связывания р45 обонятельного эпителия крысы с Ptdlns(3,4,5)P3 при его различном содержании в липосомах с использованием мАТ 1F4C1. Буквами «о» и «с» обозначены фракции супернатантов и осадков. Концентрация мАТ 1F4C1 составляла 1,5 мкг/мл, разведение вторичных AT - 1:5000. Стрелкой указано положение р45.

Вышеизложенные методы нахождения специфичных лигандов липид-переносящих белков, по существу, указывают только на сам факт связывания полипептида с лигандом, но способность удерживать лиганд, т.е. транспортная активность белковой молекулы при этом не демонстрируется.

Опыты по выявлению функциональной активности транспортеров обычно проводятся с использованием метки как в составе липида, так и в составе акцепторных липосом. Введение метки обеспечивает меры контроля неспецифического переноса, так как помещенные в модельных экспериментах в одну емкость донорные и акцепторные мицеллы могут контактировать.

Чтобы не использовать радиоактивную метку (для удешевления экспериментов и предотвращения стерических затруднений при связывании, неизбежно возникающих при введении в молекулу лиганда дополнительных реперов), был разработан новый подход изучения липид-белковых взаимодействий in vitro, позволяющий определять транспортную активность белка. Метод можно классифицировать как вариант распределительной трехфазной хроматографии, включающей две неподвижные, не контактирующие между собой фазы («донорную» и «акцепторную») и одну подвижную. Исследуемый белок, растворенный в водной подвижной фазе, с помощью насоса прокачивается через два заполненных носителями резервуара и может осуществлять доставку специфического липида в акцепторный липидный слой. Переносимый липид идентифицируется в липидных экстрактах акцепторного слоя носителя и в подвижной фазе. Техническая реализация метода предусматривает использование двух резервуаров, содержащих используемые в качестве твердой подложки для полимерного слоя стеклянные бусинки сферической формы (рис. 22).

Рис. 22. Схема метода изучения липид-белковых взаимодействий. Д-резервуар, содержащий донорную фазу, а А-акцепторную. эД, эА и эВ -липидные фракции экстрактов Д, А и подвижной водной фазы В, соответственно. Показаны результаты обнаружения РкИпз(3,4,5)Рз в липидных экстрактах эА, эД и эВ (а). Экстракты наносили на нитроцеллюлозный фильтр и обрабатывали раствором р45 в БЕТ-буфере (30 нМ) с дальнейшим проявлением белка хемилюминисцентным методом. В нижней части рисунка приведен масс-спектр липидного экстракта эА (б). На выноске справа часть масс-спектра с пиком, соответствующим фосфатидилинозиттрифосфату, показана крупно.

На их поверхности создается слой гидрофильного полимера Оставшееся свободным от бусин пространство в каждом резервуаре заполняется специальным раствором липидов в смеси органических растворителей, один из которых смешивается с водой, а другой нет (метанол хлороформ 1 4) Раствор для резервуара Д в наших экспериментах содержал PtdCho и PtdIns(3,4,5)P3 в соотношении 10 1 Раствор для А только PtdCho

Липидный слой формируется на границе раздела фаз воды и органического растворителя После нанесения липидов и формирования липидных слоев каждую часть системы независимо промывали 10 объемами Трис-HCl (рН 7,4) буферного раствора, содержащего сахарозу и EDTA («SET-буфер») Затем обе части соединяли через пористый фильтр, предотвращающий непосредственный контакт бусин В ходе эксперимента через собранную систему пропускали 50 нМ раствор природного БесНр-подобного белка Этот SET-буферный раствор представлял собой подвижную фазу «В» Направление циркуляции подвижной фазы на приведенной схеме (рис 22) показано черными стрелками Затем водную фазу сливали и разбирали систему Предварительно промытые бусины, заполнявшие резервуары А и Д, а также собранную водную фазу В экстрагировали по методу Фолча Полученные таким образом липидные фракции (обозначенные эА, эД, эВ) исследовали с помощью PLO-assay, используя для детекции PtdIns(3,4,5)P3 связывающийся с ним р45 Обнаружение белка на подложке осуществляли с помощью AT Как показано на рис 22, в случае отрицательных контролей (когда подвижная фаза не содержала Secl4p-подобный белок, либо когда вместо него раствор содержал 50 нМ BSA) в липидных экстрактах эВ и эА PtdIns(3,4,5)P3 не обнаруживался

Условия точной масс-спектрометрической идентификации методом MALDI-TOF микроколичеств переносимого лиганда во фракциях эВ и эА были разработаны с участием к б н В Е Третьякова (ФГУ НИИ ФХМ)

Таким образом, на примере исследования транспортной активности р45 была продемонстрирована применимость новой методики и подтверждено, что гидрофобным лигандом р45 - БесНр-подобного белка обонятельного эпителия является PtdIns(3,4,5)P3

2.5. Экспрессия кДНК 5ес14р-подобного белка и его фрагментов в клетках COS-1, колокализация белка и липидного лиганда

Ранее было предположено, что в обонятельном эпителии р45 локализован в секреторных гранулах бокаловидных клеток и в прилегающем слое слизи, окружающей обонятельный эпителий Однако из этих исследований не было ясно, является ли р45 действительно активно секретируемым или он пассивно высвобождается при разрушении назальных клеток Обычно секретируемые белки синтезируются в виде предшественников, содержащих отщепляемый N-концевой сигнальный пептид с характерным аминокислотным составом, однако такая последовательность в цепи р45 не была обнаружена Дальнейшие исследования по изучению внутриклеточной локализации белка и его

секреторных путей были проведены совместно с проф. Т. Мустелиным в Раковом центре Института Бурхама (Калифорнийский университет, США) с помощью конфокальной микроскопии.

клетки среда 12 3 4

Рис. 23. Иммуноблотгинг клеточного лизата (дорожки 1 и 2) и культуральной среды (дорожки 3 и 4) С05-1 клеток, трансфецированных конструкциями рПРЗНАСОШ (дорожки 1и 3) и рЕРЗНА_5ЕС14 (дорожки 2 и 4)

37~?

0819-

9"1 чшшш.

вес 14

GOLD

1 О "....." '

Для решения этого вопроса фрагменты кДНК, кодирующие отдельные домены (SEC 14 и GOLD) SecMp-подобного белка, были экспрессированы в эукариотических клетках (клетки COS-1). В этих экспериментах были использованы генно-инженерные конструкции на основе экспрессирующего вектора для животных клеток pEF3HA. Полученные с его помощью продукты экспрессии имеют в своем составе НА-эпитоп (Anti-influenza Hemagglutinin) и могут идентифицироваться с помощью мАТ. Для детекции НА-эпитопа под конфокальным микроскопом также коммерчески доступны мАТ, конъюгированные с флуоресцентным красителем

тетраметилродаминизотиоцианатом (TRITC, красное окрашивание).

Клетки COS-1 были трансфецированы конструкциями pEF3HA_GOLD и pEF3HA_SEC14. После наращивания клеток белковые продукты, кодируемые этими конструкциями, были обнаружены и в клетках, и в среде культивирования. Результаты идентификации нарабатываемых пептидов приведены на рисунке 23. Поскольку в культуральной среде присутствовал только SECM-фрагмент белка, был сделан вывод: экстрацеллюлярная секреция исследуемого белка определяется его липид-связывающим доменом, который так же хорошо может секретироваться, как и полноразмерная цепъ.

Внутриклеточная локализация р45 устанавливалась с помощью экспериментов с конструкцией, включающей в себя полноразмерную кДНК р45 (pEF3HA_p45) и «пустой» вектор pEF3HA. Клетки, несущие эти конструкции, были иммунологически окрашены и проанализированы под конфокальным микроскопом (рис. 24, а). В случае пустого вектора (рис. 24 а, верхняя панель) экспрессии р45 не наблюдалось, но полипептидная цепь, включающая в себя последовательность р45 и НА-эпитоп (НА_р45), легко идентифицировалась во внутриклеточных везикулах, мембрано-ассоциированных везикулярных структурах и во внеклеточном пространстве.

Присутствие гибридного белка с соответствующей расчетной молекулярной массой (48192 Да) также было подтверждено иммуноблоттингом с помощью мАТ к НА-эпитопу и в культуральной среде, и в клеточном лизате.

Рис. 24. Эндогенная локализация р45 в гранулярных цитоплазматических структурах и внеклеточном пространстве С08-1 клеток; (а) - конфокальная микроскопия клеток, трансфецированных рЕИЗНА (верхняя панель) или рЕЕЗНА_р45 (нижняя панель) и окрашенных (красный цвет) мАТ анти-НА, конъюгированным с ТМТС. Правая колонка -контрастная микроскопия для определения областей окрашивания. (Ь)- Конфокальная микроскопия С08-1 клеток, котрансфецированных ОРР-ЕЕА1-(РУУЕ)2 (зеленый цвет) и рЕРЗНА_р45, окрашенных как (а), (с) - Конфокальная микроскопия С08-1 клеток, трансфецированных рЕРЗНА_р45, с двойным иммуноокрашиванием карбоксипептидазы Е и НА_р45 первичными мАТ, а затем конъюгированными с зеленым или красным красителями вторичными АТ. ДНК окрашивалась диамидинофенилиндолом (ОАР1), и нижняя правая панель демонстрирует совмещение этих трех цветов.

мр1у рЫ-ЗНА

рЕРЗНА (¡4.4

оягзсоМзг]

Следующее доказательство присутствия внутриклеточного Secl4p-подобного белка именно в секреторных везикулах было получено в экспериментах по совместной экспрессии в клетках COS-1 р45 и гибридной полипептидной цепи, включающей в себя зеленый флуоресцентный белок (GFP) и два тандемных липидсвязывающих « РУУЕ»-доменов белка ЕЕА1- маркера ранних эндосом Специфическим лигандом белка ЕЕА1 является фосфатидилинозит-3-монофосфат, самое высокое содержание которого наблюдается в эндосомах и секреторных гранулах Также, но в заметно меньших количествах, PtdIns(3)P присутствует в мембранах аппарата Гольджи и плазматической мембране На рисунке 24 (Ь) видно, как в трансфецированных клетках интенсивное красное флуоресцентное окрашивание внутривезикулярного р45 обрамляется зеленым цветом Котрансфекция клеток также выявила существование и более мелких меченых GFP-EEA1-(FYVE)2 везикул, где р45 не визуализируется (лизосомы и эндосомы Интенсивное зеленое окрашивание ядра клетки является известным фактом, обычно возникающим при использовании конструкций с GFP, имеющим тенденцию к накапливанию в ядре

В подтверждение того, что внутриклеточные образования, содержащие р45, действительно являются секреторными везикулами, на этом же рисунке 24 (с) приведены данные по колокализации р45 и карбоксипептидазы Е - специфичного клеточного маркера секреторных везикул

Таким образом, из этих экспериментов можно заключить, что р45 синтезируется в эукариотических клетках, транслоцируется в аппарат Гольджи и затем упаковывается в секреторные везикулы, большинство из которых находится в цитозоле и предназначаются для экзоцитоза («secretory vesicle» на рис 24 (Ь) Также необходимо отметить, что внеклеточная локализация гибридного белка НА_р45, наблюдаемая при каждой трансфекции, («extracellular, рис 24 (Ь)», скорее всего, определяется свойствами самого р45, а не НА-эпитопа, так как известно множество внутриклеточных белков, локализацию которых в клетке устанавливали с помощью конструкций на основе вектора pEF3HA

Принимая во внимание широкое представление р45 в слизи, покрывающей эпителий, можно с уверенностью утверждать, что секреция исследуемого белка есть проявление его физиологической функции в клетке

Совместное присутствие р45 и PtdIns(3,4,5)P3 ш vivo было подтверждено экспериментами по трансфекции клеток COS-1 плазмидой pEF3HA_p45 с последующим двойным иммуноокрашиванием мАТ анти- PtdIns(3,4,5)P3 и анти-НА (рис 25) Как видно из этого рисунка, колокализация белка с липидом в основном наблюдается внутри секреторных везикул, в меньшей степени - в плазматической мембране и внеклеточном пространстве, что не удивительно, учитывая присутствие детергента в растворе для окрашивания

анти- НА анти-Р1с11п5(3,4,5)РЗ совмещение без окрашивания

Щ А Щ • -

... ."• _ - \ 'Я ■

■ т ^Ш* ? ¡■ИИИИИИ!! &....... 1 ■

Рис. 25. Колокализация 5ес14р-подобного белка и Р1с11пз(3,4,5)Рз. Конфокальная микроскопия трех независимых образцов (горизонтальные ряды) С05-1 клеток, трансфецированных конструкцией рЕРЗНА_р45 и дважды обработанных мАТ: первоначально к Р1с11пз(3,4,5)Рз (зеленое окрашивание, второй вертикальный ряд), а затем к НА-эпитопу (красное окрашивание, первый вертикальный ряд). Совмещение изображений (третий вертикальный ряд, золотистое окрашивание) демонстрирует совместную локализацию белка и липида. Изображения, полученные при контрастной микроскопии (четвертый вертикальный ряд), дают возможность оценить области локализации.

Помимо секреторных везикул исследуемый белок проявлялся и в пузырьках пространства транс-Гольджи (рис. 24 (Ь)). Поэтому было решено проверить совпадение клеточной локализации р45 и гибридного белка, несущего в своем составе (помимо вРР) плекстриновый домен (РН) ЕИк-киназы и являющегося цитозольным маркером Р1сНп5(3,4,5)Рз (данные не приведены). При анализе котрансфецированных клеток совпадений окрашивания НА_р45 и СРР-ЕЯк-РН не выявлено. Таким образом, можно сделать вывод, что БесМр-подобный белок находится в комплексе с фосфатидилинозиттрифосфатом только в секреторных везикулах, но клеточным цитозольным маркером для этого липида он не является.

Р1с11п5(3,4,5)Рз является ключевым посредником самых разнообразных сигнальных путей, запускающих и регулирующих такие клеточные процессы, как дифференцировка, хемотаксис, эндоцитоз, транспорт и гомеостаз глюкозы. Но означает ли взаимодействие БесМр-подобного белка с фосфолипидом его

вовлечение в один из этих процессов или этот лиганд необходим для реализации какой-либо собственной активности, пока остается неясным

Обнаружение Sec 14р-подобного белка в секреторных везикулах и культуральной среде - это первое известное автору сообщение о возможной секреции липидных транспортеров (LTP) млекопитающих во внеклеточное пространство Однако заметим, что в мире растений это явление уже известно Поверхность контактирующих с атмосферой эпидермальных клеток растений покрыта кутикулярной пленкой, в формировании которой и принимают участие секреторные LTP (nsLTP) Эта пленка регулирует водный режим и защищает листья от повреждений и проникновения инфекции Как было показано недавно (Cameron KD et al, 2006), в условиях водного дефицита усиление экспрессии гена nsLTP листьев табака и увеличение плотности кутикулярной пленки происходит синхронно Таким образом, уместно предположить, что функционирование БесМр-подобного белка в клетках, имеющих непосредственный контакт с атмосферой, может быть как-то связано с регулированием распределения или доступности гидрофобных лигандов в экстраклеточной области, что, в конечном счете, может приводить к структуризации слизистого барьера носоглотки

ВЫВОДЫ

1. Идентифицирован и выделен в гомогенном состоянии из обонятельной выстилки крысы новый секреторный белок, выявляющийся при электрофоретическом анализе в виде мономера с кажущейся молекулярной массой ~ 28 кДа (р28) и обладающий протекторным действием в металл-окислительных системах

2. Установлена нуклеотидная последовательность кДНК р28 Кодирующая область кДНК содержит 672 по и соответствует белку с вычисленной массой 24680 Да Реконструирована полная аминокислотная последовательность р28, включающая в себя 223 остатка

3. Сравнение первичной структуры р28 с последовательностями других белков показало, что он содержит участок, подобный последовательности Р3'хВРТРУСхТЕ49, включает в себя единственный остаток Суэ (СуБ46) и принадлежит к подсемейству 1 -Су Б-содержащих тиол-специфических антиоксидантов или пероксиредоксинов VI На основании этого сделано предположение, что основной функцией р28 является защита клеток эпителия от повреждений, вызываемых действием активных форм кислорода

4. Показано, что, несмотря на имеющийся в составе Ргх VI участок АбпТЬгТЬг, белок не гликозилирован, отсутствие пост-трансляционной модификации имеет важное значение для проявления ферментом функциональной активности

5. Разработаны условия получения высокоактивных генно-инженерных аналогов Ргх VI человека и осуществлено сравнение их протекторных свойств с природным белком

6. Идентифицирован и выделен в гомогенном состоянии из обонятельной выстилки крысы новый секреторный белок, выявляющийся при электрофоретическом анализе в виде мономера с кажущейся молекулярной массой ~ 45 кДа (р45)

7. Установлена полная нуклеотидная последовательность кДНК р45 Кодирующая область кДНК содержит 1200 п о Реконструирована полная аминокислотная последовательность р45, включающая в себя 400 остатков

8. Определена частичная аминокислотная последовательность белка, подобного по физико-химическим свойствам р45 и сопутствующему ему практически на всех стадиях хроматографической очистки (УМ-1) Впервые показано присутствие в обонятельной выстилке млекопитающих хитиназы УМ-1

9. Выявлена гомология между аминокислотными последовательностями р45 и липид-переносящими белками, несущими в своем составе СЯАЬ/ТШО- или БесМр-подобный домен Показано, что наибольшая концентрация р45 обнаруживается в эпителиальных тканях, имеющих непрерывный контакт с окружающей средой

10. В экспериментах с препаратами природного и рекомбинантного р45 с помощью блотгинга на нитроцеллюлозных пластинках и на искусственных липосомах, а также с помощью специально разработанной методики изучения липидного транспорта, впервые показано, что специфическим лигандом БесМр-подобного белка обонятельного эпителия млекопитающих является фосфатидилинозит-3,4,5-трифосфат

11. Осуществлена экспрессия БесМр-подобного белка в эукариотических клетках С08-1 Анализом трансфецированных клеток показано, что исследуемый белок действительно является секреторным, и что секреция есть проявление его физиологической функции

12 Впервые продемонстрировано участие БесМр-подобного белка во внеклеточном транспорте и присутствие фосфатидилинозит-3,4,5-трифосфата у высших эукариот во внеклеточной среде В связи с этим высказано предположение о вовлечении исследуемого белка в транспорт фосфатидилинозитидов и образование защитного слоя слизи на обонятельном эпителии

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ

Обзоры

1 Липкин ВМ, Шуе аева ТМ. Розынов Б В Анализ химического строения белка, в кн «Проблема белка», т 1,подред ВМ Липкина. М Наука, 1995, стр 291-354 2. Липкин В М, Шуе аева ТМ Белки, в кн «Большая Российская энциклопедия», т 3, М Большая Российская энциклопедия, 2005, стр 211-215

Статьи (в журналах, рекомендованных ВАК и включенных в систему цитирования Web of Science)

3 Пешенко И В, Новоселов В И, Евдокимов В А, Попов В И, Николаев Ю В, Шуваева ТМ, Липкин ВМ, Фесенко ЕЕ Выделение и биохимический анализ нового секреторного 28-кДа белка из обонятельного эпителия крысы Сенсорные системы 1996, 10 (3), 97-109

4 Peshenko I V, Novoselov VI, Evdokimov VА , Nikolaev Yu V, Shuvaeva TM. Lipkm VM, FesenkoEE Novel 28-kDa secretory protein from rat olfactory epithelium FEBS Lett 1996,381 (1), 12-14

5 Peshenko I V, Novoselov VI, Evdokimov 17A, Nikolaev Yu V, Kamzalov SS, Shuvaeva TM, Lipkin VM, Fesenko E E Identification of a 28 kDa secretory protein from rat olfactory epithelium as a thiol-specific antioxidant Free Radical Biology & Medicine 1998,25 (6), 654-659

6 Андреева CP, Меркулова МИ, Шуваева TM. Новоселов В И, Пешенко ИВ, Новоселов СВ, Фесенко ЕЕ, Липкин ВМ Структурные исследования секреторного 28-кДа белка из обонятельного эпителия крысы Биоорган химия 1998,24 (11), 816-821

7 Novoselov SV, Peshenko IV, Popov VI, Novoselov VI, Bystrova MF, Evdokimov VA, Kamzalov SS, Merkulova MI, Shuvaeva TM. Lipkm VM, Fesenko EE Localization of 28-kDa peroxiredoxm in rat epithelial tissues and its antioxidant properties Cell Tissue Res 1999, 298 (3), 471-480

8 Shuvaeva TM, Andreeva SG, Merkulova MI, Novoselov VI, Peshenko I V, Fesenko EE, Lipkm VM Novel 28 kD and 45 kD olfactory enzymes structure and functions J Neurochemistry 1999, 73 (suppl), S46

9 Меркулова МИ, Шуваева TM. Радченко В В, Янин В А, Бондарь А А, Софин АД, Липкин В М Рекомбинантный пероксиредоксин человека получение и протекторные свойства in vitro Биохимия 2002,67 (11), 1496-1501

10 Radchenko VV, Nekrasov AN, Shuvaeva TM. Merkulova MI, Lipkin VM Analysis of informational structure of protein amino acid sequences and obtaining large biologically active peptides of human 1-Cys peroxyredoxm J Peptide Sci 2004, 10 (8), 258

11 Merkulova MI, Andreeva SG, Shuvaeva TM Novoselov S V, Peshenko IV, Bystrova MF, Novoselov VI, Fesenko EE, Lipkin VM A novel 45 kDa secretory protein from rat olfactory epithelium primary structure and localisation FEBS Lett 1999,450(1-2), 126-130

12 Меркулова MИ, Радченко В В, Илъницкая ЕВ, Шуваева ТМ, Липкин В М Протеомный подход к изучению функций 8ес14р-подобного белка р45 Биоорган химия 2005, 31 (3), 280287

13 Радченко В В, Шуваева ТМ, Илъницкая Е В, Третьяков В Е, Липкин В М Новый метод изучения липидного транспорта т vitro белок с молекулярной массой 45 кДа из обонятельного эпителия крысы - специфический переносчик фосфатидилинозит-3,4,5-трифосфата Биоорган химия 2005,31 (4), 445-448

14 MerkulovaМ, HuynhH, Radchenko V, SaitoK, Lipkin V. Shuvaeva Т. Mustelm T Secretion of the mammalian Secl4p-like phosphoinositide-binding p45 protein FEBS Journal 2005, 272 (10), 5595-5605

15 Радченко В В, Меркулова МИ, Шуваева ТМ, Симонова ТН, Бондарь А А , Липкин В М Функциональная экспрессия SecMp-подобного белка с молекулярной массой 45 кДа из обонятельного эпителия крысы Биохимия 2005,70(12), 1631-1638

16 Илъницкая Е В, Шамборант О Г, Радченко В В, Шуваева ТМ, Липкин В М Связывание SecM-подобного белка с молекулярной массой 45 кДа из обонятельного эпителия крысы с фосфатидилинозит-3,4,5-трифосфатом в липосомах Биоорган химия 2006,32 (3), 335-336

17. Nekrasov А N, Radchenko V V, Shuvaeva Т.М. Novoselov VI, Fesenko ЕЕ, Lipkin VM The

novel approach to the protein design active truncated forms of human

1-Cys peroxiredoxm Journal of Biomolecular Structure & Dynamics 2007,24 (5), 455-462

Материалы конференции

18 Шуваева ТМ. Андреева С Г, Меркулова МИ, Пешенко ИВ, Новоселов ВИ, Фесенко ЕЕ, Липким ВМ Новые секреторные белки обонятельного эпителия крысы IV Чтения, посвященные памяти академика Ю А Овчинникова, Москва 1998 Тез докп и стенд сообщ, С 33

19 Новоселов В И, Пешенко И В, Попов В И, Новоселов С В, Быстрова М Ф, Евдокимов ВА, Камзолов С С, МеркуловаМИ, Шуваева ТМ. ЛипкинВМ, ФесенкоЕЕ Локализация пероксиредоксина с молекулярной массой 28 кДа в эпителиальных тканях крысы и его антиоксидантные свойства. II Съезд биофизиков России, Москва 1999 Тез докл и стенд сообщ, XIII 1 9

20 Novoselov VI, Peshenko 1 V, Bystrova MF, Evdokimov VJ, Novoselov S V, Kamzalov SS, Shuvaeva TM. Merkulova MI, Andreeva S G, Lipkm VM, Fesenko EE Novel secretory proteins from rat epithelium tissues INTAS Symposium "Microbial and Cellular Systems for Pharmacology, Biotechnology, Medicine and Environment", Moscow 1999 Proceeding book, P 32

21 Merkulova MI, Novoselov S V, Peshenko I V, Novoselov VI, Shuvaeva TM. Lipkm VM The novel transfer protein from rat olfactory epithelium NATO-FEBS Meeting "Protein, lipid and membrane traffic pathways and targeting", Cargese-Corsica-France 1999, Abstr

22 Шуваева TM, Меркулова MИ, Новоселов В И, Бондарь А А , Радченко В В, Липкин В М Структурно-функциональное изучение пероксиредоксина VI и создание на его основе лекарственных препаратов X Международная конф «Новые информационные технологии в медицине и экологии», Украина, Крым, Гурзуф 2002 Тез докл, С 345

23 Радченко ВВ, Меркулова МИ, Евдокимов В А, Барышникова ЛМ, Шуваева ТМ, Липкин В М Получение в прокариотических системах экспрессии рекомбинантного белка 45 кДа из обонятельного эпителия крысы и гомологичного ему белка 45 кДа человека X Международная конф «Новые информационные технологии в медицине и экологии», Украина, Крым, Гурзуф 2002 Тез докл, С 376-377

24 Меркулова МИ, Huynh Н, Радченко ВВ, Липкин ВМ, Шуваева ТМ. Mustelin Т Секреция 5ЕС14р-подобного белка из обонятельного эпителия крысы VII Чтения, посвященные памяти академика Ю А Овчинникова, Москва 2004 Тез докл и стенд сообщ, С 52-53

25 Радченко ВВ, Меркулова МИ. Шуваева ТМ. Липкин ВМ Фосфатидилинозит-связывающий домен SECHp-подобного белка из обонятельного эпителия крысы VII Чтения, посвященные памяти академика Ю А Овчинникова, Москва 2004 Тез докл и стенд сообщ, С 54

26 Nekrasov AN, Radchenko VV, Merkulova MI, Shuvaeva TM, Lipkm УМ Expression of recombinant truncated forms of human peroxtredoxtn (1-Cys PrxVI) designed using a structural-information analysis of its amino acid sequence 7th Int Symp on Biomol Chem, Sheffield 2004, The United Kingdom, Abstr, P 24

27 Radchenko VV, Nekrasov AN, Shuvaeva TM. Merkulova MI, Lipkm VM Analysis of informational structure of protein amino acid sequences and obtaining large biologically active peptides of human 1-Cys peroxyredoxin J Peptide Sci 2004, 10 (8), 258

28 Radchenko V V, Nekrasov A N, Shuvaeva TM. Lipkm VM Information structure analysis of protein sequences Design and purification of recombinant truncated forms of human 1-Cys peroxiredoxin Moscow Conference on computational molecular biology, Moscow 2005, Abstr P 311-313

29 Шуваева TM, Новоселов В И, Радченко В В, Ильницкая Е В, Фесенко Е Е, Липкин В М Новые белки обонятельного эпителия млекопитающих VIII Чтения, посвященные памяти академика Ю А Овчинникова, Москва 2006 Тез докл и стенд сообщ, С 9

30 Radchenko VV, Il'mtskaya Е V, Shuvaeva ТМ. Tret'yakov VE, Lipkin VM A new method for lipid transport studying in vitro The tool for identification unknown lipid binding proteins and

their hydrophobic ligands determining lipid metabolism pathology Special meeting "New concepts in lipidology from lipidomics to disease", Noordwijkerhout 2006, The Netherlands Abstr,P 109

Патенты

31 ЛипкинВМ, Шуваева TM, Радченко В В, МеркуловаМИ, Новоселов В И, ФесенкоЕЕ Рекомбинантная плазмидная ДНК pET23-a(+)PrxVIhumA 178, кодирующая N-концевой фрагмент пероксиредоксина VI человека, и штамм Е coll BL2 l/DE3/pET23-a(+)/PrxVIhumAl 78 - продуцент N-концевого фрагмента пероксиредоксина VI человека Патент РФ № 2250262, 20 04 2005

32 Fesenko ЕЕ, Novoselov VI, Yanin VA, Lipkin VM, Shuvaeva TM Antioxidant pharmaceutical compound, method for producing polypeptide and method of cure PCT WO 2004/043485 A 1,27 05 2004

33 Радченко В В, Шуваева TM, Ильнщкая ЕВ, Липкин ВМ Способ определения липидпереносящей способности белков Патент РФ №2302426,10 07 2007

Подписано в печать 09 07 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 594 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Введение стр.

1. Литературный обзор

1.1. Пероксиредоксины - новое семейство белков, антиоксидантов

1.1.1. Организация антиоксидантной защиты клеток

1.1.2. История открытия первого представителя семейства пероксиредоксинов. Белок дрожжей, защищающий ферменты от инактивации в присутствии тиолов

1.1.3. Общие свойства пероксиредоксинов

1.1.4. Идентификация субстратов и тиолового кофактора пероксиредоксинов

1.1.5. Три типа пероксиредоксинов млекопитающих и механизмы их каталитического действия

1.1.6. Пероксинитритредуктазная активность пероксиредоксинов

1.2. Перекись водорода и ее регуляция пероксиредоксинами

1.2.1. Н202 - вторичный посредник сигнальной трансдукции

1.2.2. Регуляция активности самих пероксиредоксинов

1.2.3. Образование сульфинового производного существенного остатка Сув пероксиредоксинов. Обратимость реакции и ее биологическое значение

1.2.4. Бифункциональность пероксиредоксинов

1.3. Пероксиредоксины VI подгруппы

1.3.1. Физиологический электронный донор для пероксидазной активности ^ пероксиредоксина VI

1.3.2. Ферментативнаяактивность пероксиредоксина VI

1.3.3. Антиоксидантные свойства пероксиредоксина VI

1.4. Медицинские аспекты изучения пероксиредоксинов

2. Результаты и их обсуждение

2-1. Пероксиредоксин обонятельного эпителия крысы

2.1.1. Очистка, идентификация и определение частичной аминокислотной последовательности белка р28, пероксиредоксина VI ^

2.1.2. Установление и анализ полной аминокислотной последовательности пероксиредоксина VI

2.1.3. Локализация пероксиредоксина VI в тканях млекопитающих ^

2.2. Функциональная экспрессия пероксиредоксина VI. Выделение и очистка рекомбинантных белков ^

2.2.1. Экспрессия кДНК пероксиредоксина VI в эукариотической системе

Pichia pastoris ^

2.2.2. Экспрессия кДНК пероксиредоксина VI человека в прокариотической системе Е. coli ^

2.2.3. Функциональная экспрессия укороченного варианта белка человека 79 2.3. Sec 14р-подобный белок обонятельного эпителия крысы

2.3.1. Очистка и идентификация в обонятельном эпителии хитиназы YM

2.3.2. Установление и анализ полной аминокислотной последовательности р45 - Secl4p - подобного белка обонятельного эпителия крысы g^

2.3.3. Локализация места синтеза Secl4p - подобного белка

2.3.4. Поиск возможных биологических партнеров Secl4p - подобного белка

2.3.5. Исследование липид-связывающей специфичности Secl4p - подобного белка из обонятельного эпителия крысы

2.3.5.1. Получение рекомбинантного Sec 14р - подобного белка

2.3.5.2. Изучение р45-лигандного взаимодействия на нитроцеллюлозных пластинках jQg

2.3.5.3. Изучение взаимодействия Secl4p - подобного белка с PtdIns(3,4,5)P

2.3.6. Секреция Secl4p - подобного белка и его фрагментов в клетках COS

2.3.7. Колокализация р45 с PtdIns(3,4,5)P3 в клетках COS

3. Экспериментальная часть

4. Выводы

5. Благодарности

6. Список сокращений и обозначений

Обмен веществ между организмом и окружающей средой - основная функция эпителиальной ткани как пограничного образования. Некоторые из этих тканей, такие как обонятельная выстилка, ткани респираторного эпителия и некоторые другие, непосредственно контактируют с атмосферой и в норме покрыты слизью, которая является первым барьером между ними и окружающим воздухом и, фактически обеспечивает нормальное функционирование всех тканей дыхательной системы и, следовательно, всего организма в целом.

Для поддержания жизнедеятельности организма через слизь осуществляется транспорт важных веществ, например, кислорода - в респираторном эпителии, пахучих стимулов - в обонятельной выстилке. Но одновременно через этот секрет в эпителий поступают вещества, которые могут быть и токсичными для клеток. Действие этих факторов в органах и тканях респираторной системы нейтрализуется путем самоочищения дыхательной поверхности с помощью фагоцитоза, неспецифической бактерицидной защиты органов дыхания радикальными соединениями, генерируемыми активированными фагоцитами, специфической иммунной защитой от инфекционных возбудителей и чужеродных макромолекул. Нарушение работы этих систем является причиной развития многих заболеваний различной этиологии.

Большая физиологическая значимость понимания процессов регулировки адаптационных механизмов защиты организма предопределяет интенсивность исследований самых различных структурно-функциональных аспектов этих систем. В частности, проводятся работы по поиску и характеризации белковых регуляторных компонентов обонятельной слизи, называемых часто (если пользоваться медицинской терминологией) «белками первой линии защиты». Несмотря на достигнутый прогресс в этой области в течение последних лет, связанный, в первую очередь, с полным секвенированием генома человека, многие молекулы, важные для поддержания гомеостаза в органах дыхания, все еще остаются неизвестными, так как выделение белковых компонентов в индивидуальном виде и их идентификация имеют свои специфические трудности. Это обстоятельство сдерживает прогресс в изучении реально существующих защитных механизмов эпителиальных тканей воздухоносных путей, нормальное функционирование которых представляет собой основу естественной невосприимчивости организма к болезням. Вышеизложенное позволяет заключить, что идентификация и структурно-функциональное исследование белков обонятельной выстилки, является актуальной проблемой физико-химической биологии.

Основной целью настоящей работы явился поиск, идентификация и исследование новых белковых компонентов, непосредственно контактирующих с окружающей средой клеток. В дыхательных путях, в зависимости от анатомической структуры, по-разному распределяются субстанции, противодействующие токсичным для клеток веществам. Особое внимание было сосредоточено на характеристике полипептидов, находящихся в слое жидкости, выстилающей эпителий. Первым встречается с воздушным потоком муцин (собирательный термин) - наиболее поверхностно расположенный белок этой жидкости (гель-фаза слизи). Другие белковые компоненты жидкости, обладающие защитными свойствами, расположены в растворимой части слизи (золь-фаза) как бы «под муцином».

Исторически сложилось так, что к началу настоящей работы было известно, что при мягких промывках обонятельного эпителия крысы изотоническим раствором из ткани экстрагируется полипептид, имеющий при электрофоретическом анализе в ПААГ в присутствии БОБ подвижность, соответствующую белку с молекулярной массой ~ 45 кДа (далее в тексте «р45»). Этот полипептид не совпадал по подвижности с описанными ранее белками и на основании его взаимодействия с пкАТ, выработанными против синтетического пептида, соответствующего участку общего для а-субъединиц в-белков (СОАОЕЭОКЗИУКОМК), был охарактеризован как СТР-связывающий, хотя его биологическая роль в клетке не была определена [1]. Повышенный интерес к р45 вызывал тот факт, что он содержится в обонятельном эпителии в значительных количествах и составляет примерно 2% от всех растворимых белков обонятельного эпителия. В 1996 г. была предложена методика очистки р45 [2], при которой было, замечено, что в некоторых фракциях, полученных при первичном разделении экстракта выстилки с помощью ионообменной хроматографии, помимо р45, содержится заметное количество еще одного неисследованного белка со значением молекулярной массы ~ 28 кДа (Новоселов В.И., частное сообщение). Однако, поскольку аминокислотная последовательность и биологическая активность р45 и белка, мигрирующего в ПААГ с кажущейся молекулярной массой ~ 28 кДа («р28») не была известна, идентифицировать эти полипептиды и установить их роль в механизме функционирования эпителиальной ткани млекопитающих не представлялось возможным.

Для достижения поставленной цели на первом этапе исследований была поставлена задача разработки методов выделения р45 и р28 в индивидуальном состоянии, так как учитывалось, что определение аминокислотной последовательности неизвестного полипептида без легко определяемой биохимической характеристики зачастую не приводит к идентификации искомого компонента.

На втором этапе работы планировалось определить первичную структуру этих полипептидов, провести поиск в банках данных гомологичных белков с уже известными функциями и отобрать белки, являющиеся потенциально значимыми для функционирования эпителиальных тканей. Ключевой задачей на этом этапе стало клонирование структурных генов р45 и р28, определение их нуклеотидной последовательности, выведение полной аминокислотной и идентификация участков цепей природных продуктов, имеющих функционально значимые пост-трансляционные модификации.

Целью следующего этапа исследования стало выявление клеточной локализации новых белков и изучение их функциональной роли в механизмах клеточной защиты эпителиальных тканей. Также была поставлена задача разработки методов получения генно-инженерных аналогов новых белков в количествах, достаточных для биомедицинских экспериментов, и изучить особенности их функционирования.

В ходе данной работы был открыт основной антиоксидант респираторных тканей - 1-СуБ-содержащий пероксиредоксин (р28, Ргх VI). В связи с этим была поставлена отдельная задача по разработке условий получения высокоактивных рекомбинантных аналогов Ргх VI человека и сравнения его антиоксидантных свойств с природным белком.

В процессе исследования нами была разработана методика и осуществлено выделение в гомогенном виде двух новых, ранее не описанных белков респираторного эпителия крысы с молекулярными массами 28 и 45 кДа. Впервые установлено, что в слизи обонятельного эпителия в значительных количествах

-2%) присутствует новый тип тиол-специфических пероксидаз (р28) и липид-переносящий белок (р45), БесМр-подобный белок, несущий в своем составе CRAL/TRIO- или Sec14р-подобный домен.

На основании информации о частичной аминокислотной последовательности осуществлено клонирование кДНК этих белков. По определенной нуклеотидной последовательности установлена полная первичная структура этих белков, состоящая из 223 и 400 аминокислотных остатков, соответственно. Установлено, что тиол-специфическая пероксидаза принадлежит к семейству пероксиредоксинов VI (Prx VI) и в ее составе идентифицирован домен, способный защищать белки от разрушения активными формами кислорода подобно полноразмерному ферменту. Изучены особенности химического строения Prx VI и показано, что белок не гликозилирован; отсутствие пост-трансляционной модификации имеет важное значение для проявления ферментом протекторной активности. Впервые показано, что наиболее высокая концентрация этих белков обнаруживается в тканях, имеющих непосредственный контакт с атмосферой, и больше, чем другие, подверженных действию неблагоприятных внешних факторов. На основании полученных данных сделано предположение, что эти белки входят в состав защитных систем эпителиальных тканей и обеспечивают их нормальный контакт с окружающей средой. Впервые идентифицирован в обонятельной выстилке крысы еще один новый белок (YM-1), мигрирующий в ПААГ с кажущейся молекулярной массой около 45 кДа и имеющий подобно р45 значение ИЭТ ~ 5,6. Определена его частичная аминокислотная последовательность и показано, что он принадлежит к семейству хитиназ.

Нами установлено, что ключевой посредник сигнальных путей фосфатидилинозит-3,4,5-трифосфат является специфическим липидным лигандом р45 тканей респираторной системы. Экспрессией р45 в эукариотических клетках COS-1 доказана колоколизация этих соединений в клетках млекопитающих и выявлено участие р45 в секреторном процессе. Впервые продемонстрирована транспортная активность р45 и возможность переноса фосфатидилинозит-3,4,5-трифосфата во внеклеточную среду.

Полученные нами результаты имеют не только научное, но и практическое значение. На основе р28 (Prx VI) для тканей, контактирующих с внешней средой, предложен принципиально новый специализированный препарат антиоксидантного действия, направленный, в первую очередь, на восстановление редокс-баланса тканей органов дыхания. В модельных экспериментах на животных показана высокая эффективность действия этого белка на восстановление эпителиальных тканей верхних дыхательных путей. В связи с потенциальной практической важностью Ргх VI на его использование оформлена международная заявка. Структурный и предварительный ферментативный анализ полученных в результате этой работы генно-инженерных препаратов Ргх VI человека позволяет предположить, что полноразмерный и укороченный варианты рекомбинантного белка, синтезированные в прокариотической системе, могут являться эффективными лекарственными средствами при медикаментозной коррекции ряда заболеваний, связанных с нарушением функционирования защитных систем эпителиальных тканей.

В ходе определения липид-связываюицей специфичности р45 разработан простой и не требующий использования радиоактивных липидов метод изучения липид-белковых взаимодействий. Метод позволяет исследовать транспортную активность белков по отношению к липидному лиганду и в случае, когда тип липидного лиганда не известен.

выводы

Л. Идентифицирован и выделен в гомогенном состоянии из обонятельной выстилки крысы новый секреторный белок, выявляющийся при электрофоретическом анализе в виде мономера с кажущейся молекулярной массой ~ 28 кДа (р28) и обладающий протекторным действием в металл-окислительных системах.

2. Установлена нуклеотидная последовательность кДНК р28. Кодирующая область кДНК содержит 672 п.о. и соответствует белку с вычисленной массой 24680 Да. Реконструирована полная аминокислотная последовательность р28, включающая в себя 223 остатка.

3. Сравнение первичной структуры р28 с последовательностями других белков показало, что он содержит участок, подобный последовательности Р39хОРТРУСхТЕ49, включает в себя единственный остаток СуБ (Сув46) и принадлежит к подсемейству 1-Суэ-содержащих тиол-специфических антиоксидантов или пероксиредоксинов VI. На основании этого сделано предположение, что основной функцией р28 является защита клеток эпителия от повреждений, вызываемых действием активных форм кислорода.

4. Показано, что, несмотря на имеющийся в составе Ргх VI участок АбпТЬгТИг, белок не гликозилирован; отсутствие пост-трансляционной модификации имеет важное значение для проявления ферментом функциональной активности.

5. Разработаны условия получения высокоактивных генно-инженерных аналогов Ргх VI человека и осуществлено сравнение их протекторных свойств с природным белком.

6. Идентифицирован и выделен в гомогенном состоянии из обонятельной выстилки крысы новый секреторный белок, выявляющийся при электрофоретическом анализе в виде мономера с кажущейся молекулярной массой ~ 45 кДа (р45).

7. Установлена полная нуклеотидная последовательность кДНК р45. Кодирующая область кДНК содержит 1200 п.о. Реконструирована полная аминокислотная последовательность р45, включающая в себя 400 остатков.

8. Определена частичная аминокислотная последовательность белка, подобного по физико-химическим свойствам р45 и сопутствующего ему практически на всех стадиях хроматографической очистки. Впервые показано присутствие в обонятельной выстилке млекопитающих хитиназы УМ-1.

9. Выявлена гомология между аминокислотными последовательностями р45 и липид-переносящих белков, несущими в своем составе СИАЦТРЮ- или 8ес14р-подобный домен. Показано, что наибольшая концентрация р45 обнаруживается в эпителиальных тканях, имеющих непрерывный контакт с окружающей средой.

10. В экспериментах с препаратами природного и рекомбинантного р45 с помощью блоттинга на нитроцеллюлозных пластинках и на искусственных липосомах, а также с помощью специально разработанной методики изучения липидного транспорта впервые показано, что специфическим лигандом Бес14р-подобного белка обонятельного эпителия млекопитающих является фосфатидилинозит-3,4,5-трифосфат.

11. Осуществлена экспрессия Зес14р-подобного белка в эукариотических клетках СОБ-1. Анализом трансфецированных клеток показано, что исследуемый белок действительно является секреторным, и что секреция есть проявление его физиологической функции.

12. Впервые продемонстрировано участие Зес14р-подобного белка во внеклеточном транспорте и присутствие фосфатидилинозит-3,4,5-трифосфата у высших эукариот во внеклеточной среде. В связи с этим высказано предположение о вовлечении исследуемого белка в транспорт фосфатидилинозитидов и образование защитного слоя слизи на обонятельном эпителии.

БЛАГОДАРНОСТИ

Осуществлению планов и завершению работы над диссертацией во многом способствовали плодотворные дискуссии с членами-корреспондентами РАН Липкиным Валерием Михайловичем и Фесенко Евгением Евгеньевичем, а также профессором Новоселовым Владимиром Ивановичем, за что автор им глубоко признателен.

Автор сердечно благодарит коллег из Института биофизики клетки РАН, совместно с которыми были получены первые экспериментальные результаты, лежавшие в основе данной работы, - Пешенко Игоря Владимировича, Евдокимова Вячеслава Александровича, Николаева Юрия Владимировича и Быстрову Марину Федоровну.

Необходимо отметить большую практическую работу моих молодых коллег из лаборатории белков гормональной регуляции Меркуловой Марии Игоревны, Радченко Виталия Владиславовича и Ильницкой Елены Вячеславовны, а также помощь высококвалифицированных специалистов из других лабораторий ИБХ РАН Шамборант Ольги Георгиевны, Стукачевой Елены Анатольевны, Симоновой Татьяны Николаевны, Некрасова Алексея Норбертовича и Мурановой Татьяны Анатольевны, оказавших неоценимую помощь в подготовке и обсуждении некоторых экспериментальных подходов.

Работа выполнялась при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, Министерства образования и науки Российской Федерации, Национального центра научных исследований Франции (1ЫРА), Международного научного фонда, Американского фонда гражданских исследований (СВОР) и ИНТАС.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

АФК - активные формы кислорода монАТ - антитело монокпональное пкАТ - антитело поликлональное ПААГ - полиакриламидный гель ТФУ - трифторуксусная кислота BSA - бычий сывороточный альбумин CDK - циклин-зависимая киназа

DME - среда Дульбекко (Dulbecco's modified Eagle's medium)

DTT - дитиотреит

DPPC - дипальмитоилфосфатидилхолин

EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота

FAD - флавинадениндинуклеотид

GTP - гуанозин-5'-трифосфат

GPx - глутатионпероксидаза

GSH - глутатион (восстановленная форма)

GR - глутатионредуктаза tcGST - глутатион-Б-трансфераза (изоформа л)

IPTG - изопропил-р-В-тиогалактопиранозид

LPS - липополисахарид

NADPH - никотинамидадениндинуклеотидфосфат PLA2 - фосфолипаза А2 РТК - фосфотирозинкиназа РТР - фосфотирозинфосфатаза Ptdlns(3,4,5)P3 - фосфатидилинозит-3,4,5-трифосфат Ptdlns(3)P - фосфатидилинозит-3-монофосфат Ptdlns(4)P - фосфатидилинозит-4-монофосфат Ptdlns(5)P - фосфатидилинозит-5-монофосфат PtdEtNH2 - фосфатидилэтаноламин

1. Novoselov V.I., Peshenko I.V., Evdokimov V.J., Nikolaev J.V., Matveeva E.A., Fesenko E.E. //Water-soluble GTP-binding protein from rat olfactory epithelium. FEBS Letters, 1994, V. 353, P. 286-288

2. Novoselov V.I., Peshenko I.V., Evdokimov V.J., Nikolaev J.V., Matveeva E.A., Fesenko E.E. //45-kDa GTP-binding protein from rat olfactory epithelium: purification, characterization and localization. Chem. Senses, 1996, V. 21, P. 181-188

3. Зенков H.K., Панкин B.3., Меньшикова Е.Б. //Окислительный стресс. Биохимический и патофизиологический аспекты. М.:МАИК Наука/Интерпериодика, 2001, 343 С

4. Halliwell В. // Free Radicals in Biochemistry and Medicine. Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine. Ed. R.A. Meyers, Wiley-VCH Verlag, 2004, V.4, P. 633-649

5. Зиновьева B.H., Спасов A.A. //Окисление ДНК при патологиях, сопряженных с окислительным стрессом. Успехи совр. биологии, 2004, Т. 124, С. 144-156

6. Чучалин А.Г. //Система оксиданты-антиоксиданты и пути медикаментозной коррекции. Пульмонология, 2004, Т. 2, С. 111-115

7. Winyard P.G., Moody C.J., Jacob С. //Oxidative activation of antioxidant defence. Trends Biochem. Sci., 2005, V. 30, P. 453-461

8. Chae H.Z., Chung S.J., Rhee S.G. //Thioredoxin-dependent peroxide reductase from yeast. J. Biol. Chem., 1994, V. 269, P. 27760-27678

9. Peshenko I.V., Novoselov V.I., Evdokimov V.A., Nikolaev Yu.V., Shuvaeva T.M., Lipkin V.M., Fesenko E.E. //Novel 28-kDa secretory protein from rat olfactory epithelium. FEBS Letters, 1996, V. 381, P. 12-14

10. Okado-Matsumoto A., Matsumoto A., Fujii J., Taniguchi N.//Peroxiredoxin IV is secretable protein with heparin-binding properties under reduced conditions. J. Biochem. (Tokyo), 2000, V. 127, P. 493-501

11. Immenschuh S., Baumgart-Vogt E. //Peroxiredoxins, oxidative stress, and cell proliferation. Antioxidants & Redox Signaling, 2005, V. 7, P. 768-777

12. Kim K., Rhee S.G., Stadtman E.R. //Nonenzymatic cleavage of proteins by reactive oxygen species generated by dithiothreitol and iron. J. Biol. Chem., 1985, V. 260, P. 15394-15397

13. Brunori M., Rotilio G. //Biochemistry of oxygen radical species. Methods Enzymol., 1984, V. 105, P. 22-35

14. Kim K., Kim I.H., Lee K-Y., Rhee S.G., Stadtman E.R. //The isolation and purification of a specific "protector" protein which inhibits enzyme inactivation by a thiol/Fe(III)02 mixed-function oxidation system. J. Biol. Chem., 1988, V. 263, P. 4704-4711

15. Kim I.H., Kim K., Rhee S.G.//Induction of an antioxidant protein of Saccharomyces cerevisiae by 02, Fe3+, or 2-mercaptoethanol. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, V. 86, P. 6018-6022

16. Jacobson F.S., Morgan R. W., Christman M.F., Ames B.N. //An alkyl hydroperoxide reductase from Salmonella typhimurium involved in the defense of DNA against oxidative damage. Purification and properties. J. Biol. Chem., 1989, V. 264, P. 1488-1496

17. Chae K.Z., Kim 1.1!., Kim K., Rhee S.G. //'Cloning, sequencing, and mutation of thiol-specific antioxidant gene of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem., 1993, V. 268, P. 16815-16821

18. Lim Y.S., Cha M.K., Kim H.K., Kim I.H. //The thiol-specific antioxidant protein from human brain: gene cloning and analysis of conserved cystein regions. Gene, 1994, V. 140, P. 279-284

19. Torian B.E., Flores B.M., Stroener Y.L., Hagen F.S., Stamm W.E. //cDNA sequence analysis of a 29-kDa cysteine-rich surface antigen of pathogenic Entamoeba histolytica. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V. 87, P. 6358-6362

20. O'Toole P.W., Logan S.M., Kostrzynska M„ Wadstrom T., Trust T.J. //Isolation and biochemical and molecular analyses of a species-specific protein antigen from the gastric pathogen Helicobacter pylori. J. Bacteriol., 1991, Y.173, P.505-513

21. Yamaguchi R., Matsuo K., Yamazaki A., Takahashi M., Fukasawa Y., Wada M., Abe C. //Cloning and Expression of the gene for the Avi-3 antigen of Mycobacterium avium and mapping of its epitopes. Infection and Immunity, 1992, V. 60, P. 1210-1216

22. Prosperi M-T., Ferbus D., Karczinski I., Goubin G. //A human cDNA corresponding to a gene overexpressed during cell proliferation encodes a product sharing homology with amoebic and bacterial proteins. J. Biol. Chem., 1993, V. 268, P. 11050-11056

23. Shau H., Gupta R.K., Golub S.H. //Identification of a natural killer enhancing factor (NKEF) from human erythroid cells. Cell. Immunol., 1993, Y. 147, P. 1-11

24. Yamamoto T., Matsui Y., Natori S., Obinata M. //Cloning of a houskeeping-type gene (MER5) preferentially expressed in murine erythroleukemia cells. Gene, 1989, V. 80, P.337-343

25. Ishii T., Yamada M„ Sato H., Matsue M., Taketani S., Nakayama K., Sugita Y., Bannai S. //Cloning and characterization of a 23-kDa stress-induced mouse peritoneal macrophage protein. J. Biol. Chem., 1993, V.268, P. 18633-18636

26. Kawai S., Takeshita S., Okazaki M., Kikuno R., Kudo A., Amann E. //Cloning and characterization of OSF-3, a new member of the MER5 family, expressed in mouse osteoblastic cells. J. Biochem. (Tokyo), 1994, V. 115, P. 641-643

27. Watabe S., Kohno H., Kouyama H., Hiroi T., Yago N., Nakazawa T. //Purification and characterization of a substrate protein for mitochondrial ATP-dependent protease in bovine adrenal cortex. J. Biochem. (Tokyo), 1994, Y. 115, P. 648-654

28. Iwahara S., Satoh. H., Song D-X., Webb J., Burlingame A.L., Nagae Y„ Muller-Eberhard U. //Purification, characterization, and cloning of a heme-binding protein (23 kDa) in rat liver cytosol. Biochemistry, 1995, V.34, P. 13398-13406