Структура и функции новых белков респираторного эпителия rSec14p и rYm1olf тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

Ильницкая Елена Вячеславовна

СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ НОВЫХ БЕЛКОВ РЕСПИРАТОРНОГО ЭПИТЕЛИЯ г8ес14р и гУпііогї

02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

2 0 СЕН 2012

Москва-2012

005047083

005047083

Работа выполнена в лаборатории белков гормональной регуляции Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научный руководитель: доктор химических наук

Шуваева Татьяна Маратовна

Официальные оппоненты: Румш Лев Давидович, доктор

химических наук, профессор, ИБХ РАН, руководитель подразделения

Бабаков Алексей Владимирович, доктор биологических наук, профессор, ГНУ ВНИИСБ РАСХН, руководитель подразделения

Ведущая организация: Государственный научный центр

Российской Федерации ФГУП Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Защита диссертации состоится 10 октября 2012 года в 10 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.019.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу 117997, ГСП-7, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан 10 сентября 2012 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор физико-математических наук

В.А. Олейников

л? -.Л.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Функцией эпителиальных тканей организма, как пограничного образования, непосредственно контактирующего с кислородом воздуха, является обмен веществ между организмом и окружающей средой. Некоторые из этих тканей, в том числе обонятельный и респираторный эпителии, покрыты слизью, являющейся первым защитным барьером, обеспечивающим нормальное функционирование клеток эпителия и, следовательно, всего организма в целом. В условиях постоянного роста влияния на человека техногенных воздействий, изучение механизмов нарушения невосприимчивости организма к внешним условиям вызывает постоянный интерес.

Несмотря на значительные события, произошедшие за последние годы в развитии понимания механизмов, обеспечивающих барьерную функцию слизистых воздухоносных путей, клинического разнообразия условий, способствующих патологии процессов, и, как следствие, фармакотерапии, непрекращающийся рост социально-значимых бронхо-легочных заболеваний (астма, аллергия) приводит к выводу, что их причины многофакторны, далеко не все участники развития процесса идентифицированы и изучены, так как выделение природных белковых соединений в индивидуальном виде имеет свои специфические трудности. Поэтому большой фундаментальный и практический интерес представляет задача поиска и определения новых молекул белков-аутоантигенов, способствующих хронизации воспалительных процессов слизистых, специфических маркеров и белков, формирующих проницаемость защитного слоя тканей, контактирующих с внешней средой. Эти вещества потенциально могут служить сначала основой системы выявления факторов риска - критериями прогнозируемое™ рецидивирующего течения, а затем и лекарственных препаратов, корректирующих вышеупомянутые заболевания. Исходя из вышесказанного, структурно-функциональное изучение белков респираторного эпителия представляется значимым и интересным.

В лаборатории белков гормональной регуляции ИБХ в слизи обонятельного эпителия крысы были идентифицированы новые секреторные белки: основной антиоксидант контактирующих с окружающей средой тканей пероксиредоксин VI (PrxVI, Peshenko, 1998) и 5ес14р-подобный белок (rSecl4p, Merkulova, 1999). Анализ аминокислотной последовательности rSecl4p показал, что в его составе присутствует липид-связывающий домен SEC 14. rSecl4p широко представлен в слизистых оболочках эпителиальных тканей (его содержание в обонятельной выстилке составляет ~ 2 % от всех водорастворимых белков), формируя защитный слой контактирующих с внешней средой клеток, но его биохимическая и физиологическая роль была неизвестна. В 2009 году с использованием аллергических животных моделей (Shan L., 2009) была выявлена обратная зависимость между уровнем экспрессии гена rSecl4p и степенью хронизации болезни. Недавнее исследование этих же авторов (Shan L., 2011) на трахее

показало, что уменьшение экспрессии мРНК rSecl4p в патофизиологических условиях, предусматривающих использование внешних воздействий, вызвано только гибелью клеток реснитчатого эпителия, в которых белок синтезируется, а не изменением уровня экспрессии его гена. Это обстоятельство сдерживает прогресс в понимании механизмов естественной невосприимчивости организма и требует дальнейших исследований rSecl4p в условиях других патофизиологических моделей.

Открытием, с которым в последние годы связывается надежда на выявление новых перспективных терапевтических мишеней развития воспалений, явилось обнаружение в организмах млекопитающих представителей семейства гликогидролаз 18 - хитиназ и хитиназоподобных белков (chitinase-like proteins, CLPs). Показано, что накопление того или иного члена семейства гликогидролаз 18 является отрицательным прогностическим маркером многих заболеваний самой различной этиологии.

В данной работе описаны исследования структуры и функций двух новых секреторных белков обонятельного эпителия, вовлеченных в иммунный ответ организма, - липидсвязывающего rSecl4p и защитного хитиназоподобного белка rYmlolf.

Цель и задачи исследования

Данная работа является частью исследований, проводимых в ИБХ РАН по поиску и изучению белков, участвующих в обеспечении нормального функционирования эпителиальных тканей. Цель диссертационной работы состояла в определении функциональной роли белка rSecl4p, поиске и идентификации его возможных биологических партнеров, а также структурно-функциональной характеризации новых белков, синтезирующихся на разных стадиях развития воспалительных реакций в слизистых оболочках. Для достижения поставленной цели потребовалось решить следующие задачи:

1. Выделить природный rSecl4p в гомогенном состоянии, оценить уровень его экспрессии в патологически измененных объектах;

2. Идентифицировать новый обнаруженный белок обонятельного эпителия (в последствии назван нами rYmlolf), определить его полную аминокислотную последовательность, клонировать его структурный ген;

3. Разработать животную модель воспалительного заболевания в отсутствие внешних раздражителей и исследовать функциональную роль белков rSecl4p и rYmlolf на разных стадиях развития защитной реакции организма.

Научная новизна и практическая значимость работы

В процессе исследования белок rSecl4p был получен в гомогенном состоянии, создана модель экспериментальных животных, на которой впервые было продемонстрировано резкое увеличение его количества в условиях острого воспаления по сравнению с контролем. При этом обнаружен новый ранее неизвестный белок с молекулярной массой 43 кДа.

С помощью масс-спектрометрии проведена идентификация нового белка и установлена его частичная аминокислотная последовательность. Выяснено, что он относится к семейству гликогидролаз 18, резкое увеличение синтеза и секреции представителей которого в условиях формирования иммунной защиты, ассоциировано со слизистыми оболочками. В соответствии с местом локализации (epithelium olfacctorium) и подобием с мышиным белком Yml, новый белок назван нами rYmlolf

Определена и проанализирована полная нуклеотидная последовательность гена, кодирующего rYmlolf обонятельного эпителия крысы, включая участки его 5'- и З'-нетранслируемых областей. Определена структура его мРНК. Последовательность полноразмерной кДНК rYmlolf депонирована в международную базу данных GenBank (под номером JF781276).

Установлена последовательность предшественника зрелой формы rYmlolf крысы. Полноразмерный зрелый белок rYmlolf содержит 380 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 42986 Да. При этом подтверждены ранее полученные данные о том, что хитин не является обязательным антигеном для индукции синтеза хитиназоподобных белков.

Разработаны и созданы крысиные модели с синдромами острого системного и хронического воспалений. С помощью ПЦР-анализа в реальном времени показано резкое синхронное увеличение уровней экспрессии rYmlolf и rSecl4p в обонятельной выстилке модельных животных с острым воспалением на первые сутки, что говорит о совместном вовлечении этих белков в иммунный ответ организма. Все представленные в данной работе результаты получены впервые и приоритетны. Сделанные выводы весьма перспективны для возможного выявления изучаемого нами белка rSecl4p как показателя развития воспалительных заболеваний воздухоносных путей.

Поскольку накапливание белков подсемейства CLPs в тканях является отрицательным прогностическим маркером многих воспалительных заболеваний самой различной этиологии, rYmlolf может стать потенциальной терапевтической мишенью при заболеваниях дыхательных путей.

Апробация работы

По теме диссертационной работы опубликованы 3 статьи в рецензируемых научных журналах. Результаты работы представлены на российских и международных конференциях: Международной конференции FEBS «Новые концепции липидологии: от липидомики до болезней» (SM06-07) (Нидерланды, Нарвайкерхуд, 2006); IV и V Российских симпозиумах «Белки и пептиды» (Казань, 2009, Петрозаводск, 2011); Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю. А. Овчинникова (Москва, 2009); X чтениях памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2011); XX Международной конференции и

дискуссионном научном клуб «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, Украина, 2012).

Структура диссертации

Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов и экспериментальной части, основных выводов и списка цитируемой литературы, включающего ссылок. Материал иллюстрирован рисунками и таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

К началу настоящей работы в нашей лаборатории при изучении белкового состава слизи обонятельного эпителия крысы методом Ds-Na-ПААГ-электрофореза был обнаружен новый водорастворимый высокопредставленный белок (порядка 2% от всех водорастворимых белков обонятельного эпителия) rSecl4p с молекулярной массой ~ 45 кДа.

Была определена последовательность кДНК этого крысиного белка (GenBank AJ132352) и показано, что в его состав входит характерный для многих липид-переносящих белков, так называемый, «8ЕС14»-домен (по названию дрожжевого белка Secl4p, в котором он впервые был обнаружен, и поэтому получил название rSec!4p) и «GOLD» (Golgi dynamics)-flOMeH, определяющий белок-белковые взаимодействия. Было установлено, что специфическим гидрофобным лигандом rSecl4p из обонятельного эпителия крысы является фосфатидилинозит-3,4,5-трифосфат (PtdIns(3,4,5)P3).

1. Изучение функциональных свойств rSecl4p. Обнаружение нового белка

Ранее в результате двугибридного поиска партнеров изучаемого нами белка rSecl4p, его вероятными партнерами идентифицированы несколько белков иммунной системы (Меркулова М.И., 2005). Повышенный интерес среди них вызвали белки, чей синтез резко возрастает при воспалении и нейродегенеративных изменениях: секретоглобин - защитный белок, медиатор противовоспалительных процессов, CCL5 (RANTES) - хемокин, медиатор противовоспалительных процессов, и эндоглин (CD 105) - цитокин, участвующий в гемопоэзе, сердечно-сосудистом развитии и ангиогенезе, компонент рецепторного комплекса трансформирующего ростового фактора pi. Учитывая высокую степень представленности rSecl4p в обонятельной выстилке, и тот факт, что слизистая оболочка является типичным местом развития иммунных реакций, очевидно вовлечение этого белка в защитные ответные реакции организма. На данном этапе представлялся важным подбор подходящей модели животных для исследования нашего белка. С одной стороны, модель должна сопровождаться воспалительными

процессами, отражающимися на слизистой оболочке дыхательных путей, но, с другой, нельзя было допускать непосредственного воздействия препаратов, используемых для создания модели, на эпителиальные клетки, поскольку изменение уровня мРНК может также вызываться дегенерацией или некрозом клеток эпителиального слоя воздухоносных путей, синтезирующих 8ес14р-подобные белки. Поэтому нами было решено оценить уровень rSecl4p в обонятельной выстилке крыс с хроническим воспалением, вызванным инъекцией р-амилоидного пептида и иботеновой кислоты, что является моделью болезни Альцгеймера (Morimoto К., 1998). Данная модель предусматривает длиннодистантные эффекты и характеризуется накапливанием таких белков воспаления, как интерлейкины (IL)-lp, 1L-6,1L-8, фактор некроза опухоли-а (TNFct), моноцитарный хемоаттрактивный белок-1 (МСР-1), макрофагальный белок воспаления-1 (MIP-la) и хемокин CCL5.

1.1. Оценка уровня синтеза rSecl4p в обонятельной выстилке крыс с хроническим воспалением

Для проверки уровня синтеза rSecl4p были использованы 2 группы крыс линии Вистар (по 5 животных каждая): группа 1 — животные с синдромами хронического воспаления (модель болезни Альцгеймера), вызываемая инъекцией Р-амилоидного пептида в количестве 2 мкг и иботеновой кислоты в количестве 0,5 мкг на каждую сторону гиппокампа и контрольная группа 2 - крысы, содержащиеся в нормальных условиях, которым интрацеребрально вводили физраствор. Животных выводили из эксперимента через 21 день путем транслокации шейных позвонков. Эксперименты с использованием контрольных животных и имеющих синдромы хронического воспаления проводились параллельно. Изолированный обонятельный эпителий подвергали обработке на льду в ручном гомогенизаторе Поттера в буферном растворе, содержащем ЗОмМ Tris-HCl, рН 7,4 и 150 мМ NaCl. Супернатант после центрифугирования при 12 000g в течение 15 мин диализовали и использовали для выделения белка. В результате очистки с помощью ионообменной хроматографии на DEAE-сефацеле (рис.1) в пробирках 71-78 по данным электрофореза в ПААГ накапливался rSecl4p. Картина хроматографического разделения изотонических экстрактов обонятельных выстилок контрольных и экспериментальных крыс была идентична. Содержимое указанных пробирок объединяли и проводили высаживание с помощью 9% метанола. Выход белка составил примерно 100 мкг из 5 крыс. Анализ общего белкового водорастворимого экстракта и очищенного препарата rSecl4p осуществлялся с помощью ЭФ в ПААГ.

При электрофоретическом анализе белкового экстракта обонятельной выстилки контрольных животных в ПААГ присутствовала полоса, соответствующая подвижности rSecl4p (рис.2). В обонятельной выстилке

модельных крыс с синдромами хронического воспаления денситометрически было обнаружено незначительное увеличение количества гвесЫр.

Рис. 1. Хроматограмма разделения изотонического экстракта обонятельного эпителия крыс с хроническим воспалением на ЭЕАЕ-сефацеле. Указано положение пика, обогащенного белком гБес14р с молекулярной массой ~ 45 кДа. Номера собираемых фракций отложены по оси абсцисс.

Однако, помимо гёесНр, здесь же была выявлена заметная полоса белка с меньшей молекулярной массой (примерно 43 кДа), которая не проявлялась антителами к гБесЫр (рис. 2, дорожки 4, 5). Сравнение белковых профилей двух групп животных свидетельствовало о том, что в обонятельной выстилке экспериментальных крыс идет накопление нового белка, имеющего близкую с г8ес14р ИЭТ и совыделяющегося с ним при ионообменной хроматографии.

1.2. Определение уровня экспрессии гена г8ес14р в обонятельной выстилке крыс с хроническим воспалением

Из замороженных, измельчённых в жидком азоте образцов обонятельных выстилок двух групп животных выделяли суммарную РНК, которую обрабатывали ДНК-азой; качество РНК проверяли электрофорезом в 1% агарозном геле в присутствии бромида этидия. Количество РНК

определяли на спектрофотометре по поглощению при длине волны 260 нм. Далее обратной транскрипцией получали кДНК. Для анализа относительной экспрессии данного гена проводили ПЦР-анализ в реальном времени (в трех повторах) с использованием в качестве внутреннего контроля крысиный ген глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (САРЭН).

1 2 3 4 5

47 - г8ес14р

34-

?

-

Рис. 2. Электрофоретический анализ в 12.5 % БОБ-ПААГ водорастворимых белков обонятельной выстилки крыс с окрашиванием геля кумасси 11-250 (дорожки 1, 2, 3, 4) или с помощью вестерн-блота с иммунохштческой идентификацией гБесНр (5); 1- белковые стандарты молекулярных масс, кДа, 2- экстракт выстшок животных 2 -ой (контрольной) группы, 3- экстракт выстилок животных 1-ой группы (с хроническим воспалением), 4, 5 — очищенный препарат гБесЫр (фракции 71-78), полученный после разделения экстракта водорастворимых белков из обонятельных выстилок животных 1-ой группы с помощью ионообменной хроматографии. Разведение первичных антител 1:750, вторичных - 1:5000. Проявление методом хемилюминисцентной детекции (ЕСЬ).

Показано, что уровень экспрессии гена белка гвесМр в ткани животных с моделью болезни Альцгеймера, сопровождающейся хроническим воспалением, увеличивается более, чем в 10 раз по сравнению с контрольной группой (табл. 1). Однако разброс значений количества транскриптов гена гБесНр в обонятельной выстилке индивидуальных животных с этой моделью оказался очень значительным. Это можно объяснить тем, что мы работали с небольшой группой крыс, выборка из пяти животных может даль лишь оценочное представление об уровне экспрессии гена.

2. Идентификация нового белка из обонятельного эпителия крысы

Для идентификации нового полипептида было решено определить его частичную аминокислотную последовательность и установить истинную молекулярную массу.

Таблица 1. Сравнение относительных уровней экспрессии мРНК гБес!4р в обонятельной выстилке контрольных крыс и с хроническим воспалением

I-группа животных (п=5) Медиана (1; 3 квартиль) II- группа животных (п=5) Медиана (I;3 квартиль)

Относительный уровень экспрессии мРНК rSecl4p 1,2 (0,37; 1,88) 15,1 (13,2; 18,3)

2.1. Определение N-концевой аминокислотной последовательности

Из-за ограниченной доступности модельных животных и подобия физико-химических свойств rSecl4p и сопутствующего белка с молекулярной массой 43 кДа, выделение очищенного препарата последнего было весьма сложной задачей. Но, учитывая тот факт, что N-концевой остаток rSecl4p блокирован, определение N-концевой последовательности нового белка было решено провести на смеси двух белков. После переноса белков частично очищенной фракции (пробирки 71-78, рис.1) на поливинилидендифторидную мембрану с помощью автоматического газофазного секвенатора (Applied Biosystem 470А, США) была установлена аминокислотная последовательность 11 остатков:

YQLMCYYTSWA

Эта структура не имела гомологии с аминокислотной последовательностью rSecMp, но полностью соответствовала N-концевой структуре одного из представителей семейства гликогидролаз 18 - хитиназоподобного секреторного белка мышиных перитониальных макрофагов Yml, активно экспрессирующегося в условиях заражения животного Trichinella spiralis (Chang N.C., 2001).

На основании полученных данных было высказано предположение о принадлежности белка из обонятельной выстилки крысы, имеющего в ПААГ подвижность ~ 43 кДа, к подсемейству CLPs, но индуцирование синтеза которого не связано с хитином. В соответствии с местом локализации (epithelium olfacctorium) он был назван «rYmlolf».

2.2. Масс-спектрометрический анализ белка rYmlolf

Для определения истинной молекулярной массы rYmlolf белковую полосу с кажущейся подвижностью в области 43 кДа вырезали из ПААГ, гомогенизировали и анализировали с помощью масс-спектрометрии. Как видно из рис. 3, экспериментально определённый молекулярный вес rYmlolf (самый интенсивный пик) составляет 42986 Да. Минорный пик m/z 45935 соответствует следовой примеси белка rSecl4p.

ят эмм

оме 7ММ ЯЛ

Рис. 3. Масс-спектр белка г¥т!о1/. Условия: МАЬ01-времяпролетно-времяпролетный масс-спектрометр ИНгсфех II ВКЬ'СЕИ (Германия).

2.3. Определение частичной аминокислотной последовательности гУт1о1Г

С целью определения аминокислотной последовательности полосу ПААГ, содержащую гУт1о1Г, вырезали и подвергали трипсинолизу. Образовавшиеся в результате гидролиза низкомолекулярные фрагменты экстрагировали из ПААГ и анализировали с помощью масс-спектрометрии. Молекулярные массы обнаруженных в масс-спектре ионов сравнивали с расчетными массами ожидаемых пептидов, образующихся при гидролизе трипсином хитиназоподобных белковых структур, имеющих в своем составе фрагмент, идентичный экспериментально установленной Ь'-конпевой аминокислотной последовательности гУт1о!Г Регистрационные пики идентифицированных фрагментов исследуемого белка на рис. 4 отмечены соответствующим значением [М+Н]+.

Результаты анализа триптического гидролизата гУш1о1Г суммированы в табл. 2. Таким образом, была установлена первичная структура уникальных 10 пептидов, в сумме содержащих 112 аминокислотных остатков.

Рис. 4. Масс-спектр триптического гидролизата г¥т1о1/. Значения т/: указаны над идентифицированными пиками. Условия: МАЬ01-времяпролетно-времяпролетный масс-спектрометр иЬгаАех II ВЯиСЕЯ (Германия).

Таблица 2. Аминокислотные последовательности триптических фрагментов гУт!о1/

Номер пептида Масса пептида [М+Н] Местоположение ам иио кислотных остатков в цепи гипотетического белка ХР 001069857 Последовательность пептида*

1 886.6 334-340 K..I1CAQWLK

2 906.6 367-374 R.FPLTSTLK

3 958.6 82-90 K..TLLAIGGWK.

4 1002.6 336-343 1C.AQWLKDNK.

5 1088.6 159-167 K..ESTEQE1PR

6 1374.8 143-153 K..HLFSVLVQEMR

7 1563.8 155-167 K..AFEKESTEQEIPR

8 1667.8 122- 135 K..FDGLNLDWQYPGSR

9 1696.8 91-106 K..FGSAPFSAMVSTPQNR

10 2056.9 375-391 K..HYLGVQSTNCMAYKEEL

* К. ши Я. соответствуют предполагаемым аминокислотным остаткам лизина или аргинина, по которым происходил гидролиз трипсином, предшествующих последовательности пептидов.

2.4. Сравнение полученных результатов с базой данных GenBank

В результате сопоставления изученных пептидов со структурами белков, хранящихся в базе данных, стало ясно, что rYmlolf действительно относится к семейству гликогидролаз 18 и проявляет заметное сходство с секреторным белком Yml мыши. В литературе его также часто называют «ECF-L» или эозинофил-хемотактическим фактором, впервые, как уже было упомянуто, он идентифицирован в перитониальных макрофагах, его следы были обнаружены в условиях регенерации нейронов после повреждения обонятельной выстилки мыши (Chang N.С., 2001).

В базе данных GenBank выведенных белковых последовательностей крысы наиболее близким к изучаемому нами белку оказался гипотетический белок СЫ313 (ХР_001069857), или Yml по аналогии с мышиным белком. Ген Chi3l3 распространен только среди грызунов, и на мышах он достаточно хорошо изучен.

С целью определения полной аминокислотной последовательности зрелого природного rYmlolf крысы проведено сравнение структуры пептидов с гипотетической структурой СЫ313. На рис. 5 видно, что, за исключением пептида № 10, экспериментальные триптические пептиды идеально укладываются в структуру СЫ313.

Транслированная мРНК MAKLILATGSSYQLMCYYTSWAKDRPTVGSFKIGNIDPCL 40 Эксперимент, пептиды YQLMCYYTSWA

Транслированная мРНК CTHLIYAFAGMRNNEIINTSEQDLIDYEAINYLKDRNTEL 80 Транслированная мРНК KTLLAIGGWKFGSAPFSAMVSTPQNRQTFIKSVIKFLRQY 120 Эксперимент, пептиды TLLAIGGWKFGSAPFSAMVSTPQNR

Транслированная мРНК KFDGLNbDWQYPGSRGSPPKDKHLFSVLVQEMRKAFEKES 160 Эксперимент, пептиды FDGLNLDWQYPGSR HLFSVbVQEMR AFEKES

Транслированная мРНК TEQEIPRLLLTATVAGVIDTIQSGYKIPELSQSLDYFQVM 200 Эксперимент, пептиды TEQBIPR

Транслированная мРНК TYNLHDFQNGYTRENSPLYQSPSDTGIYAYLNVDAIISYW 240 Транслированная мРНК KDNGAAREKLIVGFPAYGHNFILSDPSNTGINAPIVSTGP 280 Транслированная мРНК PGKFTGEAGLWAYYEICTFLNDGATDLWDGPQEVPYAVQG 320 Транслированная мРНК NVWVGYDNVKSFKIKAQWLKDNKLGGAMVWPLDMDDFTGS 360 Эксперимент, пептиды IKAQWLKDNK

Транслированная мРНК FCQQGRFPLTSTLKHYiGVQSTSK 384

Эксперимент, пептиды FP'LTST'LKHYLGVQSTNCMAYKEEL

Рис. 5. Сравнение структур экспериментально полученных пептидов с последовательностью транслированной мРНК гипотетического белка крысы сЫПпаье З-Пке 3 (СЫ313) ХР_001069857. Нижней строчкой представлены последовательности экспериментальных пептидов. С-Концевые фрагменты гипотетического белка СЫ313 и пептида № 10 выделены курсивом. Не совпадающие аминокислотные остатки выделены красным цветом.

Аминокислотная последовательность 8 N-концевых остатков 17-членного триптического пептида № 10 полностью совпадает со структурой His375 - Thr382 , расхождения наблюдаются только в его С-концевой области, а именно, не совпадают лишь последние 2 аминокислотных остатка СЫ313 (рис. 5): Ser383 —♦ Asn, a Lys384 —» Cys. Кроме того, экспериментальный пептид на С-конце имеет дополнительный участок длиной в 7 аминокислотных остатков. Поскольку на С-конце пептида № 10 остатков аргинина или лизина обнаружено не было и молекулярная масса зрелого белка, имеющего в качестве N-концевого остаток Туг, составляет 42986 Да (рис. 3), было предположено, что пептид №10 является С-концевым фрагментом rYmlolf, белок кодируется геном СЫ313, но 3'-концевая область нуклеотидной последовательности гена, представленная в базе данных, требует уточнения.

3. Установление последовательности полноразмерной кДНК rYmlolf из обонятельной выстилки крысы

Следующим этапом представленной работы стало установление полной нуклеотидной последовательности кДНК rYmlolf. Для эксперимента была выбрана модель животных с эндотоксикозом (крысам внутрибрушинно вводилась доза липополисахарида (ЛПС) 1,5 мг/кг), характеризующаяся острым воспалением. ЛПС - компонент клеточной стенки грамотрицательных бактерий, он запускает каскад внутриклеточных реакций, вызванных образованием на клеточной мембране комплекса с TLR-4 (toll like receptors - TLR-4), что способствует продукции провоспалительных цитокинов. Высокий уровень эндотоксина в крови приводит к развитию патологических процессов, в том числе синдрому системного воспалительного ответа.

3.1. Получение фрагмента кДНК, кодирующего белок rYmlolf

Из ткани обонятельной выстилки модельных животных выделена стабильная фракция суммарной РНК. Построенная в ходе ревертазной реакции суммарная двуцепочечная кДНК (дц-кДНК) послужила матрицей для получения полноразмерной кДНК rYmlolf. На основании ранее полученных данных об N-концевой структуре белка и структуре пептида №10 были синтезированы вырожденные праймеры rYmlolfForvNcol 5'- TA(Y)CA(R)(Y)T(N)ATGTG(Y)TA(Y)TA(Y)AC(N)(W)(S)(N)TGGGC - 3' и rYM-IolfRevBamHI

5'- (N)A(R)(Y)TC(Y)TC(Y)TT(R)TA(N)GCCAT(R)CA(R)TT(N)GT(N)(S)(W) -3' (где Y- С/Т, R- A/G, N- A/C/T/G, W- A/T, S- G/C), фланкирующие кодирующую область гена. Амплифицированный с помощью данной пары праймеров продукт длиной примерно 1150 п.о клонировали в вектор pGEM-Т. Анализ клонов на наличие вставки проводили при помощи ПЦР с

использованием стандартных праймеров, комплементарных последовательности вектора рСЕМ-Т.

В результате секвенирования последовательности вставки отобранных клонов был полностью установлен уникальный фрагмент размером 1140 п.о., кодирующий полноразмерный гУт1о1Г(рис. 6).

ТАТСАССТСАТСТССТАСТАТАССАСТТССССТААССАСАСАССААСАСТАСССАСТТТСАААА ТТСССААТАТТСАСССТТСТСТСТСТАСССАСТТСАТСТАТСССТТТССТСССАТССССААТАА ТСАСАТТАТСААСАСААСТСАССАССАСТТСАТТСАСТАТСААССААТАААТТАТСТСАААСАС АССААСАСТСАССТАААААСТСТССТССССАТТССАСССТССААСТТТССАТСТССССССТТСА стсссатсстстстастсстсасаасссссасасаттсатсааатсастсатсаааттссттсс ССАСТАТААСТТТСАТССССТСААСТТССАСТСССААТАСССТСССТСТССТССААССССТССТ ААССАСАААСАТСТСТТСАСТСТССТССТССАССАААТСССТАААСССТТТСАСАААСААТСТА СТСАССААСАААТСССААСССТССТТСТСАСТСССАСАСТАССТССАСТСАТТСАСАСААТССА стстссттасаасаттсстсаастстстсастсасттсастаттттсаастсатсасататаат стссатбатттссасаатссттасастасасаааатастсссстстатсаатстссатсссаса стссаатататссстатстсаатстссатссаатсатаасстастссаассаааатсссссасс тсстсасаасстсаттстсссатттссассататссссатаастттатсстсастсасссстст аасастссааттаатссссстаттстсастастсссссассасссаасттсасасстсаассас састстссссттастатсасатттссасатттстсаатсатссасссастсатстстсссатсс сссссассаастассстатссссттсассссаатстатсссттссттатсатаатстсаасасс ттсаасаттаассстсастссстсаассасаасаааттассасстссаатсстстсссссстсс асатссатсасттсастссттстттстстсаасасссаассттссстттсасттстастттааа ссаттатстасстстасасастасаааттстатсссттатааасассасстт

Рис. 6. Нуклеотидиая последовательность гена (1140 п.о.), кодирующего белок гУт1о1/.

3.2. Определение 5"- и З'-нетранслируемых областей гУш1о1Г

Для получения последовательности 5'- и 3'- нетранслируемых областей (НТО) гена, кодирующего белок гУт1оИ', суммарная дц-кДНК из обонятельной выстилки крысы замыкалась в кольцо с помощью Т4 ДНК-лигазы и использовалась в качестве матрицы для инвертированной ПЦР с помощью специфических праймеров, комплементарных концевым областям кодирующей части гена (рис. 7)

дц-кДНК

^ Т4 днк-лиг«а

-ААААС -ТТП<=

кодирующая область кднк 3*НТагУга1«НГог 111 5НП>*Тт1 I

-АЛЛА 1=^-11 'ССГ.С-

- птт <=31=3 сссс-тг;

з'-нто "" - ^ 5'-нто

Рис. 7. Схема получения нетранслируемыхучастков кДНК гУт!о1/.

3'НТО-гУш1о№ог 5'- СТСОАСАТССАТСАСТТСАСТСО - 3" и 5,НТО-гУт1о!А1еу 5'- ССАААСССАТАСАТСААСТСОО - 3\

Продукт амплификации длиной около 700 п.о., содержащий нетранслируемые области и участки кодирующей последовательности, клонировали в вектор рСЕМ-Т и определяли его структуру (рис. 8).

CGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATG3CCGCGGGATT \

CTGGACATGGATGACTTCACTGGfrTCTTTCTGT CAGGGAAGGTTCCCTTTGACTTCTACTTTAAAGCATTATCTAGGTGTACAGAGTACAAATT TATGGCTTATAAAGAGGAGCTTT

1

_gJCTGGTAATTTGTCCTTGAACCTATCAGATTAAGAGC

AAATTCAAACAGCTTTTCCATAGTGGATTCTGTATCACCCTTCGAAGGAGAATAATAGCAAT AAATCCTGGGCTTGCCTGAATTGAATCCCAGAGCAGTACTACTAAAATGGATGTCCTGTCTG CTGTACCAGCTAAGAAGAAACCAAGAATGGCCTTCATCTCTCTGCTTTTTGCTAATCTCTGA ACATTGCTTGCTTCCTGCAAAACTACCTTGCATGTTTCTGGCTTTCATAATAAATTCCACAT TCAAAATACCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA^GTACrCTGCGTrGATACCACrGCTTj /jGGTATCAACGCAGAGTACGGGGG^GAAATCCTGAAGACACCATGGCCAAGCTCATTCTTG CCACAGGTCTAGCAATTCTTCTGTATGCACACCTGGGATCTTCC

»TACCAGCTGATGTGCTAC TATACCAGTTGGGCTAAGGAGAGACCAACAGTAGGGAGTTTCAAAATTGGCAATATTGACCC TTGTCTGTGTACCCACTTGATCTATGCCTTTG

AA7CAi-rAA,7<k:<;:*:;-: a-at. a:a:AjA :gaccatatgggagag CTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTGGCG7AAT

1- 1Ш(Ш»Ш 3- 1ВВЯШЯ 5- NNNNNNN

4- \NNNNNmH

6- NNNNNNN

Рис. 8. Нуклеотидная последовательность продукта амплификации кДНК на кольцевой матрице, содержащей 5'- и 3 '-нетранслируемые области. Условные обозначения: 1 - последовательности полилинкера вектора pGEM-T, 2 - последовательности праймеров З'НТО-YmlolfFor и 5'HTO-YmlolfRev, 3 - участки последовательностей, кодирующих С- и N-концевые фрагменты зрелого белка Ymlolf крысы, 4 - последовательности праймеров «CDS-I adapter» и «PlugOligo-1 adapter» («Евроген», Россия), использованных для синтеза сулшарной дц-кДНК, 5 - последовательность, кодирующая лидерный пептид, б - 5'- и 3'- нетранслируемые последовательности полноразмерной кДНК Ymlolf крысы. Указаны границы клонированного в вектор pGEM-T фрагмента размером около 700 п. о. (\...у и место сшивания концов дц-кДНК в ходе инвертированного лигирования (../..). Большим шрифтом выделены инициирующий кодон АТС и стоп-кодон ТАА кодирующей области г Ymlolf.

3.3. Определение полноразмерной последовательности кДНК и аминокислотной последовательности белка rYmlolf

При сопоставлении данных о нетранслируемых областях с кодирующей последовательностью гена была установлена полная нуклеотидная последовательность зрелой мРНК rYmlolf. На рис. 9 представлена нуклеотидная последовательность полноразмерной кДНК rYmlolf, включающая 1545 п.о.

_И Д

5'- :::::т: | Атксс^^дстслттстсссАса^стстаосллттсттсте ео г а в ь а б в у о ь м су у т г и а к е 13

RPTVGSFKIGHIDPCI.CTHI.33

AGACCAACЛGTAoC^^GTTTCлAAATTGGCAATATTGACCCXTGTCTGTGTЛCCCACTTG 130

1УАРАвМКЫНЕ11НТ5ЕОР1.53 АТСТАТСССТГТССТССОАТССЗСЛАТААТЙА^АТТАТО^САСАЛетСАССАЕСАСГТС 240

1ОУЕА1НХЬК0КНТЕЬК Т Ь X. 73 АТТС^ХТАтААЗСААТАААТТАТСТа^ 300

9...У __5 5 А Р У .4 АМУв Т Р О 93

И Я <2ТГ1К8УХКРЬ110ТК Т Р С ИЗ

ААСССССАаАСАТТСАТСАААТСАОТСАТСАААТТССТТСОССАЗТАТААСГГХСАХй^С 420

ьиьрястРбзн о э р р к р к н_ь 133

саас;. 7!^^сла;ассс:^^с,с^тосда^ссстссглЛсслсладсл:стс 480 У8УЬу0ИМККАУЕКЕ8ТЕ0_Е 153 ТТС£^Т&1ССТО-3^ьСАООААА1 ;ЗС07АААЗСЗТТ7 ОА:^^А£АЛ7С7АСТ£АьСАА1*АА 540 I Р К ЬЬЬТАТУАОУ! Б Т I О Б С 173 А7С^СЛЛ^"'^5~ТТСТСАСТе"САСА27А^СТООАОТСл7ГаАСАСДАТССАСТСТС.ЗТ 600 ТК1РЕ1.8031.0Т70УМТТПХ. 193 ТАСйАСАТТССТСААСТСТСТСАСТСАСТТСАСТАТТТТСААЗТСАТСАСАТАТААТСТС 660 НРР<2ПСУТ11ЕЫЗР1.У05РЗР 213 САТСАТТТССАа^ТССТТЛСАСТ-ЛАСА^А~АСТССССТСТАТОи\ТСТССАТСССАС 720 ТСХУАУ1.НУРА118У»»КЕНе233 АСТССААТАТАТСССГАТСТСААТгТССАТСа'АТСАТААЗСТАСТОСААССААААТССС 780 ДАЛЕК1.ХУвРРАУвННР11.8 253 0СА9СТССТСАСААССТСАТТСТСССАГТТССАССАТАТС<;^АТАчСТТГ.".ТССТЗАСТ 040 РР5НТ51ЫАР1У5ТвРР6КР273 САССССТСТААСАСТ5СААТТ.гАТСССССТА-ГГетСАЗТАСТ&оССС=.ССАСССААеТТС 900 ТСЕАвЬЯАУУЕ1СТР1.НРСА293 АСАОСТаААССАССАСТСТЭСССТ7АСТЛТСАСЛТТТЗС71САТТТСТСААТаАТСа?.ССС 960 ТРЬИРвРОЕУРУАУОСЫУНУ313 АСТСАТСТСТСССАТСаЗССССАССА^.ЗТАСССТЛТССС-ТТТСАССОСА^ГОТАТСССТТ 1020

вУРНУКвРК I К А О И I. К Р Н К Ь 333 ССТТАТОАТААТСТСААХАЗСТТСААСА! 1ААи^ХСА^1ь^ГСААььА.С.ААСАААТТА 1060

СвАМУИРЬРМРРУТевГСОО 353 СаАСЗТССААТССТСТСЗССССТСаАСАТСоАТСАСГТСАСТСгтТСТТТСТСТСААСАЕ 1140

® к р р I- Т,_Б_ к,_н у ъ д у о э т н е 373

СОАА^£77ССС77 7ьАС7 *С7АС1 - . !■_■■..^ 1А7 С^А037С1АСАьАС7АСААА11 "^Т 1200 М А У К Е Е Ь • 380

АТьесттАТАААьА&ЗА^сигдА:. • '-: г т:"; :■■: ; ■ :.; л .:- : 1260

• • • • • • : \ • 1320

лг7 . : • -••..-. 1380

:. • . • • • . • • г.::: г:::: :тг::г: :г:лг 1440

• • • . •' ::: • . 1500

.. •/л: : • , • - • - з> 1545

Рис. 9. Последовательность полноразмерной кДНК и выведенная аминокислотная последовательность белка г )'т I о!/. Нижняя строчка -нуклеотидная последовательность, включающая 5 '-нетранслируемый участок (выделен серьш цветом), инициирующий кодон АТС (выделен курсивом жирным шрифтом), Козак-последовательноть (выделена рамкой), кодирующую область, стоп-кодон ТАА (выделен курсивом жирным шрифтом), 3 '-нетранслируемый участок и подчеркнутый пунктиром полиаденилированный «хвост» (выделены серьш г^ветом). Верхняя строчка — аминокислотная последовательность г\'т1о1/, подчеркнуты М-концевой участок и триптические пептиды, структуры которых установлены экспериментально.

Данная последовательность депонирована в международную базу данных GenBank, и ей присвоен номер JF781276.

Учитывая данные N-концевого анализа природного rYmlolf крысы, мы предположили, что последовательность предшественника зрелой формы rYmlolf крысы включает в себя 21-членный лидерный пептид (MAKLILATGLAILLYAHLGSS), а последовательность зрелого белка начинается с мотива YQLMCYYTSWA. Полноразмерный белок rYmlolf крысы содержит 380 аминокислотных остатков. Значение [М+Н]+ природного образца исследуемого белка, согласно данным масс-спектрометрического анализа, составляло 42986, в то время как рассчитанная суммированием усредненных атомных масс элементов масса цепи, состоящей из 380 остатков, дает величину 42949 Да. С учетом точности определения Aír (± 20) белков с помощью масс-спектрометрии, эти данные позволяют предположить, что rYmlolf действительно состоит только из 380 остатков и, несмотря на присутствие в его полипептидной цепи потенциального участка гликозилирования (47-49, рис. 9), зрелый белок не модифицирован.

Определенная нами последовательность полноразмерной кДНК, подтвержденная секвенированием кДНК-клона в векторе pGEM-T, не совпала с геномной последовательностью гипотетического гена Chi3l3 (ХМ_001069857), предсказанного автоматическим компьютерным анализом с помощью метода GNOMON. Аминокислотная последовательность белка rYmlolf, кодируемого геном СМ313, которая была подтверждена триптическим анализом природного rYmlolf крысы, соответственно, также не совпала с транслированной последовательностью белка, кодируемого геном Chi3l3, представленной в базе данных GenBank (рис. 5).

В предложенной в базе данных гипотетической последовательности мРНК Chi313 (XM 001069857), неверно предсказан ее З'-концевой участок. Благодаря полученным нами данным была уточнена экзон-интронная организация гена Chi3l3. А именно, мы определили, что последовательность экзона X короче на 9 п.н.о. (они относятся к следующему интрону), а ген содержит дополнительный экзон XI. Более того, экзон I имеет большую длину, чем представлено в базе данных (рис. 10).

4. Структурные особенности белков семейства гликогидролаз 18

Анализ доменной организации нового белка показал, что большую его часть составляет консервативный Глико_18 домен, присущий всем членам семейства гликогидролаз 18. В это белковое семейство входят как активные хитиназы - ферменты, способные катализировать реакцию деградации хитина, и хитиназоподобные белки, или CLPs, гидролазной активностью не обладающие, но способные связываться с углеводами, вследствие чего получившие название хитолектинов. Некоторые из них содержат в своем составе хитин-связывающий домен.

СЫ313 NCBI (Gene ID: 295151)

Ген, кодиру ющий rYmlolf

25 30 о 5 ж <7 16« 125 124 is* 120 150

■ ■ я .....■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ m

1 п iii iv v vi vii мп ix x

12 30 202 57 16« 125 124 1!« 120 141 м-

■ Я ■ ■ ■ ■ ■ ■

i п iii iv v vi vii мп ix x xi

Рис. 10. Сравнение экзон-интронной организации гена Chi313 (Rattus norvegicus), представленной в базе данных GenBank (Gene ID: 295351) и гена, кодирующего белок rYmlolf. Интроны обозначены серыми блоками, экзоны -черными, их длина указана сверху. Порядок расположения экзонов в гене указан снизу римскими цифрами. Подчеркнуты экзоны, последовательности которых были уточнены.

Гидролитическая активность всех представителей семейства 18 гликогидролаз определяется наличием каталитического остатка глутаминовой кислоты в последовательности DXDXE (где D -аспарагиновая кислота, Х-любая аминокислота, Е-глутаминовая кислота), расположенной, как правило, через один остаток после консервативного трипептида FDG (рис. 11). Последовательность каталитического центра rYmlolf на участке 115-119 имеет вид NLDWQ, т.е. по сравнению с канонической структурой содержит замены D на N и Е на Q. Поскольку этот участок входит во фрагмент, чья структура была определена экспериментально (триптический пептид 8 (122-135), см. таблицу 2), можно с уверенностью сказать, что rYmlolf действительно является хитиназоподобным белком, гидролитической активностью обладать не может, и его появление в эпителиальной ткани воздухоносных путей, ассоциированной со слизистыми оболочками, не связано с активацией иммунной системы хитин-содержащими патогенами.

При сравнении последовательности нового идентифицированного белка с другими членами семейства гликогидролаз 18 человека в NCB1 выяснилось, что ортолога изучаемому белку нет, а наиболее близкой к нему является истинная хитиназа млекопитающих (АМС-аза) — у них 68% идентичности, но которая имеет еще дополнительно хитин-связывающий домен. Известно, что АМС-аза (acid mammalian chitinase, кислая хитиназа млекопитающих) экспрессируется главным образом в желудке и нижнем отделе легких при аллергических заболеваниях и астме.

А

26

365

гУтЮ1Г

Вф39

ЕЕ - Глико 18 домен

_ -Хтин-свяшвающнй домен

АМС-аза

Хитотриозидаза

Б

гУтIо1Г FDGLNLDWG Вф39 FDGLDLAWL АМС-аза РОС1.Ш.О\УЕ Хитотриозидаза FDGLDLDWE

Рис. 11. Доменная организация (А) и структура каталитических центров (Б) представителей семейства гликогидролаз 18 крысы. Положение каталитического центра указано стрелками. Существенные аминокислотные остатки выделены жирным шрифтом. Консервативная последовательность /■"■ОС, предшествуюгцая каталитическому мотиву, выделена серым цветом.

Было сделано наложение пространственной модели гУт1о1£ созданной на основе разрешенной структуры мышиного Ут1, и структуры человеческой АМС-азы. Очевидно, что при таком значительном сходстве аминокислотных последовательностей, пространственные структуры этих белков практически совпадают (данные не приведены).

На мышиных моделях аллергического воспаления, ранее показано, что АМС-аза и Ут! экспрессируются в разных отделах такого анатомически вытянутого органа, как трахея, АМСазе — в дистальном и Ут1 — в проксимальном отделах трахеи, при их единовременной экспрессии в альвеолярных макрофагах. А также известно, что человеческая АМС-аза синтезируется в виде полноразмерной формы - 50 кДа, но в тканях обнаружена изоформа размером 39 кДа, которая образуется в результате протеолитического процессинга - после отщепления С-концевого хитин-связывающего домена. Более того, показано, что утрата АМС-азой хитиназной активности в результате мутации каталитического центра, не отражается на некоторых биологических функциях этого белка (Наги О., 2009). То есть для выполнения своих функций в организме человеческой АМС-азе наличие гидролазной активности не всегда важно.

Учитывая все вышеуказанное и помня о высокой идентичности человеческой АМС-азы и крысиного гУт1о!£ было сделано предположение о том, что изучаемый нами крысиный гУш1о№ и укороченная форма человеческой АМС-азы могут являться функциональными аналогами.

5. Исследование уровней экспрессии генов белков rYmlolf и rSecl4p из обонятельной выстилки крыс на модели острого воспаления

В работе (Shan L. et al, 2009), посвященной взаимосвязи уровня экспрессии липид-связывающего rSecl4p и воспаления слизистых оболочек, сообщалось об обратной зависимости степени воспаления (в первые двое суток после инъекции животных овальбумином) и уровня экспрессии крысиного rSecl4p, которая объяснялась изменением функций эпителиальных клеток в процессе развития воспаления воздухоносных путей. Эти данные не согласуются с нашими предположениями о взаимосвязи хитиназоподобного rYmlolf, который ассоциирован с защитными процессами организма, и по аналогии с мышиным гомологом, является медиатором воспаления, и липид-связывающего rSecl4p, ведь мы продемонстрировали резкое увеличение количества rSecl4p и появление rYmlolf при хроническом воспалении (модель болезни Альцгеймера). Для выяснения этих разногласий решено было на следующем этапе работы сравнить уровни экспрессии мРНК rYmlolf и rSecl4p в клетках обонятельного эпителия крыс с эндотоксикозом, вызываемым введением липополисахарида (ЛПС) и сопровождающимся острым воспалением. Важным при этом было сохранение целостности клеток обонятельного эпителия, непосредственно экспрессирующих rSecHp. ЛПС Е. coli штамма 026:В6 («Sigma», США) вводили внутрибрюшинно в дозе 1,5 мг/кг, исследования проводили на 1 или 7 сутки после введения ЛПС. Для получения статистически значимых результатов число животных в каждой группе составляло 10 штук.

В нашем эксперименте об активации иммунитета животных судили по уровню их цитокинов: интерлейкинов 2, 4, 6, 12, ФНОа, интерферону-/. А о том, что модель состоялась (развился синдром системного воспалительного ответа) подтверждали результаты морфологических исследований тимуса и печени. Оценку цитокинового профиля и морфологические исследования для нас любезно провела с.н.с. НИИ морфологии человека РАМН Косырева A.M. Уровни экспрессии мРНК rYmlolf и rSecl4p в тканях крыс с острым воспалением через 1 сутки или через 7 суток сравнивали с таковыми у контрольных (интактных) крыс. Суммарную РНК выделяли из замороженных, измельчённых в жидком азоте образцов обонятельных выстилок трех групп животных, обрабатывали ДНК-азой, качество РНК проверяли электрофорезом в 1% агарозном геле в присутствии бромида этидия. Количество РНК определяли на спектрофотометре по поглощению при длине волны 260 нм. С помощью обратной транскрипции получали кДНК. Для анализа относительной экспрессии генов, кодирующих белки rYmlolf и rSecl4p, проводили ПЦР-анализ в реальном времени (в трех повторах) с использованием в качестве внутреннего контроля гены крысиных белков ß-актина (ßAct) и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH).

Показано, что количество мРНК белка гУт1о1Г в ткани животных с острым воспалением на первые сутки увеличивается в 22,6 раза (р<0,05) (А), а гена г8ес14р в 5,4 раза (р<0,05) (Б) по сравнению с контрольной группой (рис. 12).

А

+

Нижняя квартихъ Минюиум Медиана Максимум Верхняя квартиль

Т

Рис. 12. Сравнение уровней экспрессии генов, кодирующих белки гУт!о1/ и гБес14р, из обонятельных выстилок контрольной (К) и экспериментапьных групп животных с острым воспалением на 1 и 7 сутки после инъекции ЛПС (Л1 и Л7). Количество транскриптов гена белка г)'т1о1/ в ткани животных с острым воспалением на первые сутки увеличивается в 22,6 раза (р<0.05) (А), а гена гБес14р в 5,4 раза (р<0.05) (Б) по сравнению с контрольной группой. На седьмые сутки эксперимента значительного увеличения уровней экспрессии этих генов по сравнению с контролем не наблюдалось.

Таким образом, мы подтвердили свои предположения: протекание воспалительных процессов сопровождается усилением экспрессии гена защитного липид-связывающего белка, обильно содержащегося в слизистой оболочке обонятельного эпителия.

На седьмые сутки эксперимента наблюдалось значительное уменьшение уровней экспрессии этих генов по сравнению с их экспрессией на 1-е сутки, морфологическая выраженность воспалительных и

дистрофических изменений органов иммунной системы снижалась, животные выздоравливали.

Такое значительное увеличение уровня экспрессии гена, кодирующего белок гУт1о1£ при остром воспалении и его снижении при выздоровлении позволяет назвать уровень мРНК этого белка перспективным критерием прогнозируемое™ течения заболевания. Поскольку при остром воспалении резкому возрастанию уровня экспрессии гена белка гУт1о^ сопутствует увеличение уровня гена белка гБесМр, а при выздоровлении животных уровни экспрессии этих генов близки к контрольным, можно говорить о совместном вовлечении этих белков в иммунный ответ организма.

6. Проверка экспрессии гена СИ1314 в обонятельной выстилке крысы

Как уже упоминалось выше, при идентификации выделенного нами нового полипептида проводилось сравнение его частичной аминокислотной последовательности со структурами белков крысы, внесенных в базу данных СепВапк. Помимо С.Ы313 другим наиболее гомологичным оказался белок, кодируемый геном СЫ314 (73% идентичности). И поскольку этот крысиный белок является гипотетическим, предсказанным методами КЕГ8ЕС). и, по литературным данным должен всегда сопутствовать синтезу СЫ313, было решено проверить, экспрессируется ли ген СЫ314 наряду с С/уЗ/З в обонятельной выстилке крыс в данной модели патофизиологии.

На матрице суммарной дц-кДНК из обонятельной выстилки контрольных и модельных животных с помощью пары праймеров, созданных на основе нуклеотидной последовательности гена крысы СЫ314, представленной в базе ОепВапк, была предпринята попытка получить уникальные фрагменты методом полуколичественной ОТ-ПЦР (рис. 13). В качестве контроля использовали ген «домашнего хозяйства» р-актин.

Рис. 13. Экспрессия мРНК СЫ314 и СЫ313 (кодирующего гУт1о1]) и /3-актина (использовался в качестве контроля) в обонятельной выстилке контрольных (К) и модельных (М), с острым воспалением, крыс. Продукты ОТ-ПЦР (30-й цикл) электрофоретически разделены в 2%-м агарозном геле.

В этих же условиях была проверена экспрессия гена СЫ313, кодирующего rYmlolf, на уникальных праймерах rYmlolfFor и rYmlolfRev.

Таким образом, экспериментально было подтверждено отсутствие экспрессии в обонятельной выстилке крыс гена СЫ314, наиболее близкого к изучаемому крысиному гену в данной модели воспаления.

ВЫВОДЫ

1. Подобрана животная модель с хроническим воспалением, на которой показано увеличение уровня экспрессии гена и белка rSecl4p по сравнению с контрольной группой.

2. В обонятельной выстилке крыс с моделью хронического воспаления обнаружен и идентифицирован новый белок rYmlolf, определена его частичная аминокислотная последовательность и принадлежность к семейству гликогидролаз 18. Установлено, что белок кодируется геном

сыт.

3. Установлена последовательность полноразмерной кДНК rYmlolf, которая депонирована в GenBank под номером JF781276, уточнена экзон-интронная организация гена СЫ313 крысы. Установлена полная 380-членная аминокислотная последовательность нового белка rYmlolf крысы, определена последовательность предшественника его зрелой формы.

4. Изучена экспрессия генов, кодирующих rYmlolf и rSecl4p в обонятельной выстилке животных с моделью острого воспаления. Показано совместное вовлечение этих белков в иммунный ответ организма - резкое увеличение количества их транскриптов (гена rYmlolf в 22,6 раза, а гена rSecl4p в 5,4) по сравнению с контрольной группой.

5. Высказано предположение, что уровень экспрессии гена, кодирующего белок rYmlolf, может являться перспективным критерием прогнозируемости течения воспалительного процесса.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ильницкая Е.В., Радченко В.В., Косырева A.M., Шуваева Т.М., Липкин В.М. Клонирование и анализ последовательности зрелой мРНК нового хитиназоподобного белка крысы, экспрессирующегося в патологических условиях. ДАН 2011, 439 (6), с. 835-837.

2. Радченко В.В., Ильницкая Е.В.. Третьяков В.Е., Серебрякова М.В., С торожева З.И., Шуваева Т.М., Липкин В.М. Идентификация в обонятельном эпителии крысы нового хитиназоподобного белка подгруппы YM-1. Биоорган.химия 2010, 36 (5), с. 646-653.

3. Ильницкая Е.В.. Шамборант О.Г., Радченко В.В., Шуваева Т.М., Липкин В.М. Связывание БесН-подобного белка с молекулярной массой 45

кДа из обонятельного эпителия крысы с фосфатидилинозит-3,4,5-трифосфатом в липосомах. Биоорган.химия 2006, 32 (3), с. 335-336.

Тезисы докладов:

1. Ильннцкая Е.В.. Радченко В.В., ШуваеваТ.М., Липкин В.М. Новые защитные белки обонятельного эпителия rSEC14p и rYMlolf. XX международная конференция и дискуссионный научный клуб «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». Гурзуф, Украина 2012. Сборник тезисов, с. 119.

2. Шуваева Т.М., Ильннцкая Е.В., Радченко В.В., Липкин В.М. Новый хитолектин крысы в животных моделях с синдромом системного воспалительного ответа. X чтения памяти академика Ю.А. Овчинникова, Москва-Пущино 2011. Сборник тезисов, с. 91.

3. Ильннцкая Е.В., Радченко В.В., Родионова А.С., Шуваева Т.М., Липкин В.М. Идентификация нового хитиназоподобного белка крысы в модели острого воспаления. V Российский симпозиум «Белки и пептиды», Петрозаводск 2011. Сборник тезисов, с. 278.

4. Радченко В.В., Ильннцкая Е.В., Третьяков В.Е, Сторожева З.И., Шуваева Т.М., Липкин В.М. Новый белок обонятельного эпителия крысы, экспрессирующийся в патофизиологических условиях. Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю. А. Овчинникова, Москва 2009. Сборник тезисов, с. 333.

5. Ильннцкая Е.В., Радченко В.В., Третьяков В.Е., Родионова А.С., Шуваева Т.М., Липкин В.М. Обнаружение нового хитиназоподобного белка крысы, экспрессирующегося в условиях нейродегенеративных изменений. IV Российский симпозиум «Белки и пептиды», Казань 2009. Сборник тезисов, с. 112.

6. Radchenko V. V., Il'nitskava Е. V.. Shuvaeva Т. М., Tret'yakov V. Е., Lipkin V. М. A new method for lipid transport studying in vitro: The tool for identification unknown lipid binding proteins and their hydrophobic ligands determining lipid metabolism pathology. The FEBS Special Meeting «New concepts in lipidology: from lipidomics to disease (SM06-07)» Noordwijkerhout 2006. Abstr., p. 109.

Подписано в печать:

03.09.2012

Заказ № 7566 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 \vww.autoreferatru

Список сокращений

Введение

1.Хитиназы и хитиназоподобные белки (Литературный обзор)

1.1. Хитин и хитозан

1.2. Хитинолитические ферменты

1.3. Семейство гликогидролаз

1.4. Представители семейства гликогидролаз 18 млекопитающих

1.4.1. Истинные хитиназы млекопитающих

1.4.2. Хитиназоподобные белки млекопитающих

1.5. Специфичность хитиназоподобных белков

1.6. Уровень экспрессии генов хитиназ и хитиназоподобных белков в организмах млекопитающих в условиях синдрома иммунного воспаления

1.6.1. Инфецирование млекопитающих микроорганизмами

1.6.2. Аллергия и астма

1.6.3. Окислительное повреждение тканей

1.6.4. Неопластические образования 47 Заключение

2. Результаты и обсуждение

2.1. Изучение функциональных свойств гБесНр

2.1.1. Оценка уровня синтеза гБесНр и обнаружение нового белка гУпйо^ в обонятельной выстилке крыс с хроническим воспалением

2.1.2. Определение уровня экспрессии гена гБесИр в обонятельной выстилке крыс с хроническим воспалением

2.2. Идентификация нового белка гУш1о1Гиз обонятельной выстилки крысы

2.2.1. Определение Ы-концевой аминокислотной последовательности

2.2.2. Масс-спектрометрический анализ белка гУт1о1Г

2.2.3. Определение частичной аминокислотной последовательности гУш1о1Г

2.2.4. Сравнение полученных результатов с базой данных вепВапк

2.3. Установление последовательности полноразмерной кДНК и полной первичной структуры белка гУт1о^ из обонятельной выстилки крысы 65 2.3.1. Подбор экспериментальной модели животных с острым воспалением

2.3.2. Получение фрагмента кДНК, кодирующего белок гУпйоН"

2.3.3. Определение 5'- и 3"-нетранслируемых областей кДНК гУт1о^

2.3.4. Определение полноразмерной последовательности кДНК и аминокислотной последовательности белка гУт 1 оИ

2.4. Структурные особенности белка гУт1о^ - представителя семейства гликогидролаз

2.5. Исследование уровней экспрессии генов белков гУт1о^ и гБес14р из обонятельной выстилки крыс на модели острого воспаления

2.6. Проверка экспрессии гена СЫ314 в обонятельной выстилке крысы 80 Заключение

3. Экспериментальная часть

3.1. Материалы

3.1.1. Реактивы

3.1.2. Бактериальные штаммы и плазмидные векторы

3.1.3. Буферы и растворы

3.2. Модели животных

3.3. Методы исследования

3.3.1. Выделение и очистка природного гБес 14р из обонятельной выстилки крыс

3.3.2. Получение моноклональных антител к белку гБесМр

3.3.3. Вестерн-блот анализ гБесМр

3.3.4. Выделение суммарной РНК и синтез кДНК

3.3.5. Полимеразная цепная реакция

3.3.6. Количественная ПЦР в реальном времени

3.3.6.1. Определение уровня экспрессии гена г8ес14р в обонятельной выстилке крыс с хроническим воспалением

3.3.6.2. Исследование уровней экспрессии генов белков гУш1о1Г и гБесМр из обонятельной выстилки крыс на модели острого воспаления

3.3.7. Приготовление гистологических срезов

3.3.8. Компьютерная обработка данных

3.3.9. Определение частичной аминокислотной последовательности гУш1о1Г

3.3.10. Получение компетентных клеток и их трансформация

3.3.11. Работы с фрагментами ДНК, их клонирование и определение нуклеотидных последовательностей

4. Выводы

Благодарности 5. Список литературы

Список сокращений

Chi - хитиназа

CID - хитиназный внутренний домен

CLP - хитиназоподобный белок

ЕСМ - внеклеточный матрикс

EGFR - рецептор эпидермального фактора роста

FAK - киназа фокальных адгезий

GH - гликозилгидролазы

IL - интерлейкин

МСР-1 - моноцитарный хемоаттрактивный белок-1 МПМа - макрофагальный белок воспаления-1 а РКВ - фосфатидилкиназа В

PtdIns(3,4,5)P3 - фосфатадилинозит-3,4,5-трифосфат

TGF-ßl - трансформирующий фактор роста-ßl

TIM - триозофосфатизомер

Tregs - Т-регуляторные клетки

ААМф - альтернативно активированные макрофаги

БЛД - бронхолегочная дисплазия

ГМ-КСФ - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

ГСПГ - гепарансульфатпротеогликаны ИНФ - интерферон

ОНП - однонуклеотидный полиморфизм ОРДС - острый респираторный дистресс-синдром ОФВ1 - объемом форсированного выдоха за 1 с ПРР - паттерн-распознающие рецепторы СОПЛ - синдром острого повреждения легких ФАТ - фактор активации тромбоцитов ФНО - фактор некроза опухоли ФРФ - фактора роста фибробластов

Эпителиальные ткани воздухоносных путей млекопитающих как пограничное образование осуществляют обмен веществ между организмом и окружающей средой. Некоторые из этих тканей, например, обонятельный эпителий, покрыты слизью, которая является первым защитным фактором и обеспечивает нормальное функционирование клеток эпителия - самоочищение дыхательной поверхности от экзогенных включений и эндогенных продуктов (с помощью фагоцитоза), неспецифическую бактерицидную защиту (радикальными соединениями, генерируемыми активированными фагоцитами) и специфическую иммунную защиту от инфекционных возбудителей и чужеродных макромолекул. Большая физиологическая значимость процессов регулировки защитных механизмов предопределяет интенсивность исследований белков и компонентов слизи эпителиальных тканей воздухоносных путей как защитного барьера организма.

Неспецифическая иммунная защита слизистых оболочек, выстилающих эпителиальные ткани, является одной из систем, нарушение работы которой приводит ко многим социально значимым, в первую очередь бронхо-легочным, заболеваниям, являющихся огромной проблемой всего мира, и с каждым годом актуальность их исследования лишь возрастает. При инфекционных процессах слизистая дыхательных путей становится местом развития иммунных процессов, которые сами по себе могут оказаться деструктивными. И самый масштабный и неадекватный характер иммунные процессы в слизистой приобретают при развитии гиперергических воспалительных процессов (при аллергии, астме). Несмотря на достигнутый за последние годы прогресс в этой области, в развитии понимания механизмов протекания, клинического разнообразия, условий, способствующих хронизации воспаления, и, как следствие, фармакотерапии, непрекращающийся рост заболеваемости этими патологиями приводит к выводу, что их причины многофакторны, далеко не все участники развития процесса идентифицированы и изучены. Поэтому большой фундаментальный и практический интерес представляет задача определения специфических маркеров, белков, сопричастных появлению и протеканию воспалительных процессов в эпителиальных тканях воздухоносных путей.

Наиболее острой проблемой в последние годы стал резкий рост случаев заболевания бронхиальной астмой, которая характеризуется пожизненным течением и высокой скоростью развития обострения. Как любой воспалительный процесс, эта патология сопровождается инфильтрацией иммунных клеток, однако, остается до конца неясным, что вызывает или способствует постоянному поддержанию концентрации этих клеток при хроническом течении заболевания, то есть, неизвестны факторы, инициирующие хронизацию воспаления.

Открытием, с которым в последние годы связывается надежда на выявление новых маркеров и перспективных терапевтических мишеней развития острого и хронического воспалений, явилось обнаружение в организмах млекопитающих хитиназ и хитиназоподобных белков (chitinase-like protein, CLP) семейства гликогидролаз 18. Накопление представителей семейства CLP является отрицательным прогностическим маркером многих воспалительных заболеваний самой различной этиологии. Имея в споем распоряжении подобные молекулы, можно идентифицировать стадию развития патологического процесса и скорректировать течение заболевания.

К началу настоящей работы в нашей лаборатории при изучении белкового состава слизи обонятельного эпителия крысы методом SDS-ПААГ-электрофореза был обнаружен новый водорастворимый белок, с молекулярной массой ~ 45 кДа, имеющий! в своем составе Sec-14-домен (по названию дрожжевого белка Secl4p, в котором он впервые был обнаружен), или, как принято его обозначать, rSecHp. Значительное содержание (порядка 2% от всех водорастворимых белков обонятельного эпителия) дало основание предположить важную роль rSecl4p в обеспечении нормального функционирования эпителиальных тканей, и, возможно, защитную функцию путем участия в биогенезе мембран клеток. В результате изучения свойств белка rSec Hp и поиска его возможных партнеров на моделях животных с хроническим воспаленном был обнаружен неизвестный белок с молекулярной массой ~ 43 кДа. Определено, что новый белок (назван нами rY::i!o!f) является хитиназоподобным, огпчситея к семейству гликогидролаз 18 и ко.лруется геном Chi3l3. Ve i .повлена последовательность полноразмериой кДНК rYmlolf. Изучение экспрессии генов белков rYmlolf и rSecl4p в обонятельной! выстилке животных с моделью острого воспаления показало совместнее вовлечение этих белков в иммуть.й ответ организма. Предположено, что уровень экспрессии генов гУш1о1Г и г8ес14р может являться критерием прогмо ?и рус мости течения заболевания.

Изучение свойств исследуемых белков позволило углубим, наше понимание проблемы идентификации и развития воспалительных реакций, связанных со слизистыми оболочками. Возможно, новые белки мот быть полезны в фундаментальных исследованиях воспалительных процессов, а также найдут практическое применение в медицине, как маркеры \р шпации воспалений различной этиологии. Походя из вышесказанного, функши мальное изучение белков обонятельно! о ьчмечия, представляется весьма .¡¡¡-'чпмым и интересным.

В работе как сипоншч.! использованы термины «обоняю^ или» и «респираторный» эпителий; и ■ ,!чюи ситуации это допустимо, :,,1ко'1ьку исследование не связано с запа\-е о ¡ьпшющими белками и изучением процесса обоняния, а рассматриваются исключительно защитные функши; белков эпителиальных клеток воздух 01 пи пых путей, так как обонятельи, мчость является частью дыхательных п> г-\

4. Выводы

1. Подобрана животная модель с хроническим воспалением, на которой показано увеличение уровня экспрессии гена и белка гБесМр по сравнению с контрольной группой.

2. В обонятельной выстилке крыс с моделью хронического воспаления обнаружен и идентифицирован новый белок гУт1о1£ определена его частичная аминокислотная последовательность и принадлежность к семейству гликогидролаз 18. Установлено, что белок кодируется геном СЫ313.

3. Установлена последовательность полноразмерной кДНК гУш1о1^ которая депонирована в ОепВапк под номером 1Р781276, уточнена экзон-интронная организация гена СЫ313 крысы. Установлена полная 380-членная аминокислотная последовательность нового белка гУт!о^ крысы, определена последовательность предшественника его зрелой формы.

4. Изучена экспрессия генов, кодирующих гУт1о^ и гБесНр в обонятельной выстилке животных с моделью острого воспаления. Показано совместное вовлечение этих белков в иммунный ответ организма - резкое увеличение количества их транскриптов (гена гУш1о^ в 22,6 раза, а гена гБесНр в 5,4) по сравнению с контрольной группой.

5. Высказано предположение, что уровень экспрессии гена, кодирующего белок гУт1оН", может являться перспективным критерием прогнозируемое™ течения воспалительного процесса.

Благодарности вюр сердечно б iaiодарил чнена-корреспонден ia РАН Линкипа Валерия Михайловича я д.х н ПКваев\ I ai ьян\ Мараювпу за нлодо] ворныс дискчссии. совеiы и весьма цепные кришчеекис замечания к диссер]анионной рабо 1е

Автор гл\боко призшиетсп всем коллетам нз лаборатории белков гормональной рсг\ляции и. в особенное!и. Радченко Вшалию Владиславовичу за ботып\ю пракгичсск\ ю помощь в данной paooie.

Необходимо oiMciHib большею пракшческ)ю помощь колiici высококвалифицированных спсциалнеюв из др\iих инсштов. Сюрожсвой Зинаиды Ивановны и5 Hncnmia нормальной фишолоши им ПК Анохина РАМН. I peiьякова Вадима Свюиьевича и Серебряковой Марины Владимировны из 11а\ чно-иеследова1сльеко1 о инешта физико-химическои медицины. Косыревои Анны Михайловны из Пахчно-исслсдовагсльского иноита морфоло! ии человека РЛМП, без \часгия которых выполнение поставленных за щч было бы невозможным

Авюр 1л}боко нризтпетеп дмн Макаровой Олые Васи прение - рхководшелю шбораюрии иммуноморфоло! ии воспаления На\ чно-псспедовалеиьско1 о инешта морфоло!ии человека РАМН, ока;авшей неоцепим) ю помощь в подготовке жеперимешальных. биомедицинских по (ходов и обс\ж ieп 11 и рсз\льгаюв. связанных с их возможным применением в медицине

Pa6oia выполнялась при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ 11-04-00761) и Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» ( Липкин В.М.)

1. Скрябин К.Г., Вихорева Г.А., Варламов В.П. Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение. М.: Наука. 2002. - 368 с.

2. Muzzarelli R.A. Chitins and Chitosans as Immunoadjuvants and Non-Allergenic Drug Carriers. Mar. Drugs 2010. V. 8. P. 292-312.

3. Goodday G.W. The ecology of chitin degratiotic. In: Marshall K.C., ed. Advance in microbial ecology. V. 11. New York: New Plenum Press. 1990. 387-430.

4. Da Silva C.A., Chalouni C., Williams A., Hartl D., Lee C.G., Elias J.A. Chitin is a size-dependent regulator of macrophage TNF and IL-10 production. J Immunol. 2009. V. 182. P. 3573-3582.

5. Nishimura K., Nishimura S., Nishi N., Saiki I., Tokura S., Azuma I. Immunological activity of chitin and its derivatives. Vaccine. 1984. V. 2. P. 93-99.

6. Da Silva C.A., Pochard P., Lee C.G., Elias J.A. Chitin particles are multifaceted immune adjuvants. Am J Respir Crit Care Med. 2010. V. 182. P. 1482-91.

7. Cantarel B.L., Coutinho P.M., Rancurel C., Bernard Т., Lombard V. The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics. Nucleic Acids Res. 2009. V. 370. P. 233-238.

8. Nakamura Т., Mine S., Hagihara Y., Ishikawa K., Uegaki K. Structure of the catalytic domain of the hyperthermophilic chitinase from Pyrococcus furiosus. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 2007. V. 63. P. 7-11.

9. Jia Z., Sun Y., Yuan L., Tian Q., Luo K. The chitinase gene (Bbchitl) from Beauveria bassiana enhances resistance to Cytospora chrysosperma in Populus tomentosa Carr. Biotechnol Lett. 2010. V. 32. P. 1325-1332.

10. Arakane Y, Muthukrishnan S. Insect chitinase and chitinase-like proteins. Cell Mol Life Sci. 2010. V. 67. P. 201-216.

11. Seibold MA, Donnelly S, Solon M, Innes A, Woodruff PG, Boot RG, Burchard EG, Fahy JV. Chitotriosidase is the primary active chitinase in the human lung and is modulated by genotype and smoking habit. J Allergy Clin Immunol. 2008. V. 122. P.944-950.

12. Hoell IA, Dalhus B, Heggset EB, Aspmo SI, Eijsink VGH. Crystal structure and enzymatic properties of a bacterial family 19 chitinase reveal differences from plant enzymes. FEBS J. 2006. V. 273. P. 4889-4900.

13. Johnson L.N. The early history of lysozme. Nat. Struct. Mol Biol 1998. V. 5. P. 942-944.

14. С.Д. Варфоломеев Химическая энзимология. — M.: Издательский центр "Академия". 2005. — С. 238-239.

15. Robertus J.D., Monzingo A.F. The structure and action of chitinases. EXS. 1999. V. 87. P. 125-135.

16. Suzuki S, Nakanishi E, Furihata K, Miyamoto K, Tsujibo H, Watanabe T, Ohnishi Y, Horinouchi S, Nagasawa H, Sakuda S. Chitinase inhibitor allosamidin promotes chitinase production of Streptomyces generally. Int J Biol Macromol. 2008. V. 43.P. 3-9.

17. Baban J., Fjeld S., Sakuda S., Eijsink V.G., Sorlie M. The roles of three Serratia marcescens chitinases in chitin conversion are reflected in different thermodynamic signatures of allosamidin binding. J Phys Chem B. 2010. V. 114. P. 6144-6149.

18. Lienemann M., Boer PL, Paananen A., Cottaz S., Koivula A. Toward understanding of carbohydrate binding and substrate specificity of a glycosyl hydrolase 18 family (GH-18) chitinase from Trichoderma harzianum. Glycobiology. 2009. V. 19. P. 1116-1126.

19. Funkhouser J.D., Aronson N.N., Jr. Chitinase family GH18: evolutionary insights from the genomic history of a diverse protein family. BMC Evol Biol. 2007. V. 7. P. 96-112.

20. Kawase Т., Saito A., Sato Т., Kanai R., Fujii T. et al. Distribution and phylogenetic analysis of family 19 chitinases in Actinobacteria. Appl Environ Microbiol. 2004. V. 70. P. 1 135-1144.

21. Huang Q.S., Xie X.L., Liang G., Gong F., Wang Y., Wei X.Q., Wang Q., Ji Z.L., Chen Q.X. The GH18 family of chitinases: their domain architectures, functions and evolutions. Glycobiology. 2012. V. 22. P. 23-34.

22. Li H , Gieene L H Sequence and Structural Analysis of the Chitinase Insertion Domain Reveals Two Conserved Motifs Involved in Chitin-Bindmg PLoS One 2010 V 5 P 8654

23. Norberg A L , Dybvik A I, Zakariassen H , Moimann M , Peter-Katalmic I, Eijsink V G , Soilie M Substiate positioning in chitinase A, a processive chito-biohydiolase from Senatia maicescens FEBS Lett 2011 V 585 P 2339-2344

24. Schuelei-Fuiman O , Bakei D Conserved lesidue clustering and protein structure piediction Proteins 2003 V 52 P 225-235

25. Park J A . Drazen J M . Tschumperhn D J The chitinase-like protein YKL-40 is secreted by airway epithelial cells at base line and m response to compiessive mechanical stress J Biol Chem 2010 V 285 P 29817-29825

26. Hartl D . He C H . Kollei B , Da Silva C A , Kobayashi Y , Lee C G , Flavell R A, Elias IA Acidic Mammalian Chitinase Regulates Epithelial Cell Apoptosis via a Chitinolytic-Independent Mechanism J Immunol 2009 V 182 P 5098-5106

27. Steck E. Breit S. Bieusch SJ. Axt M, Richter.W Enhanced expiession of the human chitinase 3-like 2 gene (YKL-39) but not chitinase 3-like 1 gene (YKL-40) in osteoaithntic caitilage Biochem Biophys Res Commun 2002 V 299 P 109-115

28. Cai Y., Kumar R.K., Zhou J., Foster P.S., Webb D.C. Yml/2 promotes Th2 cytokine expression by inhibiting 12/15(S)-lipoxygenase: identification of a novel pathway for regulating allergic inflammation. J Immunol. 2009. V. 182. P. 5393-5399.

29. Lee C.G., Da Silva C.A., Delà Cruz C.S., Ahangari F., Ma B., Kang M.J. He C.H., Takyar S., Elias J.A. Role of chitin and chitinase/chitinase-like proteins in inflammation, tissue remodeling, and injury. Annu Rev Physiol. 2011. V. 73. P. 479501.

30. Bussink A.P., Speijer D., Aerts J.M., Boot R.G. Evolution of mammalian chitinase(-like) members of family 18 glycosyl hydrolases. Genetics. 2007. V. 177. P. 959-970.

31. Saitou N., Nei M. The number of nucleotides required to determine the branching order of three species, with special reference to the human-chimpanzee-gorilla divergence. J Mol Evol. 1986. V. 24. P. 189-204.

32. Lundblad G., Hederstedt B., Lind J., Steby M. Chitinase in goat serum. Preliminary purification and characterization.Eur J Biochem. 1974. V. 46. P. 367-376.

33. Den Tandt W.R., Inaba T., Verhamme I., Overdyk B., Brouwer J., Prieur D. Non-identity of human plasma lysozyme and 4-methylumbelliferyl-tetra-N-acetyl-beta-D-chitotetraoside hydrolase. Int J Biochem. 1988. V. 20. P. 713-719.

34. Den Tandt W.R., Scharpe S. Micromethod determination of N-acetyl-alpha-D-glucosaminidase in human leukocytes and study of some of its characteristics. Int J Biochem. 1993. V. 25. P. 209-212.

35. Hollak C.E., van Weely S., van Oers M.H., Aerts J.M. Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease. J Clin Invest. 1994. V. 93. P. 1288-1292.

36. Kzhyshkowska J., Gratchev A., Goerdt S. Human chitinases and chitinase-like proteins as indicators for inflammation and cancer. Biomark Insights. 2007. V. 2. P. 128-46.

37. Bargagli E., Maggiorelli C., Rottoli P. Human chitotriosidase: a potential new marker of sarcoidosis severity. Respiration. 2008. V. 76. P. 234-238.

38. Boot R.G., Blommaart E.F., Swart E., Ghauharali-van der Vlugt K., Bijl N., Moe C., Place A., Aerts J.M. Identification of a novel acidic mammalian chitinase distinct from chitotriosidase. J Biol Chem. 2001. V. 276. P. 6770-6778.

39. Sutherland T.E, Maizels R.M., Allen J.E. Chitinases and chitinase-like proteins: potential therapeutic targets for the treatment of T-helper type 2 allergies. Clin Exp Allergy. 2009. V. 39. P. 943-955.

40. Homer R.J., Zhu Z., Cohn L., Lee C.G., White W.I., Chen S., Elias J.A. Differential expression of chitinases identify subsets of murine airway epithelial cells in allergic inflammation. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2006. V. 291. P. 502-511.

41. Hartl D., He C.H., Koller B., Da Silva C.A., Kobayashi Y., Lee C.G., Flavell R.A., Elias J.A. Acidic mammalian chitinase regulates epithelial cell apoptosis via a chitinolytic-independent mechanism. J Immunol. 2009. V. 182. P. 5098-5106.

42. Hakala B.E., White C., Recklies A.D. Human cartilage gp-39, a major secretory product of articular chondrocytes and synovial cells, is a mammalian member of a chitinase protein family. J Biol Chem. 1993. V. 268. P. 25803-25810.

43. Morrison B.W., Leder P. Neu and ras initiate murine mammary tumors that share genetic markers generally absent in c-myc and int-2-initiated tumors. Oncogene. 1994. V. 9. P. 3417-3426.

44. Correale J., Fiol M. Chitinase effects on immune cell response in neuromyelitis optica and multiple sclerosis. Mult Scler. 2011. V. 17. P. 521-531.

45. Bhat K.P., Pelloski C.E., Zhang Y., Kim S.H., deLaCruz C., Rehli M., Aldape K.D. Selective repression of YKL-40 by NF-kappaB in glioma cell linesinvolves recruitment of histone deacetylase-1 and -2. FEBS Lett. 2008. V. 582. P. 3193-3200.

46. Johansen J.S., Pedersen A.N., Schroll M., Jorgensen T., Pedersen B.K., Bruunsgaard H. High serum YKL-40 level in a cohort of octogenarians is associated with increased risk of all-cause mortality. Clin Exp Immunol. 2008. V. 51. P. 260-266.

47. Colton C.A., Mott R.T., Sharpe H., Xu Q., Van Nostrand W.E., Vitek M.P. Expression profiles for macrophage alternative activation genes in AD and in mouse models of AD. J Neuroinflammation. 2006. V. 3. P. 27.

48. Sakata M., Masuko-Hongo K., Tsuruha J., Sekine T., Nakamura H., Takigawa M., Nishioka K., Kato T. YKL-39, a human cartilage-related protein, induces arthritis in mice. Clin Exp Rheumatol. 2002. V. 20. P. 343-350.

49. Tsuruha J., Masuko-Hongo K., Kato T., Sakata M., Nakamura H., Sekine T., Takigawa M., Nishioka K. Autoimmunity against YKL-39, a human cartilage derived protein, in patients with osteoarthritis. J Rheumatol. 2002. V. 29. P. 1459-1466.

50. Chang N.C., Hung S.I., Hwa K.Y., Kato I., Chen J.E., Liu C.H., Chang A.C. A macrophage protein, Yml, transiently expressed during inflammation is a novel mammalian lectin. J Biol Chem. 2001. V. 276. P. 17497-17506.

51. Ward J.M., Yoon M., Anver M.R., Haines D.C., Kudo G., Gonzalez F.J., Kimura S. Hyalinosis and Yml/Ym2 gene expression in the stomach and respiratory tract of 129S4/SvJae and wild-type and CYPlA2-null B6, 129 mice. Am J Pathol. 2001. V. 158. P. 323-32.

52. Korolenko T.A., Cherkanova M.S. Chitotriosidase of human macrophages and mammalian chitinases: biological functions and abnormalities in pathology. Vestn Ross Akad Med Nauk. 2009. V. 11. P. 39-45.

53. Tsai M.L., Liaw S.H., Chang N.C. The crystal structure of Yml at 1.31 A resolution. J Struct Biol. 2004. V. 148. P. 290-296.

54. Waern I., Jia J., Pejler G., Zcharia E., Vlodavsky I., Li J.P., Wernersson S. Accumulation of Yml and formation of intracellular crystalline bodies in alveolar macrophages lacking heparanase. Mol Immunol. 2010. V. 47. P. 1467-1475.

55. Mansour M.K., Vyas J.M., Levitz S.M. Dynamic virulence: real-time assessment of intracellular pathogenesis links Cryptococcus neoformans phenotype with clinical outcome. MBio. 2011. V. 2. P. 1-3.

56. Gordon S., Martinez F.O. Alternative activation of macrophages: mechanism and functions. Immunity. 2010. V. 32. P. 593-604.

57. Loke P. Gallagher I., Nair M.G. et al. Alternative activation is an innate response to injury that requires CD4+ T cells to be sustained during chronic infection. J Immunol. 2007. V. 179. P. 3926-3236.

58. Arora S., Olszewski M.A., Tsang T.M., McDonald R.A., Toews G.B., Huffnagle G.B. Effect of cytokine interplay on macrophage polarization during chronic pulmonary infection with Cryptococcus neoformans. Infect Immun. 2011 V. 79. P. 1915-1926.

59. Cho W.S., Kim T.H., Lee H.M., Lee S.H., Yoo J.H., Kim Y.S. Increased expression of acidic mammalian chitinase and chitotriosidase in the nasal mucosa of patients with allergic rhinitis. Laryngoscope. 2010. V. 120. P. 870-875.

60. Di Luca M., Romi R., Severini F. et al. High levels of human chitotriosidase hinder the formation of peritrophic membrane in anopheline vectors. Parasitol Res. 2007. V. 100. P. 1033-1039.

61. Lee C.G., Da Silva C.A., Lee J.Y., Hartl D., Elias J.A. Chitin regulation of immune responses: an old molecule with new roles. Curr Opin Immunol. 2008. V. 20. P. 684-689.

62. Huber S. Hoffmann R., Muskens F., Voehringer D. Alternatively activated macrophages inhibit T-cell proliferation by Stat6-dependent expression of PD-L2. Blood. 2010. V. 116. P. 331 1-3320.

63. Pesce J., Kaviratne M., Ramalingam T.R. et al. The IL-21 receptor augments Th2 effector function and alternative macrophage activation. J Clin Invest 2006. V. 116. P. 2044-2055.

64. Yazdanbakhsh M., van den Biggelaar A., Maizels R.M. Th2 responses without atopy: immunoregulation in chronic helminth infections and reduced allergic disease. Trends Immunol 2001. V. 22. P. 372-377.

65. Wilson M.S., Taylor M.D., Balic A., Finney C.A., Lamb J.R., Maizels R.M. Suppression of allergic airway inflammation by helminth-induced regulatory T cells. J Exp Med. 2005. V. 202. P. 1199-1212.

66. Hartl D., Lee C.G., Da Silva C.A., Chupp G.L., Elias JA. Novel biomarkers in asthma: chemokines and chitinase-like proteins. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2009. V. 9. P. 60-66.

67. Ober C., Chupp G.L. The Chitinase and Chitinase-Like Proteins: A Review of Genetic and Functional Studies in Asthma and Immune-Mediated Diseases. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2009. V. 9. P. 401-408.

68. Reese T.A., Liang H.E., Tager A.M. et al. Chitin induces accumulation in tissue of innate immune cells associated with allergy. Nature 2007. V. 447. P. 9296.

69. Barnes P.J. The cytokine network in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 2009. V. 41. P. 631-638.

70. Shuhui L., Mok Y.K., Wong W.S. Role of mammalian chitinases in asthma. Int Arch Allergy Immunol. 2009. V. 149. P. 369-377.

71. Tang H., Fang Z., Sun Y., Li B., Shi Z., Chen J., Zhang T., Xiu Q. YKL-40 in asthmatic patients, and its correlations with exacerbation, eosinophils and immunoglobulin E. Eur Respir J. 2010. V. 35. P. 757-760.

72. Bhandari A., Bhandari V. Pitfalls, problems, and progress in bronchopulmonary dysplasia. Pediatrics. 2009. V. 123. P. 1562-1573.

73. Sohn M.H., Kang M.J., Matsuura H., Bhandari V., Chen N.Y., Lee C.G., Elias J.A. The chitinase-like proteins breast regression protein-39 and YKL-40 regulate hyperoxia-induced acute lung injury. Am J Respir Crit Care Med. 2010. V. 182. P. 918928.

74. Coffman F.D. Chitinase 3-Like-l (CHI3L1): a putative disease marker at the interface of proteomics and glycomics. Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 2008. V. 45. P. 531-562.

75. Shao R., Hamel K., Petersen L., Cao Q.J., Arenas R.B. et al. YKL-40, a secreted glycoprotein, promotes tumor angiogenesis. Oncogene. 2009. V. 28. P. 44564468

76. Shuhui L., Mok Y.K., Wong W.S. Role of mammalian chitinases in asthma. Int Arch Allergy Immunol. 2009. V. 49. P. 369-377.

77. Gu Z., Cao Z., Jin M. Expression and role of acidic mammalian chitinase and eotaxin-3 in chronic rhinosinusitis with nasal polyps. J Otolaryngol Head Neck Surg. 2011. V. 40. P. 64-69.

78. Song H.M., Jang A.S., Ahn M.H. et al. Yml and Ym2 expression in a mouse model exposed to diesel exhaust particles. Environ Toxicol 2008. V. 23. P. 110116.

79. Ober C., Tan Z., Sun Y. et al. Effect of variation in CHI3L1 on serum YKL-40 level, risk of asthma, and lung function. N Engl J Med. 2008. V. 358. P. 16821691.

80. Humbles A., Brewah Y., Kearley J. et al. Deficiency in chitinase-like protein BRP-39 significantly reduces airways hyper-responsiveness and inflammation in a murine model of asthma. Am Thorac Soc. 2008. V. 177. P. 501

81. Sotgiu S., Angius A., Embry A., Rosati G., Musumeci S. Hygiene hypothesis: innate immunity, malaria and multiple sclerosis. Med Hypotheses. 2008. V. 70. P. 819-825.

82. Nielsen A.R., Plomgaard P., Krabbe K.S., Johansen J.S., Pedersen B.K. IL-6, but not TNF-a, increases plasma YKL-40 in human subjects. Cytokine. 2011. V. 55. P. 152-155.

83. Hattori N., Oda S., Sadahiro T., Nakamura M., Abe R., Shinozaki K., Nomura F., Tomonaga T. Matsushita K., Kodera Y., Sogawa K., Satoh M., Hirasawa H. YKL-40 identified by proteomic analysis as a biomarker of sepsis. Shock. 2009. V. 32. P. 393-400.

84. Mylonas K.J., Nair M.G., Prieto-Lafuente L., Paape D., Allen J.E. Alternatively activated macrophages elicited by helminth infection can be reprogrammed to enable microbial killing. J Immunol. 2009. V. 182. P. 3084-3094.

85. Bargagli E., Margollicci M., Nikiforakis N. Chitotriosidase activity in the serum of patients with sarcoidosis and pulmonary tuberculosis. Respiration. 2007. V. 74. P. 548-552.

86. Korthagen N.M., van Moorsel C.H., Barlo N.P. Ruven H.J., Kruit A., Heron M., van den Bosch J.M., Grutters J.C. Serum and BALF YKL-40 levels are predictors of survival in idiopathic pulmonary fibrosis. Respir Med. 2011. V. 105. P. 106-113.

87. Migliaccio C.T., Buford M.C., Jessop F., Holian A. The IL-4R{alpha} pathway in macrophages and its potential role in silica-induced pulmonary fibrosis. J Leukoc Biol. 2008. V. 83. P. 630-639.

88. Giannetti N, Moyse E, Duciay A et al Accumulation of Yml/2 piotein in the mouse olfactoiy epithelium duimg legeneiation and aging Neuioscience 2004 V 123 P 907-917

89. Меркулова M И , Радченко В В , Ильницкая Е В , Шуваева Т М , Липкин В М Протеомный подход к изучению функций 8ес14р-подобного белка р45 Биоорган химия 2005 V 31 Р 280-287

90. Monmoto К , Yoshimi К , Tonohira Т , Yamada N , Oda Т , Koneko I Neuioscience 1998 V 84 P 479-489

91. Писарев В Б , Богомолова Н В , Новочадов В В Бактериальный эндоюксикоз взгляд патолога Волгоград Изд-во ВолГМУ 2008 -208 с

92. Maiechal X , Favory R . Joulin О . Montaigne D , Hassoun S . Decostei В . Zerimech F . Nevieie R Endothelial glycocalyx damage dunng endotoxenna coincides with miciocuculatoiy dysfunction and vascular oxidative stiess Shock 2008 V 29(5) P 572-576

93. Novoselov V I. Peshenko I V , Evdokimov V A , Nikolaev J V , Matveeva E A, Fesenko E E 45-kDa GTP-binding protein from rat olfactory epithelium purification, chaiactenzation and localization Chem Senses 1996 V 21 P 181-188

94. Shan L . Kawakami T. Asano S , Nontake S , Yoshimoto D , Yamashita K. Kikkawa H. Kinoshita M. Matsubara S Inverse lelationship between Secl413 mRNA/piotem expiession and allergic anway inflammation Eui J Pharmacol 2009 V 616 P 293-300

95. LaemmhUK Natuie 1970 V 227 P 680-685

96. Kohlei G. Milstein С Continuous cultuies of fused cells secreting antibody of predefined specificity Natuie 1975 V 256 P 495-497

97. Galfre G , Milstein С Preparation of monoclonal antibodies stiategies andpioceduies Methods Enzymol 1981 V 73 P 3-46

98. Eswai N, Maiti-Renom M A, Webb B, Madhusudhan M S. Eiamian D Shen M Pieper U Sail A Compaiative Piotein Stiuctuie Modeling With MODELLER Cuirent Piotocols in Bioinfoimatics, John Wiley & Sons. Inc, Supplement 2006 V 15 P 5 6 1-5 6 30

99. Ochman H., Ajioka J.W., Garza D., Hartl D.L. Biotechnology. 1990. V. 8. P. 759-760.

100. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V. 74. P. 5463-5467