Рекомбинантные полипептиды для терапии глазных заболеваний, сопровождающихся патологическим ангиогенезом

Бейрахова, Ксения Андреевна

Рекомбинантные полипептиды для терапии глазных заболеваний, сопровождающихся патологическим ангиогенезом тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Бейрахова, Ксения Андреевна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2012 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.10 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Рекомбинантные полипептиды для терапии глазных заболеваний, сопровождающихся патологическим ангиогенезом»

Автореферат диссертации на тему "Рекомбинантные полипептиды для терапии глазных заболеваний, сопровождающихся патологическим ангиогенезом"

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

На правах рукописи

Бейрахова Ксения Андреевна

Рекомбинантные полипептиды для терапии глазных заболеваний, сопровождающихся патологическим ангиогенезом

специальность - 02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

5 ДПР 2072

Москва 2012

005018527

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им.академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук

Научные руководители: кандидат химических наук

Есипов Роман Станиславович

доктор медицинских наук Лихванцева Вера Геннадьевна

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН

доктор химических наук, профессор, Цетлин Виктор Ионович

кандидат химических наук, доцент Демидюк Илья Валерьевич

Ведущая организация: Федеральное государственное

бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта Российской академии наук

Защита состоится 18 апреля 2012 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д.002.019.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997 ГСП-7, г. Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им.академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук

Автореферат разослан « 16 » марта 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор физико-математических наук._

Актуальность проблемы.

Неоваскуляризация является основной причиной снижения зрительных функций при возрастной макулярной дегенерации (ВМД), пролиферативной диабетической ретинопатии (ПДР), ретинопатии недоношенных, хронической хориоидальной неоваскуляри-зации при близорукости и др. Распространенность этих заболеваний неуклонно прогрессирует. По данным ВОЗ за 2008 г только количество заболевших ВМД превысило 8 млн. человек. Антиангиогенная терапия этих заболеваний признана перспективным методом лечения. Современная стратегия антиангиогенной терапии в офтальмологии основана на применении препарата (Луцентис), ингибирующего действие сосудистого эндотелиалыш-го фактора роста (VEGF), ключевого фактора неоангиогенеза. Узкая направленность ингибиторов VEGF и наличие обходных путей ангиогенеза с участием других проангиоген-ных молекул объясняют их неполноценный и непродолжительный клинический эффект. В этом аспекте представляет научный и практический интерес исследование природных биологически активных белков и их фрагментов, обладающих ангиостатическими свойствами, избирательно проявляющимися на разных этапах ангиогенеза, слабой иммуногенно-стью и токсичностью с целью создан™ на их основе инновационных лекарственных препаратов офтальмологического назначения.

Цель работы.

Цель настоящего исследования: получение рекомбинантных аналогов функциональных фрагментов природных ингибиторов ангиогенеза, изучение их способности блокировать различные этапы ангиогенеза и исследование биологической активности полученных полипептидов in vivo на моделях заболеваний глаз, сопровождающихся патологическим ангиогенезом.

Для создания рекомбинантных полипептидов были выбраны биологически активные фрагменты трёх эндогенных ингибиторов ангиогенеза: фрагмент фактора дифферен-цировки пигментного эпителия (PEDF) (44-77), фрагмент тумстатина (L69K-95) и фрагмент эндостатина (1-49).

Основными задачами работы являются:

1. Создание эффективных штаммов-продуцентов гибридных белков, содержащих фрагменты PEDF (44-77), тумстатина (L69K-95) и эндостатина (1-49);

2. Разработка эффективных схем выделения и очистки полипептидов, представляющих собой рекомбинантные аналоги фрагментов PEDF (44-77), тумстатина (69-95) и эндостатина (1-49);

3. Изучение биологических свойств полученных полипептидов на моделях различных этапов развития неоангиогенеза in vitro.

4. Исследование in vivo биологической активности пептидов на экспериментальных моделях неоваскуляризации роговицы.

Научная новизна:

Разработаны новые эффективные способы получения рекомбинантных аналогов фрагментов эндогенных ингибиторов ангиогенеза (PEDF (44-77) тумстатина (L69K-95) и эндоста-тина (1-49)). Впервые исследована антиангиогенная активность фрагмента эндостатина (149) на моделях неоангиогенеза in vitro. Впервые исследована биологическая активность фрагментов тумстатина (L69K-95) и эндостатина (1-49) на экспериментальной модели патологической неоваскуляризации роговицы.

Практическая значимость

Предложен метод выделения целевых полипептидов, позволяющий исключить стадию ферментативного расщепления гибридного белка за счет использования мини-интеина в качестве белка-носителя, и таким образом снизить себестоимость получения полипептидов. Дана количественная оценка антиангиогенной активности рекомбинантных аналогов PEDF (44-77), тумстатина (L69K-95) и эндостатина (1-49). Экспериментально подобраны предполагаемые терапевтические дозы рекомбинантных полипептидов PEDF (44-77), эндостатина (1-49) и тумстатина (L69-95).

Основные положения, выносимые на защиту.

Полученные рекомбинантные аналоги фрагментов PEDF (44-77), тумстатина (6995) и эндостатина (1-49) обладают антиангиогенной активностью на различных этапах неоангиогенеза: подавляют пролиферацию эндотелиальных клеток и образование трубочко-подобных структур in vitro и препятствуют развитию патологической неоваскуляризации in vivo.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на международных и российских конференциях: IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011); научно-практической конференции «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения» (Крым, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 105 страницах, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и обсуждения, списка цитированной литературы (209 ссылок). Диссертация включает 5 таблиц и 32 рисунка.

Основное содержание работы 1. Введение

Использование эндогенных ингибиторов ангиогенеза для лечения неоваскулярных заболеваний глаз может представлять собой альтернативу применяемой сегодня в офтальмологии терапии, направленной на подавление действия сосудистого эндотели-апьного фактора роста (VEGF). Многие эндогенные ингибиторы продемонстрировали высокую активность на этапе биологических испытаний in vitro, однако подтвердить их активность в клинике в виде полного подавления неоангиогенеза и/или резорбции новообразованных патологических сосудов с их помощью до сих пор не удавалось. Это может объясняться наличием различных компенсаторных и/или обходных путей развития неоваскуляризации.

Рисунок 1. Воздействие эндогенных ингибиторов ангиогенеза РЕОР, тумстатина и эндо-статина на разные этапы ангиогенеза. УЕСИ - сосудистый эндотелиальный фактор роста, ЬРвР -основной фактор роста фибробластов, ЭЦМ - экстрацеллюлярный матрикс, ММРэ - матриксные металлопротеиназы.

В этой связи перспективным представляется использование для терапии неоваскулярных заболеваний комплекса из нескольких антиангиогенных препаратов, избирательно блокирующих различные этапы развития неоваскуляризации. В качестве кандидатов для создания такого комплекса мы выбрали биологически активные фрагменты трёх эндогенных ингибиторов ангиогенеза: РЕОР, тумстатина и эндостатина. Действуя как антагонист УЕвЕ, РЕОР снижает его экспрессию; дефицит этого фактора в глазу способствует запуску патологического неоангиогенеза. Восполнение дефицита РЕОР может оказаться эффективным на самых ранних стадиях развития неоваскуляризации. Фрагменты коллагенов тумстатин и эндостатин блокируют более поздние этапы развития ангиогенеза, связываясь с интегринами на поверхности пролиферирующих эндотелиальных клеток, присутствующих в патологических кровеносных сосудах пациентов с активной неоваскуляризацией. Тумстатин подавляет пролиферацию эндотелиальных клеток, связываясь с интегрином

тумстатин

ctvß3. Эндостатин предотвращает миграцию эндотелиальных клеток, действуя через ин-тегрин a5ßl, и таким образом ингибирует ангиогенез отличным от тумстатина путём (Рисунок 1).

На основе анализа литературных данных мы определили минимальные функциональные фрагменты указанных эндогенных ингибиторов. Полученные нами модифицированные рекомбинантные аналоги этих фрагментов были исследованы на моделях различных этапов развития патологической неоваскуляризации in vitro и in vivo на глазах экспериментальных животных.

2. Получение рекомбинантного фрагмента тумстатина (L69K-95)

Тумстатин (28кДа), фрагмент цепи аЗ коллагена IV типа, проявляет антиангиоген-ные свойства, связываясь с интегрином avß3 на поверхности ЭК. Антиангиогенная активность локализована в фрагменте тумстатина (69-95) (пептид Т8). Свойства данного активного фрагмента были исследованы преимущественно в опухолевых моделях. Представляет большой интерес изучение биологической активности пептида Т8 не только на опухолевых, но других моделях заболеваний связанных с неоангиогенезом. Мы взяли последовательность пептида Т8 за основу при разработке рекомбинантного аналога активного фрагмента тумстатина.

Создание штамма-продуцента гибридного белка, содержащего тумстатин (L69K-95)

Для обеспечения высокого уровня биосинтеза гибридного белка была выбрана экс-прессионная система на основе вектора рЕТ32Ь(+) и штамма Е. coli ER2566. Плазмида рЕТ32Ь(+) кодирует последовательность гена тиоредоксина А и аффинную группу из шести остатков гистидина. В данный вектор ввели нуклеотидную последовательность, кодирующую сайт узнавания протеиназы вируса гравировки табака (TEV протеазы) ENLYFQ/S. Для обеспечения стерической доступности сайта его поместили между двумя гибкими глицин-содержашими линкерами. В полученной рекомбинантной плазмиде pTVG затем клонировали ген тумстатина (L69K-95).

Ген тумстатина (L69K-95), оптимизированный по составу кодонов для эффективной экспрессии в клетках Е. coli, синтезировали из перекрывающихся олигонуклеотидов и клонировали в векторной плазмиде pGEM5zf(-). Для увеличения стабильности пептида in vivo к искусственному гену тумстатина (L69K-95) была добавлена последовательность, кодирующая три дополнительные аминокислоты на С-конце пептида (Pro-Gly-Pro).

Полученную плазмиду pGEM-T8 обрабатывали рестриктазами Ncol и Hindi И, выделяли фрагмент, несущий целевой ген, и проводили лигирование с рекомбинантным век-

тором рТУв, расщепленным по тем же сайтам рестрикции. Полученной рекомбинантной плазмидой рТ\Ю-Т8 (Рисунок 2) трансформировали штамм-носитель Е. соЧ ЕЯ2566. /¡«/II ТУС-1 N001 1\'со\_Ген Т8_НЫЛИ

pTVG-T8

Ар

lacl

ori

м:

Рисунок 2. Рекомбинантная плазмида pTVG-T8. TVG-1, TVG-2 - перекрывающиеся олигонуклеоти-ды, кодирующие сайт расщепления TEV протеазы; trxA - ген, кодирующий тиоредоксин А.

В результате был создан продуцент Е. coli ER2566/pTVG-T8, синтезирующий гибридный белок TVG-T8 (21,2 кДа), состоящий из тиоредоксина, аффинной группы из шести гистидинов, сайта расщепления TEV протеазой (ENLYFQ/S) и тумстатина (L69K-95):

Штамм-продуцент Е. coli ER2566/pTVG-T8 культивировали в закреплённых кача-лочных колбах в среде LB при 37°С. Биосинтез гибридного белка индуцировали добавлением ИПТГ (изопропилтио-Р-О-гапактопиранозид). Получали 3 г влажных клеток с 1 литра культуры. Гибридный белок синтезировался в растворимой форме. Уровень биосинтеза гибридного белка составил 25% от суммарного клеточного белка (Рисунок 3, дорожка 1).

Очистка гибридного белка TVG-T8 с помощью аффинной хроматографии

Гибридный белок TVG-T8 содержал в своём составе аффинную группу из шести остатков гистидина, поэтому мы осуществляли очистку этого белка с использованием аффинного сорбента Ni2+-IDA Sepharose. Биомассу штамма-продуцента Е. coli ER2566/pTVG-T8 разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора, осветлённый клеточный лизат наносили на колонку с аффинным сорбентом. Элюцию целевого белка TVG-T8 производили градиентом концентрации имидазола (20-500 мМ). Фракции, содержащие очищенный целевой белок, объединяли (Рисунок 3, дорожка 2).

TEV протеаза

Тиоредоксин - GGG

ISGAMGKQRFTTMPFLFCNVNDVCNFASRNDYSPGP

Получение рекомбинантной протеиназы вируса гравировки табака (TEV протеазы).

Ген TEV протеазы был получен из ИБФМ РАН. Ген клонировали в векторе рЕТ23Ь+ по сайтам ЕсоRI и HindlW. Полученной экспрессионной плазмидой pER-TEV трансформировали клетки Е. coli ER2566. Штамм ER2566/pER-TEV продуцировал реком-бинантную TEV протеазу, содержащую на N-конце лидерную последовательность, обеспечивающую высокий уровень биосинтеза белка, а на С-конце аффинную группу из 6 остатков гистидина. TEV протеазу получали в виде нерастворимых телец включения. Фермент экстрагировали из телец включения буфером, содержащим мочевину (8 М). Дальнейшую очистку фермента производили при помощи металл-аффинной хроматографии с использованием сорбента Ni2+-IDA Sepharose.

кДа М 1 2 3

66 45

Рисунок 3. Очистка и расщепление гибридного белка ТУС-Т8. Электрофорез в денатурирующих условиях в 13% ПААГ. М стандарт молекулярных масс; 1 тотальный клеточный лизат штамма ЕК2566/рТУО-Т8; 2 очищенный с помощью аффинной хроматографии ТУО-Т8; 3 расщепление ТУв-ТБ ТЕУ протеазой. А - ТУв-ТБ, Б — остаточный полипептид, состоящий из тиоре-доксина и сайта расщепления ТЕУ протеазы.

Выделение и очистка рекомбинантного пептида Т8.

Очищенный с помощью аффинной хроматографии белок ТУв-Т8 обрабатывали ТЕУ протеазой при соотношении фермент : субстрат 1:100. Выход реакции достигал 98% (Рисунок 3, дорожка 3).

Продукты реакции анализировали с применением ОФ ВЭЖХ (Рисунок 4А) и масс-спектрометрии. Масса пептида, соответствующего пику 1 на хроматограмме, совпала с теоретически рассчитанной массой пептида Т8 в восстановленной форме (3872.4 Да). Для рефолдинга пептида была использована окислительно-восстановительная пара ОЗНЛЗЗЗО (10:1). Молекулярный вес окисленного Т8 (Рисунок 4Б) составил 3870.72 Да.

Очистку пептида Т8 от тиоредоксина и ТЕУ протеазы производили с помощью ультрафильтрации на установке Агшсоп. Была применена мембрана УМ 10 (МПНроге). На завершающей стадии пептид Т8 очищали с помощью ОФ ВЭЖХ. Фракции, содержащие пептид объединяли и лиофильно высушивали.

Масштабирование схемы выделения и очистки рекомбинантного пептида Т8

Выход пептида Т8 при очистке по разработанной нами схеме составил 4 мг с 1л культуральной среды. Для наработки экспериментальной партии пептида Т8 для биологических испытаний (200 мг) было необходимо масштабировать схему выделения и очистки пептида. Переход культивирования штамма-продуцента с качалочных колб на ферментёр сразу позволил добиться значительного увеличения, не менее чем в 3 раза, количества получаемой биомассы с литра культуры.

J250

гооо

1750 1500 «50 WOO

-JV-^ V----'

ггэд 2000 1750 1500 1250 10Ю

X10* 1.2 1.1

0.3 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0,3 ог 0.1 о

»ESI Sem (4.277 mn) Fi«s.200W TB OI.d ! 3370.72

2000 4000 6000 8000 1ЯЮ0 Counts (%) vs. Mass-to-Charfje (m1г)

Рисунок 4. Хроматографический и масс-спектрометрический анализ полипептидных продуктов на разных стадиях получения пептида Т8. А - ОФ ВЭЖХ на колонке с сорбентом Prosphere С-18 300 А 5р, градиент ацетонитрила (8 - 64 %) в 0,1 % ТФУ, скорость потока 0,75 мл/мин. 1 -продукты расщепления TVG-T8 протеазой TEV, II - продукты расщепления ГБ TVG-T8 после ре-фолдинга, III — пептид Т8 после очистки от тиоредоксина, IV — пептид Т8, очищенный с помощью ОФ ВЭЖХ (чистота > 99 %); 1 - восстановленный Т8, 2 - ренатурированный Т8, 3 - восстановленный тиоредоксин, 4 - окисленный тиоредоксин; Б - ESI-TOF масс-спектр ренатурированного пептида Т8.

Ферментация продуцента Е. coli ER2566/pTVG-T8 была проведена на участке экспериментальной ферментации отдела биологического производства (ОБП) ИБХ РАН. Целевой белок синтезировался в растворимой форме и составлял до 40 % от суммарного клеточного белка (Рисунок 5, дорожка 1).

кДа

72 шл ¿Л 43 " «я»

34 .... .

34 26

■

«I

Рисунок 5. Масштабирование стадий очистки и протеолитическое расщепление ГБ ТУО-

Т8 (15% ЗОЭ-РАОЕ). М - стандарты молекулярных масс; 1 — осветлённый клеточный лизат продуцента Е112566/рТУО-Т8; 2 - объединённая фракция после ионообменной хроматографии, содержащая гибридный белок ТУО-Т8; 3 - расщепление ТУй-Т8 протеазой ТЕУ. А - ТУО-Т8, Б -лидерный полипептид, состоящий из тиоредоксина и сайта расщепления ТЕУ протеазы, В - пептид Т8.

При маштабировании процесса выделения мы отказались от использования аффинного сорбента, и очистку гибридного белка проводили на колонке с анионообменном сорбентом <3 БерЬагове ХЬ (Рисунок 5, дорожка 2) (рН 9,0, элюция градиентом №01 70300 мМ). Указанный сорбент обладает значительной химической и механической устойчивостью, выдерживает высокие скорости потока может применяться как в лабораторных, так и в промышленных масштабах. Очищенный с помощью ионообменной хроматографии ТУО-Т8 обрабатывали ТЕУ протеазой при соотношении фермент : субстрат 1:100. Выход реакции достигал 95% (Рисунок 5, дорожка 3).

Таблица 1. Выделение и очистка рекомбинантного пептида Т8 (из 1 л культураль-ной среды)

Этап очистки Общий белок (мг) Содержание ГБ (%) Содержание Т8 (%)

Осветлённый клеточный лизат 2217,0 40

Ионообменная хроматография на сорбенте 0ХЬ(1) 877,5 85

Расщепление ГБ ТЕУ протеазой 877,5 14,5

Ионообменная хроматография на сорбенте 0 ХЬ (2) 112,5 78

ОФ ВЭЖХ 78,75 98

После рефолдинга пептида (в описанных ранее условиях) проводилась повторная хроматография на колонке с О-ЭерЬагозе ХЬ. Были подобраны условия нанесения раство-

pa, при которых 90% высокомолекулярных полипептидов (тиоредоксин и TEV протеаза) задерживались на колонне, а целевой пептид не сорбировался на смоле.

На завершающей стадии пептид Т8 очищали с помощью ОФ ВЭЖХ. Фракции, содержащие пептид чистотой более 98% объединяли и лиофильно высушивали. Выход пептида составил 78,8 мг с 1 л культуры (Таблица 1).

3. Получение рекомбинантного фрагмента PEDF (44-77)

Фактор дифференцировки пигментного эпителия (pigment epithelium-derived factor, PEDF) - гликопротеин (молекулярный вес 50 кДа) из группы ингибиторов сериновых про-теиназ, секретируемый клетками пигментного эпителия. PEDF является эффективным эндогенным ингибитором ангиогенеза: он препятствует миграции эндотелиальных клеток, блокирует патологический рост сосудов и снижает экспрессию VEGF, ключевого проан-гиогенного фактора.

Фрагмент PEDF (аминокислотные остатки с 44 по 77) обладает всем спектром ан-тиангиогенных эффектов полноразмерного белка. Для исследования биологической активности фрагмента PEDF (44-77) нами был синтезирован его рекомбинантный аналог. Целевой пептид получали в составе слитного белка с модифицированным мини-интеином &pDnaB. Использование мини-интеина в качестве белка-носителя при биотехнологическом получении пептидов медицинского назначения имеет ряд преимуществ: при расщеплении гибридного белка N-концевая аминокислота пептида не модифицируется; расщепление гибридной конструкции стимулируется сдвигом рН и не требует применения дорогостоящих специфических протеиназ или реактивов.

Создание штамма-продуцента гибридного белка SspDnaB-PEDF(44-77)

Искусственный ген фрагмента PEDF (44-77), оптимизированный по составу кодо-нов для экспрессии в Е. coli, был синтезирован из перекрывающихся олигонуклеотидов и клонирован в векторе pGEM5zf(-). Для увеличения стабильности пептида in vivo к искусственному гену PEDF (44-77) была добавлена последовательность, кодирующая три дополнительные аминокислоты на С-конце пептида (Pro-Gly-Pro).

Полученную плазмиду расщепляли рестриктазами Sapl и ВатШ, выделяли фрагмент, несущий целевой ген, и клонировали его в векторе pTWIN2, предварительно обработанном этими же рестриктазами. Экспрессионный вектор pTWIN2 кодирует гены ин-теина SspDnaB и хитин-связывающего домена под контролем промотора из бактериофага Т7 и обеспечивает суперэкспрессию гибридной конструкции в соответсвующих штаммах Е. coli. В качестве штамма-носителя для полученной экспрессионной плазмиды pTWIN-PEDF использовали штамм Е. coli ER2566. В результате был создан продуцент Е. coli

ЕЯ2566/рТи,1Ы-РЕВР, в котором при биосинтезе образуется гибридный белок ЗврОпаВ-РЕОР(44-77) (29,2 кДа), состоящий из хитин-связывающего домена (С1Ш, 6,4 кДа) интеи-на БэрОпаВ (17,3 кДа) и целевого фрагмента РЕВБ-(44-77) (4 кДа):

Ssp Dría В

DPFFKVPVNKLAAAVSNFGYDLYRVRSSMSPTTNPGP

Ферментация продуцента Е. coli ER2566/pTWIN-PEDF была проведена на участке экспериментальной ферментации отдела биологического производства (ОБП) ИБХ РАН. Уровень биосинтеза гибридной конструкции составил 43% от суммарного клеточного белка. Гибридный белок SspDnaB-PEDF(44-77) синтезировался в нерастворимой форме, автокаталитическое расщепление in vivo не превышало 5% (

Рисунок 6, дорожка 1).

Очистка гибридного белка SspDnaB-PEDF(44-77)

Тельца включения (ТВ), содержащие гибридный белок SspDnaB-PEDF(44-77), выделяли из лизата продуцента Е. coli ER2566/pTWIN-PEDF с помощью центрифугирования и отмывали сначала буфером для разрушения, а затем дистиллированной водой. Гибридный белок солюбилизировали в щелочном буферном растворе (pH 9,0), содержащем мочевину (8 моль/л).

Реакцию автокаталитического расщепления ГБ производили в растворе. Экстракт телец включения титровали до значений pH 7,0-7,2 и затем снижали концентрацию мочевины разбавлением раствора белка. Эффективность реакции расщепления в таких условиях достигала 77% (

Рисунок 6, дорожка 3).

кДа М

Рисунок 6. Биосинтез, очистка и расщепления гибридного белка БзрВпаВ-РЕПР. Электрофорез в 15% ПААГ в денатурирующих условиях. М — стандарты молекулярных масс; 1 -тотальный клеточный лизат штамма-продуцента Е112566/рТ\УЩ-РЕОР; 2 — экстракт телец включения, 3 - расщепление гибридного белка БзрОпаВ-РЕОР (время реакции - 12 ч, температура - 25°С). А -

гибридный белок SspDnaB-PEDF, Б - лидерный полипептид (интеин SspDnaB и хитин-связывающий домен).

Очистка пептида PEDF-(44~77)

Очистку PEDF-(44-77) от интеина проводили методом тангенциальной ультрафильтрации с использованием мембраны VivaFlow 50 10 ООО MWCO RC (регенерированная целлюлоза). Фильтрат концентрировали в 20 раз на мембране VivaFlow 50 3000 MWCO PES (полиэфирсульфон), а затем ещё в 20 раз на системе Amicon (мембрана Ultracel YM-3, регенерированная целлюлоза).

На последней стадии PEDF-(44-77) очищали с помощью обращённо-фазовой ВЭЖХ (Рисунок 7А) Выход целевого продукта (чистота >98%) составил 5,4 мг с 1 г влажных клеток (65 мг с 1 л культуры) (Таблица 2). Пик в масс-спектре PEDF-(44-77) наблюдали при m/z 4044,03 (Рисунок 7Б), что соответствует теоретически рассчитанной массе пептида (4044,6 Да). А

S 5

Ifc.TO Г.4К1

*ES1 Scwß&tl a-r]Fi4'KÖCW 25Ö5U_FtDF_ph?d BKONiWed

161171 541165

;

im гаю т

т т т т т

CotpM |Sß vi HMsftöaije (на)

Рисунок 7. Хроматографический и масс-спектрометрический анализ очищенного пептида РЕОИ-(44-77). А - хроматографический профиль пептида. ВЭЖХ на колонке с сорбентом РгоэрИеге С-18 300 А 5р, градиент ацетонитрила (8 - 64 %) в 0,1 %ТТА, скорость потока 0.75 мл/мин; Б - ЕЭРТОР масс-спектр РЕОР (44-77).

Таблица 2. Выделение и очистка рекомбинантного пептида PEDF (44-77) (из 1 л культуральной среды)

Этап очистки Общий белок (мг) Содержание ГБ (%) Содержание PEDF(44-77) (%)

Осветлённый клеточный лизат 1900,0 43

Экстракт ТВ 987,5 85

Автокаталитическое расщепление ГБ 987,5 10,6

Ультрафильтрация 95,0 89,0

Концентрирование 76,0 89,0

ОФ ВЭЖХ 65,0 98,0

4. Получение рекомбинантного фрагмента эндостатина (1-49)

Эндостатин (20 кДа) - С-концевой фрагмент коллагена XVIII, ингибирующий миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток. Эндостатин предотвращает миграцию эндотелиальных клеток, действуя через интегрин a5ßl, и таким образом ингибирует ан-гиогенез отличным от тумстатина путём.

Участок, отвечающий за антиангиогенные свойства эндостатина, локализован в N-концевой части полипептида. В литературе описаны два биологически активных фрагмента эндостатина, обладающих наиболее выраженными антиангиогенными свойствами: фрагмент 1-27, активность которого определяется остатками Hisl и His3, связывающими ион цинка, а также фрагмент 6-49, содержащий антиангиогенный кластер R27-G28-A29-D30-R47-A48. При разработке рекомбинантного аналога антиангиогенного фрагмента эндостатина мы объединили структуры двух этих пептидов в одной молекуле эндостатина (1-49), активность которой не была ранее исследована.

Создание штамма-продуцента ГБ SspDnaB-Endo

Синтез искусственного гена эндостатина (1-49) осуществляли химико-ферментативным способом из перекрывающихся олигонукпеотидов. Ген эндостатина (149) клонировали в экспрессионный вектор pTWIN 1 аналогично гену PEDF. Получили экс-прессионную плазмиду pTWIN-Endo, при экспрессии которой в клетках Е. coli образуется гибридный белок SspDnaB-Endo (30,5 кДа), содержащий на N-конце модифицированный интеин ¿ISjODnaB, включающий хитин-связывающий домен, а на С-конце — фрагмент эндостатина (1 - 49):

СВР 1 SspDrtaB HSHRDFQPVLHLVALN5PLS6GMRGIRGADRyFQQARAVGLAS!FRAF

Плазмидой pTWIN-Endo трансформировали компетентные клетки штамма Е. coli ER2566. Полученный штамм-продуцент Е. coli ER2566/pTWIN-Endo культивировали в среде YTx2 при 37°С, биосинтез гибридного белка индуцировали добавлением ИПТГ Получали 5 г влажных клеток с 1 литра культуры. ГБ был получен в виде телец включения и не претерпевал автокаталитического расщепления in vivo. Уровень биосинтеза гибридного белка составил 37% от суммарного клеточного белка (Рисунок 8).

ГБ SspDnaB-Endo очищали и солюбилизировали по методике, описанной для ГБ SspDnaB-PEDF(44-77).

Оптимизация условий расщепления ГБ 8$рОпаВ-Епс1о

При проведении расщепления ГБ 8зрОпаВ-Епс1о в условиях, подобранных для белка 88рОпаВ-РЕОГ(44-77), эффективность реакции не превышала 20% из-за агрегации гибридного белка. Мы установили, что наличие в реакционной смеси соли №С1 (концентрация не ниже 0,2 М) препятствует агрегации ГБ. Степень расщепления ГБ в оптимизированных условиях (при рН 6,5, в присутствии 0,2 М ЫаС1) достигала 80% (Рисунок 8).

кДа М 1 2 3

Рисунок 8. Биосинтез, очистка и расщепление гибридного белка БврОпаВ-Епёо. Электрофорез в 15% ПААГ в денатурирующих условиях. М - стандарты молекулярных масс; 1 -тотальный клеточный лизат штамма-продуцента ЕК^бб/рТЛУШ-Епдо; 2 - экстракт телец включения; 3 -расщепление гибридного белка БэрОпаВ-Епск): рН 6,5, буфер с ИаС1 (0,2 М), время реакции 24 ч. А - гибридный белок ЗзрОпаВ-Епёо, Б -лидерный полипептид (интеин Хг/ЛЭпаВ и хитин-связывающий домен), В - пептид эндостатин (1-49).

Очистка пептида эндостатин (1-49)

Очистку эндостатина (1-49) от интеина проводили методом тангенциальной ультрафильтрации с использованием мембраны VivaFlow 50 10 000 MWCO RC. Фильтрат концентрировали на мембране VivaFlow 50 5000 MWCO PES (полиэфирсульфон).

300 Б «10 ' 1.1-

Í ,„ ) 11 ж,- 1 os oe-

I 0? at-

i 10 t& » и я 05 o<.

UV Rcsalb Rclcniion Типе Arca Area 1'. Hcijihi 0302-

22,590 2X08? «,410 93*5729 |7ft8S 60ÚKI 1SJ1 11 3700« 0,19 230« 0.63 S2KS 0-

ЭЙО !Й0 «й» »2» «Ао <fto sio И» si» 5й» sa» бйе li

24.327 Я70М (1.91 una C<M*t 1*1 ft WaiJ NiO

Рисунок 9. Хроматографический и масс-спектрометрический анализ очищенного пептида эндостатин (1 - 49). А - хроматографический профиль пептида. ВЭЖХ на колонке с сорбентом Prosphere С-18 300 А 5ц, градиент ацетонитрила (8 - 64 %) в 0,1 %TFA, скорость потока 0.75 мл/мин; Б - ESI-TOF масс-спектр эндостатина (1 — 49).

Финальную очистку пептида осуществляли с помощью ОФ ВЭЖХ (Рисунок 9 А). Фракции, содержащие пептид чистотой более 98%, объединяли и высушивали. Выход целевого продукта составил 4,8 мг с 1 г влажных клеток (24 мг с 1 л культуры) (Таблица 3). Пик в масс-спектре эндостатина (1-49) наблюдали при m/z 5338,73 (Рисунок 9 Б), что соответствует теоретически рассчитанной массе пептида (5338,12 Да).

Таблица 3. Выделение и очистка рекомбинантного пептида эндостатин(1-49) (из 1

л культуральной среды)

Этап очистки Общий белок (мг) Содержание ГБ (%) Содержание эндоста-тина(1-49) (%)

Осветлённый клеточный лизат 610 37

Экстракт ТВ 311 86

Автокаталитическое расщепление ГБ 311 14

Ультрафильтрация 41 85

Концентрирование 30 85

ОФ ВЭЖХ 24 98

С помощью разработанных методов были получены образцы субстанций рекомби-нантных аналогов тумстатина (L69K-95) (200 мг), PEDF (44-77) (200 мг) и эндостатина (149) (30 мг). Препараты были исследованы на наличие остаточной ДНК штамма-продуцента, иммунореактивных белков Е. coli, бактериальных эндотоксинов (Таблица 4).

Таблица 4. Характеристики субстанций рекомбинантных полипептидов тумстатин (L69K-95), PEDF (44-77) и эндостатин (1-49)

Показатель Норма Тумстатин (L69K-95) PEDF (44-77) Эндостатин( 1 -49)

Описание Белый порошок соответствует соответствует соответствует

Чистота (аналит. ОФ ВЭЖХ, детекция при >.=210 нм) >98% 99% 99% 99%

Аномальная токсичность Не токсичен соответствует соответствует соответствует

Бактериальные эндотоксины < 50 ЭЕ/мг <0,03 ЭЕ/мг <0,03 ЭЕ/мг <0,03 ЭЕ/мг

Иммунореактивные белки Е. coli Не более 10 ррт < 1 ррт < 1 ррт < 1 ррт

Остаточная ДНК штамма-продуцента Не более 7 ррт < 7ррт < 7ррт < 7ррт

Таким образом, полученные пептиды по чистоте и содержанию остаточных примесей штамма-продуцента соответствуют требованиям к препаратам, подготовленным для биологических и предклинических испытаний.

5. Оценка биологической активности рекомбинантных антиангиогенных пептидов PEDF(44-77), эндостатнна (1-49) и тумстатнна (L69K-95) in vitro.

Исследования проводились совместно с сотрудниками лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДиТО РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. Для подтверждения антиангиогенной активности полученных пептидов был проведен стандартный комплекс тестов, позволяющий оценить биологическую активность пептидов на ранних этапах ангиогенеза (пролиферация эндотелиальных клеток и образование капилляроподобных структур). Антиангиогенные свойства пептидов PEDF(44—77), эндостатин (1-49) и тумстатин (L69K-95) были изучены в диапазоне концентраций от 20 нМ до 0,1 нМ. В работе использовали иммортализованную культуру эндотелиальных клеток (ЭК) мыши SVEC-4-10.

Цитотоксическое действие пептидов па эндотелиальные клетки.

Цитотоксичность препаратов исследовали с помощью стандартного МТТ-теста. МТТ-тест оценивает выживаемость клеток по их способности превращать водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид (МТТ) в нерастворимый формазан.

Для изучения цитотоксического действия препарата определяли выживаемость эндотелиальных клеток мыши SVEC4-10 после инкубации с пептидом в течение 48 часов.

Исследование показало, что эндостатин (1-49) в указанном диапазоне концентраций не обладает цитотоксическим действием. Фрагмент тумстатина оказывает слабый ци-тотоксический эффект: выживаемость ЭК при инкубации с фрагментом тумстатина составляет 90+1% при максимальной концентрации пептида в лунке (20 нМ) и 101+4% при минимальной концентрации (0,1 нМ). Выраженный цитотоксический эффект в указанном диапазоне концентраций наблюдался у фрагмента PEDF (44-77): выживаемость клеток была дозозависимой и составляла 84+3% при концентрации пептида в лунке 20 нМ и 93+3% - при концентрации 1-0,1 нМ.

Ингибирование пептидами пролиферации ЭК

Исследование ингибирования стимулированной основным фактором роста фиб-робластов пролиферации культуры эндотелиальных клеток мыши SVEC-4-10 проводилось модифицированным митогенным тестом с использованием красителя Crystal Violet. Эндотелиальные клетки инкубировали с исследуемым пептидом в течение 6 дней и окрашива-

лись Crystal Violet. ИК50 для фрагмента тумстатина составила 10 нМ. В эксперименте с фрагментом PEDF максимальное ингибирование пролиферации клеток наблюдалось при концентрации пептида 1 нМ (47% от контроля). При более высоких концентрациях пептида антипролиферативный эффект не был выражен.

Ингибирование образования трубочко-подобных структур (ТПС) Все три пептида ингибировали образование трубочко-подобных структур (ТПС). Тумстатин (69-95) и эндостатин (1 - 49) в концентрациях 20 и 10 нМ ингибировали образование ТПС в течение 24 часов после инкубации с препаратом. Антиангиогенный эффект РЕОИ (44-77) в данном тесте проявлялся при более низких концентрациях - 1 и 10 нМ (Рисунок 10, Рисунок 11).

А Б В

V ■ ~<ь * .3 Á

Рисунок 10. Микрофотографии трубочко-подобных структур, образованных эндотелиапьными клетками 8УЕС-4-10 при инкубации с пептидами тумстатин (Ь69К-95), эндостатин (1-49) и РЕОР (44-77). А - контроль, 0,1% ЭТС; Б - тумстатин (Ь69К-95) в концентрации 10 нМ; В - тумстатин (1.69К-95) в концентрации 20 нМ; Г- эндостатин (1-49) в концентрации 10 нМ; Д - РЕИИ (44-77) в концентрации 10 нМ; Е -РЕЭР (44-77) в концентрации 1 нМ.

Полученные результаты согласуются с литературными данными, согласно которым PEDF обладает антиангиогенными свойствами исключительно в низких концентрациях, в то время как высокие концентрации, напротив, стимулируют неоангиогенез, а средние дозы пептида не оказывают эффекта.

Таким образом, в исследованиях in vitro все три пептида продемонстрировали способность подавлять начальные этапы ангиогенеза. Были определены эффективные концентрации препаратов для дальнейших испытаний in vivo: 10 нМ для эндостатина (1-49) и тумстатина (69-95), ! нМ для PEDF (44-77).

12000 10000 ■ а. 8000 -i t- «000 го Д. 4000 ■ 2000 ■ т

I ti ll.ll

с А ■ / > / «¿Г # # «р Л* ^ «V / / / У s

Рисунок 11. Ингибирование образования трубочко-подобных структур ЭК SVEC-4-10 в присутствии рекомбинантных антиангиогенных пептидов. ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка (контроль).

6. Биологическая активность рекомбинантных антиангиогенных пептидов in

vivo.

Исследования проводились совместно с сотрудниками отделения офтальмологии ЦКБ РАН. В работе использовали две модели неоваскуляризации роговицы кролика для оценки антиангиогенной активности тестируемых пептидов на разных стадиях развития патологического процесса. С помощью первой модели анализировали способность препаратов предупреждать развитие патологической неоваскуляризации: пептиды вводили в глаза животных одновременно с индукцией ангиогенеза. Вторая модель позволяла выявить аваскулогенный эффект пептидов, т. е. их способность резорбировать вновь образованные сосуды, и оценить эффективность препаратов на более поздних стадиях развития заболевания. В этом эксперименте пептид вводили субконъюнктивально через 8 дней после индукции ангиогенеза, когда сосудистая сеть частично была сформирована.

6.1. Оценка антиангиогенной активности пептидов на модели неоваскуляризации роговицы кролика.

Антиангиогенную активность пептидов исследовали на модели неоваскуляризации роговицы кролика. Модель формировали на двух глазах 6 кроликов (12 глаз) путем прошивания роговицы с лимба викриловыми швами (8-0). Препараты вводили, начиная с первого дня эксперимента (день прошивания роговицы) ежедневно под конъюнктиву в следующих дозах: 7,2 нг PEDF (44-77); 70,2 нг тумстатина (69-95) и 95,4 нг эндостатина (119

49). Дозу препарата рассчитывали с учётом оптимальной концентрации пептида для подавления неоангиогенеза, выявленной при исследованиях in vitro (1 нМ для PEDF (44-77) и 10 нМ для фрагментов эндостатина и тумстатина). Делали по 10 субконъюнктивальных инъекций в каждый опытный глаз.

Оценку клинической эффективности проводили с помощью биомикроскопии на щелевой лампе. Все 3 антиангиогенных пептида оказывали сопоставимый, клинически значимый антиангиогенный эффект, проявляющийся в том, что сосуды, несмотря на нанесенную травму и внесение индуктора ангиогенеза (шовный материал), в роговицу не врастали. Помимо антиангиогенной активности пептиды оказывали противоотечный эффект. Наиболее выраженными противоотёчными свойствами обладал фрагмент PEDF: площадь отека роговицы в соответствующем опытном глазу не превышала 10%, в то время как аналогичный показатель для фрагмента тумстатина составил 42%, а эндостатина - 82% (Рисунок 12).

6.2. Оценка аваскулогенной активности пептидов на модели щелочного ожога роговицы.

В качестве второй модели ангиогенеза использовали химический ожог роговицы на глазах 8 экспериментальных животных (половозрелые кролики породы Шиншилла, самцы, весом 3-3,5 кг). В качестве контроля служили глаза животных без введения препаратов (2 глаза, кролики № 1 и № 8). Антиангиогенные пептиды начинали вводить в опытные глаза кроликам № 2,4 и 6 с 8 дня под конъюнктиву в дозах 95,4 нг для эндостатина (1-49), 70,2 нг для тумстатина Т8 и 7,2 нг для PEDF (24 - 57) соответственно. Инъекции препаратов делались ежедневно. Делали по 10 инъекций в каждый опытный глаз. Кроликам № 3, 5 и 7 дозы вводимых препаратов увеличивали в 10 раз. Оценку клинической эффективности тестируемых препаратов проводили с помощью биомикроскопии на щелевой лампе.

Мониторинг опытных глаз, в которые вводились антиангиогенные пептиды, показал, что аваскулогенный эффект присутствует только у фрагмента тумстатина. Аваскуло-генный эффект был дозозависимым: он был выше на глазах с более высокой (10-кратной) дозой фрагмента тумстатина (Рисунок 14).

Недавние исследования показали, что полноразмерный тумстатин подавляет неова-скуляризацию роговицы при введении через 12 часов после стимуляции ангиогенеза. Однако способность тумстатина или его фрагментов резорбировать уже сформированные сосуды не была доказана. На модели ожога роговицы кролика мы продемонстрировали клинически значимый дозозависимый аваскулогенный эффект рекомбинантного фрагмента тумстатина (L69K-95). Теоретически можно предполагать, что взаимодействие данного пептида с интегринами на поверхности эндотелиальных клеток может приводить к нарушению контактов этих клеток с базальной мембраной и вызывать апоптоз эндотелиальных клеток.

А Б В Г

Рисунок 12. Неоваскуляризация роговицы кролика, день 7. А - контрольный глаз; Б - глаз после 7 инъекций тумстатина (L69K-95); В - глаз после 7 инъекций эндостатина (1^49); Г - глаз после 7 инъекций PEDF(44-77).

А Б В

Рисунок 13. Аваскулогенная активность фрагмента тумстатина Т8. Модель щелочного ожога роговицы кролика. А - фотография глаза кролика № 3 до лечения. 8-е сутки после ожоговой травмы. Формируется сосудистая сеть; Б - фотография глаза кролика № 3 после 5 инъекций тумстатина (10-кратная доза); В -фотография глаза кролика № 3 после 10 инъекций тумстатина (10-кратная доза). Стрелками обозначены участки наиболее выраженной регрессии сосудов.

Выводы:

1. Получены рекомбинантные аналоги функциональных фрагментов природных ингибиторов ангиогенеза, подавляющие различные этапы неоангиогенеза.

2. Получены высокоэффективные штаммы-продуценты, обеспечивающие суперэкспрессию (свыше 35% от суммарного белка клетки) гибридных белков, содержащих в своём составе фрагменты тумстатина, PEDF и эндостатина.

4. Разработаны эффективные схемы выделения и очистки рекомбинантных аналогов фрагментов тумстатина (L69K-95), PEDF (44-77), эндостатина (1-49). Получены целевые полипептиды чистотой более 99% для биологических испытаний. Применение интеи-новой системы для биотехнологического синтеза PEDF (44-77) и эндостатина (1-49) позволило исключить стадии хроматографической очистки и энзиматического расщепления гибридного белка.

5. Продемонстрирована антиангиогенная активность фрагмента тумстатина (L69K-95), фрагмента PEDF (44-77) и фрагмента эндостатина (1-49) на разных этапах развития ангиогенеза на моделях in vitro: PEDF (44-77) оказывал цитостатический и антипролифе-ративный эффект на эндотелиальные клетки, тумстатин (L69K-95) подавлял пролиферацию, все три пептида ингибировали образование трубочко-подобных структур в пределах изученных концентраций (0,1 - 20 нМ).

6. Продемонстрирована in vivo эффективность аналогов тумстатина (L69K -95), PEDF (44-77) и эндостатина (1-49) в терапии заболеваний глаз, сопровождающихся ангио-генезом (на экспериментальной модели неоваскуляризации роговицы). При одновременном введении с индукторами ангиогенеза каждый из пептидов блокировал врастание сосудов (ранние этапы ангиогенеза). Рекомбинантный аналог тумстатина (L69K-95) продемонстрировал способность резорбировать новообразованные сосуды (поздние этапы ангиогенеза).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Публикации в научных журналах:

1. Мирошников А.И., Лихванцева В.Г., Степанова Е.В., Арутюнян Е.В., Есипов P.C., Бейрахова К.А., Степаненко В.Н., Белоус О.В. Изучение in vitro антиангиогенной активности природных ингибиторов ангиогенеза: эндостатина, тумстатина и PEDF // Оф-тальмохирургия. 2011. № 1. С. 76-81.

2. Лихванцева В.Г., Кузьмин К.А., Арутюнян Е.В., Салихов А.Ю., Андреев Ю.В., Белоус О.В., Мирошников А.И., Есипов P.C., Бейрахова К.А., Степаненко В.Н. Антиан-гиогенные эффекты природных ингибиторов ангиогенеза тумстатина, эндостатина и PEDF на экспериментальной модели васкуляризации роговицы по результатам морфологических исследований // Офтальмохирургия. 2011. № 4. С. 65-69.

3. Есипов P.C., Бейрахова К. А., Чупова Л. А., Лихванцева В. Г., Степанова Е. В., Мирошников А.И. Рекомбинантный фрагмент 44—77 фактора дифференцировки пигментного эпителия препятствует развитию патологической неоваскуляризации роговицы // Биоорганическая химия. 2012. Т.38. № 1. С. 78-85.

Опубликованные материалы российских и международных научных конференций:

1. Есипов P.C., Степаненко В.Н., Костромина, Бейрахова К.А., Мирошников А.И. Перспективы использования в биотехнологическом производстве гибридных саморасщепляющихся белков для получения рекомбинантных полипептидов // Тезисы докладов и стендовых сообщений на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск. 2008. С. 358.

2. Бейрахова К.А., Чупова Л.А., Лихванцева В.Г., Степанова Е.В., Есипов P.C. Рекомбинантный фрагмент фактор дифференцировки пигментного эпителия (44-77) препятствует развитию патологической неоваскуляризации роговицы // Материалы V Российского симпозиума "Белки и пептиды". Петрозаводск. 2011. С. 8.

3. Бейрахова К.А., Лихванцева В.Г., Степанова Е.В., Есипов P.C. Биотехнологический синтез тумстатина (69-95) и эндостатина (1-49), потенциальных препаратов для комплексной антиангиогенной терапии // Материалы научно-практической конференции

"Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения". Новый Свет, Украина. 2011.С. 26.

Публикации, находящиеся в печати:

Esipov R.S., Beyrakhova К.А., Likhvantseva V.G., Stepanova E.V., Stepanenko V.N., Kostromina M.A., Abramchik Yu.A., Miroshnikov A.I. Antiangiogenic and antivascular effects of a recombinant tumstatin-derived peptide in a corneal neovascularization model // Biochimie. 2012. V. 29. doi: 10.1016/j.biochi.2012.03.007 [в печати].

Заказ № 67-П/03/2012 Подписано в печать 15.03.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л.1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 \ www.cfr.ru; е-таИ: info@cfr.ru

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Бейрахова, Ксения Андреевна, Москва

61 12-2/405

На правах рукописи

Бейрахова Ксения Андреевна

Рекомбинантные полипептиды для терапии глазных заболеваний, сопровождающихся патологическим ангиогенезом

Специальность 02.00.10 Биоорганическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научные руководители: к.х.н. Есипов P.C. д.м.н. Лихванцева В.Г.

Москва 2012

Оглавление

Введение.........................................................................................................5

Глава 1. Препараты на основе эндогенных ингибиторов ангиогенеза как альтернатива анти-УЕвР-направленной терапии неоваскулярных глазных

заболеваний..............................................................................................................8

1.1 Основные этапы развития ангиогенеза.........................................8

1.2. AHTH-VEGF-направленная терапия............................................10

1.2.1. VEGF как терапевтическая мишень........................................10

1.2.2. Офтальмологические препараты, блокирующие действие VEGF .........................................................................................................................11

1.2.3. Ограничения и побочные эффекты при терапии блокаторами VEGF...............................................................................................................16

1.3. Эндогенные ингибиторы ангиогенеза и их терапевтический потенциал в офтальмологии.........................................................................17

1.3.1. Тромбоспондин.........................................................................17

1.3.2. Фактор дифференцировки пигментного эпителия (Pigment epithelium-derived factor, PEDF)...................................................................22

1.3.3. Фрагменты коллагена IV — аррестен, канстатин, тумстатин... 27

1.3.4. Фрагмент коллагена XVIII — эндостатин.............................32

Глава 2. Материалы и методы....................................................................36

2.1. Реактивы........................................................................................36

2.2. Ферменты......................................................................................36

2.3. Штаммы и клеточные линии.......................................................36

2.4. Плазмидные вектора....................................................................36

2.5. Лабораторное оборудование.......................................................37

2.6. Растворы........................................................................................37

2.7. Методы..........................................................................................38

Глава 3. Получение и свойства рекомбинантных полипептидных

препаратов на основе эндогенных ингибиторов ангиогенеза..........................53

3.1 Получение рекомбинантного фрагмента тумстатина (L69K-95).. 54

3.2. Получение рекомбинантного фрагмента PEDF (44-77)...........63

3.3. Получение рекомбинантного фрагмента эндостатина (1-49).. 69

3.4. Оценка биологической активности рекомбинантных антиангиогенных пептидов in vitro..............................................................73

3.5. Биологическая активность рекомбинантных антиангиогенных пептидов in vivo.............................................................................................77

3.5.1. Оценка антиангиогенной активности пептидов на модели неоваскуляризации роговицы кролика.......................................................77

3.5.2. Оценка аваскулогенной активности пептидов на модели щелочного ожога роговицы.........................................................................79

Выводы.........................................................................................................83

Список литературы.....................................................................................84

Перечень сокращений

ВМД — возрастная макулярная дегенерация

ГБ — гибридный белок

ДМСО — диметилсульфоксид

ДР — диабетическая ретинопатия

ДТТ — дитиотреитол

ИК5о — ингибирующая концентрация

ИПТГ — изопропил-P-D-1 -тиогалактопиранозид

ОФ ВЭЖХ — обращенно-фазовая высокоэффективная хроматография

ПААГ — полиакриламидный гель

ПЭГ — полиэтиленгликоль

ТПС — трубочко-подобные структуры

ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭК — эндотелиальные клетки

CBD — хитинсвязывающий домен

СОХ-2 — циклооксигеназа-2

ED5o — эффективная доза

ESI — ионизация распылением в электрическом поле

bFGF — основной фактор роста фибробластов

HIF — фактор, индуцируемый гипоксией

ММР — матриксная металлопротеиназа

NC1 — неколлагеновый домен 1

PDGF — тромбоцитарный фактор роста

PEDF — фактор дифференцировки пигментного эпителия

PMSF — фенилметилсульфонилфторид

SDS — додецилсульфат натрия

TFA — трифторуксусная кислота

TOF — времяпролётный масс-спектрометрический детектор

TSP-1 — тромбоспондин-1

VEGF — сосудистый эндотелиальный фактор роста

Введение

Неоваскуляризация является основной причиной снижения зрительных функций при возрастной макулярной дегенерации (ВМД), пролиферативной диабетической ретинопатии (ПДР), ретинопатии недоношенных, хронической хориоидальной неоваскуляризации при близорукости и др. Распространенность этих заболеваний неуклонно прогрессирует. По данным ВОЗ за 2008 г только количество заболевших ВМД превысило 8 млн. человек. Антиангиогенная терапия этих заболеваний признана перспективным методом лечения. Современная стратегия антиангиогенной терапии в офтальмологии основана на применении препарата (Луцентис), ингибирующего действие сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), ключевого фактора неоангиогенеза. Узкая направленность ингибиторов VEGF и наличие обходных путей ангиогенеза с участием других проангиогенных молекул объясняют их неполноценный и непродолжительный клинический эффект. В этом аспекте представляет научный и практический интерес исследование природных биологически активных белков и их фрагментов, обладающих ангиостатическими свойствами, избирательно проявляющимися на разных этапах ангиогенеза, слабой иммуногенностью и токсичностью с целью создания на их основе инновационных лекарственных препаратов офтальмологического назначения.

Цель настоящего исследования: получение рекомбинантных аналогов функциональных фрагментов природных ингибиторов ангиогенеза, изучение их способности блокировать различные этапы ангиогенеза и исследование биологической активности полученных полипептидов ш vivo на моделях заболеваний глаз, сопровождающихся патологическим ангиогенезом.

Для создания рекомбинантных полипептидов были выбраны биологически активные фрагменты трёх эндогенных ингибиторов

ангиогенеза: фактора дифференцировки пигментного эпителия (PEDF), тумстатина и эндостатина.

Основными задачами работы являлись:

3. Изучение биологических свойств полученных полипептидов на моделях различных этапов развития неоангиогенеза in vitro;

В результате выполнения работы были разработаны новые эффективные способы получения рекомбинантных аналогов фрагментов эндогенных ингибиторов ангиогенеза (PEDF (44-77) тумстатина (69-95) и эндостатина (1-49)). Впервые исследована антиангиогенная активность фрагмента эндостатина (1-49) на моделях неоангиогенеза in vitro. Впервые исследована биологическая активность фрагментов тумстатина (L69K-95) и эндостатина (1-49) на экспериментальной модели патологической неоваскуляризации роговицы.

Таким образом, полученные рекомбинантные аналоги фрагментов PEDF (44-77), тумстатина (69-95) и эндостатина (1-49) обладают антиангиогенной активностью на различных этапах неоангиогенеза: подавляют пролиферацию эндотелиальных клеток и образование трубочко-подобных структур in vitro и препятствуют развитию патологической неоваскуляризации in vivo.

Глава 1. Препараты на основе эндогенных ингибиторов ангиогенеза как альтернатива антиЛ/ЕСР-направленной терапии неоваскулярных глазных заболеваний

Неоваскуляризация — основная причина потери зрения при таких глазных заболеваниях, как диабетическая ретинопатия (ДР), возрастная дегенерация сетчатки (ВМД), ретинопатия недоношенных и др. Механизм развития глазной неоваскуляризации не до конца изучен, и, как следствие, не существует специфической и эффективной терапии соответствующих заболеваний. Гомеостаз в глазу здорового человека поддерживается балансом про- и антиангиогенных молекул [1, 2, 3]. Этот баланс нарушается под воздействием неблагоприятных факторов (ишемия, гипоксия, воспаление), что приводит к развитию патологического ангиогенеза [4, 5, 6]. Современные терапевтические стратегии направлены на подавление действия основного проангиогенного фактора - эндотелиального фактора роста сосудов (УЕОР). Между тем, в природе существует несколько обходных путей для неоангиогенеза, например, с помощью ЬБОР или ангиогенина. Это объясняет неполноценность и непродолжительность действия УЕОР-зависимых препаратов. В связи с этим активно развиваются альтернативные подходы к терапии неоангиогенеза, в том числе основанные на восполнении дефицита в глазу эндогенных антиангиогенных факторов [7].

1.1 Основные этапы развития ангиогенеза

Неоангиогенез — сложный многоступенчатый процесс, на каждом этапе которого задействованы различные регуляторные молекулы. К факторам, способствующим росту сосудов относятся ростовые факторы (кислый и основной факторы роста фибробластов (аРОР и ЬРОР) [8], УЕОР [9], тромбоцитарный фактор роста (РБОР) [10]), белки клеточной адгезии, белки матрикса, матриксные металлопротеиназы (ММР). К ангиостатикам принадлежат фактор дифференцировки пигментного эпителия (РЕБР) [11],

тромбоспондин-1 [12], протеолитические фрагменты внеклеточного матрикса [13] и др.

Неоангиогенез характеризуется тремя основными этапами [14] (Рисунок 1): пролиферация эндотелиальных клеток, миграция ЭК, дифференцировка и стабилизация сосудов.

Пролиферация

Стрессовые воздействия (ишемия, гипоксия) вызывают в клетках повреждённых тканей выброс проангиогенных факторов (УЕОБ, ЬЕвЕ, 1Ь-8, ангиопоэтин-2). Они взаимодействуют с узнающими рецепторами на поверхности эндотелиальных клеток близлежащих сосудов и запускают пролиферацию этих клеток. Перициты отделяются от стенки сосуда (под воздействием ангиопоэтина-2), УЕвР вызывает повышенную проницаемость слоя эндотелиальных клеток, в результате чего белки плазмы крови выходят в межклеточное пространство.

Миграция

Пролиферирующие эндотелиальные клетки секретируют коллагеназы, растворяющие базальную мембрану сосуда, и начинают мигрировать под действием сигналов интегринов (аУ|33 и аУ(35). Матриксные металлопротеиназы способствуют росту сосуда, моделируя внеклеточный матрикс с высвобождением проангиогенных факторов (РОБ, УЕОБ).

Рисунок 1. Этапы формирования сосуда при неоангиогенезе [14]. Дифференцировка и стабилизация сосудов.

Для образования функционального сосуда необходимо его созревание и стабилизация. РЭвЕ, ангиопоэтин-1, эфрин-В2 промотируют

присоединение перицитов к новообразованному сосуду. Тканевые ингибиторы металлопротеиназ (TIMPs) и ингибитор активатора плазминогена-1 (PAI-1) способствуют образованию базальной мембраны. Межклеточные контакты восстанавливаются с участием VE-кадгерина.

Многие из описанных факторов экспрессируются в тканях только во время неоваскуляризации, и таргетное воздействие на эти молекулы может оказаться перспективным для подавления неоангиогенеза.

1.2. AHmu-VEGF-напраеленная терапия 1.2.1. VEGF как терапевтическая мишень

VEGF — гликопротеин размером 46 кДа (гомодимер), впервые выделенный из васкуляризированных опухолей в 1983 г [15]. Известно по крайней мере 6 изоформ VEGF, образующихся в результате альтернативного сплайсинга мРНК [16]. VEGF]65 - наиболее распространённая изоформа, которая стимулирует несколько этапов неоваскуляризации (включая пролиферацию, миграцию и образование капилляроподобных структур) и таким образом играет важную роль как при физиологическом, так и при патологическом ангиогенезе [17, 18]. VEGF известен также как фактор проницаемости сосудов (vascular permeability factor, VPF) [15, 18].

VEGF взаимодействует с двумя мембранными рецепторами, обладающими тирозин-киназной активностью, - VEGFR-1 (fms-like tyrosine kinase-1, Fit-1) и VEGFR-2 (kinase insert domain-containing receptor, или Flk-1/KDR). Эти рецепторы экспрессированы преимущественно на поверхности эндотелиальных клеток и в меньшей степени - на моноцитах и макрофагах [19, 20]. Связывание VEGF с VEGFR-2 запускает сигнальный каскад, стимулирующий ангиогенез.

В сетчатке глаза VEGF секретируется клетками пигментного эпителия, эндотелиальными клетками, перицитами, Мюллеровскими клетками, нейронами, астроцитами [21, 22, 23], что свидетельствует о важной

физиологической роли этого фактора. При гипоксии секреция УЕСР усиливается [21]* повышенные уровни этого фактора в глазу ассоциированы с неоваскуляризацией при ДР и ВМД [24, 25]. На животных моделях пролиферативной ретинопатии было продемонстрировано, что терапевтическое ингибирование УЕвР приводит к значительному снижению неоваскуляризации и проницаемости сосудов [26, 27, 28] .

1.2.2. Офтальмологические препараты, блокирующие действие

Существует несколько терапевтических стратегий для подавления проангиогенного действия УЕСР: нейтрализация самого УЕСЩ> блокада рецептора \ZEGFR-2, ингибирование тирозинкиназного каскада, деградация мРНК УЕОР с помощью малых интерферирующих РНК [29, 30] (Рисунок 2). Рассмотрим наиболее перспективные препараты, уже использующиеся в клинической практике или находящиеся на стадии клинических испытаний.

Рисунок 2. Блокаторы сигнального пути УЕОР в терапии диабетической ретинопатии. миРНК - малые интерферирующие РНК, ЭК - эндотелиальные клетки, Н1Р - фактор, индуцируемый гипоксией.

\7EGF

чатка

Bevacizumab (Avastin, Genentech) — рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело, селективно связывающее все изоформы VEGF-A. Bcvacizumab ингибирует взаимодействие VEGF с его рецепторами и таким образом блокирует ангиогенез и снижает проницаемость сосудов. Этот препарат разрабатывался для подавления опухолевого ангиогенеза и был одобрен для лечения метастатического колоректального рака [31]. С 2005 года Bevacizumab используется в офтальмологической практике без зарегистрированных показаний. Многочисленные, но разрозненные, клинические исследования свидетельствуют об эффективности Bcvacizumab для лечения пролиферативных заболеваний глаз, в том числе влажной формы возрастной макулярной дегенерации [32, 33, 34, 35], макулярного отека при окклюзии ретинальных вен [36, 37, 38] и других.

Bevacizumab получают путём экспрессии рекомбинантных генов в клетках яичников китайских хомячков (СНО). Антитело имеет молекулярный вес около 149 кДа, состоит из двух идентичных лёгких цепей (214 а.о.) и двух тяжёлых цепей (453 а.о.), содержит один сайт гликозилирования в Fe фрагменте (Asp303) [39]. Bevacizumab был создан на основе мышиного моноклонального антитела к VEGF muMab A4.6.1 [40, 41]. Шесть гипервариабельных CDR участка A4.6.1 были перенесены в Fab каркас иммуноглобулина человека (вариабельный домен тяжёлой цепи VH III и вариабельный домен лёгкой цепи VL к I [42]), в результате чего аффинность к VEGF упала в 1000 раз [40]. Для того чтобы повысить связывание гуманизированного антитела к VEGF, семь каркасных остатков из человеческой VH цепи и один из VL цепи были заменены на мышиные. Полученный фрагмент Fab-12 после объединения с константными доменами

человеческого IgGI образует полноразмерное гуманизированное антитело rhuMab-VEGF (Bevacizumab), в котором мышиный компонент составляет 7%, и которое связывает все изоформы VEGF так же эффективно (константа диссоциации (Kd) 1,1 нмоль/л), как исходное антитело muMab A4.6.1 (Kd 0,8 нмоль/л) [40, 41]. Кристаллографический анализ комплекса антиген-связывающего фрагмента Fab-12 с VEGF (разрешение 2,4 Ä) показал, что антитело стерически блокирует сайт связывания VEGF с рецепторами [43].

Ranibizumab (Lucentis®; Genentech Inc.) — рекомбинатный Fab фрагмент гуманизированного моноклонального антитела (молекулярный вес 48 кДа), связывающий все изоформы VEGF-A. В 2006 г Ranibizumab был одобрен FDA для лечения влажной формы возрастной макулодистрофии (ВМД). Препарат разрабатывался для локального введения (интравитреальные инъекции). Благодаря относительно небольшому (по сравнению с полноразмерным антителом) размеру он быстро и полностью проникает в сетчатку [44].

При разработке Ranibizumab за основу был взят фрагмент Bevacizumab Fab-12. Для достижения максимального ингибирования VEGF указанным моновалентным фрагментом последовательность Fab-12 была оптимизирована путём аффинной селекции мутантов с использованием фагового дисплея [45]. Отобранный мутант Fab Y0317 (Ranibizumab