Полипептидные компоненты яда пауков, модулирующие активность потенциал-зависимых натриевых каналов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

на правах рукописи

005010700

Никольский Антон Сергеевич

ПОЛИПЕПТИДНЫЕ КОМПОНЕНТЫ ЯДА ПАУКОВ, МОДУЛИРУЮЩИЕ АКТИВНОСТЬ ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИСИМЫХ НАТРИЕВЫХ КАНАЛОВ

Специальность 02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

2 0ЕВ 2С"і2

Москва-2012

005010700

Работа выполнена в лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов

Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биоорганической

химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научный руководитель: доктор химических наук,

профессор, академик РАН Гришин Евгений Васильевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор,

Уткин Юрий Николаевич

доктор биологических наук, Тихонов Денис Борисович

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита диссертации состоится^. С X- 2012 года в {С часов на заседании Диссертационного совета Д 002.019.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу 117997, ГСП-7, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор физико-математических наук __________В.А. Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Потенциал-зависимые натриевые (№+) каналы - интегральные мембранные белки, селективно пропускающие ионы №+ и играющие ключевую роль в процессах генерации и проведения возбуждения в нервных клетках. Появление каналов в ходе эволюции животных тесно связано с дифференцировкой тканей и обособлением нервной системы. Принимающие участие в таких важнейших физиологических процессах, как осязание, чувство боли, сокращение мышц, биение сердца и многие другие, №+ каналы представляют большой интерес для ученых всего мира, и с каждым годом актуальность их изучения только возрастает. Несмотря на усилия многих научных коллективов, пространственная структура и механизм работы №+ каналов недостаточно изучены. Поэтому большой фундаментальный интерес представляет задача выяснить молекулярные аспекты механизма ионной проводимости и пространственную организацию этих белков.

В значительной мере современные исследования в области Ка+ каналов направлены на получение новых лекарств и пестицидов, селективно взаимодействующих с каналами и модифицирующих их активность. Имея в своем распоряжении подобные молекулы, можно направленно управлять работой каналов или, например, корректировать их функционирование в патологических процессах. Поэтому поиск новых лигандов, специфичных для №+ каналов, является важной задачей для современной медицины и биотехнологии.

№+ каналы являются мишенью для многих компонентов полипептидной природы, выделенных из различных ядовитых животных: анемон, моллюсков, скорпионов и пауков. Именно специфичное высокоаффинное взаимодействие с некоторыми лигандами позволило идентифицировать, очистить и охарактеризовать эти мембранные белки.

С точки зрения источника новых модуляторов ионных каналов природные яды представляют наибольший интерес, поскольку являются своеобразными комбинаторными библиотеками биологически активных соединений, отобранных в ходе эволюции. Особое место среди природных ядов занимает яд пауков (в среднем, в яде паука содержится от нескольких десятков до нескольких сотен компонентов), а наиболее интересными оказываются полипептидные компоненты яда, так как они характеризуются высокой специфичностью действия. Благодаря своим свойствам эти соединения получили широкое распространение как инструменты для биохимических исследований. Использование таких молекул поможет установить точный молекулярный механизм функционирования таких сложных мембранных структур, как №+ каналы, а также пролить свет на их фармакологические характеристики и пространственную организацию. Новые инструменты

могут быть полезны в фундаментальных исследованиях молекулярных механизмов нейросигнализации, а также найдут практическое применение в медицине для терапии заболеваний, связанных с дисфункцией №+ каналов, и в биотехнологии как безопасные биоинсектициды.

Цель и задачи работы

Цель данной работы - поиск и идентификация новых полипептидных веществ из яда пауков, модулирующих активность №+ каналов. В соответствии с целью были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Провести тестирование коллекции ядов пауков в отношении №+ каналов.

2. Выделить и установить первичную структуру активных полипептидов.

3. Изучить механизм действия выделенных компонентов.

4. Осуществить поиск структурных детерминант активности новых соединений.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые проведен анализ яда паука Непаеия те!Ыее1, принадлежащего к семейству ТЪогг^ске, на наличие полипептидов, обладающих ингибиторной активностью в отношении Ыа+ каналов. Обнаружены, выделены и установлены первичные структуры трех новых полипептидов (Нш-1-3). Исследована активность выделенных веществ на различные изоформы №+ каналов.

Обнаружено новое семейство гомологичных полипептидов (р/8-агатоксины-1-7) в яде паука Agelem опеМаНз, принадлежащего к семейству Ageleni(iae. Эти вещества обладают уникальным потенциал-зависимым действием на №+ каналы насекомых с одновременным влиянием на процессы активации и инактивации каналов. Подобная активность описана впервые, что может привести к пересмотру современной классификации лигандов каналов, основанной на строгом соотношении места связывания молекулы в канале и вызываемым ею эффектом.

Таким образом, полученные результаты отличаются высокой степенью новизны, расширяют наши представления о фармакологии №+ каналов и, вероятно, будут использованы для выяснения молекулярной природы специфичности действия новых токсинов. Помимо очевидной значимости для теоретической науки, выделенные молекулы могут быть использованы в качестве основы для создания новых медицинских препаратов или же, благодаря своей специфичности действия на насекомых, найдут применение в биотехнологии как безопасные инсектициды.

Апробация работы

Основные материалы диссертации были представлены на следующих конференциях и симпозиумах:

XIV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007» (Москва, 2007), XX зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2008), 16-ое собрание Европейской секции международного общества токсинологии (Лёвен, Бельгия, 2008), 12-ая международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008), XVI Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009» (Москва, 2009), IV Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Казань, 2009), XXII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2010), 14-ая Пущинская международная школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010), 10-е собрание Американской секции международного общества токсинологии (Сан-Хосе, Коста-Рика, 2010), 35-ый Конгресс федерации европейских биохимических обществ (Гётеборг, Швеция, 2010), Ежегодный симпозиум биохимического общества «Последние достижения биохимии мембран» (Кэмбридж, Великобритания, 2011), V Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на ■06 страницах, содержит рисунков и @ таблиц, имеет традиционную структуру и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Стратегия и объекты исследования

Для поиска новых веществ из яда пауков была использована стандартная стратегия, когда образцы ядов на каждом этапе исследования тестировались в системе, где можно непосредственно наблюдать и измерять эффекты интересуемого нас вещества на выбранной молекулярной мишени. Такой подход зарекомендовал себя как надежный, дающий достоверные и проверяемые результаты. Цельные яды пауков приобретались в виде лиофилизованного порошка у Fauna Laboratories, Алматы, Республика Казахстан, и хранились при -70°С. Инсектотоксичность ядов и выделенных индивидуальных веществ тестировались на личинках мясной мухи Sarcophaga carnaria. Все элекгрофизиологические эксперименты проводились в лаборатории токсикологии Католического Университета г. Лёвен, Бельгия. На первом этапе исследования было проведено тестирование ядов 16 видов пауков, принадлежащих к 9 различным семействам, на наличие ингибирующей активности в отношении потенциал-зависимых Na+ каналов млекопитающих. В качестве мишеней использовались 3 изоформы Na+ каналов - тетродотоксин-чувствительные Nav1.2, Nav1.7 и тетродотоксин-устойчивая Nav1.5, гены которых были экспрессированы в ооцитах Xenopus laevis. Измерения токов проводились по методу двухэлектродной фиксации потенциалов. Результаты тестирования приведены в таблице 1.

Таблица 1. Тестирование активности цельных ядов пауков. Приведены значения относительного (в %) снижения амплитуды Na+ токов, опосредованных различными каналами, при действии яда в концентрации 0,1 мг/мл. (-) - тестирование не проводилось;

(t) - наблюдался лизис ооцитов. Префикс г обозначает изоформы из Rattus norvegicus, h - из человека.

Семейство Вид rNav1.2 hNavl .5 rNav1.7

Agelenidae Agelena orientalis 9 3 9

Eresidae Eresus sp. - 34 17

Stegodyphus sp. 26 52

Gnaphosidae Drassodes sp. 33 71 35

Lycosidae Alopecosa sp. Desertosa sp. Geolycosa sp. Hippocosa sp. Lycosa singoriensis Nenilinia sp. t t t t t f r t f t t t t t t t t t

Miturgidae Cheiracanthium punctorium t t t

Philodromidae Tibellus oblongus 47 53 9

Theridiidae Latrodectus dahli 6 36 8

Thomisidae Heriaeus melloteei 87 81 80

Misumena vatia 69 36 100

Zodariidae Lachesana tarabaevi t t t

Некоторые яды, как видно из представленной таблицы, проявляли выраженные цитолитические свойства, в результате чего в процессе эксперимента наблюдался лизис ооцитов, что приводило к невозможности дальнейших измерений. Так, например, ранее в лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов ИБХ РАН был установлен молекулярный состав яда паука ЬасИезапа 1агаЬаеУ1, который является богатым источником цитолитических и антимикробных пептидов (латарцинов и цито-инсектотоксинов). Подобные трудности могут быть решены более сильным разведением указанных ядов, поскольку действующие концентрации нейротоксинов и цитолитических пептидов обычно различаются на порядки, или же предварительным разделением ядов на фракции с последующим тестированием.

В результате проведенного тестирования было обнаружено, что яды двух пауков Непаеиз те11о1ее1 и Мяитепа vatia, принадлежащих к одному семейству Т1югтй1с1ас, обладают наиболее выраженным ингибирующим эффектом. На основании того, что природными жертвами пауков являются насекомые, была оценена инсектицидная активность указанных ядов. Было показано, что яд Н. те11о1ее1 в дозе > 15 мг/кг вызывал немедленный паралич и смерть личинок 5. сатапа. Такая величина минимальной эффективной дозы говорит о присутствии инсектицидных компонентов в яде этих пауков. Для дальнейшей работы был выбран яд Н. те11о1ее1, поскольку он показал наибольшую активность.

Яд паука Agelena опеШаНз оказывает высокую токсичность на насекомых. Например, смертельной дозой для личинок мясной мухи является ~6 мг/кг. Цельный яд в концентрации

0,1 мг/мл вызывает ярко выраженный эффект на Иа+ каналы ОшЫау1 дрозофилы (облегчение активации и ингибирование инактивации), в то же время никак не воздействует на каналы Ыау1.2, 1.5 или 1.7 млекопитающих (табл. 1). По причине столь высокой токсичности и избирательности действия яд А. опеШаИя был исследован для поиска новых селективных веществ, воздействующих на №+ каналы насекомых.

Выделение активных молекул

С целью получения новых блокаторов Ка* каналов была использована стратегия многоступенчатого разделения цельного яда Н. теНМее! методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ). Такой подход позволяет получить искомые компоненты в индивидуальном виде за минимальное число стадий и с минимальными потерями, что является решающим фактором при работе с ограниченным количеством биологического материала. На всех стадиях разделения яда фракции подвергались тестированию на наличие искомой активности. Для этого отбирались аликвоты

так, чтобы концентрация активного компонента при тестировании сохранялась. На рисунке 1А показан профиль первой стадии разделения яда.

Рисунок 1. Выделение блокаторов Na+ каналов из яда паука Heriaeus melloteei.

(А) Разделение 4 мг цельного яда на колонке Jupiter С5 (4,6х 150 мм, Phenomenex, США) в градиенте концентрации ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте (указан пунктиром) со скоростью элюции 1 мл/мин. Цифрами обозначены фракции, для которых проводилось тестирование инсектицидной активности. (Б, В, Г) Второй этап разделения активных фракций а (Б), б (В), в (Г) на колонке Luna Cg (4,6x150 мм, Phenomenex, США) в градиенте концентрации элюента (50% ацетонитрил, 20% изопропанол в 0,1% трифторуксусной кислоте; указан пунктиром) со скоростью элюции 1 мл/мин. Фракции, содержащие активные компоненты, обозначены (Нт-1, Нт-2 и Нт-3).

Блокирующая активность в отношении №+ каналов млекопитающих (изоформы Ка»1.2 и №у1.5) была обнаружена во фракциях 3-6, в то время как инсектицидную активность проявляли фракции 2-6. Таким образом, наблюдается перекрывание профилей активности, что может быть связано с эффектом одних и тех же соединений. Активные фракции по данным МАЛДИ (матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации) масс-спектрометрии содержали компоненты с молекулярной массой 3-10 кДа, что соответствует массам наиболее часто встречаемых пептидов из яда пауков. Для дальнейшей работы были выбраны фракции 3, 5 и 6, а впоследствии предполагается также изучить активные компоненты фракций 2 и 4. В результате второй стадии ОФ-ВЭЖХ были выделены блокаторы каналов, получившие название Нт-1, 2 и 3 (рис. 1Б, В и Г). Для получения этих веществ в индивидуальном виде использовалась третья стадия хроматографического разделения. Чистота выделенных соединений подтверждена аналитической ОФ-ВЭЖХ, а

также с помощью МАЛДИ масс-спектрометрии. Измеренные средние молекулярные массы токсинов составили 4171,9 Да (Нт-1), 4555,3 Да (Нт-2) и 3907,7 Да (Нт-3).

Активные вещества из цельного яда A. oriental is были выделены также с помощью процедуры многостадийной ОФ-ВЭЖХ. На первой стадии яд подвергался разделению в основных условиях (рис. 2), а на второй полученные фракции хроматографировались в кислых условиях. В итоге были получены семь новых полипептидов, получивших название p/8-агатоксины.

CH3CN, %

10 20 ,, ТО

Время, мин

Рисунок 2. Выделение активных компонентов из яда паука Agelena orientalis, действующих на Na+ каналы.

ОФ-ВЭЖХ 1 мг цельного яда А. orientalis на колонке Jupiter С5 (4,6x150 мм) в градиенте концентрации ацетонитрила в

0,1% триэтиламине (показан пунктиром). Пронумерованные фракции содержат токсины, активные в отношении Na+ каналов насекомых: 1 - p/8-ага-

5, 2 - р/8-ага-4, 3 - р/8-ага-6, 4 -р/8-ага-7, 5 - p/5-ara-l, 6 - р/8-ага-2, 7 - p/8-ага-З.

Гомогенность полученных компонентов проверялась с помощью аналитической ОФ-ВЭЖХ и МАЛДИ масс-спектрометрии. Самый мажорный компонент цельного яда составляет около 30% от всего полипептидного состава, проявляет высокую токсичность (ЛД5о = 7 мг/кг для личинок мясной мухи) и был назван р/8-агатоксин-1 (р/8-ага-1). Остальные шесть пептидов были пронумерованы в соответствии с их сходством с р/5-ага-1 (см. ниже табл. 3). Высокая инсектотоксичность делает р/8-агатоксины перспективными объектами для использования в биотехнологии в качестве пестицидов.

Структурный анализ и поиск гомологов новых полипептидов

При определении первичных структур выделенных полипептидов использовались классические приемы белковой химии, включающие хроматографические методы, масс-спектрометрию, автоматическое секвенированис по Эдману и в отдельных случаях фрагментацию полипептидной цепи. Для установления аминокислотных последовательностей новых токсинов были проведены реакции восстановления

дисульфидных связей с последующим алкилированием 4-винилпиридином высвободившихся тиольных групп.

Полные аминокислотные последовательности блокаторов №+ каналов из Н. те1Ыеег (табл. 2) были установлены с помощью перечисленных выше методов, включая селективную фрагментацию по остаткам метионина (бромцианом) и глутаминовой кислоты (эндопротеиназой Ии-С). На первом этапе устанавливались частичные 1Ч-концевые последовательности полипептидов, после чего они подвергались селективному расщеплению. Полученные фрагменты разделяли с помощью ОФ-ВЭЖХ, измеряли их массу, а затем секвенировали. В результате получали набор последовательностей, которые однозначно и полностью соответствовали исходным полипептидам. Из-за разницы измеренных молекулярных масс токсина Нт-1 и его С-концевых фрагментов и соответствующих расчетных значений по данным секвенирования (Д = 1 Да) был сделан вывод о наличии у этого пептида посттрансляционной модификации - С-концевого амидирования.

Таблица 2. Аминокислотные последовательности блокаторов каналов из яда паука Непает те1Шее1. Жирным шрифтом выделены остатки глутаминовой кислоты и метионина, остатки цистеина выделены затемнением. Разрывы внесены для оптимизации сравнения последовательностей.

Токсин Аминокислотная последовательность Длина, а.о.

1 10 20 30

Нт-1 (^1рускт^еризсриЩ||аск-|кь№/мзмтьз||т1Шр-№12 37

Нт-2 0§1Р:ЗРСЕ|АдаЗСЕзЩ^С1-|кВДРРТЗКРМ|кЯ\ЖСКО-ОН 40

Нт-3 (511 АКМ^А^ЗЙЕиМпАТ .яЩкУЯ ТККЫТ ,КТ||у-Г)Н 35

Все выделенные полипептиды содержат по 35^0 аминокислотных остатков (а.о.), шесть из которых являются остатками цистеина, образующими три внутримолекулярные дисульфидные связи. Порядок замыкания этих связей не исследовался. Расположение остатков цистеина в аминокислотной последовательности позволяет предположить формирование пространственной укладки типа «цистинового узла» у найденных молекул, характерной для многих других пептидных токсинов пауков (см. ниже рис. 3). Подобный тип укладки является довольно общим и распространенным в мире токсинов, однако не определяет биологические свойства молекулы.

При анализе Нт-2 и 3 для них не было найдено ни одной сходной последовательности в базе данных ишРпй (http://www.uniprot.org/), но они показали некоторую степень сходства между собой (46% идентичных остатков). Для Нт-1 обнаружена низкая степень сходства с

уже известными пептидами агеленином и ц-агатоксином 2, выделенными из яда пауков и активными в отношении потенциал-зависимых Са2+ и №+ каналов, соответственно (рис. 3). Отсутствие значимого сходства с другими токсинами позволяет нам говорить об отнесении этих молекул к новым группам блокаторов Ыа+ каналов.

Рисунок 3. Сравнение аминокислотной последовательности Нш-1 с известными пептидами. Заштрихованы идентичные аминокислотные остатки. Справа приведено процентное содержание остатков, идентичных с Нт-1.

1 10 20 30

Нт-1 -0С1|УСЙТ§ЕР1®М®^-^Ьл!1УИ8МТЬ9^ТН11Р

агелснин сШь1ныкршА11шшаз^№МЕь.1ттяя <зь— 40

р-агатоксин 2 -ЕСАТШККСАПМА^рИССОСЬУрБСКвУРССМ-рНРЗЗ 32

Полную аминокислотную последовательность полипептидов из яда А. опеШаИя устанавливали с помощью автоматической деградации по Эдману. М-концевое секвенирование восстановленных и алкилированных полипептидов показало, что )3/5-ага-5 и 6 имеют по 36 а.о., (З/8-ага-З, 4 и 7 - 37 а.о., а р/5-ага-1 и 2 - 38 а.о. (табл. 3). Каждая молекула токсинов содержит 8 остатков цистеина, которые образуют четыре внутримолекулярные дисульфидные связи. Из-за разницы в 1 Да между измеренной и вычисленной на основании аминокислотной последовательности молекулярными массами, был сделан вывод, что все семь полипептидов имеют С-концевое амидирование.

Аминокислотные последовательности р/8-агатоксинов показывают значительное сходство с другими известными токсинами, такими как р-агатоксины из паука Agelenopsis арег1а, куртатоксины из НоЫепа сиПа и 8-палутоксиньг из РагасоеШея Ышояиэ. Все эти токсины образуют большое семейство родственных полипептидов, действующих на №+ каналы насекомых. К настоящему времени пространственные структуры разрешены только для двух представителей - ц-агатоксина-1 и 5-палутоксина-2, формирующих наиболее общий мотив укладки для токсинов пауков - «цистиновый узел». Даже при отсутствии прямых экспериментальных данных о расположении дисульфидных связей р/8-агатоксинов разумно предполагать, что они формируют в пространстве аналогичный тип укладки (см. ниже, рис. 9).

Таблица 3. Аминокислотные последовательности р/8-агатоксинов. Разрывы внесены для оптимизации сравнения последовательностей. Серым выделены а.о., отличные от (5/6-агатоксина-1. Все молекулы имеют С-концевое амидирование. Остатки цистеина выделены жирным шрифтом.

Токсин Аминокислотная последовательность Молекулярная масса, Да

р/8-ага-1 1 10 20 30 СОСУСЕ ЗООСАБДОЗСРУССКСУУСТСКУЕ РКС 1С\ЛГОЫ-Ша 4271,8

р/8-ага-2 (3|СТСЕ300САШ36РУССК6УУСГСЯУЕРКС1СтаПЭ11-Ш2 4213,8

р/8-ага-З С^СУСЕВД0САВ1\'АСРНСС5СУУСТСКУЕРКС1СНКО§-Ж12 4144,7

р/8-ага-4 С-СУСЕЙООСАОМАСШССЗСУУСТСКУЕРКС1СЙК05-ОТ12 4160,8

р/8-ага-5 -ОСУСЕ^^С1|ПУЩ-рССОС?УС8СЕ^РРуС1СМм-Ш2 4234,7

р/8-ага-6 -^УСЕШНСЙЗМта-ОССТСУУСЭСЙ0#?ЫСТСК№В1 ян* 4143,6

р/8-ага-7 -ЕСААКМККСАО'.лГАСРМССЕСЬУСЗСБЙ УI ССМСР.-^З-ш2 4111,8

Механизм действия выделенных токсинов

Испытания активности цельных ядов, отдельных фракций и очищенных компонентов проводились на ооцитах X. 1аеУ1э методом двухэлектродной фиксации потенциала. Предварительно в ооциты вводилась кэпированая матричная РНК, кодирующая а- и 0-субъединицы различных изоформ №+ каналов млекопитающих или дрозофилы.

Было обнаружено, что при аппликации токсинов Нт-1, 2 и 3 в концентрациях -100 нМ происходило уменьшение амплитуды №+ тока. Например, в отношении мышечного типа каналов (изоформа Кау1.4) были получены кривые «доза-ответ», определены эффективные концентрации токсинов, при которых наблюдается 50%-ное снижение амплитуды Ыа+ тока (ЕС50), составившие ~340 нМ для Нт-1 (коэффициент Хилла 1,0+0,1) и -160 нМ для Нт-2 (коэффициент Хилла 1,2+0,1). Достаточно низкие действующие концентрации токсинов позволяют предположить, что главной мишенью для них являются №+ каналы.

В отличие от большинства полипептидных лигандов, в случае Нт-1 и 2 не происходило изменений вольт-амперных характеристик, кинетики активации и инактивации №+ каналов. Таким образом, эти токсины являются, по-видимому, типичными поровыми блокаторами. Предполагается, что Нт-1 и 2 взаимодействуют с теми же областями канала, что и классические блокаторы тетродотоксин и сакситоксин (т.н. сайт 1), или близкими к ним.

Нт-1 и 2 не проявляют выраженной специфичности в отношении различных изоформ №+ каналов. На рисунке 4 показаны записи №+ токов на фоне приложения токсина Нт-2.

Видно, что этот полипептид наиболее активен в отношении каналов насекомых, а также изоформ каналов млекопитающих Navl.2 и Navl.4, и наименее активен на Navl.5 и Navl.8.

Рисунок 4. Эффекты Нш-2 на различные изоформы потенциал-зависимых Na+ каналов. Изоформы rNav1.2, rNav1.4 и rNav1.8 из R. norvegicus, hNav1.5 из человека, mNav1.6 из Mus musculus и DmNavl из Drosophila melanogaster

экспрессировались в ооцитах X. laevis. Стрелкой указана пиковая амплитуда Na+ тока на фоне приложения токсина в концентрации 200 нМ.

Нт-3, несмотря на значительное сходство по аминокислотной последовательности с Нт-2 (46% идентичных остатков), характеризуется иным механизмом действия. На рисунке 5 заметны отчетливый сдвиг вольт-амперной характеристики канала при действии этого токсина и отсутствие такого эффекта в случае Нт-1 и 2. Подобный эффект обнаружен у токсинов JZTX-III из яда паука Chilobrachys jingzhao и ProTx-I и II из яда паука Thrixopelma pruriens, предположительно действующих на т.н. рецепторный сайт 4. По-видимому, Нт-3 также связывается с сайтом 4. Стоит отметить, что классическими модуляторами Na+ каналов, действующими через сайт 4, являются (3-токсины скорпионов. Характер их действия, однако, отличается: процесс активации не ингибируется, а напротив, облегчается. Сходным образом действуют р-агатоксины из яда паука A. aperta и Magi 5 из яда паука Macrothele gigas. S-Палутоксины из яда паука P. luctuosus взаимодействуют с сайтом 4, однако по физиологическому эффекту сходны с а-токсинами скорпионов, воздействующими на сайт 3.

Таким образом, наблюдается широкое разнообразие фармакологической активности полипептидных модуляторов Na+ каналов. При этом молекулы, связывающиеся со сходными участками канального белка, могут оказывать различное влияние на его активность и наоборот, полипептиды, взаимодействующие с различными рецепторными сайтами, могут производить сходный физиологический эффект.

Рисунок 5. Изменение вольт-амперной характеристики мышечной изоформы №+ канала (г№у1.4) при действии токсинов. • - контроль, о - при действии токсинов: Нт-1 (200 нМ), Нт-2 (200 нМ) и Нт-3 (1 цМ).

Нт-1

Нт-2

Нт-3

. V

• о.

і /Г

Л

•я

\ ч

\ и-оо.

\ I

\ -

г/

оооооооуооооп^-\ 1

°оо° у

контроль -о-токсин

При исследовании функциональной активности компонентов яда А. ог1еЫаИ5 в первую очередь испытанию подвергли |3/5-ага-1 как самый мажорный компонент яда. Запись токов при приложении 1 мкМ (3/5-ага-1 производилась при деполяризации мембраны до -10 мВ (при этом значении амплитуда тока максимальна). В результате было отмечено три различимых эффекта (рис. 6). Первый связан с увеличением пиковой амплитуды тока на -35%, второй с уменьшением времени достижения максимальной амплитуды тока с -1,1 до

0,9 мс, третий с появлением неинактивированной компоненты тока величиной ~5% от пиковой амплитуды после реполяризации.

Все три эффекта хорошо прослеживаются на вольт-амперной характеристике канала БшКау1, полученной при деполяризации мембраны от -80 мВ до 60 мВ с шагом 5 мВ. Каждое значение силы тока при определенном значении мембранного потенциала записывали и откладывали на графике зависимости тока от потенциала активации канала. Также измерялся ток спустя 50 мс с начала деполяризации для отслеживания воздействия токсина на инактивацию канала. Как видно из рисунка 6, р/5-ага-1 вызывает сильный сдвиг порогового потенциала активации в более гиперполяризованную область мембранного потенциала. Т.е. Иа+ каналы активируются при более низких значениях мембранного потенциала (максимальный ток наблюдали при потенциале активации -35 мВ), а действие |3/5-ага-1 характеризуется облегчением процесса активации (ЕС5о -290 нМ, коэффициент Хилла 1,5±0,7). Амплитуда тока, измеренного спустя 50 мс, зависит от потенциала активации, и эти остаточные токи возникают только в диапазоне от -80 до 10 мВ. Так, максимальная амплитуда этого тока составляет -20% от значения амплитуды быстрой компоненты тока при потенциале активации -45 мВ. Т.е. некоторые каналы еще остаются открытыми спустя время, значительно большее нормального времени их работы, не переходя в инактивированное состояние (значение ЕС50 -220 нМ, коэффициент Хилла 1,5+0,4). При

этом р/6-ага-1 не проявляет никакого эффекта на №+ каналы млекопитающих при концентрации I мкМ (на рисунке 6 приведены данные для г№у1.2 крысы А norvegicus).

Рисунок 6. Эффекты р/й-ага-1 на №а+ каналы Оп^ау1 и rNav1.2, экспрессируемые в ооцитах Хепорт 1аеу1я. В верхнем ряду представлены записи токов в контроле (черный график) и при приложении 1 мкМ р/8-ага-1 (серый график). В нижнем ряду представлена вольт-амперная характеристика для быстрой компоненты тока в контроле (черные кружочки) и в присутствии 1 мкМ р/8-ага-1 (белые кружочки). Измерение тока проводилось также спустя 50 мс после деполяризации (серые треугольники для контроля и белые для 1 мкМ р/бага-1).

Проводился также анализ функциональной активности шести других токсинов, выделенных из яда А. опеШаНз и характеризующихся высоким сходством с р/8-ага-1 ф/8-агатоксины-2-7). Для исследования вольт-амперных характеристик канала использовался описанный выше протокол. Измерение максимальных токов осуществлялось при потенциале активации -35 мВ, а остаточных токов - -45 мВ спустя 50 мс. Полученные данные свидетельствуют о том, что все полипептиды действуют схожим с р/8-ага-1 образом. На рисунке 7 представлены эффекты для каждого токсина, нормализованные относительно максимальных значений.

N3^1.2

Вп^а 1

Рисунок 7. Относительные величины эффектов р/6-агатоксинов на активацию и инактивацию каналов От№у1. Концентрация токсинов 1 мкМ. Амплитуда

наибольшего наблюдаемого тока принята за 100%.

Поиск структурных детерминант активности новых полипептидов

Установление пространственной организации молекулы позволило бы выявить некоторые ее структурные особенности и предположить вероятный механизм действия на мишень. Для всех изученных молекул пространственная структура пока не исследована. Однако с помощью компьютерных методов представляется возможным построить модели их пространственной организации на основе сходства с токсинами, для которых 3D структура уже разрешена. Молекулярное моделирование проводились с использованием программы MODELLER на основе ранее известной структуры близкого аналога. Далее все модели проверялись программой TINKER с минимизацией свободной энергии молекулы в силовом поле CHARMM27.

Гомологичное моделирование Нт-1, 2 и 3 проводилось на основе структуры агеленина - токсина, действующего на Са2+ каналы (рис. 8). Отличительной особенностью токсинов Нт-1 и Нт-2 является высокое содержание остатков ароматических аминокислот, которые возможно ответственны за связывание данных соединений с канальным белком. Похожая ситуация, по-видимому, имеет место и у хайнантоксина-1 - блокатора Na+ каналов: остатки Phe, Туг, Тгр, а также Val формируют гидрофобные кластеры. Такие области предположительно действуют как якорь при связывании токсинов с каналом. Расположение заряженных остатков может указывать на вероятный механизм действия токсинов. Так, у Нт-1 три положительно заряженных остатка (Lys-21, Lys-23 и Arg-35) из четырех сближены, а единственный остаток, несущий отрицательный заряд (Glu-Ю), вероятно образует ионную пару с N-концевой аминогруппой молекулы. В случае Нт-2 остатки положительно

Ш Активация ЕЭ Инактивация

заряженных аминокислот (Ьуз-23, Ьуэ-ЗО, Arg-34, А^-35 и Ьуэ-ЗЭ) сконцентрированы на одном полюсе молекулы. Такое распределение зарядов характерно и ожидаемо для токсинов, являющихся поровыми блокаторами. Напротив, у Нш-3, являющегося модулятором активации и предположительно взаимодействующего с рецепторным сайтом 4, не наблюдается выраженной асимметрии распределения зарядов.

Рисунок 8. Модели пространственной структуры полипептидов Нш-1, 2 и 3. Модели построены на основе структуры агеленина (код РОВ 2Е2Э). Боковые радикалы заряженных а.о. показаны линиями. Обозначены Ы- и С-концы основной цепи. Воображаемая поверхность молекул раскрашена: красным обозначены отрицательно заряженные остатки, фиолетовым - положительно заряженные, синим - гидрофобные, серым - прочие.

Высокое сходство между аминокислотными последовательностями полипептидов обычно подразумевает общность пространственной организации (такое сходство наблюдается, например, у ц-ага-1 и 5-палутоксинов-1 и 2, для которых известна пространственная структура) и механизмов действия, хотя и существует достаточное количество исключений. В рамках данной работы мы можем предположить, что р/5- и р-агатоксины, а также куртатоксины и б-палутоксины (рис. 9) составляют крупное семейство родственных полипептидов, имеют общий тип укладки и связываются с рецепторным сайтом 4 каналов насекомых.

Для р-агатоксинов, которые были выделены первыми из яда А. ареПа, показано, что они специфично действуют на №+ каналы насекомых. Для наиболее изученных р-ага-1 и 4 обнаружено, что они сдвигают активационную кривую каналов в область более отрицательных значений потенциала, сродни (3-токсинам скорпионов. Кроме того, для них было показано замедление процесса инактивации каналов и возникновение

неинактивируемого тока. Эти эффекты не были подробно изучены, но, по крайней мере, для р-ага-1 и 4 можно сказать, что они качественно похожи на токсины, описанные нами. Мы полагаем, что префикс «ц-» не подходит для обозначения этих токсинов, поскольку обычно применяется для названия поровых блокаторов №+ каналов; р-агатоксины следует

Нш-1

Нт-2

Нт-З

переименовать в соответствии с проявляемыми ими эффектами. Куртатоксины из яда

Н. сиМа не изучены подробно, однако, по-видимому, действуют схожим образом с другими членами семейства.

Рисунок 9. Сравнение аминокислотных последовательностей р/б-ага-1 с известными токсинами. Светло-серым выделены идентичные с р/б-ага-1 а.о., темно-серым - остатки цистеина, жирным - остатки, по-видимому, ответственные за (3-эффект, подчеркнуты функционально значимые остатки 8-палутоксина-2.

р/§-агатоксин-1 ц-агатоксин-1 |д-агатоксин-4 куртатоксин-1 куртатоксин-2 куртатоксин-3 8-палутоксин-1 8-палутоксин-2 8-палутоксин-З 8-палутоксин-4

В настоящий момент 8-палутоксины из P. luctuosus являются, пожалуй, наиболее исследованными токсинами описываемого семейства. В отличие от гомологичных им ц-ага-1

и 4, а также p/8-агатоксинов, 8-палутоксины-1 и 2 не влияют на активацию каналов, однако

вызывают эффект, схожий с а-токсинами скорпионов, т.е. ингибирование инактивации Na+ I каналов. Основное отличие от а-токсинов скорпионов заключается в том, что 8-палутоксин-2

| конкурирует с р-токсинами скорпионов за связывание с рецепторным сайтом 4.

Чтобы установить взаимосвязь между эффектами р/8-агатоксина-1 и его структурой, необходимо определить функционально значимые а.о. Для этого необходимо получить р/бага-1 с модифицированными или замещенными, например, на Ala, остатками.

Рисунок 10. Модель пространственной структуры р/б-агатоксина-1. Модель построена на основе структуры близкого гомолога 8-палутоксина-2 (код PDB 1V91). Боковые радикалы

предполагаемых функционально важных остатков показаны линиями. Обозначены N- и С-концы основной цепи. Воображаемая поверхность молекулы раскрашена: остатки, по-видимому,

ответственные за p-эффект, выделены фиолетовым, другие функционально важные остатки - синим, прочие - серым.

10

20

30

-EgVPENGHj

A-|VGENQQ(

s-|vgeyg:

adIvgdgq:

ad|vgdgq

g-|lgegek

A-|VGDGQ.

ad|lnegdi

a-|atknq:

|ryfp:

|rqpp:

:ryfpk<

jSQPPYl

|rsmpy|

:rsmpy|

RSMP'

|rsmpy|

■PGFGK

IRSYPG

В нашей работе мы использовали природные «мутанты» p/8-ara-l, а именно молекулы с родственной первичной структурой и обладающие сходным действием. Вначале проанализируем аминокислотные остатки группы p/5-агатоксинов (табл. 3), в соответствии с силой вызываемых ими эффектов (рис. 7). Большая разница наблюдается между p/8-ага-З и р/8-ага-4. Они отличаются единственным остатком в положении 15: Pro у p/5-ага-З и Leu у р/8-ага-4. Остаток пролина, по-видимому, вносит существенный вклад в формирование структуры молекулы (образует си-пептидную связь в 6-палутоксинах-1 и 2). Вероятно, поэтому при замене Prol5Leu происходит сильное снижение активности р/8-ага-4. В p/5-ага-

7, у которого активность тоже слабая, имеется замена Lys31Gly, затрагивающая фармакофор 6-палутоксина-2 (см. ниже). У р/5-ага-5 и -6 хорошо выражен один из эффектов (рис. 7), что можно объяснить укороченной петлей между вторым и третьим остатками цистеина по сравнению с другими p/8-агатоксинами.

Для б-палутоксина-2 были определены функционально важные остатки, которые формируют «фармакофор» этой молекулы: Arg-8, Trp-12, Tyr-22, Ser-24, Arg-26, Met-28, Тут-30, Arg-32 и Arg-34. Интересно, что этот фармакофор сохраняется практически во всех представителях семейства. Например, Тгр-12, Тут-22 и Ser/Thr-24 сохраняются во всех полипептидах, за исключением замен Тгр12А1а и Ser24Asn в куртатоксине-1 и Туг22Тгр в 8-палутоксине-3. Однако встречаются и некоторые вариации: в положениях 32 и 34 присутствуют положительно заряженные или большие гидрофобные остатки, в позиции 28 метионин заменяется другими гидрофобными остатками, а в позициях 8 и 30 могут располагаться разнообразные остатки.

Как было показано выше, (i/8-агатоксины обладают сразу двумя эффектами: воздействуют на активацию и инактивацию Na+ каналов. При этом близкородственные 8-палутоксины обладают эффектом только на инактивацию каналов. По сути, р/8- и ц-агатоксины (наиболее изученные ц-ага-1 и ц-ага-4) в сравнении с 6-палутоксинами можно считать имеющими «дополнительную» активность в отношении активации каналов. По этой причине остатки, которые отвечают за эту «дополнительную» функцию, могут быть локализованы. В р/8-ага-1 такими остатками, по-видимому, являются Ser-7, Tyr-28, Phe-29 и Ие-ЗЗ. Соответствующие им остатки 5-палутоксина-2: Gly-6, Ser-27, Met-28 и Arg-32. Все другие замены у 8-палутоксина-2 по сравнению с p/5-ara-l могут быть найдены и у остальных представителей этого семейства, обладающих активностью в отношении активации каналов, и таким образом являются нейтральными. Интересно, что все представленные остатки, ответственные за эффект токсина на активацию каналов, по-видимому, сближены в пространстве (рис. 10), а два из четырех входят в фармакофор 5-палутоксина-2.

Заключение

Структурное разнообразие и важная роль №+ каналов во многих биологических процессах обуславливает интерес к этим объектам со стороны исследователей. Неудивительно, что в настоящее время описано большое количество лигандов №+ каналов различной природы. Представленная работа дополняет существующее многообразие, демонстрируя, как с помощью арсенала современных методов в яде пауков можно найти и охарактеризовать вещества, проявляющие активность в отношении Иа+ каналов млекопитающих и насекомых. Обнаруженные полипептиды являются как поровыми блокаторами, так и модуляторами различных стадий работы каналов - активации и инактивации. Кроме того, некоторые из найденных токсинов проявляют высокую специфичность в отношении насекомых и могут быть использованы как основа для разработки эффективных и безопасных инсектицидов.

ВЫВОДЫ:

1. Проведено тестирование коллекции ядов 16 видов пауков из 9 семейств с целью поиска модуляторов функциональной активности потенциал-зависимых №+ каналов насекомых и млекопитающих. Показано, что яд Непаеш те!!о1ее1 обладает наибольшим ингибирующим действием на каналы млекопитающих, а яд Agelena опеЫаШ высокотоксичен для насекомых.

2. Из яда паука Непаеш те11о(еел получены три полипептида (Нт-1-3), относящиеся к

новым группам блокаторов №+ каналов млекопитающих и насекомых. Эти полипептиды длиной 35-40 остатков содержат по 6 остатков цистеина, образующих 3 внутримолекулярные дисульфидные связи. Согласно полученным данным, Нт-1 и 2 являются поровыми блокаторами, а Нш-3 - ингибитором активации каналов.

3. Из яда паука А$е1епа опеп1аИ$ получены семь полипептидов ([Уй-агатоксины-1 -7),

специфично воздействующих на №+ каналы насекомых. Все они содержат 36-38 остатков, среди которых 8 являются остатками цистеина, образующих 4 внутримолекулярные дисульфидные связи. Уникальность р/8-агатоксинов заключается в их способности к одновременному и потенциал-зависимому действию на процессы активации и инактивации каналов.

4. На основании моделей пространственной организации выделенных полипептидов и

их сравнения с другими известными токсинами сделано предположение о локализации функционально важных аминокислотных остатков. У р/6-агатоксинов и родственных полипептидов выявлены аминокислотные остатки, вероятно отвечающие за проявление эффектов на активацию и инактивацию Ма+ каналов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:

1. В. Billen, A. Vassilevski, A. Nikolsky. J. Tytgat, Е. Grishin. Two novel sodium channel inhibitors from Heriaeus melloteei spider venom differentially interacting with mammalian channel’s isoforms. Toxicon. 2008, (52), 309-317

2. А. Никольский. Б. Биллен, А. Василевский, С. Филькин, Я. Титгат, Е. Гришин. Потенциалзависимые натриевые каналы - мишени действия токсинов из яда паука Heriaeus melloteei. Биологические мембраны. 2009,26(4), 1-9

3. Billen В., Vassilevski A., Nikolsky A.. Debaveye S., Tytgat J., Grishin E. Unique bell-shaped voltage-dependent modulation of Na+ channel gating by novel insect-selective toxins from the spider Agelena orientalis. J. Biol. Chem. 2010,285(24), 18545-18554.

Тезисы докладов:

1. Никольский А.. Василевский А., Гришин E. Новые блокаторы Na+ каналов из яда паука Heriaeus melloteei. Тезисы докладов XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007», секция «Биология», Москва, 11-14 апреля 2007, стр. 33

2. Никольский А.. Василевский А., Гришин Е. Новые блокаторы Na+ каналов из яда паука Heriaeus melloteei. Тезисы докладов и стендовых сообщений XX зимней международной молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» Москва, 11-15 февраля 2008, стр. 73

3. Billen В., Vassilevski A., Nikolsky A.. Tytgat J., Grishin Е. Two novel peptides from Heriaeus melloteei spider venom differentially interacting with sodium channel isoforms. In Abstract book of The European Section Meeting of the International Society on Toxinology. Leuven, Belgium, 7-10 September 2008, p. 36

4. Никольский А.. Биллен Б., Василевский А., Титгат Я., Гришин Е. Полипептидные токсины паука Heriaeus melloteei - новые лиганды Na+ каналов. Сборник тезисов 12-ой международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 10-14 ноября 2008, стр. 97

5. Кузьменков А., Никольский А.. Василевский А. Идентификация и изучение нового блокатора натриевых каналов из яда паука Heriaeus melloteei. XVI Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009», Москва, 13-18 апреля 2009, стр. 52-53

6. Никольский А.. Биллен Б., Василевский А., Гришин Е. Новый токсин из яда паука Heriaeus melloteei, модулирующий процесс активации потенциал-зависимых натриевых каналов.

Тезисы докладов IV Российского симпозиума «Белки и пептиды», Казань, 23-27 июня 2009, стр. 296

7. Кузьменков А., Биллен Б., Никольский А.. Василевский А., Титгат Я., Гришин Е. Новый пептидный блокатор натриевых каналов из яда паука Heriaeus melloteei. Тезисы докладов и стендовых сообщений XXII зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 8-11 февраля 2010, стр. 38

8. Никольский А.. Василевский А., Биллен Б., Титгат Я., Гришин Е. p/5-агатоксины из яда паука Agelena orientalis - уникальные модуляторы потенциал-зависимых натриевых каналов. Тезисы докладов и стендовых сообщений XXII зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 8-11 февраля 2010, стр. 42

9. Никольский А- Биллен Б., Василевский А., Титгат Я., Гришин Е. p/5-агатоксины - новое семейство модуляторов потенциал-зависимых натриевых каналов. Сборник тезисов 14-ой Пущинской международной школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 19-23 апреля 2010, стр. 49

10. Bert Billen, Alexander Vassilevski, Anton Nikolsky. Sarah Debaveye, Eugene Grishin, Jan Tytgat. Spider toxins with a dual function: modulation of both activation and inactivation of insect sodium channels. Abstract book of 10th Meeting of the Pan American Section of the International Society on Toxinology. San Jose, Costa Rica, April 18th-22nd, 2010, p.57

11. A. Nikolsky. B. Billen, A. Vassilevski, J. Tytgat, E. Grishin. p/5-Agatoxins are unique modulators of voltage-gated sodium channels. Abstracts of the 35th FEBS Congress. Gothenburg, Sweden, 26 June-1 July, 2010, p. 292-293

12. A. Nikolsky. B. Billen, A. Vassilevski, S. Debaveye, J. Tytgat and E. Grishin. Bimodal toxins from agelenid spider. Abstract book of The Biochemical Society Annual Symposium “Recent advances in membrane biochemistry”. Robinson College, Cambridge, UK, 5-7 January 2011, p.25

13. Никольский A.C.. Василевский A.A., Гришин E.B. Новые модуляторы натриевых каналов. Тезисы докладов V Российского симпозиума «Белки и пептиды», Петрозаводск, 812 августа 2011, стр. 226.

Заказ № ЗЗ-р/01/2012 Подписано в печать 17.01.2012 Тираж 100 экз. Уел, п.л. 1

ООО “Цифровичок”, тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

61 12-2/269

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА

Никольский Антон Сергеевич

ПОЛИПЕПТИДНЫЕ КОМПОНЕНТЫ ЯДА ПАУКОВ, МОДУЛИРУЮЩИЕ АКТИВНОСТЬ ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИСИМЫХ

НАТРИЕВЫХ КАНАЛОВ

Специальность 02.00.10 - Биоорганическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: доктор химических наук,

профессор, академик РАН Гришин Е.В.

Москва-2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

Список сокращений 4

1. Введение 6

2. Обзор литературы 8

2.1. Структура и функция Ыа+ каналов 8

2.2. Состав яда пауков 17

2.2.1. Низкомолекулярные компоненты 19

2.2.2. Пептидные компоненты 20

2.2.2.1. Линейные пептиды 21

2.2.2.2. Цистеин-содержащие пептиды 22

2.2.3. Белковые компоненты 25

2.3. Фундаментальный и прикладной интерес к ядам пауков 26

2.4. Фармакология потенциал-зависимых Ыа+ каналов 27

2.4.1. Поровые блокаторы 29

2.4.2. Модуляторы 33

2.4.2.1. Модуляторы активации 33

2.4.2.2. Модуляторы инактивации 41

2.4.2.3. Модуляторы смешанного действия 47

2.5. Заключение 50

3. Материалы и методы исследования 51

3.1. Материалы 51

3.2. Разделение яда. Очистка пептидов 54

3.3. Масс-спектрометрия 55

3.4. Восстановление дисульфидных связей и алкилирование тиольных групп 55

3.5. Определение ТУ-концевой аминокислотной

последовательности 56

3.6. Селективный гидролиз полипептидов 56 3.6.1. Расщепление полипептидов бромцианом 5 6

3.6.2. Ферментативный гидролиз полипептидов 57

3.7. Определение концентрации полипептидов

УФ-спектрофотометрия 57

3.8. Анализ инсектицидной активности 57

3.9. Извлечение ооцитов изХепорш \aevis 58

3.10. Экспрессия генов каналов в ооцитах Хепорш \aevis 5 8

3.11. Электрофизиологические исследования 5 9

3.12. Построение модели пространственных структур 60

4. Результаты исследования и обсуждение 61

4.1. Стратегия и выбор объектов исследований 62

4.2. Выделение активных молекул 64

4.3. Установление первичной структуры выделенных веществ 67

4.4. Анализ первичной структуры новых блокаторов

каналов 71

4.5. Механизм действия выделенных токсинов 72

4.6. Поиск структурных детерминант активности

новых полипептидов 79

4.7. Заключение 84

5. Выводы 85

6. Благодарности 86

7. Список литературы 87

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ а.о. - аминокислотный остаток, БСА - бычий сывороточный альбумин, ВП - 4-винилпиридин,

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография, ДДТ - дихлордифенилтрихлорметилметан, ДТТ - 1,4-дитиотреитол, ЛД5о - средняя летальная доза,

МАЛДИ - матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация,

MC - масс-спектрометрия,

ОФ-ВЭЖХ - обращенно-фазовая ВЭЖХ,

ПНС - периферическая нервная система,

ПЧД - потенциал-чувствительный домен,

Трис - тригидроксиметиламинометан,

ТФУ - трифторуксусная кислота,

ТЭА - триэтиамин,

ЦНС - центральная нервная система,

ЦП - цитолитический пептид,

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия,

ЯМР - ядерный магнитный резонанс,

ВТХ - батрахотоксин,

СНСА - а-циано-4-гидроксикоричная кислота, ЕС50 - средняя эффективная концентрация, GTX - граянотоксин,

HEPES - 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота,

ICK - «цистиновый узел» (inhibitor cystine knot),

Na+ каналы - потенциал-зависимые натриевые каналы,

NavAb - бактериальный Na+ канал из Arcobacter butzleri,

NaChBac - семейство бактериальных Na+ каналов,

PDB - база данных пространственных структур белков (Protein Data

Bank),

STX - сакситоксин,

TTX - тетродотоксин,

TTX-R - тетродотоксин-устойчивый,

TTX-S - тетродотоксин-чувствительный,

Uniprot - база данных известных полипептидов.

1. ВВЕДЕНИЕ

Потенциал-зависимые натриевые (№+) каналы - интегральные мембранные белки, селективно проводящие ионы Ыа+ и играющие ключевую роль в процессах генерации и проведения возбуждения в нервных клетках. Появление каналов в ходе эволюции животных тесно связано с

дифференцировкой тканей и обособлением нервной системы. Задействованные в таких важнейших физиологических процессах, как осязание, чувство боли, сокращение мышц, биение сердца и многие другие,

каналы представляют большой интерес для ученых всего мира, и с каждым годом актуальность их изучения только возрастает. Несмотря на усилия многих научных коллективов, пространственная структура и механизм работы каналов недостаточно изучены. Поэтому большой фундаментальный интерес представляет задача выяснить молекулярные аспекты механизма ионной проводимости и пространственную организацию этих белков.

В значительной мере современные исследования в области каналов направлены на получение новых лекарств и пестицидов, селективно взаимодействующих с каналами и модифицирующих их активность. Имея в своем распоряжении подобные молекулы, можно направленно управлять работой каналов или, например, корректировать их функционирование в патологических процессах. Поэтому поиск новых лигандов, специфичных для каналов, является важной задачей современной медицины и

биотехнологии.

каналы являются мишенью для многих компонентов полипептидной природы, выделенных из различных ядовитых животных: анемон, моллюсков, скорпионов, пауков и др. Именно специфичное высокоаффинное взаимодействие с некоторыми лигандами позволило идентифицировать, очистить и охарактеризовать эти мембранные белки.

С точки зрения источника новых модуляторов ионных каналов природные яды представляют наибольший интерес, поскольку являются

своеобразными комбинаторными библиотеками биологически активных соединений, отобранных в ходе эволюции. Особое место среди природных ядов занимает яд пауков (в среднем, в яде паука содержится от нескольких десятков до нескольких сотен компонентов), а наиболее интересными оказываются полипептидные компоненты яда, так как они характеризуются высокой специфичностью действия. Благодаря своим свойствам эти соединения получили широкое распространение как инструменты для биохимических исследований. Использование новых лигандов поможет установить точный молекулярный механизм функционирования таких сложных мембранных структур, как Ыа+ каналы, а также пролить свет на их фармакологические характеристики и пространственную организацию. Новые инструменты могут быть полезны в фундаментальных исследованиях молекулярных механизмов нейросигнализации, а так же найдут практическое применение в медицине для терапии заболеваний, связанных с дисфункцией

каналов, и в биотехнологии как безопасные биоинсектициды.

Цель и задачи работы

Цель данной работы - поиск и идентификация новых полипептидных веществ из яда пауков, модулирующих активность Ыа+ каналов. В соответствии с целью были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Провести тестирование коллекции ядов пауков в отношении каналов.

2. Выделить и установить первичную структуру активных полипептидов.

3. Изучить механизм действия выделенных компонентов.

4. Осуществить поиск структурных детерминант активности новых соединений.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Структура и функция каналов

Потенциал-зависимые натриевые (№+) каналы - интегральные мембранные белки, селективно проводящие ионы и играющие ключевую роль в процессах генерации и проведения возбуждения в нервных клетках [1, 2]. Как правило, наибольшее количество этих мембранных транспортных систем локализовано в аксонах, перехватах Ранвье, пре- и постсинаптических мембранах нервных и мышечных клеток. каналы состоят из нескольких субъединиц, количество которых у разных животных и у разных изоформ каналов одного животного может варьировать. а-Субъединица (-260 кДа), является основным функциональным компонентом канала (рис. 1). Она содержит все необходимые функциональные элементы канала: участки связывания для различных лигандов, сенсор мембранного потенциала и селективный фильтр. (З-Субъединицы (-30 кДа) являются дополнительными, и, по-видимому, выполняют модулирующую функцию, более тонко настраивая работу канала [3]. Экспрессия только а-субъединицы достаточна для нормального функционирования канала, однако для правильного созревания и сортинга а-субъединицы требуется экспрессия одной или более дополнительных 0-субъединиц [4]. У млекопитающих найдено четыре 0-субъединицы ((31-04), а у насекомых лишь одна, т.н. йрЕ-субъединица. В клетке четыре |3-субъединицы ассоциируются с а-субъединицей; (32 или 04 ковалентной или нековалентной связью связывается с 01 или 03, соответственно. Изучение структурной организации 0-субъединицы показало, что она состоит из одного трансмембранного сегмента с небольшим внутриклеточным и достаточно протяженным гликозилированным внеклеточным доменом, который, как предполагается, действует наподобие молекулы клеточной адгезии, обеспечивая связывание с матриксными белками [5-7]. Возможна также роль дополнительных субъедениц в межклеточных взаимодействиях и направленной локализации и кластеризации каналов в цитоплазматической мембране. Все четыре 08

субъединицы экспрессируются в различных количествах в электровозбудимых тканях. Фармакология этих молекул изучена довольно плохо, поскольку большинство известных лигандов, взаимодействующих с Na+ каналами, связывается с а-субъединицей. Na+ каналы, как правило, имеют сайты гликозилирования [8-10].

а-Субъединица канала состоит из четырех гомологичных повторов-псевдо-субъединиц (обозначаются римскими цифрами I—IV) соединенных цитоплазматическими линкерами [1, 3]. Каждая псевдо-субъединица в свою очередь состоит из шести трансмембранных сегментов (обозначаются S1-S6). Поровый домен канала образуется сегментами S5 и S6 от каждой псевдо-субъединицы, между которыми формируется особая структура т.н. Р-петли, и также расположен селективный фильтр. Главная функция порового домена состоит в том, чтобы селективно пропускать через мембрану ионы Na . Так, проводимость одиночных Na+ каналов в разных мембранах составляет 4-24 пСм. Через канал проходят и другие одновалентные катионы, чья проникающая способность зависит от радиуса и убывает в ряду: Na -Li >К >Rb >Cs . Известно также, что Na каналы проницаемы для протонов и некоторых органических катионов, таких как гидразин. Селективный фильтр потенциал-зависимых Na+ каналов представляет собой область, образованную определенными остатками Р-петли (т.н. DEKA мотив). Такими остатками в канале, характерном для скелетной мускулатуры крысы, являются Asp-400, Glu-755, Lys-1237, Ala-1539 в псевдо-субъединицах I, II, III и IV, соответственно. Предполагается наличие электростатического взаимодействия между положительно заряженным Lys-1237 и отрицательно заряженными Asp-400 и Glu-755, которое, по-видимому, является ключевым для определения селективной проводимости канала. Проходя через селективный фильтр, ионы Na+ теряют гидратную оболочку, связываясь с атомами кислорода боковых цепей остатков, образующих фильтр. Освобожденный от гидратной оболочки Na+ свободно проникает через канал [11, 12].

Другая функция, а точнее функциональная особенность каналов, состоит в том, чтобы реагировать на изменение потенциала на мембране клетки. За это отвечает потенциал-чувствительный домен (ПЧД) Ыа' канала. Он формируется из 81-54 сегментов в каждой псевдо-субъединице.

I П III IV

^N-конец Скопец

Рисунок 1. Диаграмма организации а-субъединицы потенциал-зависимого Na" канала. Отмечено положение N- и С-концевых остатков, сайтов гликозилирования (vy), гомологичных повторов (I-IV), трансмембранных сегментов (1-6), каждый четвертый из которых несет положительно заряженные остатки (выделены красным), а между каждыми пятым и шестым (выделены зеленым) формируется структура Р-петли. Р-сайт фосфорилирования протеинкиназами А (кружочки) и С (ромбики). IFM - инактивационная петля. Синие кружочки - области, вовлеченные в образование инактивационных ворот.

Было установлено, что сегменты S4 являются консервативными и играют роль сенсора мембранного потенциала благодаря тому, что каждый третий аминокислотный остаток (а.о.) в их составе несет положительный заряд [13]. Функционирование Na' каналов характеризуется последовательностью четырех основных процессов: активацией при деполяризации мембраны; деактивацией при реполяризации мембраны; инактивацией после длительной деполяризации; регенерацией - выходом из и н активирован но го состояния (рис. 2). Процессы активации и деактивации осуществляются с помощью ПЧД. Что же касается процессов инактивации и регенерации, они являются результатом работы т.н. инактивационных ворот, которые блокируют прохождение ионов через канал, Инактивационные ворота образуются петлей между псевдо-субъединицами 111 и IV (т.н.

инактивационная петля) и некоторыми другими участками цитоплазматических петель (рис. 1) [14-16]. Канал находится в инактивированном состоянии, пока мембрана не реполяризуется обратно до исходного состояния покоя и канал медленно не регенерирует. Инактивация 1Ча~ каналов во время потенциала действия приводит к тому, что клетка в этот период не может быть повторно возбуждена, даже если есть внешний возбуждающий стимул. Также в процессе инактивации и регенерации, по-видимому, участвуют р-субъединицы канала [4].

ЗАКРЫТ состояние покоя

ОТКРЫТ активирован

акткация > быстро 1™

? дёакшвация

ЗАКРЫТ инакгавирован

* <4 Ма*

Рисунок 2. Цикл работы потенциал-зависимого канала.

Анализ происхождения каналов крайне затруднен из-за недостатка биофизических данных об этих системах у низших организмов. По всей видимости, Ка '-зависимые потенциалы действия в привычном понимании характерны для всех животных с организованной нервной системой, начиная с плоских червей, однако и в этом случае нет четких прямых электрофизиологических и фармакологических доказательств. Известно,

однако, одно исключение: представитель саркодовых АсНпосогупе соп^аМаШ реагирует на краткие и внезапные механические раздражения (50 мс), прячась при этом в свою раковину, при этом №+-зависимый потенциал действия распространяется по клетке менее чем за 2 мс [17].

В настоящее время известно 9 различных генов, кодирующих каналы у человека (8С№А-8С№А и БСША-ЗСШ1А) [18] и только один ген у насекомых (например, у плодовой мушки Drosoph.Ua melanogaster) [19]. Предполагается, что разнообразие каналов у насекомых достигается благодаря альтернативному сплайсингу и редактированию РНК [20, 21]. Разнообразие изоформ потенциал-зависимых Ыа+ каналов было раскрыто благодаря электрофизиологическим, биохимическим и молекулярно-биологическим методам. Оно определяется различиями в последовательностях а- и р-субъединиц, а также многообразием их комбинаций. Гены каналов экспрессируются в тех или иных клетках на различном уровне и в различных комбинациях субъединиц. Обнаруженные у человека 9 типов (изоформ) а-субъединицы каналов (№у1.1-1Чау1.9) были классифицированы на основании различий их аминокислотных последовательностей [22]. Экспрессия различных изоформ каналов регулируется в процессе онтогенеза и является клеточно- и тканеспецифичной [1, 23].

Большинство потенциал-зависимых каналов в разной степени

селективно и обратимо блокируются тетродотоксином (ТТХ). Часть изоформ блокируются наномолярными концентрациями ТТХ, другие же -микромолярными и даже миллимолярными, т.е. наблюдается 1000-кратное падение чувствительности к ТТХ [24]. Это фармакологическое различие лежит в основе классификации каналов на т.н. тетродотоксин-

чувствительные (ТТХ-8) и тетродотоксин-устойчивые (ТТХ-Я) (табл. 1).

Изоформа Ген Локализация Чувствительность к ТТХ Вызываемые дисфункции

Navl.l SCN1A ЦНС, ганглии корешков спинного мозга + Эпилепсия, мигрень

Nav1.2 SCN2A2 ЦНС + Эпилепсия

Nav1.3 SCN3A Эмбриональная ЦНС + Боль

Nav1.4 SCN4A Скелетная мускулатура + Проблемы с сокращением мускулатуры

Nav1.5 SCN5A Сердечная мускулатура — Сердечная аритмия, висцеральная боль

Nav1.6 SCN8A ЦНС, ПНС, нейроглия + Нейрологические дисфункции

Nav1.7 SCN9A ГНС, нейроглия + Нарушения передачи сигнала в ПНС

Nav1.8 SCN10A ПНС — Гиперчувствительность, висцеральная боль

Nav1.9 SCN11A ПНС — Гиперчувствительность, повышенный болевой порог, висцеральная боль

Таблица 1. Гены, локализация, чувствительность к тетродотоксину и дисфункции различных изоформ потенциал-зависимых Ыа+ каналов человека. ЦНС- центральная нервная система, ПНС- периферическая нервная система.

К настоящему времени описано несколько сотен мутаций генов Ка+каналов. Нарушения таких генов приводят к различным неврологическим и психическим заболеваниям, а также к патологиям скелетной и сердечной мускулатуры [25-27]. Показано, что гены 8США, БСША и 8С№А, кодирующие изформы каналов, экспрессирующихся в ЦНС, принимают участие в развитии некоторых форм эпилепсии [28]. Так, например, мутации в гене БСША (выявлено порядка 700 мутаций в этом гене) являются наиболее общим и частым случаем возникновения наследственной или спорадической формы эпилепсии [28]. Нарушения в гене БСК5А (кодирует сердечную изоформу №у1.5) являются причиной синдрома Бургада -врожденной болезни сердца, связанной с дисфункцией нормального электрического цикла [29]. Мутации гена Б �