Узнавание 5альфа-андрост-16-ен-3-она и его моноциклических аналогов обонятельной системой тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУЛОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ТОНКОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ ИМ. М.В.ЛОМОНОСОВА

Специализированный совет Д 063.41.01

На правах рукописи

КРАЕВСКАЯ МАРИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

УДК 511.63 : 577.25 : 612.66

УЗНАВАНИЕ Ба-АНДРОСТ-16-ЕН-З-ОНА И ЕГО МОНОЦИКЛИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ ОБОНЯТЕЛЬНОЙ СИСТЕМОЙ

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ •

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1990

Работа выполнена в Институте эволюционной морфологии и экологии животных ии. А.Н. Северцова АН СССР г. Москва

Научный руководитель: ведущий научный сотрудник

кандидат химических наук Э.П. Зинкевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор Г.А. Серебренникова

доктор химических наук Ю.С. Циэин

Ведущая организация: Всесоюзный научно-исследовательский

институт химических средств зашиты растений

Зашита диссертации состоится ОСЛЫЛ^Ъ^-- ¡ддр р,

в на заседании Специализированного совета

Д 063.41.01 при Московском институте тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова ( 117571, г. Москва, пр. Вернадского, д.86).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ иц. М.В.Ломоносова (119831, г.Москва, ул. М. Пироговская, д. )1 Автореферат разослан " . 1990 г.

Ученый секретарь Специализированного совета Кандидат химических наук

л А.И. Лютик

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В рамках исследования по химической коммуникации животных особыл интерес представляет изучение узнавания пахучих веществ обонятельной системой. Обонятельная система позволяет обнаруживать в воздухе пары индивидуальных веществ и

-15

их смесей в чрезвычайно низких концентрациях (до 10 М), воспринимать смесь как единое целое и в то же время вычленять в ней определенные компоненты, отличать смеси одних и тех хе веществ с различными соотношениями. Молекулярные механизмы обоняния, в том числе, механизмы узнавания пахучих вешеств, до настоящего времени не выяснены. '

Исследование механизмов узнавания пахучих веществ обонятель-ноя системой целесобразно направить как на поиск и выделеление молекулярного обонятельного рецептора и изучение характеристик связывания с ним пахучих веществ, так и на изучение строения узнавшего центра рецептора с помощью корреляций структура вещества - обонятельные свойства.

Обонятельное действие пахучих веществ на животнь'ч может проявляется в виде их характерного поведения. До.-настоящего времени нет общепринятых строгих объективных критериев определения обонятельных свойств пахучих веществ для людей и литературные данные часто несопоставимы.

В исследованиях по химической коммуникации особенно важны работы по механизмам узнавания феромонов, и в частности, 5а-анд-рост-16-ен-З-она (1), являвшегося половым феромоном хряка. Самки свиньи высокочувствительны к нему, легко его узнают, показывая характерную поведенческую реакцию. Известно действие (1 ) на фи-

экологические состояния свиньи (синхронизация прихода в охоту, родов и др.), имеющее обонятельную природу.

Для людей (1I имеет характерный запах с низким обонятельным порогом 110~10М>, легко узнается в индивидуальном виде и в сложных смесях, для него характерна специфическая аносыия. Появились данные о действии (1) на физиологию женшли.

Бее это позволяет предположить существование специфических обонятельных рецепторов к (1) у человека и у свиньи, исследование механизмов узнавания которыми феромона и его- аналогов позволит выявить пути целенаправленного создания активных аналогов (1), но более доступных для производства.

Работа выполнена в рамках темы: "Разработка новых направлений исследования генетического аппарата, основных биополимеров и структур клетки и внедрение достижений физико-химической биологии в народное хозяйство" Н'ГП 0.74.05 ("Физико-химическая биология"), РАН N 10103-967 от 19.06.87.

Цель и задачи работы. Цель работы заключается в изучении молекулярного узнавания веществ с запахом 5а-андрост-16-ев-З-оиа (11 обонятельными системами человека и свиньи. Б связи с этим били поставлены следующие задачи: 1) в соответствии с нашей гипотезой о механизме узнавания (1 ) синтезировать ряд его моноциклических аналогов, определить их обонятельные свойства и выявить корреляции между пространственным строением и обонятельными свойствами; 2) обнаружить обонятельные рецепторы 5а-андрост-16-ен-З-она

в обонятельной ткани свиньи и исследовать узнавание рецептором 5а-андрост-16-ен-3-она и его аналогов методом связывания радиолнганда".

ЕауДЫМ ШШШ.4 Разработан методический подход к определению обонятельных свойств пахучих веиеств. Синтезирован ряд моноциклических аналогов 5а-андрост~16-ен-3-она; изучены их обонятельные свойства; выявлены корреляций между пространственным строением и обонятельными свойствами. Получены доказазательства, что вевества, имеюшме запах 5а-андрост-16-ен-3--она, взаимодействуют с одним типом обонятельных рецепторов. В обонятельной ткани свиньи выявлены компоненты, которые могут являться обонятельными рецепторами 5а-андрост-16-ен-3-она. Показана их мембранная локализация и возможность частичного перехода в водорастворимую Фракцию.

Практическая ценность. Полученные результаты могут быть использованы для определения обонятельных свояств веиеств при изучении механизмов обоняния, для целенаправленного синтеза и предварительной оценки активности новых синтетических аналогов феромона свиньи, а также для исследований в области химии душистых веществ.

В диссертации выносятся на защиту следтпие положения: методический подход к оценке обонятельных свойств пахучих веществ; синтез и доказательство строения моноциклических аналогов 5а-анДрост-16~ен-3-она: цис- и транс-изомеров 4-(4-ирет-бутмл-циклогексил)-4-метил~пентан-2~она, 4-14-йрет-бутилциклогекс~3-енйл )-4~метилпентан-2-она, стереоизомеров 4-(4-трет-бутипцикло-гексил)-пент-3-ен-2-она, частичный конформационний анализ полу-

ученных соединений, результаты изучения их обонятельных свойств и их корреляция с пространственным строением; качественная модель узнающего центра обонятельного рецептора андростеноиа; экспериментальные доказательства существования специфических обонятельных рецепторов к андростенону в обонятельной ткани свиньи.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на II w III Всесоюзных совещаниях по химической коммуникации животных (Москва, 1983; 19881, на IX Совещании по эволюционной физиологии (Ленинград, 1986 1, на 8 Международном конгрессе Европейской Организации по Хеморецепции, I 8 th International Congress ECHO, Warwick, 198SI.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликованы 4 статьи и тезисы 3 докладов.

Объем работы. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, состоит из введения,3 глав, заключения и выводов. Материал иллюстрирован таблицами, рисунками и схемами. Список литературы включает/S1^ названий.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1, Синтез моноциклических аналогов 5а-андрост-16-ен-З-она.

Из литературы известно (Thelmer et.al., 1977 1, что 4-( 4-шрел1-бутилциклогексил )-4-метилпентан-2-он имеет такой же запах, что и (1), Авторы отмечали наличие запаха (1) только у цис-изоыера (2), не объясняя этого факта, не приводили никаких данных, подтверждающих структуру этих соединэний и методов определения обонятельных свойств.

Нами получена смесь изомеров (2) и (3) (схема 1) алкилиро-ваниеы 4-иетил-4-фенилпентан-2-она (9) mpem-бутанолом, восстанор-

лением бензольного ядра и окислением полученной смеси спиртов (й) хлорхроматом пиридина. При каталитическом гидрировании подородои в итоге получена смесь изомеров (2! и (31 в соотношении 85:15. Индивидуальны« изомер» (2 1 и (3) выделены с помощью препаративной обращоннофазовоп ВЭЖХ (колонка ЫсМгобогЬ 10 [?Ра, сола-ацетонит-рил 1:3). Полученное соединения гомогенны при аналитической ВЭЖХ, капиллярной ГЖХ. Оба соединения имепт в масс-спектре мол»кулярнмя

а I t-PuOH, H2S04; Ы 1Ц/111; с) HCl' Ру' CrO,: - ti) Li/HH^:

e) ll?lEtj, CF3C0011 ион 232, характер распада одинаковый, ИМР-слектры практически одинаковы; имеющиеся небольшие различия ИК-епсктроп в области "отпечатков пальпев" не позволили опеделить цис- или транс-конфи-рацию. Наблюдаемая аналогия с каталитическим гидрированием

СХЕМА 1

л

П

ОН

1 ,Ч-ди-трет-СутилЗспзола позволила предварительно соотнести изо-

¡3

мерк. Данные С-ЯМР-спектросг.опии подтвердили соотнесение:

сигналы от Сг и ¡»томов углерода ннс-(?. > находились в более

1 "5

Таблица 1. Данные С-ЯМР -спектров цис- и транс- изомеров 4-14-трет-бутилииклогексил)-4-иетнлпентан-2-она-12 и 3 ).

цис-изомер (2 1 транс -изомер (3 1

®ть/о Но 6 тыс Мо

(м.д. 1 С-атомов (м.д.) С-атомов

52 ,59 т 3 52,61 т 3

42,07 д 5, 8 48,24 д 5,8

41 ,31 д 46,67 д

36 ,41 с 4, 13 35 ,87 с 4,13

33 ,00 с 32 ,70 к 1

32 ,75 к 1 32 ,37 с 4,13

27,66 м И ,12 27,58 ц 11,12,14-16

24,76 ы 14-16 24,94 1! 6,7,9,10

24,44 т 6,7,9,10 209 .50 с 2

23,00 т

218,46 с 2

сильном поле по сравнению с аналогичными сигналами транс-(З),

1 з

что согласуется с литературными данными по С-ЯМР для 1,4-ди-

юреа-бутиликклогексанов /Looes, Robinson, 1977/. При восстановлении (7) по методу Берча получен 4~(4-трот-бутилциклогекс-З-енил)-4~метилпентаи-2-ол 14), последующим восстаиовдением которого методой ионного гидрирования получена смесь изомеров (2) и 131 в соогяо&ешю 3:1 (при 30°С) и 2:1 (при 5-10°С).

-1-йре«-бутилциклогекс-3-еяил )-4-метилпентан~2-он (5 ), полученный окислением (4), был очищен ВЗЖХ. Вещество гомогенно при ЕЭлХ на полярной и обращенной фазах. Вывод о положении двойной связи у С3,-углеродного атома сделан на основе IUIP-спектров по аналогии с п-ди-трет~бутилииклогекс-1-еном /Stolow et.al.,

1966/, у которого улш. сдвиг трет-Сутилъной группы, распг>яожеи-ной рядом с двойной связью, 8 1,00 м.д., а удаленной от мое -О,Р0 м.д. В соединении !5) 3 1.00 м.Д.(с,9Н), д 0,80 м.д. (с, 6111 соответствует отмеченному положении двойной связи.

Смесь цис- и транс-изомеров (13,14 I получена конденсацией Дарзана 4-трея1-бутилциклогексанона с этиловым эфиром хлорпропио-новой кислоты (схема 2) с последующим гидролизом полученного эпоксида и содержала (13) и (14) в соотношении 69:31. Индивидуальные компоненты смеси выделены препаративной ВЭЖХ (ИсЬгобогЬ 3160, гексан-этилаиетат 95:5). Оба кетона в этаноль-ном растворе КОН легко изомеризовались с образованием равновесной смеси одинакового состава, содержащей оба компонента в соотношении 98:2, что позволило идентифицировать более термодинами-

СХЕМА 2

40

0

а

0 Х00Е1

¿IV

+СК

+ОЧ

сн.

а) СН3СНС1С00Е1, Е«Ша; Ы Н^, Н20, А; с) С^И-СдНц Ги

й) (СООН)2, Д

чески стабильный кетон (14), как транс-изомер.

Смесь а,р-ненасышенных кетонов (11,12) (Схема'2) получена нуклеофильным присоединением ииклогексилизопропиламида лития к транс-кетону (14) с последующим разложением основания Шиффа щавелевой кислотой в условиях перегонки с водяным паром и содержала (11) и (12) в соотношении 4:1. Индивидуальные компоненты смеси выделяли препаративно с помощью БЭЖХ (Lichrosorb SI60, гексан-этилацетат 98:2) с последующей рехроматографией (Zorbax 0D5, аце-тонитрил-вода 9:11. а./з-Ненасыщенныя кетон (10) был получен аналогично из (13), причем второй возможный изомер был обнаружен в следовых количествах. Структуры соединений (10-12) подтверждены ИК-, масс- и ПМР-спектрами. Изомерию по двойной связи определяли с помощью ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО). Облучение олефино-вого протона 3-Н в соединении (10) (3 6,22 м.д.) приводило к отклику протонов метильнои группы С1 и l'-Н, что указывало на пространственную сближенность этих протонов. При этом отсутствие отклика протона при С5 однозначно указывало на транс-структуру. Структуры соединений (11) и (12) были определены аналогично.

Таблица 2. Химические сдвиги протонов в ПМР-спектрах (8 м.д.) и регистрация ЯЭО («) при облучении олефинового протона 3-Н.

110) 2,23" 2,12 6,22 2,35* 0,83

(11) 2,14* 1,78* 5,59 3,46 0,82

(12 ]_ 2,19* 2,11 6.0J 1,9* 0,87

2. Оценка обонятельных свойств полученных веществ.

Определение обонятельных свойств проводилось постоянной группой (8 человек) высокочувствительных испытуемых. В отличие от ранних исследований, испытуемым предлагалось характеризовать качество запаха относительно эталона -5а-андрост-16-ен-З-она, а не описывать ассоциации, вызываемые запахом. За количественный критерий мы принимали обонятельный порог - минимальное количество

2

вещества, нанесенное на 1 см фильтовальнойбумаги, которое при пронюхивании вызывает у испытуемого запах андростенона. Запах андростенона приписывался соединению в том случае, если высоко-

о^МЛ И-а)

оД-К>Ь <3)

о^-Н > (6) о ®

/0+- № оК>Н №

Рис.1 Синтезированные моноциклическиа аналоги андростенона. чувствительные испытуемые не могли отличить его от андростенона при концентрациях, близких к пороговым. При более высоких концентрациях возможно неспецифическое возбуждение других обонятельных рецепторов и появление других нот в запахе. В каждом опыте

проверяли чувствительность испытуемых к (II, т.к. чувствительность людей колеблется в зависимости от погодных условий, самочувствия, циклики и др.

Таблица 3. Обонятельные свойства соединений (1-14): качество запаха (наличие/отсутствие запаха андростенона 1+/-1), обонятельные пороги (г); наличие/отсутствие специфической аносмии (+/-1.

Вещество запах порог аносмия Вещество запах порог аносмия

1 + ¡0'9 + 8 - -

2 10-° - 10 + Ю-5 +

3 + ю"6 + 11 - -

4 - - - 'l 2 + 10"7 ♦

5 + ю"7 + 13 - -

6 - - - И - -

7 - - -

Специфическую аносиию I полная нечувствительность некоторых людей к запаху андростенона при сохранении нормальной чувстви-

тельности к другим близким типам запаха - санталовому, мускусному и др.) оценивали, предъявляя аносмичным особям (6 человек) насыщенные пары веществ. Мы показали, что соединения (2,5,10,12), а такко транс-изомер (3 1, очищенный с помощью ВЭЖХ до постоянного значения обонятельного порога, обладают запахом андростенона. Явление специфической аносмии было одинаково для андростенона и этих, соединений.

Кросс-адаптация. Явление кросс-адаптации заключается в том, что на фоне полной адаптапции к одному веществу (предполагается полное насыщение обонятельных рецепторов ) падает чувствительность

к другому. Отсутствие кросе-алаптаиии для какой либо пар» веиоств доказывает, что эти соединения воспринимаются разними типами обонятельных рецепторов. Предварительно определяли качество запаха и обонятельные пороги изучаемых веществ. Затем испытуемые дышали воздухом, содержащим насыщенные пары вещества, адаптацию к которому изучали до того момента, когда ощущение запаха исчезало (2-4 минуты); сразу после этого проводили определение обонятельных порогов исследуемых веществ.

Показано, что после адаптации к запаху вещества (1) обонятельный порог (2), имеющего запах андростенона, повышается на несколько порядков, тогда как порог камфоры не изменяется. При адаптации к камфоре, элесанту и (6) (другое качество запаха) пороги (1) и (2) менялись незначительно.

Таким образом, вещества, имепшле запах андростенона, конкурируют друг с другом при кросс- адаптации и не являются конкурентами к веществам с другим типом запаха. На взаимодействие соединений (1,2,3,5,10,12) с одним типом обонятельных рецепторов указывает такте одинаковый характер специфической аносмии, которая, как предполагают, связана с отсутствием рецепторов андростенона.

3. Поиск обонятельных рецепторов к 5а-андрост-1б-ен-3-ону.

В качестве обонятельного стимула использовали структурный и функциональный аналог (1)- [16,17- Н )-5а-андростан—3-он ( Н-15). Получение препаратов тканей. Образцы тканей для каждой серии опытов брали от 3-4 самок свиньи крупной белой породы на мясокомбинате через 30-40 минут после забой. Обонятельную ткань брали с обонятельных раковин и перегородки, идентифицируя по темно-желтоватой окраске. Респираторную ткань брали с перегородки й средней

И

части носового прохода на расстоянии 3-10 см от входа в носовую полость. Обонятельную ткань серой крысы брали от 5 самок линии Вистар. В качестве контрольных тканей брали мышечную ткань и почки. Ткани хранили до опыта не более 2-2,5 часа при 0°С. Цитозольную Фракцию получали ультраиентрифугированием гомогената обонятельной ткани в буфере (100 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 1 мМ р-мер-каптоэтанол, 1 мМ ЭДТА, 10 I глицерина) 1 час при 100 000g. Количество белка определяли по методу Брэдфорда (Bradford ,19761.

а

Несвязанный (Н-15) после инкубации удаляли методом сорбции активированным углем Норит А ( 4% суспензия угля 0,4% декстрана Т70), с последующим центрифугированием.

Фракцию плазматических мембран получали центрифугированием

гомогената обонятельной ткани после стандартной обработки в

буфере (7 мМ Трис-HCl, рН 7,4) 1 час при 100 OOOg. Разделение

3

свободного и связанного Н-15 проводили фильтрацией инкубационной смеси через фильтры GF/C (Whatman).

з

Концентрационная зависимость связывания Н-15 цитозольной Фракцией обонятельной ткани свиньи. В цитоэольно" фракции обонятельной ткани свиньи установлено наличие специфического, насышае-

з

мого связывания (Н-15) I рис.2), которое характеризуется высоким

з

сродством к лиганду. Изучение кинетики связывания (Н-15) показало, что равновесие достигается к 1часу инкубации. Константа дис-

-9

социации, определенная по методу Скэтчарда, Кд=1.3х10 М, количество связывающих участков, Bms= 0,38 п«юль/ыг белка. Специфическое связывание практически исчезало при хранении цитозоля (-70°С) уже через двое суток, что говорит о низкой устойчивости рецепторных структур.

о /

□

свободный (* Н-15 ), F, нМ Рис. 2. I: Связывание I 11-15) с цитозольной фракцией обоня-тельой ткани свиньи: о- общее, п- неспецифическое (250-кратный избыток немеченного 115)), s- специфическое I разность общего и неспецифического связывания). II: s - в координатах Скэтчарда. (Условия инкубации: 0°С, 1 час, 0,2 мг белка в 0,5 мл.)

Тканеспецифичность. Изучение тканеспецифичности показало,

что мышцы свиньи не обладали способностью специфически связывать

(3Н-10) (рис. 3,ml. Почки свиньи связывали (3!-f-15) значительно

3

хуже, чем обонятельная ткань, причем характер вытеснения ( Н-15) немеченным (15) в этих двух случаях отличался. Это означает, что обонятельный андростеноновнй рецептор н рецепторы андрогенов, в значительных количествах присутствующие в почках, имеют, скорее всего, разную природу..Однако, оказалось, что как общее, так и специфическое связывание (3H-i51 питозольной фракций респиратор-

ной ткани (рис 3, г! свиньи значительно выше, чем в обонятельной.

1 3

Связывание имеет насыщаемый характер к характеризуется высоким сродством: К„ 2,0x10 М, 4,8 пмолъ/ мг белка.

Д ШаХ

свободный (3Н-15), Г, нМ В/Р

Рис.3. I: Специфическое связывание (Н-15) цитозольной фракцией в- обонятельной , г- респираторной и ш- кишечной тканями свиньи. II: г— в координатах Скэтчарда [условия инкубации те же).

Компоненты респираторной ткани, связывающие (Н-15), отличались большей устойчивостью, чем в случае обонятельной ткани.

Изучение узнавания веществ с_ запахом ЦП обонятельной тканьп свиньи . Способность обнаруженных компонент обонятельной ткани свиньи узнавать вещества с запахом андростенона оценивалось по их

3

способности конкурировать с (Н-15) при связывании. Обнаружено, что в цитозольной фракции обонятельной ткани свиньи лучше всего

3

вытесняют ( Н-15) вещества с запахом андростенона: сам (1) [обонятельный порог 1(Г9г], (15) ПО"8] и (16) ПСГ10), цис- и транс-изомеры 12)110 81 и (3) [10 (отмечается некоторая корре-

(1) «5)

3Н

№ СН-15)

(г) " (з)

Ц7) н0 (-13)

(21)

НО-4^^^ _

"(22)

мо-чсз

Г23)

Рис. 4. Структуры соединении, для которых изучалась конкурентная способность линия степени вытеснения и величины обонятельных порогов!, а также близкий структурный аналог ¡17), вообще не имеющий запаха (рис 4 и 5). Слабыми конкурентами оказались вещества, имеющие другой тип запаха и значительные структурные отличия от (1): анд-

0

ростерон (19) и мускон (21). Хорошо вытесняли (3Н-15) половые стероидные гормоны: 5а-дигидротестостерон (18) и 17р-эстрадиол 120), не имевшие запаха. Б респираторном эпителии наблюдались некоторые отличия. Не обнаружено вытеснения (''H15I аналогами (1,15-17, 2, 20) в цитозоле мышцы свиньи.

3 о

к 1 II 1« 1 1 11 11 1* 18 20 XI 14 X* 1 И 1» 1 3 17 21 1» 18 10 11 14 1*

X

.«¡> соединения соединения з Рис. 5. Влияние аналогов 5а-андрост-16-ен-3-она и некоторых

СО о

стероидных соединений на связывание (Н-15) с цитозолыюй фракцией обонятельной (I) и респираторной (II) тканей свиньи. <0°С,

з

12 час, концентрация ( Н-15) - 10 нМ, конкурентов - 2,5 мкМ). Видоспециаичность■ При исследовании других видов животных

з

обнаружено наличие специфического связывания I Н-15) цитозолем обонятельной ткани теленка, причем как общее, так и специфическое связывание (Н-15) у теленка несколько ниже, чем у свиньи. Поведенческой реакции на (1) у коров не обнаружено, однако воэможло ожидать, что (1) воздействует на физиологи» коров также, как у

3

свиней. Обнаружено специфическое связывание ( Н-15) цитозолем обонятельной ткани серой крысы (феромонной активности (1) для крысы не обнаружено,) однако оно значительно ниже, чем у свиньи. Таким образом, в обонятельной ткани свиньи выявлены компонен

ты, которые по способности к специфическому высокоаффинному насыщаемому связыванию, определеннойткане- и видоспецифичности, конкурентному вытеснению феромона различными структурными аналогами известной обонятельной и физиологической активности могут претендовать на роль обонятельных рецепторов андростенона. Для доказательства их рецепторнои функции необходимы данные их участия в передаче обонятельного сигнала. Недавно были получены данные о сопряжении этих I^Н-15 )-свяэывающих компонентов цито-зольнои фракции обонятельной ткани свиньи с С-белками (Парфенова, Эгингоф, 1988), что доказывает их рецепторную функцию. Отсутствие сопряжения с в-белками у аналогичных компонентов респираторной ткани подтверждает их нерецепторную природу.

свободный ( Н-15), Р, нМ Рис. 6. I: Специфическое связывание (0Н-15) грубой фракцией мембран - т и цитозолем - с обонятельной ткани свиньи. II: т - в

координатах Скэтчарда. (0°С, 1час, 0,2 мг белка в 0,5 мл).

з

Связывание £ Щ.5! мембранной фракцией обонятельной ткани.

свиньи^ Показано наличие специфического высокоаффиного насышаемо-

з

го связывания ( Н-15) грубой фракцией плазматических мембран обо-

-О

нятельноя ткани свиньи (К„ 3,1 х 10 М, B„,v 6,0 пмоль/мг белка)

д шо. x

!рис.6). Значительно более высокое содержание связывающих участков указывает на мембранную локализацию обонятельных рецепторов, однако, возможна их частичная солюбилизация в результате действия ЭДТА.

4■ Анализ пространственной структуры и поиск корреляции: структура - обонятельные свойства в ряду 1 ,4-дизамещенных циклогексанов■ Соединения с запахом андростенона (1,2,3,5,10,12) имеют общие структурные фрагменты: карбонильную группу (А) и гидрофобный участок (Е), представленный четвертичным атомом углерода, связанным с метальной группой: . . ^.СНъ

Фрагменты (А) и (В) разделены семью связями С-С. Замена карбонильной группы на гидроксильную (4, 8), изменение количества связей С-С между участками (А) и (В) (13, 14), замена участка (В) водородом (6) приводит к Исчезновению запаха андростенона.

Мы провели частичный конформационньш анализ исследуемых соединений и построили модели молекул с помощью компьютерной программы "Desktop Molecular Modeling"(Oxford Electronic Publishing), которая позволяет с хорошей точностью рассчитывать расстояния и углы в молекулах, но сильно занижает разницу в энергиях между конформерами. Из-за относительно низких барьеров вращения и большого количества воэможшх конформация в алифатической цепи исследуемых молекул мы ограничились рассмотрением конформаций циклогексанового кольца и его ближайшего окружения. У цис-Ч ,4-ди-шрет-бутилциклогексана существует равновесие двух

форм: кресла с акснально-зкваторцалыю расположенными -заместителями и твист - с диэкваториальными заместителями, с преобладанием последнего (энергии конформаций 5,6 ккал/моль, и 5,3 ккал/моль - соответственно! /Иллиея, 1965/. Такое же соотношение энергий, а следовательно и соотношение конформаций, можно предположить и для ни с - < 2 ):

телыю отличается. Это позволило предположить, что запах (2 1 обусловлен наличием копформпции (2а). Форма молекулы наиболее выгодной коформации соединения (5) почти не отличается от (2а); в ароматической системе (7) в результате полного уплощению кольца происходит уменьшение ван-дер-ваальсова объема, что приводит полной потере активности.

При замене одно» из треа-бутильных групп на изопропильну» энергия твист-конформации практически не изменяется, тогда как энергия конформации кресла с аксиально расположенным изопропилон снимется до 2,1 ккал/моль. Разница в энергиях конформеров (3,2 ккал/моль) соответствует заселенности твиет-коннфорнацни 1/200. Удаление иетильноП группы в '1-полигении соединения (2) с образованием двойной связи (Ю) делает кислород-содорташия заместитель Солее похожим на изопропилыша, чем на /гроя-Сутильнкй. Применив вивсиамяеишю рассучщения к соединенно (10), воаяо допустить, что (10) является смесь» кон'Горыеров (10е4) и по6) в соотношении

Как видно из рис.7, формы молекул (1), (2а) и (3) похожи (взаимное расположение фрагментов (А) и (В) ), а конформер (2б) значи-

о %

М Н 1

(20°)

По форме ван-дер-ваальсовой поверхности твист-конформация (Ю6) похожа на молекулы активных соединений (1,2а), а (10°) значительно отличается. Йаиболее устойчивой конформацией (12) является кресло с диэкваториальным расположением заместителей. Форма ее мало отличается от (10®). Исходя из заселенности конформации (106) следует ожидать, что обонятельный порог (10) будет на два порядка выше, чем порог (12). Результаты обонятельных испытаний хорошо согласуются с этим предположением (табл.3). Отсутствие запаха андростенона у (11) также объясняется значительным отличием формы молекулы от формы активных конформации 12а, 12). Разница в обонятельной активности изомеров 12) и (3) дает основания считать, что молекулярный объем транс-соединения (3) -наибольший среди исследованных соединений - превышает оптимальный. Уменьшение объема молекулы путем замены одного из атомов углерода на кислород (ОМоГГ et а1., 1983), а также удаление метильных групп или их замена на атомы водорода приводит к увеличению активности транс-изомеров.

Полученные данные позволяют предположить, что узнавший центр обонятельного рецептора (рйс.8) состоит из области связывания карбонильной группы и гидрофобной полости, радиус которой примерно равен ван-дер-ваальсову радиусу третбутильной группы (3 Л), а расстояние от ее центра до карбонильного атома кислорода, равно

200:1.

таковому в 5а-андрост-16-ен-3-оне (8,4 А).

■ н ... -I', ^ 1

" к

»УЛ»-V; "-"О--5

" * , ч-«' ■ V

и

4Г

: ::' П> '

и.?

■ Л

Од Д > ¿аэ

^ г,/" *

аЬ'Ч/ г о<

Г'ч-'ЧХ " 1 ' ■ 3 е--—■ ч,^

«.

А

и - -ч I у • ( - - УХ'

У.-' ~ (У Ч^4"^8

, ^^^ , и *

V Л, Л ?' дрш

; 1 О еМ Ц'Р

("О ° ^ «<5П* * *

Рис. 7. Пространственные модели в ван-дер-ваальсовых радиу-сах соединения (1, 2а,. 26, 3, 5, 7, 10а,¿С И, 12) г проекции на плоскость, проходящую через атом кислорода, четвертичный углериди связанную с ним'ыетильную группу.

\

Рис. 8. Схематическое изображение участков связывания молекулы андростенона с обонятельным рецептором. А - участок, связывающий карбонильную группу, В - гидрофобная полость.

Выводы.

1. В соответствии с гипотезой о зависимости обонятельных свойств от строения вещества синтезирован ряд моноциклических аналогов 5а-андрост-16-ен-3-она. Исследованы их обонятельные свойства:

а) установлено, что цис- и транс-изомеры 4-( 4-тре/п-бутилцикло-гексил )-4-метилпентан-2-она (2) и 13), неописанные ранее 4-(4-трел1- бутилциклогекс-3-енил )-4-метилпентан-2-он (5) и сте-реоизомеры 4-(4-трет-бутилциклогексил )-пент-3-ен-2-она (10, 12) имеют запах 5а-андрост-16-ен-3-она (обонятельные пороги: 10

-7 _7

10 , 10 , 10 и 10 г, соответственно);

б) опыты по кросс-адаптации и специфической аносыии на людях показали, что вещества, имеющие запах андростенона, взаимодействуют с одним типом обонятельных рецепторов.

2. Сформулирован новый методический подход к оценке качества запаха:' качество запаха следует определять отнесением к эталонно му веществу и в концентрациях,.близких к пороговым, так как возможно его искажение из-за неспецифического возбуждения других типов обонятельных рецепторов при больших концентрациях стимула.

3. в обонятельной ткани свиньи обнаружены коипонеитн, kotojw ногут претендовать на роль обонятельных рецепторов апдростенона. Показана их мембранная локализация и возможность частичного перехода в водорастворимую фракцию (К 3,}х10~9 М, Вглх6,0 пноль/мг белка - для мембранной, и К 1 ,3х10~9 М, aIPiax0'38 пиоль/мг белка - для цитозольяои Фракции).

4. В цитозоле респираторной ткани свиньи также обнаружены компоненты, специфически, высокоаффинно связывающие печеный аналог

-О

феромона-(К 2,0x10 М, 3Jsax 4,3 пмоль/мг белка), однако они имели некоторые отличия от компонент обонятельной ткани, Предполагается их необонятельная Функция.

5. На примере 1 ,4-дизамещенних циклогексанов показало, что для наличия запаха апдростенона необходимы: карбонильная группа (фрагмент Л) и гидрофобный участок, представленный четвертичным атомом углерода, связанным с метильной группой (В). Фрагменты (А) Я (В) разделены семью С-С связями, их взаимное расположение должно быть таким, как в 5к-андрост-16-ен-3-оне (конформации "кресла" и "твист" с диэкваториалыю расположенными заместителями).

0. Сформулирована качественная модель узнающего центра обонятельного рецептора андростенона: уэва#ВДй центр имеет область связывания карбонильной группы и гидрофобную полость, радиус ко-

о

примерно равен 3 А, а расстояние от ее центра до карбонильного

о

атома кислорода - 8,4 А.

Основные результаты опубликованы в следующих работах: 1. Kagan U.Z., Kraft vi; 1-:ауа U.A., VasUleva V.S., ZlnUevlch E.P. Analytical and preparative separation of the els- and trans-lsossrs of 4-1 4' - tert.-buty lcyc loltexy i )-4-irs thy 1 pent an-2-one ty

reversed phase high-performance liquid chromatography// J. Chromatography.- 1981,- V.219.- P.183-186.

2. Соколов E.E., Цибульский H.M., Орлов A.C., Каган M.3., Васильева B.C., Краевская H.A., Зинкевич Э.П., Антропов Л.А. Влияние искусственного феромона хряка на приход свиней в охоту// II Всесоюзное совещание по химической коммуникации животных. Тезисы докладов. М: Наука,- 1983.- С.150.

3. Зинкевич Э.П., Краевская М.А., Каган М.З. Андростеноновый и андростероновып обонятельный рецептор//1Х Совещание по эволюционной физиологии. Тезисы докладов,- Л.: 1986.- С.98.

4. Краевская М.А., Каган М.З., Зинкевич Э.П., Шевченко В.П., Мясоедов Н.Ф. , Парфенова Е.В., Этингоф Р.П. Молекулярные механизмы обоняния: связывание полового феромона хряка 5а-андрост-16-ен-3-она и его аналогов цитозольной фракцией обонятельной вЬстилки свиньи//Сенсорные системы.- 1987,- Т.2.-С.127-136.

5. Парфенова Е.В., Краевская М.А., Каган М.З., Зинкевич Э.П., Шевченко В.П., Этингоф Р.Н. О рецепторах полового феромона хряка в тканях носовой полости свиньи//Докл. АН СССР.- 1987.- Т.292.-N.3.- С.741-745.

6. Краевская М.А. Молекулярные механизмы рецепции обонятельных сигналов. Радиорецепторный анализ в изучении первичных механизмов обонятельной рецепиии//Актуальные проблемы морфологии и экологии Высших позвоночных. М.: Наука,- 1989,- С.364-392

7. Zlnkevich Е.Р., Kraevskaya H.A., Minor A.V. In search for a molecular receptor of a boar sex pheromone/ZClientcal Senses.-1989 -V.14.- No.1P.229.

L'