Новые подходы к синтезу кортикостероидов на базе 5альфа-Н-стероидного сырья тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАД&Ш ШК ИНСТИТУТ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ.имени Н. Д. ЗЕЛИНСКОГО

Ла правах рукописи

УДК 542.91:547.92 576.025:577. Г58

Дялантиашвчли Нино Бпсильевна

НШЗЫВ ПОДХОДИ И С1П1ТЕЗУ КОРТШШГЖШШ НА БАЗЕ БсА-Н-СТЕРО! ШЮГО СИГЫч

02.00.03 - оргшпгческая химия

Автореферат ■ диссертации на соискагатэ ученой степени

ютуз{дата химических наук Москва - 1392

Работа выполнена в Институте органической химии имени Н.Д.Зелинокого РАН

Научный руководитель: кандидат химических наук,

ст.н.о. А.М.ЗУРУТА

«г

Научный коноультант: кандидат биологических наук,

. и.о. Н.Е.ВОЙШБИЛЛО • Официальные ошоченты: доктор химических наук • проф. Э.П.СЕРЕБРЯКОВ доктор биологических наук К.А.КСЩЕЕНКО

Ведущее предприятие: Центр химии лекарственных оредств -ВНИХФИ им.С. Орджоникидзе

Зайдата диссертации состоится "¿1 ' 1993 года в

10 часов на.заседании специализированного совета К002.62.02 ''..■•• с

по присуждению отепени кандидата химических наук в Институте

органической химии им.Н.Д.Зелинского РАН, 117913, Москва,

Ленинский проспект, 47.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОХ РАН,

Автореферат разослан "51" 1993 года

Ученый секретарь специализированного совета доктор химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РаБОТЫ

Актуальность темы.В связи с резким повышением цен на основные импортные источники стероидного сырья - диосгенин, соласодин и получаемый из них ацетат дегндропрегненолона в настоящее время проводятся интенсивные поиски новых отечественных источников стероидного' сырья и путей его траснформации в кортикостероиды. Немаловакное значение в этом плане приобретают выявленный во флоре Грузии тигогенин и получаемый из него ацетат прегненолона (АЛ). Однако, отсутствие эффективных путей функционализации колец А, В и С насыщенных 5а-Н-стероидов является лимитирующим фактором в синтезе на их основе стероидных лекарственных препаратов. Актуальной задачей является изучение оптимальных с»ште-тических возможностей превращения All в известные биологически-активные кортикостероиды или полупродукты в w синтезе.

Цель работы. Разработка рациональных методов превращения All в 16а,17а-эпоксиды, 16а,17а-диоксоланы и 16а,17а~оксатиоланы 9а-гидрокси-, Iip-гидрокси- и Д9-прегн-4-ен-Р1-ол-3,20-диона.

Научная новизна и практическая цешюсть работы Впервые

разработаны варианты превращения 1ьа,17а-эпокси~&а-Н-прегнано-лона в 9а-гидрокси-, 11р-гидрокси-16а,17а-эпоксипрегн-4-ен-21-ол-3,20-дион и 21-ацетат 16а,17а-эпоксипрегна-4,Э-диен-21-ол-3,20-диона - ценные интермедиаты в синтезе стероидных лекарственных препаратов.

Впервые показана эффективность использования 20,20-диметил-. ацетальной защиты для претративной микробиологической трансформации как 5а-Н-прегнанов, так и их Д5~вналогов в Д4-3-кето-, 9а-гидрокси- и Пр-гадроксй-Д4-3-котопро7!зводныо.

Впервые проведено изучение двух последовательностей введения Д4, -З-кетогруппировки и 16а,17а-диоксоланового кольца в молекулу 16а,17а-э1юксга1роп;анолона, в результате которого разработана оригинальная схема превращения Ail в 16а,17а-диоксолан прегна-4,9-диен -21-ол-3,20-диона.

Предложено два эффективных варипнта превращения ЛП в 17-тиоаналоги ацетонидов - 16а, Г/а-окс^тиолачи Уа,2Г-лигндрокси-прегн-4-ен-З,20-диона и его Д^-нроизводного.

Впервые исследованы реакции цис-раскрытия эпоксидного цикла 16а, 17а-эпокси-5а-Н-прегнан-Зр. 21 -даол-20-она и его 9а-гид-рокси-А4-3-кетопроизводного уксусной и тиоуксусной кислотами, на базе которых получены новые 16а,17а-цис-дизамещенные 20-ке-тостероиды.

Впервые обнаружена способность выделенного в лаборатории нового штамма июйосоооиь вр. эффективно превращать 5а-Н-прег-наны в А4-3-кето- и- Эа-гидрокск-Л4-3-к$топроизводные а также возможность отделения процесса А4-3-кетодегидрирования от 9а-гидроксилирования.

Впервые найдены условия превращения 5а-Н-прегн-16-енолона микроорганизмом Шюйосооошз вр. в прегна-4,16-дион-3,20-дион или в 9а-гидроксипрегна-4,16-диен-3,20-дион, предусматривающие в первом случае использование ингибитора 9а-гидроксилазы, а во втором - разных диссоциативных вариантов Шойососоиа вр.

Апробация работы и публикации: Часть работы была представлена на Всесоюзной конференции "Химии природных биорегуляторов" з 1990 году в г. Ереване. По материалам диссертации опубликовано 7 статей и одна работа послана в печать.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного трансформации Ба-Н-стероидов, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на ¿63 страницах машинописного текста, включает 12 таблиц, список литературы состоит из 298 наименований.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

I. Синтез 9а,21- и НР.21-дигидрокси-16а,17а-дизам9щен-ных прегн-4-ен-3,20-дионов.

Кортикостероидьые препараты, применяющиеся в медицинской практике (триамцинолон, синалар, десонид, флуоцинолон, его ацетонид и, др.) объединены наличием общих структурных элементов - 16а,17а-цис-диольной (или диоксолановой) группировки, А • -3-кето (или А4-3-кето)-группировки и Пр,21-дигидрокси-

групп. Их 17-тиогтроизвод1Шо нередко проявляют более выраженную активность. В соответствии с этим функционалгзация АП проводилась с учетом направленного синтезп именно этого типа соединений. Для трансформации кольца о использовались химические методы, а для активации колец А,В и С - микробиологические метода, при этом изучались возможные последовательности введения заместителей.

1.1. Синтез 20-производних 16а,17с-эпоксиирегн-4-ен-9а,21-диол-3,20-диона и 16а,17а-9поксипрогн-4-он-11р,21-диол-3,20-диона.

Разработка путей синтеза целевых продуктов на базе АП осуществлялась в ггределах избранной в лаборатории стероидов ИОХ АН СССР схемы, йсходящей из 16а,17а-эгюкси-5а Н-прегнан-зр-ол-

20-она (I) с использованием оригинальных методов 21-гидрокси-лирования, стерсоспецифичного цис-раскрытия окисного цикла и микробиологической активации колец А и С. Акцент в выборе способа микробиологической трансформации колец Л и С сосредоточен на использовании штамма ИюДососсшз вр. (ИОХ-77), "атализирую-щего Д4-3-кето-дегидрирование и введение 9а-гидроксилыюй группы, легко превращаемой известными способами в Пр-гидрокси, 9а-гал'огензамещенные стероиды.

1.1.1. 21-Гидроксилирование 16а,17а-эпскси-5а-Н-ггрегнан-Зр-ол-20-она.

21-Гидроксилирова1ше окиси (I) осуществляю по апробированной ранее в синтезе Л5-3(Э-гидрокси~ и Д*-З -кчтоагшлогов методике, использующей диацетоксийодбонзол в метаколыгом раствсре щелочи. Образующийся при этом 20,20-димотилацеталь (2) отделяется фильтрованием через 3 ч после начала реакции и превращается в 20-кетон (3) кислотным гидролизом в ацетоне. Превращение (I) в (3) может быть достигнуто с 72Ж выходом без выделения (2) -подкисленном роакциотюй смеси водным раствором НО0. Разработанный способ синтеза (3) является фактически единственным одностадийным методом получения этого инте.медиата. Икэнно этот вариант

21-гидроксилирования, позволяющий на первой стадии выделить

20,20-диметилацеталь (2), помог преодолеть главную трудность задачу последующей микробиологической активации колец А и С.

Схема I

|-он -он

88*

Реагенты: 1 - рм (ОАо )2/кон/Меон 11 - р-Тв0Н,Ме2С0

1.1.2. Микробиологическое А4-дагидрирование и 9а-гидроксилирование 16а.17а-эпокси-Ба-Н-прегнанов в сравнении с их Аь-аналбгами.

Проблема синтеза кортикостероидов из 5а-Н-прегнанов тесно связана с разработкой эффективных путей функционализации дезак тивированных колец А, В и С. До сих пор это достигалось сочетанием многостадийных химических и микробиологических методов, с помощью которых осуществляют последовательную функционализа-цию кольца А. а затем кольца С. Мы нашли новый микробиологический подход к решению этой задачи, показав принципиальную возможность одновременного Д4-дегидрирования и 9а-гидроксилированш Ба-Н-прегнанов. С этой целью, использован штамм, принадлежащий к роду Шгойоооооиа ер., у которого ранее выявлена д^-3-кетадегид-рирупцая и 9а-гидроксилирующая способности в ряду ДБ~стероидов.

Изучена способность этого штамма к трансформации 16а,17а-впокси-&а-Н.-прегнанов (I)-(3) в сравнении с их Д5-аналогами (4)-(6). Анализ данных, суммированных в Табл.1, показывает, что активность культуры Июйоооооиа ер. при переходе от Д5-Зр-гид:

б

роксипрегнанов (4)-(6; к соответствующим 5а-Н-соединениям (I)-(3) варьирует незначительно. Этот штамм эффективно трансформирует с препаративными выходами 20,20-диматилацетпли эпоксидов

Схема 3

гОН (оме)2

Н 2 6б* , 7 90

И

/ч. I

9М ™

112 75Х Н

14 " 15 ~ 10,11

11*=Н(8а),. И^Ас (86); И=Н (9а,10); 1?=0Н (9(5,11)

1 - ВЪойоооооиз зр; 11' - Сигти1аг1а

111 - СогупеЪас^егЧит ше<11о1апит; 1г - р-ТоОН, Ме2С0.

(2),(5) в их 9а-гидрокси-Л4-3-кетопроизводное (8а). причем в обоих случаях реакции протекают через стадию образования Л -3-кетопроизводаого (7). Фактором, препятствующим целенаправлен-

Таблица I

Микробиологическая трансформация116а,17а-эпоксидов (1)-(6) штаммом Кгойоооооив вр. ИОХ-77

Субстрат Конц., Время Полученный Выход

г /л инкубации, ч продукт %

(I) За 20 (9а) 45

(Ю) 22

(2) 1а 26 (8а) 75

(3) за 12 (96) 27

(II) Б

(4) 3 40 (9а) 70

(Ю) 15

(5) 1-3 16 (8а) 90

(6) I 17 (96) 16

(И) 18

а) Стероид измельчен и внесен в культуральную жидкость без растиорения.

ной трансформации 20-кетоэпоксидов (I),(3),(4),(6) в их Уа-гид-рокси-Д4-3-кетопроизводние, является незащищенность 20-като-группы от действия 20-оксостероидредуктазы, синтезируемой микроорганизмом - трансформатором. В результате, целевой процесс сопровождается восстановлением 20-кетогруппи с образованием 20р-спиртов (10),(II) (Таблица I), и в конечном итого, отщеплением боковой цепи с образованием Эа-гидрокси-АД и полным раз-

рушением стероида. В атом плане 20,20-диметилацетальная группировка оказалась эффективной защитной функцией для осуществленной с препаративными выходами (7556 и 90%' соответственно) трансформации 16а,17а-эпоксидов (2),(5) в их 9а-гидрокси-А4~кетопро-изводноэ (8а), диметилацеталь (8а) количественно гидролизуется в (90) упомянутым выше способом. Найдьна эффективная возможность отделения процесса А4-дегидрирования 20,20-диметиляцета-ля (2) от последующего 9а-гидроксилирования образующегося при этом его Д4-3-кетопроизводного (7), что достигается применением клеток Rhodoooocus sp. отделенных от культуральной жидкости в начале стационарной фазы роста. Трансформация с такими покоящимися клетками протекает с образованием только Д^-З-кетопроиз-водного (7) с выходом 66%, аналогичная реакция р присутствии 1Шгибитора 9а-гидроксилазы (а,а-диш»ридила или СоС13) дает целевой продукт с низким выходом (35%).

I.I.3. Синтез 16а,17а-эпоксикортикостерона и 16а,I7a-эпоксикортизона.

Найденные и описанные' выше возможности, во-поррцх, использования 20,20-диметилацетальной заг'дты для эффективной трансформации 16а,17а-эпоксидов (2),(5) с помощью Phodoqoocua ор. и, во-вторых, отдолеш!/? процесса А^-дегидрировашп от последующего процесса 9а-гидроксилироваш1Я для первого-из "тих субстратов позволили предложить эффективный способ превращения как А5-, так и 5а-Н-прегнанов в ценный и до настоящего времени практически недоступный интермеднат в синтезе кортикос-тероидов КЗа.Г/а-эпоксикортикост^рои (14) (Схема 3). Для этого Д4-3-кетоэпоксид (7), полученный микробиологическим дегидр1грова1шем как 5а-Н-эпоксида (2), так и Д5-эпоксида (5) соответственно с применением Rhodoeoccu3 sp. и Corynebaqteri-uai medlolanum (60% и 70% соответственно) окислен количественно о использованием' Iip-гилроксилирущей культуры - Curvularia lu-nata (VCPM-70). Из образующейся при этим смеси Пр-гидрокси- и П-кетоэпоксидов (12),(13) первый выдзляется с 75% выходом кристаллизацией и последующим хрома', ографированмем маточного раствора. Традиционное удаление 20,20-ацетальной защиты в (12).

(13) дает соответственно 16а,17а-эпоксикортикостерон (14) и 16а,17а-эпоксикортизон (15), которые известными трансформациями по эпоксидному циклу могут быть превращены в гидрокортизон и другие лекарственные препараты..Нельзя не отметить, что по патентным данным катализируемое С.1ишИ;а окис :ение 16а,17а-эпоксипрегн- <*-ен--21 -ол-3,20-диона приводит к трехксмпонентной смеси ир-гидрокси-, 14а-гидрокси- и 11§,14а-дигидроксипроиз-водных (без указания выходов и констан* полученных продуктов). Из этого очевидно, что 20,20-диметилацетальная группировка, ' предотвращая сопутствующий этой культуре нежелательный процесс 14а-гидроксшшрования, делает трансформацию целенаправленной.

1.2. Синтез 16а,17а-диоксоланов и 16а,17а-оксатиоланов 9а,21-дигидроксипрегн-4-ен-3.20-диона.

Изучено два варианта синтеза заглавных соединений на базе 16а,17а-эпокси-5а-Н-прегнанолона (I), отличающиеся последовательностью трансформаций в кольцах л,С и с. Первый из них предусматривает использование Ба-Н-элоксида (3) для химической модификации кольца о в стадам, предшествующих микробиологической активации колец А и С (А4-3-кето-9а-гидроксилиро- с ваниэ). Второй вариант включает обратную последовательность и по существу основан на использовании полученного выше 9а-гидрокси-16а,17а-эпоксида (96) в стерео- и регионаправленной модификации кольца 0.

1.2.1. Цис-раскрытие окисного цикла 16а.1Уа-эпокси-5а-Н-прегнан-3,21-диол- 20-она.

Для регио- и стереоспецифичного превращения 5а-Н--оиоксида (3) в 16а,17а-диоксолан (21) и 16а,17а-оксатиолан (22) при- ' менена реакция цис-раскрытия этой окиси уксусной и тноукеусной кислотами в присутствии реагента на карбонильную группу - карб-этоксигидразина (КЭГ). Ацетолиз окиси (3), приводящий к 16-аце-тату (17), осуществлен как непосредственно в присутствии КЭГ, так и постадийно - с предварительным выделением 20-карбэтокси-гидразона окиси (16). Последний получен катализируемой Ру НС1 конденсацией (3) с КЭГ в Ру при 5°. Проведение этой реакции б

::o (Ir

ш ^ le

-OH r-OH

^NHCptfi ^NHCOjEt

:-.o LV (i—SH

18

60Í

-OH =NNHCOj£t

И--"ОН v

V-^N^-.QAc

71«

17

53*

H —

Г°н X77Гэ гон

=,NNHCC^tt

^ (Ы< + (Ш

H H

23 22% 22 7№

Реагенты: 1 - H2NNHC02Et; ii - PyHCg; iii - :!OAo

iv -. HSAo; v - (C04o)2CI!.,

диоксане в присутствии каталитических количеств ПоЛс менее эффективно. Пщразон окиси (16) реагируот с'тиоуксусной кислотой с образованием неоднородной смеси, из которой целевой продукт выделен с СО% выходом. Следует заметить, что попытки раскрытия окиси (16) сероводородом оказались безуспешными. Удаление гид-разонпой защиты в (17), (18) проведено соответственно ацетил-ацетоном в líoAc" (85-05°) и ВОЛНО|! 1!С2 в МоОН (40-42°); образующийся в последнем случае тиол (20; неустойчив при хранении.

1.2.2. Синтез и микробиологическое окисление 16а.17а-диоксолана и 16а.17а-оксатиолана 5а-Н-прегнан-3.21-диол-20-она.

Конденсацию 16а-ацетата диола (17) с ацетоном удалось провести при одновременном удалении гидразонногс фрагмента путем длительного нагревания при 50° в растворе МеОН и Ме2С0 в присутствии НС604 (Схема 4). Хотя выход 16а,17а-ацетонида (21) в этом случае не превышает 53%, этот результат существенно выше, чем известные литературные варианты. Разработан равнозначный двухстадийный вариант получения диоксолана (21) из 20-гидразо-на(17) через стадию конденсации 20-кетона (19) с ацетоном (5756), Кетализация тиола (20) с ацетоном в оксатиолан (22) осуществляется без выделения (20) из реакционной смеси предшествующей стадии. Однако, гидролиз 20-гидразонной группы в тиоле (18) протекает с трудом и в этом варианте синтеза оксатиолана (22), выделенного с 7056 выходом; сопутствующим продуктом всегда является его 20-карбэтоксигидраэон (23) (22%).

Схема S

-О

HI

4-

26

гон =0

-ОН: =0

Н 21

I

г-ОН

=о

i - Rhodococcus sp.

При исследовании трансформации диоксолана (21) и оксатио-лана (22) с помощью ШюйЬсоосиз вр. четко прослекивается субстратная специфичность этой культуры. Данные, представленные на Схеме 5 и суммированные в Табл.2 в сочетании с результатами превращения с ШюсЗососсиз ар. 21-дезоксианалога диоксолана (24), иллюстрируют этот вывод. Так, если трансформация диоксолана (21) тормозится на стадии образовании 5а-Н-3,20-дикетона (27), то его 21-дезоксианалог (полученный по литературной схеме) в этих условиях дает смесь 9а-гидрокси-А4-2-кето~ и Д4-3-кетопроизводных (25),(26). Даже через 40 ч инкубации соединения (21) культуральная жидкость содержит исхолшй субстрат и лишь следы Л4-3-кетопроизводного. Этот результат пока является главным препятствием в использовании обсуждаемой последовательности превращения 5а-Н-16а,17а-эпоксида (3) р Г6а,17а-диоксолан 9а,21-дигидроксипрегн-4-ен-3,20-диона. Трансформации оксатиола-на (22) и диоксолана (24) имеют идентичные особенности, а именно: оба субстрата дают примерно одинаковые смеси 9я-гшГрокси-Д4-3-кето- и Д4-3-кетопроизводных, причем накопление последних в культуралыюй жидкости ингибирует процесс дальнейшего 9а-гид-роксилирования. Возможность разделогая этих процессов для целенаправленного получения не только 9а-гидроксиоксатиолана (28), но и его 9з-дозоксианалога (29) представляет существенный препаративный интерес, поскольку (29), альтернативно полученный ранее из АЛЛ, эффективно трансформируется с помоцью культуры Сигуи1аг1а 1иг^а в биологически активное 1Iр-гидроксипроиз-водное. Поэтому проведена серия специальных исследований, по-кязавиая, что в зависимости от возраста гаюкулята, вносимого в среду для трансформации, и от аэрации в период трансформации, превращение (22) протекает либо с образованием 48« 9а-гидрокси-Д4-3-кетона (28), либо с накоплением до 75Ж д4-3-кетопроиэводно-го (29). В первом случае использован шюкулят в возрасте 20 ч, во втором - в возрасте 40 ч; интенсивность аэрации варьировалась изменением скорости перемсшившшя среда (200 и 120 об/мин соответственно для получения (28) и (29)).

Таблица 2

Трансформация диоксоланов (21),(24) микроорганизмом

Шюйосоооиз ар.

Субстрат Конц. Время Полученный Выход

г/л инкубации продукт %

ч. ■__

(24) Г~ 26 (25) 7

. (26) 29.

I 40 (25) 22

(26) 18

0,Ьа 24 (25) 50

(26) . Ю

(21) 1а 40 (27) 10 + 30 исх.

0,5 20 . (27)' 45

а) Стероид измельчон и внесен в культуральную жидкость без растворителя.

1.2.3. Синтез 16а,17а-диоксолана и 16а,17а-оксатиолана на базе 9а.21-дигидрокси-16а.17а-8поксипрегн-4-ен-3,20-диона

Изложенные в предгдущем разделе затруднения на стадии микробиологической активации колец А и 0 диоксолана (21) застави ли нас исследовать альтернативные подхода к синтезу 9а,21-дигидрокси-16а,17а-даоксолане и 1иа,17а-оксатиолана прогн-4-ен 3,20-даона, основанные на использовании 16а,17а-эноксикетоиа (90), уже содержащего 9а-гидрокси-Д4--8-кетогруппу. При этом для модификации кольца о применен все тот же подход, ключевой стадией которого является стереоспецифичное цис-раскрытие окисного цикла уксусной и тиоуксусной кислотами в присутствии КЭГ. В результате, целевой 16а,17а-диоксолан (34а) получен представленной на схеме серией превращений, каждое из которых осуществлено судовлетворительным выходом.

гОН j-OH

bNNHCOjet rNNHCOjCt

. frTSH

QAc

о

32 „.«л u

ctfck (t^

31 9IH

зз m

Ие2СО,МеОН

нс&4

rOR -X

H

;35 67?« 36a 58i 366 825$

X=NNHC02Et(31).(35); X=0(33),(36a,0);

R = H(34a). (36a); R=Ao(340), (36(3)

Реагенты: i - HgNNHCOgEt; ii - HOAc; iii - HSAo

Адетолиз окиси (90) проведен как непосредственно в присутствии КЭГ, с образованием 16-ацетата цис-диола (31), так и по стадийно через образование 3,20-дикар0зтоксш'вдразона L6а,17а-эпоксида (30). Последний получен конденсацией окиси (90s с КЭГ в диоксане в присутствии р теон. Аналогичная реакция цис-раскрытия окиси (30) тиоуксусной кислотой протекает с одновременным удалением гидразонной группы в кольце А, приводя к 20-карбэтоксигидразону 16а-ацетокси-17а-тиола (32).

Удаление гидразонной защиты легко протекает при обработке 20-карб'этсксигидразона (31) ацетилацетоном афи 20° в водной уксусной кислоте с образованием 16-ацетата цис-диола (33). Следует заметить, что тиоаналог (32) в этих условиях но реагирует, а более жесткие условия приводят к деструкции молекулн.

Катализируемая НС604 конденсация (33) и (32) с ацетоном дает соответственно диоксолан (34а) и 20-карбэтоксигидразон оксатио-лана (35). Первый из них получен с низким выходом (36%) также непосредственно реакцией 16-ацетата диола (31) с ацетоном в МеОН присутствии НСЮ4. По аналогии с. 5а-Н-17-тиолом (18) гидролиз 20-гидразонной группы в тиоле (32) протекает с трудом и только добавление в реакционную смесь воды и избытка НС104 позволяет получить оксатиолан (36а) с 5856 выходом.

Предлагаемая схема превращения Эа-гидроксиэпокслда (96) в 16а-ацетат диола (33) и диоксолан (34а) является единственным известным методом их получения, поскольку альтернативный вариант, как было показано выше, безуспешен. Изученный путь равно-эффективен в синтезе оксатиолана (36а), как из эпоксида (3), так и из его Эа~гидрокси-Л4-3-кетоаналога (96).

1.3. Синтез 16а,17а-диоксолана прегн-4-ен-9а,16а,17а-триол-3,20-диона на базе 5а-Н-прегн-16-ен-ЗР-ол-20-она.

В поиске рациональных путей синтеза биологически активных стероидов на базе доступного из тигогенина АЛ мы изучили такую последовательность превращения зр-гидрокси АП в 16а,17а-диоксо- . лан прегн-4-ен-9а,16а,17а-триол-3,20-диона (25), в которой построению диоксоланового кольца предшествует микробиологическое окисление 5а-Н-прегн-16-ен-30-ол-2О-она (37) в его 9а-гидрокои-Д4-3-кетоаналог (38). Это стало возможным при использовании индивидуальных диссоциативных Б- и й-форм штамма шюаососсиз пр., препаративно трансформирующих (37) в соединение (38). Традиционное цис-гидроксилирование (38) КМп04 в НС02Н дает цис-диол (39) с 64% выходом, последний легко конденсируется с ацетоном с образованием диоксолана (25). Изучена также возможность избирательного щелочного эпоксидирования диенона (38) (П^.НаОН) с целью синтеза на его основе 9а-гидрокси-16а,17а-эпоксипрогестор01ш (9а), полученного выше с неудовлетворительными выходами из (I) и (4). Однако, диенон (38) эпоксидируется по обеим кратным связям, давая 4р,5р;16а,17а-диэпоксид (40) структура которого доказана физико-химическими методами.

¿^ 60-60* Н 37

Ш

=о •он •он

Реагенты: i - Rhodocoooua ер., 11 - КЫп04; Iii - Ме^СО, HCg04; iv - Н202, ЙаОН

2. Дегидратация 9а-гидрокси-А4-3-кето-прегнанов.

Исследованы возможности дегидратации полученных выше Эагид-роксипрегнанов (8а,б), (9а,б), (30), (346), (366) в их ¿^производные. С этой целью использовались различные дегидратирующие агенты с учетом лабильности присутствующих в этих молекулах эпоксидной, диоксолановой и оксатиолановой групп - р-ТзОН/8М2, полифосфорная кислота, хлорсульфоновая кислота, метансулгфокисло-та. Оказалось, что вопреки литературным данным, И^РО^, дащая высокие выходы Л9-производных при дегидратации широкого набора 9атидроксистероидов. не реагирует с изученными соединениями. Использование р-толуолсульфокислоты на подлокке (аю2) дает целевой продукт (41а), но с низким выходом (2656), только в случае эпоксида (9а). В этих ке условиях 20,20-диметилац^таль эиоксида (8а) только омыляется до 20-кетоаналога (96), который далее претерпевает раскрытие окисного цикла с образованием Фур.шона (42) (03%). Близкая картина наблюдаотря при использовании 'св^о.и,

б)iL

Реагенты: i - р - Ts0H/si02; ii - с£БОэн/сн2ев2; Iii - Phsoce

где целевой продукт получен только из (9а) (45-50%), тогда как его 20,20-диметокси-21-гидроксианалог (8а) в этих условиях не дегидратируется вовсе, омыляясь до соответствующего 20 -кетона (96). •

Изложенные выше результаты побудили нас изучить косвенные "способы дегидратации 9а-гидроксигруппы, предусматривающие получение на промежуточной стадии легко элиминируемой 9а-эфирной группировки. Оказалось, что самим эффективным реагентом для этой цели является фенилсульфинилхлорид, легко образующий суль-фшювые эфиры (43а,б), (44), (45), ( 88Ж), которые быстро дегидратируются р-ТоОН на Si02; общие выходы на две стадии достигают при этом ЧЬ%.

х- 0 (340), (46); х= Б (366), (47)

Реагенты: 1 - РЬБоСб; 11 - р-Т80Н/ЗЮ2 .

а

Полученные таким образом Д -прегнаны (41а,0), (46), (47) являются непосредственными предшественниками в синтезе известных противовоспалительных лекарственных препаратов;

3. 0 некоторых особенностях микробиологической активации колец А и С 5а--Н-нрогнанов культурой ШоДюсоооиа вр.

Ход микробиологической трансформации Ба-Н-прегнанов с помо -щыо 1Шо(1ооосоив вр. и выходы целевых продуктов существенно зависят но только от структуры субстрата, но и способов его внесении, нагрузки, температуры инкубации, интенсивности аэрации и т.д. Оптимизация процесса в каждом конкретном случае осуществлялась с учетом этих Факторов. Стероид вносился в культуральную жидкость в растворе ДМФА при нагрузке 0,25-2 г/л. При необходимости увеличения нагрузки до 3 г/л стероид вносили в виде мелкодисперсного порошка с размером частиц 1-10 мк. Разработанный эффективный синтез 20,20-диметилацеталей 21-гидрокси-5а-Н-нрепшнов и выявленная предпочтительность их использования в микробиологических трансформациях определили основное направление работы, предусматривающее использование в микробиологическом окислении Шгойо-соосиз ар. 5а-Н-субстратов с уже готовой кортикоидной- боковой цепью. Тем не менее мы изучили и альтернативную возможность,

предполагающую первоначальное Д4-3-кето-9а-гидроксилирование непосредственно АЛ, его Зр-гидроксианалог (37) и 16а.17а-эпо-ксида (I). Качественный и количественный контроль за ходом трансформации АЛ показывает, что культура МгоЛоооооиз вр. катализирует следующие реакции: гидролиз зр-ацетатной группы, окисление зр-гидроксильной группы с образованием 5а-Н-3,20-ди-кетона, его А4-дегидрирование, последующее 9а-гидроксилирова-ние образующегося А^-З-кетона, восстановление 20-кетогруппы и, наконец, деградацию боковой цепи (Схема 10). 1:а примере Зр-гидрокси АЛ (37) и зпоксида (I) найдены возможности отделе-

Схема 10

ния процессов А -дегидрирования от последующего 9а-тидроксили-рования, что достигается внесением ингибиторов 9а-гидроксилазы а,а-дипиридила или СоСбд. Трансформация (37) при нагрузке 3 г/л в присутствии 0,1% а,а-дипиридила завершается за 42 ч с 65% выходом прегна-4,16-диен-3,20-диона. Этим найдена воз-мокность перехода от соединений 5а-Н-прегнанового ряда к их А^-З-кетоаналогам. Аналогичная трансформация зпоксида (I) за 40 ч протекает с образованием 40% 16а,17а-эпоксипрогестерона и 22% его 20р-гидроксипроизводного..

Превращение АП в его 9а-гидрокси-Д4-3-кетопроизводное (38) Июйосоооиз вр. в традиционных условиях ослокняется деструкцией молекулы до 9а-гидроксиандростендиона; в результате чего выход целевого продукта не превышает 20%. Оптимизация этого процесса и применен!; 1 отдельных Б и й-диссоциативных вариантов позволили увеличить выход 9а-гидроксипрегна-4,16-диен-3,20-диона до 60 и Б0% соответственно.

ВЫВОДЫ

1. Впервые осуществлен переход от -доступного отечественного сырья 5а-Н-прегненолона к важным полупродуктам в синтезе стероидных лекарственных препаратов - 9а-гидрокси-16а,17а-эпоксикортексолону, 16а,17а-эпоксикортикостерону, 16а,17а-диоксолану 9а,21-дигидроксипрегн-4-ен-3,20-диона, 16а,17а-оксатиолану 9а,21-дигидроксипрегн-4-ен-3,20-диона и их Д9-производным.

2. Обнаружена способность штамма тгос1оооооия ар. (ИОХ-77) трансформировать Ба-П-прегнаны в их Д4-3-кето- и 9а-гидрокси-

Д -З-кетопроизводные, причем подобраны условия для разделения этих процессов.

3. Показаны эффективность использовашм диацетоксийодбензола

ОТ

для С -гидроксшшрования 16а,17а-эпокси-Ба-Н-ирегнанолона и применении образующегося при этом 21-гидрокси-20,20-диме-тилацеталя в целенаправленных микробиологических трансформациях культураШ1 СогупеЪаогег1ит те<11о1апит, Ююйоооосиа ер., Сипш1аг1а lurlata.

4. Найдена оригинальная и эффективная схема превращения

16а, 17агэгюкси-5а-Н-1грегнанолона в 16а,Г/а-эпокси-9а,21-

дигидроксипрегн-4-ен-З,20-дион и 16а,17а-э1Юксшсортикос-

терон - цешше Ш1термедиаты в синтезе кортикостероидных

препаратов.

5. Исследованы реакции цис-раскрытия эпоксидного цикла 16а,17а-

эпокси-5а-Н-прегн-Зр,21-диол-20-она и 16а,17а-эпоксипрегн-4-ен-9а,21-диол-3,20-диона ускусной и тиоуксусной кислотами, показавшие универсальность этой методологии для введения различных 16а,17а-цис-заместителей.

6. Изучены различные последовательности функционализации колец .А, С и D 16а,17а-эпокси-5а-Н-прегнанолона. Установлено, что

в синтезе 16а,17а-диоксолана 9а,21-дигидрокси-прегн-4-ен-3,20-диона и его Аэ-аналога единственно возмокной является такая последовательность реакций, в которой вводимая, синхронно с С21-гидроксигруппой 20,20-диметилацетальная защита обуславливает эффективную микробиологическую трансформацию стероида в "кольцах А и С; удаление ацетальной защиты осущест вляется на стадии предшествующей введению диоксолановой груп пы в кольцо D методом цис-раскрытия окиси уксусной кислотой.

7. Исследованы подходы к синтезу 16а,17а-оксатиоланов 9а,21-ди-гидроксипрегн-4-ен-3,20-диона и его д-производного из 16а,17а-эпокси-5а-н-прегнанолона, основа!Шые на различной последовательности функционализации колец А, С и D.

8. Найдены условия превращения 5а-Н-16-прегненолона'микроорганизмом Rhodocoocus sp. в прегна-4,16-диен-3,20-дион или

в 9р-гидроксш1регна-4,16-диен-3,20-дион, предусматривающие в первом случае использование ингибитора Эа-гидроксилазы, а во втором - разных диссоциативных вариантов Rhodococcus sp.

Основное содержание диссертации изложено в следующих печатных работах:

I. Турута A.M., Фадеева Т.М., Камерницкий A.B., Джлантиашви-ли Н.В., Войшвилло Н.Е. Пути превращегая 9а-гидроксиандро-стендиона и 5а-Н-прегненолона в 16а,17а-эпоксикортикостерон. //Конференция "Химия природных биорегуляторов" Ереван, 1990. Тезисы докл. С. 63.