Водорастворимые сополимеры N-винил-2-пирролидона и кротоновых эфиров глюкокортикоидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

г ^ ^

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

На правах рукописи

ТИМОФЕЕВСКИЙ Сергей Леонидович

ВОДОРАСТВОРИШЕ СОПОЛИМЕРЫ Л-ВИНИЛ-2-1ЩРР0ЛИД0НА И НРОТОНОВЫХ ЭФИРОВ ГШСОКОРТИКОИДОВ.

02.00.06 - химия высокомолекулярных соединений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Санкт-Петербург. - 1994

Работа выполнена в Институте высокомолекулярных соединений РАН

Научный руководитель: член-корреспондент РАН, профессор ПАНАРИН Е.Ф.

Официальные оппоненты: доктор .химических, наук, старший научный сотрудник КРАКОВЯК М.Г.

кандидат химических наук, старший научный сотрудник ДОМНИНА Н.С.

о

Ведущая организация: Санкт-Петербургский технологический

институт - Технический университет г

Защита состоится " ^мчср*. 1994 г. в '_!_ часов на заседании специализированного совета Д 002.72.01 при Институте высокомолекулярных соединений РАН по адресу: 199004 Санкт-Петербург, Большой пр. В.О., 31.

С дййОор'гациой можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан " ^ " Нс'-^/Г-^ .1994 г.

Ученый секретарь специализированного соваГа кандидат физ.-мат.наук

[трочеяко Д.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность работа.

В последнее время успешно развивается химия физиологически активных полимеров, одно из направлений которой посвящено модификации природных биорегуляторов синтетическими полимерами для решения научных и прикладных задач в медицине, биологии и биотехнологии.

В терапии, в частности, актуальна проблема коррекции фармакологических свойств препаратов на основе глюкокортикоидных гормонов, сочетающих, как правило, терапевтическую активность с нежелательными побочными эффектами.

Известно, что первым этапом в реализации гормонального сигнала глюкокортикоидов является их специфическое взаимодействие со своими рецепторами (Розен и соавт., 1Э81). Различают рецепторы глюкокортикоидов, локализованные в цитоплазме тетки (Koch et al., 1979) и на поверхности клеточной мембраны (Сергеев и соавт., 1986: Калинин, 1987). Этот факт обуславливает принципиальную возможность разделения регуляторных функций глюкокортикоидов на разных уровнях клеточной организации путем включения гормона в структуру гидрофильных макромолекул, поскольку транспорт стероидов, иммобилизованных на полимере, через мембрану клетки затруднен (Godeau et al., 1978; Nenci et al., 1981; Калинин. 1987).

Предпринятая ранее попытка (Панарш и соавт., 1989) решить проблему коррекции физиологической активности глюкокортикоидов модификацией их гидрофильным карбоцегешм сополимером (СП) N-винил-2-пирролидона (ВП) с малеиновым ангидридом привела к сохранению полимерными производными специфической биологической активности исходных гормонов при некотором снижении отрицательных эффектов последних. Полученнлй результат, возможно, связан как с-наруше-

нием взаимодействия модифицированных глюкокортикоидов с клетками-мишенямн, так и с низкой гидролитической стабильностью полиэфиров вследствие акхимерного содействия соседней к сложноэфирной связи карбоксильной группы. Следовательно, для вияснения влияния полимерной структуры на биологические свойства модифицируемого гормона необходимо решение комплекса задач, связанных с возможностью синтеза водорастворимых и стабильных в физиологических условиях полимерных аналогов глюкокортикоидов, способных взаимодействовать с клетками в составе макромолекул.

Основная цель работы заключалась;(1) в синтезе ненасыщенных аналогов глюкокортикоиддшх гормонов и их гидрофильных сополимеров, несущих остатки стероида в боковой цепи макромолекулы; (2) в изу- . чении взаимного влияния структуры полимера-носителя и модифицируемого гормона на их свойства.

Научная новизна -работы определяется тем, что впервые были синтезированы и охарактеризованы 21-кротонатн глюкокортикоидов -гидрокортизона (ГК), преднизолсна (ПР), дексаметазона (ДМ), и показана их способность вступать в сололимеризацию с гидрофильными сомономерами - Н-винил-2-пирролидоном (ВП), ВП и кротоновой кислотой (КК), ВП и МД-диэтиламиноэтилкротонатом (ДЭАЭК). Оценена относительная реакционная сиоооонооть ¿¡.-кротоната ГК (КГК) и сомономеров, микроструктура СП. Показана возможность получения водорастворимых двойных неионогенных и тройных ионоген-ных СП о заданными ММ (от 5-Ю3 до 4• 10^) и содержанием стероидных груш (до 14 мол.%), имеющих случайное распределение по цепи макромолекулы. Изучена взаимосвязь структуры СП с их физико-химическими и биологическими свойствами. Установлено, что в водных растворах макромолекулы СП структурированы и имеют более высокую компактность, по сравнению о полимером -носителем, за счет гидрофобных взаимодействий'стероидных фрагментов; обладают высо-

- 2 -

кой гидролитической стабильностью в условиях, близких к физиологическим. Иммобилизация глюкокортикоидов по положению 21 на гидрофильном полимере приводит к полному сохранению специфической биологической активности модифицируемых гормонов .при резком ослаблении их отрицательного побочного действия и значительном повышении противошоковой активности.

Практическая цзнность работы заключается в том, что в ней научно обоснован подход к решению проблемы создания новых лекарственных средств, более эффективных, по сравнению с используемыми в настоящее время в медицинской практике глюкокортикоидными препаратами.

Личный вклад автора состоит в непосредственном получении большинства экспериментальных данных, вошедших в текст диссертации, а также участии в формулировке задач исследования и интерпретации полученных резльтатов совместно с научным руководителем.

Апробация работы. Основные результаты диссертации докладывались и обсуадались на Всесоюзной конференции "Фундаментальные проблемы науки о полимерах" (Ленинград, 1990), ^-й Всесоюзной конференции "Водорастворимые полимеры и их применение" (Иркутск, 1991), 2-й Советско-Итальянской встреча по полимерам (Санкт-Петербург, 1991), 8-й Конференции молодых ученых по органической и биоорганической химии (Рига, 1991) и 4-м Всесоюзном симпозиуме "Синтетические полимэры медицинского назначения" (Звенигород, 1991).

Публикации. Основное содержание работы изложено в 7 печатных работах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав, общих выводов, приложения и списка литературы. Работа изложена на 161 странице машинописного текста, включая 17 рисунков, 19 таблиц и списка цитируемой литературы из 193 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Во введении к работе обосновала актуальность исследования, сформулированы цель и аадачи работы. В качестве объектов исследования были выбрани 21-кротонаты ряда природных и синтетических глюкокортикоидов - ГК, ПР, ДМ и их СП с ВП, ВП и КК, ВП и ДЭАЭК, что обусловлено: (1) возможностью получения хорошо охарактеризованных полимеров методом сополимеризации; (2) литературными данными (Ушаков и соавт., 1967) об образовании статистических СИ ВП с КК и ее производными, в макромолекулах которых отсутствуют рядом стоящие звенья кротоновогс мономера; (3) применением поли(И-вшшл-2-пирролидона) (ПВП) в качестве гидрофильного полимера для медицинских целей.

1. Литературный обзор.

Обзор литературы посвящен методам синтеза полимерных аналогов стероидов, влиянию структуры конъюгата на его свойства и основным сферам применения таких производных в медицине и биологии.

Иммобилизация глюкокортикоидов на полимере осуществлялась с целью создания эффекта "депо" и контролируймпгп подтуплен?.?, стероида из биодеструктируемого конъюгата в заданную мишень (Tani et al., 1980; Nguyen Vu Khue et al., 1985, 1986; Larsen et al.,

1989), разработки биоспецифичных сорбентов (Пшеничный и соавт.,

1990), полимерных транспортных систем для иммуноферментного анализа (Панарин и соавт., 1992), инструмента изучения локализации рецепторов и механизма биологического действия глюкокорти-коидных гормонов (Сергеев и соавт., 1986; Калинин, 1987; Панарин и соавт., 1990). Данные о биологических свойствах синтезированных полимерных производных, как правило, отсутствуют, а в ряде работ носят оценочный характер.

2. Методическая часть.

В методическом разделе указана квалификация исходных веществ, описаны метода синтеза мономеров и СП, а также методы исследования структуры и свойств СП.

3. Синтез мономеров глюкокортикоидов и их СП с ВП. 21-кротонаты глюкокортикоидов были синтезированы реакцией

ГК, ПР и да с кротонилхлоридом в апротонном полярном растворителе в присутствии акцептора' кислоты при температуре от О до 20 °С:

Выход кротоновых эфиров составил 52 + 80 % от теоретического. Полученные эфиры 21-стероидов представляют собой белые кристаллические вещества со следующими Тм : 21-кротонат ДМ (КДМ) -194,5 + 196 °С, КГК - 197 + 198°С, 21-кротонат ПР (КПГ) - 234 + 236°С. Структура эфиров стероидов установлена по данным ПМР и КНР 13С спектроскопии, подтверждена данными ИК- и УФ-спектров, элементного анализа.

Показана способность КГК, КПР и КДМ вступать в сслолимериза-щпо с ВП в растворе в присутствии радикального инициатора ДАК при Т = 65 °С. Условия .синтеза и структура СП представлены в Табл.1.

С целью повышения порогового содержания стероида, при котором полимер сохраняет водорастворимость, и связанной с ним удельной активности СП, а также изучения влияния наличия и знака заряда макромолекул на физико-химические и биологические свойства; полимера, били синтезированы тройные СП 21-кротонатов стероидов с

- 5 - •

Таблица 1. Условия синтеза и структура водорастворимых СП ВП с 21-кротонатами глюкокортикоидов (М2) и ионогенными сомономерами (Мд).

1

ст>

г с л 0 в и я с и н т е з а Выход через Структура СП

Кротоновые Состав исходной мономерной смеси (мол.%) Раство- С о с т в "V _з 25 [71]

сомономеры ]штель Ш0. ДАК, Т 18 ч мол Л а масс.% (сн3он)

«2 12 1° моль/л мол. % (°С) (%) Р2 М2 •10 (дл/г)

кгк _ 98.5 1.5 _ бензол 3.9 0.5 65 91° 98.6 1.4 _ 4.4 440 1.2

кгк КПР : 95.1 95.1 4.9 4.9 — :г-иропа нол » 1.9 1.9 1.0 1.0 65 65 88 79 95.4 96.0 4.6 4.0 - 13.3 11.6 30 24 0.20 0.16

кдм - 95.2 4.8 - 1.9 1.0 65 80 95.9 4.1 -- 12.8 32 0.21

кгк ДЭАЭК 65.0 5.0 30.0 1:0 1.0 65 41 80.6 10.5 8.9 25.1 14 0.12

кдо кгк ДЭАЭК кк 84.6 82.6 4.7 11.5 10.7 5.9 ,'!-пропа нол | этанол 2.0 1.0 1.0 1.0 70 65 72 72 89.7 |81.8 5.8 10.9 4.5 5.3 17.0 27.7 17 Г 9 0.13 0.08в

кдм кк 81.3 11.3 7.41 бензол 3.6 Э.7 65 '91 84.6 10.5 4.9 28.1 40 0.30г

а б в г

УФ-спектр, значения в расчЕче на остатки ГК, ПР и ДМ. Через 4 ч. ДМФА, 25 С. Этанол, 21 С.

ВП и ионогенным кротоновым сомономером (КК или ДЭАЭК). СП выделены методом эксклюзионной хроматографии ка Сефадексе LH-20 или осаждением даэтиловым эфиром. Содержание низкомолекулярк ¡го стероида в СП, по данным эксклюзионной хроматографии, составило менее 0.1%. Условия синтеза и структура терполикеров приведены в Табл.1.

Наличие звеньев КГК и ВП в СП было установлено по данным ик-и УФ-спектроскопии. В ИК-спектрах полимеров зарегистрированы полосы поглощения остатков 21-стероидов. ГК: 1650 (0=С—С=) и 1705 .см-1 (С2О=0), ПР и ДМ: 1650 + 1660 и 1600 см"1 (кольцо А), 1705 см-1 (Сго=0); сложноэфирная группа звеньев стероидного мономера в бинарных СП поглощает в области 1725 см-1. Карбонильная группа лактамного кольца звеньев ВП поглощает при 1680 см"1. Содержание стероидных груш определяли по поглощению кольца А глюкокорти-коидов в области 240 нм. Сшитых структур, обусловленных полифункциональностью стероида, обнаружено не было.

Состав тройных СП ВП с 21-эфиром стероида и КК (или ДЭАЭК) определяли по УФ-поглощению остатков глюкокортикоидов и данным потенциометрического титрования карбоксильных и аминогрупп. Значения состава СП согласуются с данными, полученными другими методами (Табл.2).

Таблица 2. Состав СП КГК (по данным разных методов).

СП м, - М2- М3 . Состав СП, мольнЛ

F2 F3

ВП - КГК 86.2 87 ± а ± 0.3 в 1 б 13.8 ± 0.3 а • 13 ± 1 -

а Ö г

ВП - КГК - КК 72 t 2 6.0 ± 0.1 22 ± 2

Д Д Д

70 ± 4 5.0 ± 0.5 25 ± 3

а б в

По разности. Спектрофотометрия. Элементный анализ (N). г ' д

Титриметрия; ШР.

4. Сопэлимеризэция ВП с КГК.

Как следует из данных Табл.1., мономеры глюкокортикоидов (КГК, КПР, КДМ) при сололимеризации с ВП характеризуются близкой реакционной способностью. Для установления возможности направленного синтеза стероидсодэржащих СП с заданным составом была изучена кинетика сополимеризации ВП с 21-эфирами стероидов (на примере КГК) и ионогенными кротоновыми сомономорами в бинарной и тройной системах с независимым определением каждого мономера' методом ВЭЯСС.

4.1. Бинарная сополимеризация ВП с КГК.

Значения констант скоростий расходования мономеров, рассчитанные в приближении реакции первого порядка, указывают на снижение скорости сополимеризации при увеличении содержания КГК в реакционной смеси, особенно в области малых 1°. При этом наблюдается также снижение Ш СП (Табл.3).

Обнаруженное замедление реакции, по-видимому, связано как ц неспособностью КГК к гомополимеризации, что было подтверждено экспериментально, так и с деградационной передачей кинетической цепи на мономер КГК с отрывом атома водорода в а-положении к одной из кратных связей КГК и образованием малоактивного радикала. В пользу предположения о передаче цепи на КГК свидетельствует замедление гомополимеризации ВП в присутствии ГК и вхождение ГК в состав полимера в следовых количествах (по-видимому, на концах цепи). Кажущиеся константа передачи цепи на стероид для полимери-зационных систем ВП-КГК и ВП-ГК, оцененные по методу Мэйо, составляют СТ(КГК> ~ 0.12 и СТ(ГК) *> 0.07 (в 2-пропаноле) и незначительно зависят от механизма обрыва цепи, выбранного при их расчете.

Относительные активности мономеров, рассчитанные аналитическим и графическими методами с учетом концевой модели сополимери-

- 8 -

защм из данных состава выделенных СЕ (конверсия <15%) составили: Г, = 0.72 4 0.75 (ВП), г2 и О (КГК) в ДМФА и г, = 0.76 + 0.79, г2 = -1.5 + 1.2 в 2-пропаноле. При сополимеризации мономэрчой ■ смеси, обогащенной ВП (Г° > 0.7), состав образующегося СП близок к составу исходной смеси (Рис.1). При содержании КГК в реакцион-. ной смеси 1| > 0.22 наблюдается "предел полимеризации" и, кроме того, постепенное отклонение экспериментальных данных от расчетной кривой состава СП (выходящей на предельное значение Г2 = 0.5) (Рис.1.). Последнее обстоятельство, вероятно, связано с некоторой неадекватностью концевой модели при высоких значениях из-за влияния предконцевого стероидного звена на состав СП.

Таблица 3. Влияние состава реакционной среды при сополимеризации ВП (М1) с КГК (М2) в 2-пропаноле на значение констант скоростей расходования мономеров Н (л0-5моль_0-5с_') и на ММ СП ([ВШ0 = = 1.6 моль/л, 1 кол.% ДАК, Т =65 °С).

М Ы1 Л МР Л М5 М1 - "3 *

г 1г Н'-Ю4 Я 2.104 И г/Н 1 М, • 10

р р Р Р V

- 0 19 - - 43

ГК 0.05 3.3 - - 26

» 0.10 1.7 - - 21

ГК+КГК 0.05+0.05 2Л 5.9 2.5 -

КГК 0.05 7.2 2.4 3.4 25

> 0.10 4.1 9.8 2.4 ' 21

» 0.15 2.6 5.5 2.1 14

> 0.20 1.9 3.8 2.0 11

*

Использованы константы Марка-Куна-Хаувинка для ПВП в ДМФА.

Найденные значения констант сополимеризации (г, и < 1; г, т^ " О) свидетельствуют о большей'склонности КГК и ВП присоединяться к "чужому" радикалу, <ем к "своему", что приводит к образованию статистических СП с высокой тенденцией к чередованию звеньев обоих мономеров вдоль полимерной цепи. Значение г£ » О указывает на отсутствие в цепи- рядом стоящих звеньев КГК, что позволяет получать гидрофильные СП ВП с КГК, характеризуемые более выраженной тенденцией к чередованию звеньев стероида и •сомономера по цепи, чем при использовании акрилатов и метакри-латов ГК.

1.0

0.5 -

0.0„

\з \ /'■' V ' .....А _

----' 2 Г-ДгР** ¿¿Ь \ о а \ ■6 \

0.5

0.0

35

25-|

15-

¡л,-'5*

1

и в

—а

РИС.1.

50 ¡00

конверсия,% Рис.2.

Рис. I. Зависимость состава СП ВП с КГК от состава исходной мономерной смеси на ранних стадиях реакции в ДМФА (а) и 2-пропа-ноле (б), по данным анализа СП, и расчетные кривые состава начального (1) и конечного (2) полимэра, а также предельной конверсии мономерной смеси Ь (3) при г1 = О.Т2 и г2 = О.

Рис.2. Зависимость ММ СП от- глубины сополимеризации ВП с КГК в 2-пропаноле при = 0.05 (1) и 0.20 (2) ЦВП)0 = 1.6 моль/л, 1 мол.% ДАК, Т= 65 °С).

; - 10 -

Ванннм структурным параметром полимеров биомедицинского назначения является их ММ и полидисперсность по ММ. Поэтому представляло интерес исследовать влияние состава реакционной среда и глубины сополимеризации В11 со стероидным мономером на JAM и ММР СП.

Установлено, что состав мономерной смеси и природа растворителя позволяют изменять ММ СП в широких пределах - от 1-1СИ до 4-1U5. В большинстве случаев значения ММ составляют менее 3-104 (Табл. 1, 3; Рис.2). При оценке Mv использовались коэффициеты Марка-Куна-Хаувинка для. ПВП в соответствующих растворителях.

Mw СП ВП-КГК, оцененная эксклквионной хроматографией СП ВП-КК (полученных после полного отщепления стероидных груш от стероид-содержащего СП в условиях щелочного гидролиза) с использованием калибровочных коэффициентов для ПВП, в ходе сополимеризации меняется незначительно, постепенно возрастая при 1° = 5+20 мол.% (Рис.2), что, возможно, связано с относительным обеднением реакционной смеси КГК по мере сополимеризации и уменьшением роли деградационной передачи цепи на стероидный мономер. ММР СП на разных стадиях реакции остается узким (Mw/M = 1.7 * 2.0), что может быть следствием различных факторов ограничения цепи - передачи цепи на КГК, 2-пропанол и т.д., а также механизма обрыва цепи как рекомбинацией, так и диспропорционированием растущих, мжрорадикалов. Природа стероидного мономера (КГК, КПР) не оказывает заметного влияния на ММ и ММР СП.

4.2. Тройная сополимеризация ВП с КГК и ионогешшм кротоновым сомономером.

Ионогенные глюкокортикоидсодержащие СП представляют интерес как макромолекулярные аналоги 21-стероидов с потенциально высокой специфической биологической активностью, поскольку позволяют повысить пороговое содержание стероида в водорастворимом поли- II -

мере, по сравнению с неионогенным СП, и дополнительно влиять на связывание с клетками-мишенями.

Для выяснения возможности синтеза таких СП заданного состава была исследована тройная сополимеризация ВП с КГК и гидрофильным кротоновым сомономером - КК или ДЭАЭК, звенья которых, по литературным данным, имеют случайное распределение по цепи их СП с ВП.

Из кинетических кривых сополимеризации ВП с НТК и КК в этаноле следует, что при исходном содержании в реакционной смеси кротоновых мономеров 25 мол.Ж образующийся терполимер

обогпщен КГК и обеднен КК, по сравнению с исходной смесью (Рис.3). При повышении 1° + 1° до 50 мол.% происходит изменение соотношения скоростей вступления ВП и КГК в СП и появление "предела полимеризации" (Рис.3). Значения констант скоростей расходования сомономеров, рассчитанные из линейных полулогарифмических анаморфоз показывают, что КГК является более эффективным замедлителем сополимеризации, по сравнению с КК.

Константы относительной реакционной способности ВП по отношению к КГК и КК, не способных присоединяться к кротоновому макрорадикалу, были рассчитаны по уравнению Алфрея-Гоулдфингера из данных анализа как мономерной смеси, так и начального СП: г12 = = и.А- + и.о. г13 = 0.9 + ¿л при г^ = и, где 1 ~ г, и; д = а, г, 3; 1 * 3. .. ■

Изучение кинетики сополимеризации ВП с КГК и ДЭАЭК в этаноле при Г° = 0.10 и Г° = 0.25 показало, что образующийся терполимер обогащен КГК и обеднен ДЭАЭК, по сравнению с исходной смесью мономеров. Методом ВЭЖХ установлено, что сополимеризация в этих услбвиях сопровождается побочной реакцией переэтерификации ДЭАЭК, что осложняет получение хорошо охарактеризованных тройных СП, в отличие от реакции в ДМФА. В свою очередь, КГК алкоголизу не подвергается.

Рис.3. Зависимость глубины превращения ВЛ (1), КГК (2) и КК (3) от времени их сополимеризации в этаноле при 1°:1д:1д = 75:10:15 (а), 75:20:5 (б) и 50:20:30 (в), (1М10 = 1 моль/л, ДАК - 1 мол.Ж,' Т = 65 °С).

Сравнение рассмотренных тройных систем свидетельствует о снижении относительной активности кротоновых мономеров по отношению к макрорадикалу ВП в ряду: КГК > КК > ДЭАЭК - так же, как и в соответствующих бинарных системах. Кроме того, природа кротоно-вого мономера оказывает влияние на ММ СП: КГК обладает большей способностью, чем КК и ДЭАЭК, обрывать растущие макрорадикалы. Полидисперсность СП по ММ при повышении содержания кротоновых мономеров в исходной смеси уменьшается (Табл.4).

Проведенный анализ сополимеризации ВП с кротоновым стероидным мономером показал, что образующиеся СП имеют случайное внутримолекулярное распределение стероидных звеньев и могут быть синте-зированн с заданными значениями состава и ММ в широком диапазоне, что позволяет исследовать корреляционные связи структура-свойства.

- 13 -

Таблица 4.Влияние состава мономерной смеси ВП (1^) и КГК (М2) на ММ и ММР СП (СМ] =1.0 моль / л в ДМФА, 1 мол. % ДА1{, Т = 65°С).

мз 3 Конверсия (%) ■ - " -3" V10

- 0.95 0.05 > - 32 27 2.11

- 0.80 0.20 - 26 13 1.84

ДЭАЭК 0.65 0.05 0.30 28 17 1.55

КК 0.65 0.05 0.30 30 15 1.64

5. Взаимное влияние структуры полимера-носителя и модифицируемого 21-стероида на их свойства.

5.1. Состояние макромолекул в растворе.

Наличие в структуре СП ВП к 21-кротонатов глюкокортикоидов амфщильных лактямных звеньев обуславливает сродство этих СП к растворителям различной природы. Вместе с тем, на свойства СП оказывают влияние также стероидные звенья.

В ытротонных растворителях (ДМФА, хлороформ) СП ВП с 21-кро-токагакш хл^сисртпг.спг.с!: ргстЕср:1'.!ы во всем дияпяяоня состава. По отношению к протонодонорннм растворителям (низшим спиртам, воде) существует верхнее критическое содержание стероидных групп, при котором СП теряет растворимость. Вследствие кооперативных взаимодействий неполярных стероидных фрагментов макромолекул, СП ВП с 21-эфирами стероидов, содержащие более 7 + 9 мол.Ж звеньев 21-эфиров, нерастворимы при 25°С в метаноле и этаноле, а содержащие более 3+5 мол." стероида - нерастворимы в воде.

Ионизация цепей тройных СП ВП-КГК(КДМ)-КК (Р3= 0.02 + 0.3) и ВП-КГК-ДЭАЭХ (Р3=0.09) в эквимолярных (по отношению к звеньям КК

- 14 -

или ДЭАЭК) водных растворах МаОН и СН3СООН, соответственно, приводит к образованию полиэлектролитов, растворимых в воде при ?г < < 0.10 + 0.14 и < 0.11 (Табл.1).

Влияние взаимодействий стероидных групп СП ВП на состояние макромолекул в воде, по сравнению с органическим растворителем, в котором гидрофобные взаимодействия значительно ослаблены, оценивалось методом поляризованной люминесценции с использованием.СП, модифицированных антраценозой меткой.

Таблица 5. Время' релаксьции 1 и характеристическая вязкость Ст) 1 СП ВП и 21-эфиров стероидов в воде и метаноле при 25 °С.

Полимер Г2. * ^о [т>] ' н20 [-П]СН30Н ^]СН3ОН - -3

мол.% (не) (дл/г) (дл/г) V10

ПВП 0 29 0.14 0.20 1.4 20

0.2 32 0.19 0.26 1.3 46

1.4 0.7 1.2 1.7 440

ВП-КГК 2.3 57 0.08 0.16 2.0 23

3.8 67 0.07 0.15 2.1 20

ВП-КПР 4.0 46 0.09 . 0.15 1.7 21

* а... = 9 + 10 не, приведено к вязкости еоды при 25 °С.

Резкий рост времен релаксации, указывающий на внутримолекулярную заторможенность полимерных цепей в воде (в отличие от метанола) при увеличении Р2, свидетельствует о формировании внутренней структуры макромолекул за счет гидрофобных контактов стероидных

- 15 -

фрагментов, а увеличение соотношения характеристических вязкостей СП в этих растворителях, показывает, что такое структурообразова-ние сопровождается увеличением компактности макромолекул. При этом не выявлено существенного влияния строения глюкокортикоида (ГК, ЛР) на характер структурообразования (Табл.5).

Методом потенциометрической титриметрии было установлено, что гидрофобные стероидные группы оказывают влияние тоже на кислотно-основные свойства тройных ионогенных СП. Показано, что значение константы ионизации звеньев КК и ДЭАЭК СП в водных растворах существенно уменьшается при переходе от двойных 'СП ВП-КК и ВП-ДЭАЭК к тройным СП ВП-КГК-КК и ВП-КГК-ДЭАЭК, соответствешо.

5.2. Гидролитическая стабильность СП.

В связи с тем, что ионизация полимерных цепей повышает гидро-фильность СП 21-кротонатов стероидов, которые могут быть использованы в виде водных растворов, было исследовано влияние заряженных групп макромолекул на гидролитическую стабильность сложно-эфирной связи полимер-стероид, обеспечивающей функционирование стероидных остатков в составе конъюгата.

По данным аналитической эксклюзионной хроматографии, гидролиз СП КГК в водэ и водно-солевых растворах протекает как.реакция псевдопервого порядка при отщеплении до 10 + 15 % стероидных груш от основной полимерной цепи (Рис.4). На последующих стадиях реакция замедляется, что характерно для гидролиза в цепях макромолекул. Отщепившийся стероид, вероятно, не покидает зону реакции вследствие гидрофобного взаимодействия с цепью и звеньями КГК, что еще более замедляет реакцию гидролиза. Низкие значения констант скорости гидролиза СП при рН = 5.2 + 9.3 и Т = 23 °С (Кр = Ю-10 + 10~8 с"1) свидетельствуют о значительном экранировании сложноэфирных связей гидрофобными фрагментами макромолекулы

- 16 -

и отщепившимися молекулами стероида. Средняя энергия активации реакции при Т= 23 + 75 °С составила Еа = 60 + 100 кДж/моль.

Выраженного влияния заряженных групп в тройных СП на стабильность связи полимер-стероид, по сравнении с бинарным СП, не выявлено. Вместе стем, в области наибольшей устойчивости СП в водных растворах (рН = 5.2 + 7.3) отмечена некоторая тенденция к более высокой стабильности троГ шх СП КГК. При этом стабильность терполимеров коррелирует с плотностью заряда полимерных цепей, рассчитанной из констант ионизации макромолекул при различных рН.

Таким образом, совокупность физико-.лклических свойств СП 21-кротонатов глюкокор'шкоидов в растворах покг ывает, что макромолекулы СП в водном растворе являются структурированными "поджатыми" полимерными клубками.

Высокая стабильность СП 21-кротонатов глюкокортикоидов создает условия для включения гормона в стероидный транспорт и для его взаимодействия с клетками-мишенями в составе макромолекул.

5.3. Биологические свойства полимерных аналогов 21-стероидов

5.3.1. Моделирование биоспецифической функции модифицированных гормонов.

Известно, что биологическая активность глюкокортикоидных гормонов обусловлена их специфическим взаимодействием с группой веществ белковой природы.

Поскольку включение 21-стероидов в структуру макромолекул может.затрагивать или экранировать участвующие в специфических взаимодействиях элементы структуры гормона, была провэдена оценка различий в связывании модифицированных полимером и исходных стероидов с молекулярной биологической "мишенью" в модельной системе. В качестве доступной модели специфического белка был выбран

- 17 -

сывороточный альбумин (БСА), который является одним из транспортных, белков глюкокортикоидов в организме.

Рис.4. Гидролитическая стабильность СП ВП-КГК (95:5) (1), ВП-КГК-КК (76:6:22) (2) и ВП-КГК-ДЭАЭК (85:6:9) (3) в буферных растворах с рН = 5.2 (а), 7.3 (б), 9.3 (в) и дистишрованной воде (г) при Т = 23 ± 3 °С. (Концентрация СП 1мг/мл).

Об образовании кг отлекса 21-стероидов с БСА судили по туше-шш флуоресценции триптофэновых остатков альбумина в присутствии стероида (А«а1аЬ ег а1., 1968). Установлено, что в разбавленном водном растворе (1БСА]о •» 1.5 • Ю-5 моль/л) различия в связывании ГК (ПР, ДМ) и СП ВП-КГК (КПР, КДМ) альбумином при мольном

- 18 -

соотношении tстероид)Q /(Б0А1о с 8 лежат в проделах случайных колебаний. Аналогичные результаты были получены ранее (Калинин, 1987) для конкурентного взаимодействия 3Н-меченого ГК и терполи-мера ВП - 21-мономалеат ГК - малеиновая кислота с БСА, а для специфического взаимодействия гормона и его полимерного производного с транскортином, антителами к ГК и рецепторами 21-стероидов такие отличия были незначительны.

Полученные данные позволяют ожидать сохранение специфической биологической активности модифицированных (по положению 21) гидрофильным гибкоцепным полимером глюкокортикоидов, обусловленной их взаимодействием с мембранными рецепторами этих гормонов.

5.3.2. Биологическая активность СП.

Специфическая активность СП ВП с 21-кротонатами глюкокортикоидов была исследована на кафедре фармакологии Ленинградского педиатрического медицинского института при внутркбрюшинном введении" полимерных производных крысам и мышам.

На моделях "ватной" гранулемы и формалинового отека было установлено, что полимерные аналоги ГК и ДМ подавляют воспалительную реакцию в такой же степени, как и низкомолекулярные гормоны, а по противошоковой активности (при травматическом шоке) значительно превосходят их (Табл.6). Полученный результат, возможно, обусловлен не только взаимодействием модифицированных гормонов с мембранными рецепторами клеток-мишеней, но также эффектом локальной концентрации стероида.

Оценка отрицательного побочного действия полимерных производных глюкокортикоидов - катаболического и иммунодепрессивного эффектов, связанных с блокировкой биосинтеза эндогенных гормонов, показала, что, в отличие от низкомолекулярных стероидов, их полимерные эфиры не задерживаьг физического развития молодых животных

- 19 -

Таблица 6. Противовоспалительная активность, катаболический эффект и иымуноделрассивное

действие полимерных производных глюкококортикоидов.

Сополимер Состав СП Противовоспалительный эффект "Турни- Отрицательные »ффекты

(мол.?) М V Форма- "Ватная кетный" Задержка скорости (£) Гипотрофия

М1_М2 3 линовой отек {%) гранулема (мг)

М1 «2 «3 •10 шок роста прибавки веса тимуса, %

контроль - - - - 100 -12 100 ± 7 100 0 + 5 0 ± 6 0 ± 5

да _ _ - 0.4 75 ± 8 65-5 90 67 ± 3 45-4 75 ± 2

сп вп-кда 95.7 4.3 - 30 78 ± 10 55-4 - 7 ±4 9 ± 5 15 ± 4

СП ВП-КДМ-ДЭАЭК 89.7 5.8 4.5 17 70 - 7 60-5 3 ± 5 5 ± 5 31 - 4

СП вп-кдм-кк 89.4 5.5 5.1 19 75-8 70-5 45 4 ± 5 30 ± 4

гк _ _ - 0.4 71 - 8 65 ± 5 . 95 67 ± 3 45-3 75-2

СП вп-кгк . 95.3 - 4.7 9 56 ± 10 37 ± 4 50 5 ± 4 10 1 5 56-2

* % погибших животных

(скорости ¡три б зеки ьеса и длины тела) и вызывают значительно меньшую гипотрофию тимуса, по сравнению с исходными гормонами (Табл.6). Причиной наблюдаемого явления, по-видимому, служит нарушение взаимодействия глюкокортикоидов, иммобилизовашшх на полимере, с их клетками-мишенями, приводящее к устранению или ослаблению отрицательных гормональных эффектов, имеющих геномную природу, поскольку транспорт полимера в клетку затруднен.

Заметного влияния наличия и знака заряда макромолекул тройных ионогенных СП, несущих остатки ДМ, на биологические свойства стероида, по сравнению с двойным СП, выявлено не было (Табл.6.).

Таким образом, включение глюкокортикоидов по положению 21 в структуру гидрофильного синтетического полимера обеспечивает полное сохранение их специфической активности. Резкое ослабление лри этом отрицательных биологических эффектов» характерных, для низкомолекулярных гормонов, по-видимому, обусловлено разделением функций глюкокортикоидов в регуляции метаболических процессов на мембранном и внутриклеточном уровнях.

Полученные полимерные аналоги стероидов представляют интерес как инструмент исследования локализации рецепторного аппарата 21-стероидов и молекулярного механизма их биологического действия. СП могут быть твкке использованы для создания новых лекарственных средств с улучшенными фармакологическими свойствами.

ОБЩИЕ ВЫВОДИ.

1. Впервые синтезированы и охарактеризованы кротоновые эфири глшокортикоидных гормонов (гидрокортизона, преднизолона, декса-метрзона) и показана их способность вступать в сополимеризацию с 1{-винил-2-пирролидоном (ВП) и гидрофильными кротоновыми сомономе-рами.

2. Исследована сополимеризация 21-кротоната гидрокортизона с ВП и их тройная сополимеризация с кротоновой кислотой или Н,Ы-ди-этиламиноэтилкротонатом и показано, что образующиеся сополимеры (СП) характеризуются высокой степенью чередования мономерных звеньев по цепи и отсутствием рядом стоящих звеньев стероидного мономера. '

3. Методом поляризованной люминесценции исследована внутримолекулярная подвижность СП и показано, что модификация поли(Ы-винил-2-пирролидона) глгоокортикоидом приводит к формированию внутренней структуры макромолекул в водном растворе за счет гидрофобных взаимодействий стероидных групп, которое, по данным вискозиметрии, сопровождается увеличением компактности макромолекул.

4. Получены водорастворимые двойные- неионогенные и тройные ионогенные СП ВП и 21-кротонатов глкжокортикоидов с заданными ММ (от 5-103 до 4■1О5) и содержанием стероидных остатков (до 40 масс.Я). СП обладают высокой гидролитической стабильностью в условиях, близких к физиологическим.

5. Включение глкжокортикоидов в гидрофильные макромолекулы по полокеник? плгпйгк-тйпм стабильной к гидволизу сложноэфирной связи обеспечивает полное сохранение специфической биологической активности исходных гормонов при уменьшении их отрицатель-ного побочного действия и повышении противошоковой активности.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

1. Полимерные производные глкжокортикоидов как инструмент для. изучения механизма действия стероидных гормонов. /Е.Ф.Панарин, В.Е.Байков, Д.А.Жуков, М.В.Нежэнцев, О.Л.Виноградов, Г.В.Калинин, С.Л.Тимофеевский, О.Г.Пасхина. -В кн.: Фундаментальные

- 22 -

проблемы науки о полимерах. Всесоюз.конф.Симпозиум IV. Наука о полимерах - смежным областям химии, физики и биологии: Тез.докл. -Л., 1ЭЭ0. -С.85.

2. Синтез и исследование сополимеров Н-винил-2-1шрролидона и кротоновых эфиров стероидов. /С.Л.Тимофеевский, В.Е.Байков, Е.Ф.Панарин, В.Д.Паутов, М.В.Незкенцев, О.Л.Виноградов. -В кн.: Водорастворимые полимеры и их применение. 4-я Всесоюз.конф.: Тез.докл. -Иркутск, 1991. -С.87.

3. Water-soluble polymer derivatives of steroids. /V'.E.Balliov, E.T.Panarln, S.L.Tlmofeyevaky, O.G.Paskhlnav -In: Second Soviet Union - Italy Polymer Meeting: Abatr.Meeting. -Saint Petersburg, 1991. -P.41.

4& Steroid crotonic estera and their water-soluble polymers. /S.L.Tlmoieyevsky, V.E.Baikov, E.F.Panarin, V.D.Pautov. -In: 8th Conference of Young Scientists on Organic and Bioorganic Chemistry: Abstr.Meeting. -Riga, 1991. - P.272.

Б. Синтез сополимеров N-винил-2-пирролидона и кротонатов глюко-кортикоидов и исследование их биологической активности. /С.Л.Тимофеевский, В.Е.Байков, Е.Ф.Панарин, В.Д.Паутов, М.В.Нежбнцев, О.Л.Виноградов. - В кн.: Синтетические полимеры медицинского назначения. 4-й Всесоюз.Сиш. :Тез.докл. -Звенигород, 1991. -С.132.

6. Байков В.Е., Панарин Е.Ф., Тимофеевский С.Л. Особенности радикальной сополимеризации ^-винил-2-пирролидона и 21-кротоната гидрокортизона. //Васокомолек.соед. -1992. -Т.Б34. -ЖЗ. -С.3-7.

7. Синтез и исследование свойств сополимеров Н-винил-2-пирролидона и 21-кротонатов кортикостероидов. /С.Л.Тимофеевский, Е.Ф.Панарин, В.Е.БаЯков, В.Д.Паутов. //Высокомолек.соед. -1994. -Т.36. -Ж. -С.15-19.

Подписано к печати 04.11.94. Формат 60x84 I/IB. Бум. газетная. Печать офсетная. Печ.л. 1,6. Тираж 80 экз. Заказ № 5ВД.

Малое предприятие "ТеплоКон" Санкт-Петербургской государственной академии холода и пищевых технологий. 191002, Санкт-Петербург, ул.Ломоносова, 9