Модельные системы белково-нуклеинового узнавания тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

/г 2$

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.Ломоносова

Химический факультет

На правах рукописи

БРУСКОВ ВАДИМ ИВАНОВИЧ

УДК 577.21; 577.323

МОДЕЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ БЕЛКОВО-НУКЛЕИНОВОГО УЗНАВАНИЯ

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Диссертация

на соискание ученой степени Доктора химических наук в форме научного доклада

Москва - 1990 г.

Работа выполнена-в Институте биологической физики АН СССР

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Б.П.Готтих

доктор химических наук Е.С.Громова

доктор биологических наук Б.С.Жоров

Ведущая организация: Институт кристаллографии АН СССР

Защита состоится "_"_1990 г. в _ часов

на заседании Специализированного совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: Москва 119899, Ленинские горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан "_"_1990 г.

Ученый секретарь Специализированного совета,

кандидат химических наук

Г.И.Лавренова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Молекулярное узнавание является одной з наиболее важных проблем биоорганической химии, существенной ля понимания многих биологических процессов. Среди разнообраз-ых систем молекулярно-биологического узнавания особая роль при-адлежит белково-нуклеиновому узнаванию. Этот процесс осуществля-тся при образовании специфических комплексов белков с нуклеино-ыми кислотами (НК). Такие комплексы образуются на всех этапах еализации генетической информации: при репликации и репарации |НК, биосинтезе РНК и белка, регуляции активности генов. В этих роцессах происходит передача информации от НК к белкам, однако :х физико-химическая природа остается невыясненной. Одной из ак- • уальных задач является выяснение кода белково-нуклеинового узна-ания - закономерностей стереохимического пространственного соот-етствия фрагментов структуры белка и НК. Детальное понимание фи-ико-химических механизмов белково-нуклеинового узнавания явля-!тся чрезвычайно трудной задачей даже в наиболее простых случаях, [оэтому исследование простых модельных систем взаимодействия на юномер-мономерном и мономер-полимерном уровне, позволяющее вы-:ленить и оценить роль и специфичность отдельных относительно 1лементарных взаимодействий, является актуальной задачей для по-|имания сложных явлений белково-нуклеинового узнавания.

В нашей работе исследование узнавания проведено на простях- мо-[елях - системах комплексообраэоэания между компонентами белков [ НК. Основной задачей в этих исследованиях было выяснение роли ¡одородйых связей (Н-связей) как наиболее избирательных взаимо-1ействиях, вносящих определяющий вклад в процесс узнавания, [зучен новый класс относительно слабых Н-связей типа С-Н-»-0, которые должны играть важную роль в молекулярном узнавании. Экспе-шментально исследованы в растворах С-Н-->0 связи, образуемые :8-Н группами пуриновых и С6-Н группами пиримидиновых оснований [К и получены термодинамические характеристики комплексов с таки-ш связями.

Среди относительно простых систем белково-нуклеинового узнава-1ия осрбое место занимает фермент-нуклеотидное узнавание при био-:интезе НК. Это узнавание непосредственным образом связано с та-:ими важными биологическими процессами как мутагенез, надежность >ункционирования генома, с процессами, происходящими при вирусных и бактериальных инфекциях, с канцерогенезом и старением. В 1Том плане весьма актуальной является разработка концепции фер-

мент-нуклеотидного узнавания инвариантных атомов и групп в соста ве комплементарной нуклеотидной пары при биосинтезе НК. Согласно этой концепции правильность выбора нуклеотида при биосинтезе НК обеспечивается не только полинуклеотидной матрицей, но и узнава нием ферментом правильной нуклеотидной пары. Предполагается нали чие у ферментов биосинтеза НК наряду с хорошо известными в энзи-мологии каталитически (активным) и регуляторным (аллостерическим центрами дополнительно узнающего центра. Механизм фермент-нуклео тидного узнавания, согласно предложенной концепции, осуществляет' ся путем образования специфических Н-связей между атомами и груП' пами узнающего центра полимераэ и инвариантными атомами и группами в комплементарных парах нуклеотидов в фермент-матрица-субстратном комплексе. При этом узнающий центр фермента играет роль дополнительной матрицы, определяющей правильность синтеза.

Цель работы состояла в том, чтобы на основе анализа простых модельных систем молекулярного узнавания и экспериментального исследования взаимодействий между компонентами белков и НК выявить принципы и закономерности, лежащие в основе белково-нуклеинового узнавания. В том числе, выявить.физико-химические основы фермент--нуклеотидного узнавания при биосинтезе НК, обеспечивающие высокую точность и надежность передачи генетической информации.

На защиту выносятся следующие основные положения и результаты:

1. Рассмотрение основных возможных схем образования Н-связей между боковыми радикалами аминокислот и основаниями НК и экспериментальное подтверждение существования таких связей между карбоксильной, амидной, гуанидиновой и аминогруппами аминокислот и азотистыми основаниями НК на мономерном уровне и при взаимодействии аминокислот с ДНК.

2. Обнаружение и исследование методом ЯМР слабых Н-связей типа С—Н••*о в растворах метилированных аналогов оснований НК. Получение термодинамических характеристик таких связей для С8-Н групп пуриновых и С6-Н пиримидиновых оснований.

3. Создание и обоснование концепции фермент-нуклеотидного узнавания по инвариантным N3 атомам и С8-Н группам пуриновых и 02 атомам и С6-Н группам пиримидиновых оснований в комплементарных парах нуклеотидов при биосинтезе НК, как фундаментального фактора, определяющего высокую точность и надежность передачи генетической информации. Формулировка принципа стереохимического усиления специфичности в молекулярно-биологических системах узнавания.

4. Результаты экспериментальной проверки некоторых следствий

энцепции фермент-нуклеотидного узнавания в РНК-полимеразной си-геме с помощью 8-бром и 8-окси замещенных аналогов АТР и GTP. зспособность этих аналогов к замещению природных субстратов при нициации синтеза РНК, как свидетельство узнавания С8-Н группы /риновых нуклеотидов в этом процессе. Неоднозначные субстратно-кодовые свойства 8-окси-СТР,как проявление узнавания РНК-полиме-азсй инвариантных N3 атомов пуринов и 02 пиримидинов в компле-ентарных парах оснований НК.

Научная новизна. Все перечисленные выше результаты получены втором впервые. Ряд данных по взаимодействию между компонентами елков и НК были подтверждены и развиты в исследованиях зарубеж-ых авторов. Однако, приоритет наших исследований признан и полу-енные нами результаты цитируются в обзорах (Helene, Maurizot, 981; Helene, Lancelot, 1982) и монографии (Зенгер, 1987) . Впер-ые получены доказательства существования С-Н---0 Н-связей в ра-творах и определены их термодинамические характеристики. Энталь-ия таких связей лишь в 1.5-2 раза меньше, чем для обычных Н-свя-ей между атомами кислорода и азота. Следовательно, такой тип' вязей должен учитываться при изучении внутри- и межмолекулярных заимодействий НК и их компонентов и при биологическом функциони-овании НК и нуклеотидов. Впервые разработана концепция фермент-уклеотидного узнавания инвариантных атомов и групп в комплемен-арных парах нуклеотидов при биосинтезе НК. Такими инвариантными вляются N3 атомы и С8-Н группы пуриновых и 02 атомы и С6-Н груп-ы пиримидиновых оснований, а также состав и конформационные осо-енности сахаро-фосфатной части нуклеотида. Это узнавание являет-я одним из механизмов, обеспечивающих высокую точность и надеж-ость воспроизведения генетической информации. Впервые дана фор-[улировка принципа стереохимического усиления специфичности и по-азана возможность компенсации ошибок за счет неспецифических ¡заимодействий. Впервые показано, что 8-бром-АТР, 8-окси-АТР, -бром-GTP, 8-okch-GTP не способны к инициации синтеза олиго- и галинуклеотидов в РНК-полимеразной реакции. В реакции синтеза по-[инуклеотида на матрице поли [(clA-T) (dA-Tj) РНК-полимеразной E.ooli [оказано, что 8-okch-GTP узнается и проявляет субстратные свойст-ia UTP. А при абортивном синтезе олигонуклеотидов на промоторе il ДНК мутанта фага Т7 ЛД111 8-okch-GTP проявляет субстратные :войства как GTP, так и UTP. Эти факты впервые показывают прояв-[ение этим аналогом неоднозначных субстратно-кодовых свойств.

Практическая ценность работы. Концепция Фермент-нуклеотидного гзнавания предсказывает ряд новых явлений, доступных эксперимен-

тальной проверке, В этом плане она является стимулом для дальней ших экспериментальных исследований. Она вносит дополнительный вклад в понимание процессов точечного мутагенеза. Из нее следует что мутагенными могут быть не только воздействия, изменяющие структуру ДНК, но также узнающий центр фермента и, более того, воздействия, влияющие на характер взаимодействий в комплексе ДНК -фермент-нуклеозидтрифосфат. Эта концепция открывает возможность для целенаправленного поиска новых биологически активных веществ влияющих на функцию узнавания. Она может быть использована для конструирования лекарственных средств: противовирусных, антибактериальных и противоопухолевых препаратов. Выяснение роли 8-ок-си-АТР и 8-okch-GTP в РНК-полимеразной реакции представляет прак тический интерес, т.к. соответствующие производные образуются в клетках под действием ионизирующей радиации (Hutchinson, 1985) . Модификация гуанина в 8-окси-гуанин осуществляется в нуклеозидах и ДНК под влиянием кислородных радикалов, в том числе, ряда канцерогенных веществ (Kasai et al., 1987). Его биологическая роль, обусловленная проявлением неоднозначных субстратно-кодовых свойств, может оказаться существенной для понимания некоторых путей спонтанного, радиационного и химического мутагенеза и канцерогенеза. Данные о характере взаимодействий между компонентами белков и НК могут быть использованы для построения молекулярных моделей белково-нуклеиновых комплексов.

Апробация работы и публикации. Материалы работы докладывались и обсуждались на Всесоюзных симпозиумах по межмолекулярным взаимодействиям молекул (3 симпозиум - Пущино, 1976; 4 симпозиум -Баку, 1978; 5 симпозиум - Алма-Ата, 1980) на 3 и 5 Всесоюзных конференциях по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1977, 1984), на 4 и б двусторонних Советско-Французских симпозиумах по взаимодействию белков и нуклеиновых кислот (Ташкент, 1977; Цхалтубо, 1982), на 2 координационном совещании "Системы надежности клеток" (Канев, 1977), на 5 Советско-американском симпозиуме "Критерии необходимых и достаточных тест-систем для идентификации потенциальных мутагенных и канцерогенных факторов в окружающей среде" (Пущино-Баку, 1978), на симпозиумах стран СЭВ по биофизике нуклеиновых кислот (Брно, ЧССР, 1977; Таллин, 1981; Сегед, ВНР, 1983), на 4 Всесоюзном совещании по конформационным изменениям биополимеров в растворах (Тбилиси, 1977), на 4 Всесоюзном биохимическом съезде (Ленинград, 1977), на Всесоюзном совещании "Надежность Функционирования процессов репарации ДНК" (Пущино, 1980) , на 8 йенском симпозиуме по биофизической химии "Узнавание между биопо-

гсимерами" (Веймар, ГДР, 1980), на Всесоюзном симпозиуме "Перспективы биоорганической химии в создании новых лекарственных препаратов" (Рига, 1982), на 1 Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982) , на Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы репликации, репарации и рекомбинации в норме и при действии радиации у эукариот" (Пущино, 1983), на 6 Всесоюзном симпозиуме "Конформаци-онные изменения биополимеров в растворах" (Тбилиси, 1985), на 2 Всесоюзном рабочем совещании "Энзимология матричных синтезов нуклеиновых кислот" (Новосибирск, 1986), а также на научных конференциях Института биологической физики АН СССР в 1978, 1980, 1983, 1984 и 1985 гг.

Содержание работы отражено в 42 опубликованных статьях.

Структура работы. Работа состоит из 4 частей, заключения, основных результатов и выводов и списка статей, опубликованных по теме.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ЧАСТЬ 1. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МЕЖДУ КОМПОНЕНТАМИ БЕЛКОВ И НК

1.1. Проблема кода белково-нуклеинового узнавания {6]

Под кодом, в самом общем смысле, понимают правила соответствия одних элементов другим. Решение проблемы генетического кода состояло в установлении соответствия между триплетами нуклеоти-дов в НК и 20 аминокислотами, включающимися в полипептидную цепь при биосинтезе белка. В белково-нуклеиновом узнавании мы имеем дело с задачей выяснения другого кода стереохимического, пространственного соответствия фрагментов структуры НК фрагментам белка, реализуемые при образовании высокоспецифических белково-нук-леиновых комплексов [б],(Гурский и др., 1975). Наши знания в этом вопросе остаются весьма ограниченными. Эта проблема может быть решена путем экспериментального исследования молекулярных механизмов образования реальных высоко-специфических белково-нук-леиновых комплексов физико-химическими методами. Модельные исследования взаимодействия между компонентами белков и НК имеют своей задачей и могут выявить лишь отдельные характерные элементы этого кода. Одним из актуальных вопросов в проблеме кода белково-нуклеинового узнавания является следующий: "Существует ли специфичность взаимодействия на уровне мономеров или отдельных групп, входящих в состав белков и НК, или же специфичность белко-

во-нуклеиновых взаимодействий всецело определяется их пространст венной структурой и пространственной организацией неспецифически; элементарных взаимодействий?". Для ответа на этот вопрос проведв' ны исследования по взаимодействию между основаниями НК и рядом аминокислот на мономерном уровне.

1.2. Узнавание оснований НК и комплементарных пар нуклеотидов аминокислотами и пептидами с помощью Н-связей [6]

Наиболее специфическими взаимодействиями между компонентами белков и НК являются Н-связи. Их избирательный характер обусловлен следующими причинами: 1) они образуются между определенными донорами Н-связи, и энергия их взаимодействия зависит от природы донора и акцептора, 2) они имеют направленный в пространстве характер, 3) существование Н-связей осуществляется в узком диапазоне расстояний, а энергия существенным образом зависит от длины н--связей. При этом надо учитывать, что электростатические взаимодействия между компонентами белков и НК также включают в себя образование Н-связей. Често это - те же Н-связи, дополнительно усиленные наличием зарядов. Поэтому естественно рассмотреть образование Н-связей между компонентами белков и НК и иг. специфичность как основу для белково-нуклеинового узнавания, в наших исследованиях предполагается, что белково-нуклеиновое узнавание обусловлено, в первую очередь избирательным взаимодействием между основаниями НК и, осуществляющей функцию узнавания группой аминокислот, боковые радикалы которых способны к образованию Н-связей. Возможности образования .специфических Н-связей между основаниями НК и аминокислотами и пептидами были проанализированы на объемных атомно-молекулярных моделях. Установлено, что для эффективной дискриминации оснований друг от друга, необходимо образование не менее двух Н-связей. Аминокислоты, которые могут образовать одновременно две или более, при участии пептидной группы, Н-связи, это -содержащие карбоксильную группу (аспарагиновая и глутаминовая), амидную (аспарагин и глутамин), гуанидиновую (аргинин), амино(лизин) , гидроксильную (серин, треонин, тирозин) и некоторые другие. Схемы образования Н-связей основаниями НК в составе однонитевых и двухспиральных нуклеиновых кислот с карбоксильной, амидной и гуа-нидиновой группами показаны на рис. 1, Следует отметить избирательное взаимодействие с образованием двух Н-связей карбоксилат-иона с Ы1-Н и N2-42 группами гуанина и гуанидиновой группы аргинина с 06, N7 атомами гуанина и 02, N3 атомами цитозина. С помощью молекулярных моделей удается показать, что стереохимически воэ-

>жны такие конформации глутамина, глутаминила и аргинина, кото-ле совместно с полипептидной цепочкой образуют по три водородных зязи с гуанином, тимином (урацилом) и цитозином соответственно. 1- и трипептиды с боковыми радикалами, способными к образованию -связей, могут давать сравнительно большее число возможных комп-гментарных к азотистым основаниям структур.

гс. 1. Схемы комплексов с двумя Н-связями боковых радикалов ами-жислот с основаниями НК и их комплементарными парами. 1 - компас карбоксилат кона с гуанином, 2 - комплекс гуанидиновой груп-I с цитозином и С-С парой, 3 - комплексы амидной группы с адени->м, тимином, гуанином, цитозином и А-Г и С-С парами.

Основные результаты анализа, полученного на молекулярных моде-[X в отношении элементов кода белково-нуклеинового узнавания, «но сформулировать следующим образом: 1. Необходимо, как прави->, образование двух Н-связей для эффективной дискриминации от-!льных азотистых оснований или их комплементарных пар. 2. Отсут-•вие универсальности и сильная вырожденность .кода. Узнавание оп-¡делеиного основания или их последовательности можно осуществить помощью разных аминокислот или их комбинаций и разных конформа-1й пептидов. 3. Стереохимический конформационный характер кода, именно, необходимость стабилизации положения в пространстве

участвующих в узнавании определенных конформаций полипептидной це пи и положения бокового радикала за счет стерических ограничений или дополнительных взаимодействий, с тем чтобы обеспечить необходимую избирательность взаимодействия.

1.3. Исследование комплексообразования аминокислота-нуклеозид

(основание) методом измерения растворимости в воде [3,7,13

Для пуриновых нуклеозидов и пиримидиновых оснований было показано увеличение их растворимости в присутствии ряда аминокислот и других соединений при образовании комплексов (рис. 2). По этим данным были определены кажущиеся константы ассоциации комплексов нуклеозид (основание)-аминокислота (табл.1). Эти результаты демон стрируют специфическое взаимодействие карбоксильной группы глупа -миновой кислоты и глицина с гуанозином и избирательное взаимодействие аргинина, лизина и глицина с гуанозином и цитозином. Взаимо действие гуанозина с глицином почти одинаково с взаимодействием с Na-ацетатом и довольно близко к лизину. Эксперименты по растворимости гуанозина с глицином, Na глутаматом, Na ацетатом, Nací и др показывают, что только в том случае, когда присутствует карбоксильная группа, имеет место специфическое увеличение растворимост: гуанозина по сравнению с другими нуклеозидами и основаниями. С учетом поправки на взаимодействие с глицином следует отметить предпочтительность взаимодействия амидной группы с аденином и ти-мином по сравнению с гуанином и цитозином. Полученные результаты хорошо коррелируют со способностью карбоксильной группы образовывать специфические водородные связи с Nl-Н и N2-H., группами гуанина, особенно при сравнении данных между гуанозином и инозином. Они свидетельствуют также об избирательном взаимодействии гуани-диновой группы аргинина и аминогруппы лизина (глицина) с Об и N7 атомами гуанина и 02, N3 атомами цигозина.

Таблица 1. Константы связывания для комплексов оснований НК с аминокислотами по изменению растворимости пуриновых нуклеозидов и пиримидиновых оснований в водном растворе при нейтральных рН и 25°С

Нуклеозид,

К,

~Г

основание L- ■аргинин L-лизин L-глутамин L-глутамат глицин

Тимидин 0. 6 + 0.1 0 0.31+0.24 0 0

Цитозин 1. 5 + 0.2 0.63+0.2 0.46+0.21 0 0 .27+0.12

Инозин 1. 26+0.09 0 1.02+0.18 0.26+0.15 0 .12+0.09

Аденозин 1. 14+0.08 0 0.78+0.14 0 0

Гуанозин 1. 91+0.1 0.85+0.14 1.05+0.15 0.71+0.12 0 .51+0.07

Рис.2. Концентрационные зависимости растворимости Э пури-новых нуклеозидов и пиримиди-новых оснований в миллимолях в присутствии аминокислот и др. соединений [А 1 в молях Вверху: 1 - Ь-аргинин, 2 - Ь--лизнн, 3 - глицин. Внизу: 1 - 1,-глутамин, 2 - Ь--глутамат Яа, 3 - глицин, 4 - ацетат Иа, 5 - ЫаС1.

£зеП между карбоксильной да протонного магнитного

5 [103

Ы

' « а

о -

* 9 ' >

вано . • ,

триптамино. о ,

■ 1 * „

единений, позво... - -Наиболее сильные а сл

х-саязей азотистых оснований в '•.. 1 . Характерным признаком Н-свяви нала протона, участвующего в та-нитных полей. Для выяснения специ-.сильной группы (карбоксилат иона Л воды) с нуклеозидамн Выло исследо-а с изобутнратом Иа, триптофаном н ение результатов для последних двух со-.нить взаимодействие карбоксильной группы, хфические изменения под влиянием карбок-

сильной группы происходят в случае гуанозина. Наблюдается ушире-

ние и сдвиг в область -низкого поля аминогруппы гуанозина без существенного влияния на аминогруппу аденозина и цитидина, свидетельствующее об образовании этой группой гуанозина специфической связи с карбоксильной группой. Одновременно происходит очень сил ное уиярение, приводящее к исчезновению сигналов, соответствуют« имино-группам, в спектрах гуанозина, инозина, тимидина и уридина

Для комплекса гуанозин-изобутират Na получено значение кажущейся

-1

константы ассоциации К„ = 60 И , которой соответствует величина а

свободной энергии комплексообразования - 2.4 ккал/М. Вскоре поел опубликования наших данных, аналогичные результаты об образована специфического комплекса карбоксилат- иона с гуанином, методом ЯМР в сходных условиях были получена в работе французских автора ^Lancelot, Helene, 1977). При образовании комплекса 1:1 гуанозин с L-триптофаном, аналогично изобутирату Na, происходит исчезноа ние сигнала иминогруппы в спектре из-за его сильного уширения и сдвиг в низкое поле на 0.53 м.д. аминогруппы гуанина. В случае триптамина HCl имеет место приблизительно равный 0.25 м.д. сдви: в низкое поле амино-и иминогрупп гуанина, обусловленный, как пок; эываег сравнение с гуанидин*НС1, действием хлорид-иона.

1,5. Специфичность взаимодействия глицина и его метилированных производных с основаниями НК по данным ЯМР [36, 37 ]

Избирательное взаимодействие метилового эфира глицина с нукле-озидами в МезБО. Положение и интенсивность сигнала аминогруппы

метилового эфира глицина хорошо растворимого в Me,SO, свидетельс:

+

вует о существовании ее в заряженной -Ш^ форме, что позволяет ис следовать ее взаимодействия с нуклеозидами. Из пяти исследованных нуклеозидов (аденозин, гуанозин, инозин, уридин и цитидин) толькс цитидин и гуанозин обнаруживают существенные изменения в спектрах свидетельствующие о взаимодействии (рис.3). Наиболее значительные изменения под влиянием Гли-О-Ме происходят в спектре цитидина.Наблюдается сильное уширение сигнала -Ш^ группы Гли-О-Ме и ее смещение в высокое поле и, одновременно, происходит уширение сигнала N4-H, группы цитидина и ее смещение в низкое поле. Эффекты для -ЫН^ группы Гли-О-Ме возрастают с увеличением примеси воды в Me2S0, свидетельствующие об участии гидратной воды в этом процессе. Эти результаты показывают образование специфического комплекса между -NH^ группой и цитозином, вероятно с 02, N3 атомами. Одновременно происходит образование Н-связи между карбоксильной группой Гли-О-Ме и N4-H2 группой цитозина, о чем свидетельствует сдвиг сигнала аминогруппы цитозина в низкое поле и его уширение. Это комплексообразование, по-видимому, сопровождается дегидрата-

гей -NH+ группы Гли-о-Ме и, как следствие этого, сдвигу ее реэо-з

mea в высокое поле.

Рис.3. Спектры ПМР метилового эфира глицина, цитидина. и их эк-вимолярной смеси в МезБО. Все концентрации равны 0.03 М. Химические сдвиги относительно внутреннего эталона ТМС. Температура 300°К. Стрелками показаны изменения химических сдвигов ЯН^ и -ИНд групп при образовании комплекса.

J кд.

В случае гуаноэина происходит смещение в низкое поле реэонан-эв Nl-Н и N2-H2 протонов. Известно, что Nl-Н и N2-H2 группы гуа-ззина специфически взаимодействуют с ионами xnopa(Plaush, Sharp, 576). Данные с LiCl показали, что сдвиг в низкое поле Nl-Н и

"Ротонов в случае Гли-О-Ме-НСХ полностью обусловлен хло-1д-ионами.

Образование комплексов гуанознна и цитидина с метилированными зонзводными глицина и их конкуренция за образование Н-связей в -С парах нуклеозидов в растворе Me2SO : Н,0 = 3:1. Для выяснения зли карбоксилат- и амино-ионов в комплексообразовании с основании нуклеотидов интересно сравнить их взаимодействие с Гли-О-Ме Гли-N-Me. Низкая растворимость не позволяет сделать это в Me2SO. ^вствительность метода ЯКР позволяет сделать такое сравнение при эбавлении 25% воды к He2SO, хотя увеличение содержания воды при-здит к существенному уменьшению констант ассоциации (Lancelot, lyer, 1981). При добавлении Гли-О-Ме-НС1 к цитидину наблюдается {ень сильное уширение сигналов протонов N4-H-, группы. В случае -метилглицина происходит сдвиг в низкое поле сигнала Н^-протона

более сильный сдвиг в низкое поле и уширение сигнала Н,-протона

о

нозина. Эти данные свидетельствуют о более сильном взаимодейст-т цитозина с Гли-О-Ме, по сравнению с Гли-N-Me, т.е. о преиму-зственном вкладе в комплексообразование NH* группы. В случае гу-юзина добавление Гли-N-Me сопровождается сильным сдвигом в ниэ-

кое поле N2-H2 группы гуанина и сильным увшрением Н1-Н-группы. Эти изменения существенно больше, чем те, что обусловлены Гли-О--Ме и■аналогичным изменением, вызванным ионом С1. Полученные данные подтверждают специфическое комплексообразование карбоксилат--иона Гли-N-Me с Nl-Н и N2-H2 группами гуанина, показанные выше в случае карбоксильной группы изомасляной кислоты и триптофана. Изу чено также влияние Гли-О-Ме и Гли-N-Me на G-C пары нуклеозидов. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что в обоих случаях происходит конкурентное с образованием Н-связей в G-C паре ком плексообразование как с гуанином, так и с цитозином. Однако в слу чае Гли-О-Ме преимущественно образуется комплекс с цитозином, а в случае Гли-N-Me с гуанозином.

Взаимодействие глицина с цитозином СМР и GMP в воде. В воде в присутствии глицина происходит сдвиг в низкое поле сигнала N2-H2 группы гуанина в GMP и б-протона N4-^ группы в цитозине и СМР, тогда как изменение сигнала Н4-На протона незначительно. Эти данные свидетельствуют об образовании Н-связей аминогруппами гуанина и цитидина, с карбоксилат-ионом глицина в воде, причем в случае цитозина комплексообразование идет по протону, участвующему в ком плементарном спаривании. Аналогичные изменения в спектрах в присутствии глицина происходят и в случае смеси СМР и GMP в воде, когда происходит образование G-C пар. Эти результаты свидетельствуют о конкуренции за образование Н-связей в воде между карбокси-лат- и амино-ионами глицина с гуанином и цитозином и образованием G-C пар.

1.6. Влияние аминокарбоксильного диполя на термостабильность и конформацию ДНК [30, 32, 36 J

Для выяснения характера взаимодействия аминокарбоксильного диполя аминокислот с ДНК изучено влияние глицина на термостабильность и конформацию ДНК методами спектрофотометрического термического плавления и кругового дихроизма (КД). Проведено сравнение взаимодействия с ДНК диполя из амино- и карбоксилат-ионов глицина с диссоциируемыми в воде амино- и карбоксилат-ионами в случае аммония ацетата. Для устранения влияния примесей двухвалентных ионо; металлов все препараты тщательно очищали, а содержание примесных ионов определяли методом атомной абсорбционной спектроскопии. Концентрационные зависимости влияния глицина на температуру плавленш (бТш) и температурный интервал плавления (ДТ) ДНК в системе ДНК-глицин при разных концентрациях NaCl и Na-цитрата представлены на рис.4. Изменений в спектрах КД ДНК под влиянием глицина до кон-

¡траций равных 1 И не было обнаружено. При низких ионных силах ■4

М ЫаС1 и На-цитрата наблюдается стабилизирующее действие щина на ДНК, качественно сходное с влиянием одновалентных ка->нов. В этих условиях получены линейные анаморфозы изменения ( от логарифма концентрации глицина, которые свидетельствуют об :ктростатическом взаимодействии диполей глицина с фосфатными -ппами ДНК. При 10" М ИаС1 и На-цитрата наблюдается двухфазное [яние на температуру плавления ДНК, более ярко выраженное для :1. При концёнтрации глицина 0.2 М наблюдается дестабилизация ¡уктуры ДНК, которая уменьшается при дальнейшем увеличении кои-;трации глицина. Двухфазный характер влияния глицина на термо-.бильность ДНК свидетельствует о двух конкурирующих взаимодей-иях в системе ДНК-глицин: дестабилизирующего и стабилизирующе-Дестабилизирующее действие глицина на ДНК может быть обуслов-о двумя причинами: взаимодействием глицина с основаниями ДНК дноспиральных участках по группам, участвующим в комллементар-! спаривании [32), или вытеснением связанных с фосфатными груп-:и ДНК противоионоо (Асланян, Арутюнян, Бабаян, 1984) . В наших периментах возможность изменений <5Тт, обусловленная вытеснени-примесных двухвалентных ионов, была полностью исключена.

е и м

. м

сз t

¡a¡S .М

,4. Концентрационные зависимости изменения температуры плавле-

5Т„

Тш - T¿ в системе ДНК-глицин при разных концентрациях

L (А) и Na-цитрата (В). А: 1) 10"4 м, 2) Ю-3 М, 3) 5-Ю"3 М, LO-2 М. В: 1) Ю-4 М, 2) 5-10"4 М, 3) 10~3 М, 4) Ю-1 М, концентрационные зависимости изменения температурного интерва-тлавлення ДТ в системе ДНК-глиции при 10"^ М Na-цитрэта (1) и 3 М NaCl (2) .

1ьшекие ширины интервала плавления ЛТ свидетельствует о преиму-гвенной дестабилизации под влиянием глицина С-С пар относитель-1-Т пар (Вегез1еЪзкауа еЬ а1,, 1974). Таким образом, дестабили-

зирующее действие глицина на термостабильность ДНК, наряду с результатами, полученными методом ЯМР и растворимости о взаимодей ствиях между карбоксилат- и амино-ионами с нуклеоэидами, приведенными выше, свидетельствуют о специфическом взаимодействии ка] боксилат- и амино-ионов глицина с гуанином и цитозином, соответ' ственно, в односпиральных участках ДНК в процессе ее плавления. Наряду с этим имеет место стабилизирующее электростатическое в: имодействие аминокарбоксильного диполя глицина с фосфатными гр: пами ДНК и конкурирующее влияние ионов солей на эти взаимодейст:

1.7. Влияние амидной группы аминокислот на термостабильность и конформацию ДНК [30, 32]

Изучено комплексное влияние амидной группы и аминокарбоксиль

го диполя глутамина и изолированной амидной группы акриламида н

-4

тепловую денатурацию и конформацию ДНК при 10 М Ка-цитрата (ри 5). Концентрационная зависимость изменения температуры плавлени 6Т 1 имеет узкий минимум при концентрации 5-10 М. Дальнейшее увеличение концентрации аминокислоты приводит к двухфазному уве

-3

личению 6Тт. В области малых концентраций глутамина до 5-10 н блюдается скачкообразное увеличение ширины температурного интер вала плавления ДТ с последующим монотонным уменьшением к исход» му уровню. Аналогично концентрационной зависимости 6Тт имеется узкий минимум ДТ в изменении положительной полосы в спектре КД ДНК в присутствии глутамина,без изменения ее отрицательной полосы. Для выяснения влияния на ДНК изолированной амидной группы проведены модельные опыты по влиянию акриламида на термостабильность и ко формацию ДНК. Характер концентрационных зависимостей ДНК с глу-тамином и акриламидом в области узкого минимума одинаков. Полож ние и величины минимумов концентрационных зависимостей 6Тт совп дают в обоих случаях. Этот факт свидетельствует о том, что этот эффект для глутамина обусловлен влиянием амидной группы. Деста билизирующее действие амидной группы можно объяснить ее взаимодействием с основаниями в односпиральных участках ДНК с образо ванием двух Н-связей с N1 и И6-Н2 аденина, 02, ИЗ-Н или ИЗ-Н, 0 тимина, 06 Ш-Н гуанина, N3, Ы4-Н2 цитозина (рис.1) . Это объясн ние подтверждается рассмотренными выше результатами по увеличен растворимости пуриновых нуклеозидов и пиримидиновых оснований п влиянием глутамина. Причем, увеличение ¿Т при понижении 6ТШ, и оборот, хорошо коррелирует с данными по растворимости о предпоч тельном взаимодействии амидной группы с А и Т по сравнению с С С. Увеличение термостабильности ДНК при концентрациях глутамина

_3

выше 5'10 М относительно минимального значения может быть обу

влено взаимодействием с фосфатами амилокарбоксильных диполей инокислоты иамидных групп, о чем свидетельствуют данные по ак-ламиду. Полученные данные показывают, что амидная группа белка лжна играть важную роль в узнавании оснований НК и при образо-нии нуклеопротеидных комплексов. Дестабилизирующее действие на ойную спираль ДНК амико- и карбоксилат-ионов и амидных групп >жет использоваться при функционировании белков, "раскрывающих" юйную спираль НК.

О

г,о

0 0,05 0,1 с,М

1 1 «« г 18 ¡> 1 1 |

У 1:1 1Б

I 1 I 111 !<»

0 3,0 с 0 , 3,0 м

Рис.5. Концентрационные зависимости изменения температуры плавления 6ТГО (1) и температурного интервала плавления ДТ (2) ДНК в системах ДНК-глутамин (А) и ДНК-акриламид (В). 10~ М цитрат Иа, рН = 6.45.

Заключение. В работе исследована специфичность взаимодействия а мономерном и мономер-полимерном уровнях между компонентами елков и НК как наиболее простая модельная система белково-нук-еинового узнавания. Этот подход, несмотря на его ограниченность, оэволяет выявить ряд характерных особенностей взаимодействия, оторые реализуются и в реальных системах белково-нуклеинового знавания. При образовании специфических комплексов ряда белков, ■знающих нуклеотидную последовательность в составе двойной спира-;и ДНК, методом рентгеноструктурного анализа показано образована двух специфических Н-связей между боковыми радикалами амино-:ислот и донорно-акцепторными центрами оснований, расположенных г широком желобе ДНК. Например, показано образование двух Н-свя-1ей между гуанидиновой группой аргинина и 06,N7 атомами гуанина I специфическом комплексе эндонуклеазы ЕсоМ (МсС1аг1п et аХ, , .986) и амидной группы глутамина с Иб-Н, N7 аденина в комплексе >епрессора 434 с оперативным участком ДВДАпсЗегетп et а1., 1987) .Наря-

ду с мономерными специфическими взаимодействиями существенную роль в узнавании последовательности нуклеотидов играют мостико вые Н-связи боковых радикалов аминокислот с двумя последователь ными парами оснований. Нет сомнения, что в дальнейшем будут выя лены и другие типы мономерных взаимодействий, рассмотрении в да ной работе, в специфических белково-нуклеиновых комплексах.

ЧАСТЬ 2. ОБРАЗОВАНИЕ И ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ C-H...I ВОДОРОДНЫХ СВЯЗЕЙ В РАСТВОРАХ МЕТИЛИРОВАННЫХ АНАЛОГОВ ОСНОВАНИЙ НК ПО ДАННЫМ ЯМР [18, 25, 29, 39]

2.1. Введение

Макромолекулярная структура, физико-химические свойства и би< логическое функционирование НК определяются внутри- и межмолекулярными взаимодействиями, среди которых существенную роль играют Н-связи между атомами кислорода и азота, типа N-н...О, N-H...N, 0-Н...0 и 0-H...N, Известно, что определенные С-Н группы различных органических соединений образуют слабые Н-связи (Green,1974) например, в системе хлороформ-ацетон. С-Н...О Н-связи обнаружень в кристаллах органических и биологически важных веществ, включая основания НК и их аналоги, с помощью методов рентгеноструктурно-го анализа и диффракции нейтронов (Taylor, Kennard, 1982). Об ос разовании Н-связей свидетельствует существование коротких С-Н...О контактов, которые меньше, чем сумма их Ван-дер-ваальсовых радиу сов.

Признание существенной роли Н-связей, образуемых С-Н группами оснований НК, оказалось необходимым для понимания ряда результатов по биосинтезу НК, изложенных в следующих главах этой работы В связи с этим мы провели экспериментальное и теоретическое изучение образования С-Н...О Н-связей при самоассоциации и взаимодействии с растворителем метилированных аналогов урацила*. 1,3-ди

13 13 6

метилурацила (га2' Ura) 1,3,6-триметилурацила (ш^' ' ига), 1,3-ди

метилтимина (m^ < ^Thy) и кофеина. Эти аналоги удобны для исследования С-Н...О Н-связей, поскольку они не образуют обычные для ос нований НК N-Н...О или N-H...N Н-связи. Для них образование Н--связей возможно только через С-Н группы как доноры протонов.

2.2. Самоассоциация метилированных аналогов урацила и кофеина в хлороформе

Исследованы концентрационные и температурные зависимости спек-

13 13

тров ПМР метилированных производных урацила: ггц' Ura, m_' Thy и 13 6

га,' ' ига и кофеина в хлороформе. С увеличением концентрации 1 3

га ' ига наблюдается смещение сигнала Н-С6 протона в сторону низ-16

?о поля, тогда как положение Н-С5 протона сдвигается лишь яе-хчительно в сторону высокого поля. Сигналы метальных групп так-сдвигаются незначительно. С уменьшением температуры во всей об-:ти концентрационной зависимости происходит сдвиг в низкое по-сигналов Н-С6 больше, чем Н-С5. Одновременно происходит сущест-шый сдвиг в низкое поле сигнала протона примеси CHCl^ в дейте-хлороформе, как при увеличении концентрации m^'^Ura, так и ¡ньшении температуры. Аналогичные зависимости наблюдаются для и Н5 протонов nij'^Thy и Шз'3,6ига и протонов хлороформа.Приданные данные позволяют заключить, что в исследованных раство-: происходит самоассоциация га^' ^Ura и образуется межмолекуляр-t комплекс, стабилизированный Сб -Н...О Н-связью. Образование

:оциатов с С6 -Н...0 Н-связями наблюдается и для mi'^Thy, а в 13 6

■чае га^' ' Ura такая ассоциация отсутствует. Наряду с этим про-

:одит образование С-Н...0 связей между карбонильными кислорода-13 13

т„' Ura, га_' Thy и хлороформом. Го есть происходит конкуренция

13

образование С-Н...0 Н-связей между Сб -Н группами m,' Ura и

3 i

Thy и молекулами хлороформа. Для комплексообразования хлоро-

ма с метилированными производными урацила получены следующие

1 3

модинамические величины: для m,' Ura ДН = -2.4 ккал/М, ДБ = 13

11.6 э.е.; для т.' Ura ДН = -2.1 ккал/М, ДБ = -10.6 э.е.. Ка-

13 13

иеся энтальпии димеризации m2' Ura и п^' Thy равнялись -0.6 л/М и -1.1 ккал/М, соответственно.

1, з

.3. Расчеты энергии взаимодействия для димеров in^ Ura

Для интерпретации полученных данных методом атом-атомных потен-

лов пррведены расчеты величин локальных минимумов энергии взаи-

эйствия и геометрии комплексов, соответствующих разным типам

эров iru'^Ura. Имеется несколько локальных минимумов энергии 13

кмодействия двух m^' Ura молекул в одной плоскости с обра-анием одной С-Н...0 связи между Н6 протоном и 02 или 04, с веяной энергии от -3.9 до -4.1 ккал/М. Б результате расчетов в < минимумах энергии получены сокращенные С-Н.,,0 контакты, со-гтствующие образованию Н-связей. Минимумы для других комплек-в плоскости оснований имеют энергию по абсолютной величине эше, чем с участием С6-Н и не приводят к сокращенным контактам.

,4.Термодинамические характеристики С-Н...0 водородных связей

t:

Сложный характер взаимодействий при больших концентрациях ме-фованных аналогов урацила и кофеина: образование комплексов ■Н...0 Н-связями, возможность стэкинга и конкуренция молекул гворителя с этими взаимодействиями затрудняют получение надеж-

ных термодинамических характеристик С-Н...О н-связей. Для устранения влияния межплоскостного взаимодействия были взяты малые пс стоянные концентрации аналогов оснований. Чтобы свести к минимьго конкурирующее взаимодействие растворителя, использовали один из наиболее нейтральных растворителей - четыреххлористый углерод. Показано, что при низких концентрациях ш^^ига и кофеина в СС1^

при добавлении ацетона и Ме-БО происходит образование С6 -Н...С 13

связей для т^ ига и С8 -Н...0 связей для кофеина с кислородами ацетона и Ме^О как акцепторами Н-связи (рис.6) . Из концентрационных зависимостей при разных температурах получены константы а!

13 13

социации для комплексов п^' ига-Ме2БО, т2' ига-ацетон, кофеин-

-Ме^О, кофеин -ацетон и их термодинамические параметры (табл.2

Йеличина энтальпии этих комплексов, характеризующая образование

С-Н...0 Н-связей,во всех случаях была равна -2.0 + 0.1 ккал/М.

Рис.6. Концентрационные и температурные зависимости химических сдвигов протонов m^' üra (0.01 М) и кофеина (0.005 М)1 в СС14 в присутствии Me2SO (А) и ацетона (В) в молях. А. m2' Ura: 1) -1°С, 2) 19°С, 3) 37°С, 4) 55"С; В. кофеин; 1) 0°С, 2) 20"С, 3) 40"С, 4) 60°С.

Таблица 2. Константы ассоциации К и термодинамические параметрь комплексов с С-Н...0 водородной связью

ТвС тг'3Ura-Me2SO Т°С кофеин-Me2S0 К Т°С ацетон К Т°С кофеин-ацетон К

-1 2.307 24 1.317 0 0.87 0 0.476

19 1.892 36 1.131 19 0.702 20 0.365

24 1.704 54 0.932 37 0.556 40 0.301

37 1.452 71 0.815 59 0.45 60 0.246

55 1.162

ДН=-1.98+0.05 ДН=-2.07+0.05 ДН=-2.02+0.05 ДН=-1.92+0.05

ккал/М ккал/М ккал/М

ДБ=-5.6+0.2э.е ДБ=-6.2+0.2 э.е. ДБ=-7.7+0.2 э.е.Дв=-8.5+0.2э.<

2.5. Участие карбонильных кислородов в С-Н...0 Н-свяэях

При образовании С-Н...0 Н-связей, как у атома углерода, участ-

ющего в этап связи, так и у карбонильного атома углерода долж-

' происходить уменьшение электронной плотности я смещение в низ-

|е поле ^С резонанса соответствующих ядер (ХкпЪазМ, Куодоки,

>77), Чтобы показать участие кислорода в образованна С-Н...0 Н-

••вязей, сняты спектры ^С в системах ' ^ига-ацегон, кофеин-аце-

>н, га2'3ига-Ме250 к т2'3Пга-хлороформ. В присутствии т2'3ига и

;феина действительно происходит зависящий от концентрации сдвиг

низкое поле резонанса С2 атома карбонильной группы ацетона,тог-

1 как положение резонанса метилькых групп не меняется. При до-

13

лвлении Ие,50 происходит сдвиг в низкое поле резонансов С

у СГга: Сб ~Н > С4 = О > С2 = О в высокое поле С5 -Н и СН3ГЛ.

ги данные свидетельствуит о том, что преобладают комплексы с

б -Н...0 связью, но частично образуются комплексы через СН,

13

руппы Ме2БО с кислородами карбонильных групп га2' ига, причем, реимукественно через С4 = О.

2.6. Расчеты энергии мокмолекулярного взаимодействия ацетона с т^' ''ига к кофеином

Для сравнения с экспериментальными данными и их интерпретации

роведены расчеты энергии межмолекулярных взаимодействий молеку-1.3

:ы ацетона с ига и кофеином в разных взаимных положениях и 'Онск минимумов этой энергии. Расчеты показали, что наиболее глубокие минимумы энергии межмолекулярного взаимодействия ацетона с ¡2'3ига и кофеином в плоскости аналога основания соответствуют узя кофеина С8 -Н...0 Н-свяэи с энергией - 3.5 ккал/М, для 12'3ига Сб -Н...0 Н-связн с энергией -3.4 ккал/М. Кроме того, «;еюгся минимумы, соответствующие контактам двух СН^ групп ацето-1а с кислорода»«! гс^'^ига и кофеина, но с энергиями приблизительно

1а 1 ккал/М меньшими по абсолютной величине. Причем, в соответст-

13

зии с экспериментальными данными по С ЯМР минимум энергии взаимодействия молекулы ацетона с С4 = О на 0.2 ккал/М глубже, чем з случае С2 = О.

2,7. Сравнение экспериментальных и расчетных величин

Поскольку рассчитанные значения энергии молекулярных взаимодействий относятся к вакууму, а экспериментальные величины получены для растворов СНС13 и СС14, их сопоставление может быть сделано путем учета конкурентного влияния растворителя. Приближенную оценку влияния растворителя можно сделать двумя способами. Во-первых, путем введения поправки в расчетные величины электростатичес-

кого вклада с учетом диэлектрической проницаемости среды (еНСС1.

=5, еСС1.=°2.24), Тогда расчетные значения для образования димер<

13 13

и2' ига и комплексов т2' Ога-ацетон, кофеин-ацетон в растворе б!

дут равны -2.3, -2.35, -2.3 ккал/М, соответственно. Экспериментальные значения этих величин соответственно равны -3.0, -2.0 у -1.9 ккал/М. Во втором способе сравнения, с учетом, что энергия контакта С-Н...С1 в СС14 и СНС13 составляет величину около -1*-1

ккал/М (СгаиБЪай , 1972) , вакуумная величина энергии оС

1 3

разования димеров и комплексов п^' ига-ацетон, кофеин-ацетон по экспериментальным данным равна: -4*4.5, -3*-3.4 и -2.9«— З.4ккал/Н в соответствии с расчетными значениями энергии соответствующих комплексов -4.1, -3.4 и -3.5 ккал/М.

2.8. О роли Н-связей, образуемых С-Н группами оснований НК

Прямых данных о возможности образования межмолекулярных Н-свя зей типа С-Н...О в растворах аналогов оснований НК и их термодин. мических характеристик до нашей работы не существовало. Получении е нами результаты свидетельствуют об образовании пуринами С8--Н...0 и пиримидинами С6-Н...О Н-связей в растворах. Преимущественно такие Н-свяэи обнаружены и в ряде кристаллических структур, содержаниях компоненты НК и их аналоги. Энтальпия комплексов с С-Н...О Н-свяэями достаточно велика, поэтому необходимо их учитывать при изучении внутри и межмолекулярных взаимодействий НК и нуклеотидов, их конформационного поведения и биологического функци онирования. Такие связи, как С-Н...0 и С-Н...И, возможно играют существенную роль в процессах молекулярного узнавания. Образована ем таких связей можно объяснить дополнительную стабилизацию ряда ошибочных пар оснований НК в обычной таутомерной форме [ 9,15,17], ошибки при биосинтезе НК с участием алкилированных оснований 120,23], а также включение в полинуклеотидную цепь аналогов нуклеотидов, не образующих обычные Н-связи. Инвариантное положение Сб-Н групп пиримидиновых и С8-Н групп пуриновых оснований в структуре двойной спирали НК и возможность образования ими.С-Н...О связей могут быть использованы ферментами для узнавания комплементарной пары нуклеотидов при биосинтезе и репарации НК. Более подробно этот вопрос рассмотрен в следующих частях работы.

ЧАСТЬ 3. ФЕРМЕНТ-НУКЛЕОТИДНОЕ УЗНАВАНИЕ ПРИ БИОСИНТЕЗЕ НК ЗЛЛроблема молекулярного узнавания в биологических системах[27,281

Обычно под понятием "узнавание" подразумевают высокую избирательность, специфичность комплексообразования и химического превращения в различных молекулярно-биологических системах. Ряд наи-

более характерных примеров таких систем, интенсивно исследуемых в настоящее время, перечислен ниже: 1) системы фермент-субстратного узнавания, 2) иммунохимические системы взаимодействия антигена с антителом, 3) системы белково-нуклеинового узнавания, 4) узнавание рецепторами лигандов, 5) самоорганизация белковых структур и их надмолекулярных комплексов.

Наряду со специфическими особенностями узнавания в каждой конкретной системе, по-видимому, существуют общие физико-химические механизмы, присущие всем системам молекулярного узнавания. Про- , стое- сравнение различных систем позволяет выявить закономерность, присущую молекулярному узнаванию. Общим элементом в рассмотренных системах узнавания являются белковые макромолекулярные структуры. Это позволяет считать, что именно белковые молекула или их фрагменты, иногда в комплексе с другими биологически важными соединениями, являются универсальными узнающими элементами в молекулярной биологии. Узнаваемыми элементами могут быть практически любые химические соединения, как низкомолекулярные, так и белки и НК или их фрагменты. Следовательно, молекулярно-биологическое узнавание можно определить как Функциональную способность белков различать молекулярные структуры путем избирательного комплексообразо-вания или химического превращения [27).

3.2. Концепция фермент-нуклеотидного узнавания при биосинтезе нуклеиновых кислот 14, 11, 14, 16, 19, 27, 28J

Определяющая роль ферментов в обеспечении высокой степени правильности первичной структуры дак при ее воспроизведении-репликации и при хранении в процессах репарации установлена экспериментально. Средняя частота замен оснований в ДНК in vivo находится -7 —11

в пределах от 10 до 10 ошибочных включений в расчете на пару

нуклеотидов по данным о частотах спонтанных точечных мутаций (Lo-

eb, Kunkel, 1982). Частоты ошибочных включений нуклеотидов при

-4 -7

биосинтезе НК in vitro достигают величин 10 -10 , тогда как

взаимодействие нуклеотида с матрицей по принципу комплементарно-

-1 -2

сти может обеспечить точность линь порядка 10 -10 . Ранее возникновение ошибок при биосинтезе НК объяснялось образованием редких таутомерных форм у оснований НК (Watson, Crick, 1953; Topal, Fresco, 1976), Однако, этим нельзя объяснить образование ошибочных пиримидин-пиримидиновых пар, которые наблюдаются экспериментально. Кроме того, возможна "комплементарная" ошибочная пара С5-А*(син) в обычной таутомерной форме, что должно приводить к высокому уровню ошибок такого типа. В нашей работе [9,14,15] проанализированы способы образования неправильных пар оснований в

обычных таутомерных формах вблизи положений, соответствующих комплементарным па-рам в двойных спиралях НК. Образование таких пар является одним из наиболее вероятных путей нуклеотидных замен-точеч-ного мутагенеза, происходящего при биосинтезе НК. В этих парах происходит образование двух Н-связей типа N-H...N и (или)£)-Н...О или одной N-H...N и дополнительно одной слабой C-H...N или С-Н...О Н-свяэи. Минимумы энергии межмолекулярних взаимодействий в этих парах, рассчитанные методом атом-атомных потенциальных функций, часто соответствует wobble-положению оснований, а ряд минимумов отвечает син-конформации одного из нуклеотидов в паре. Впоследствии было показано (Chuprina, Poltev, 1983), что возможно встраивание таких пар в двойную спираль ДНК и РНК без возникновения сокращенных межатомных расстояний с относительно небольшими искажениями сахаро-фосфатного остова двойной спирали НК. Ряд неправильных пар, например, wobble пары GT и АС и пурин-пуриновые пары с син--конформацией С) одного из нуклеотидов GA* и GG* имеют энергии взаимодействия сопоставимые с комплементарной AT (U) парой. Малая частота ошибок биосинтеза НК in vitro свидетельствует об определяющей роли фермента в отборе правильного нуклеотида при биосинтезе НК. Участие полимераэ в селекции нуклеотидов и обеспечении правильности матричного синтеза НК показано экспериментально. Обнаружены мутанты в структурных генах ДНК-полимераэ, обладающие повышенным и пониженным уровнем мутаций по сравнению с диким типом. Разная точность биосинтеза ДНК разными ферментами из этих штаммов показана в экспериментах in vitro. Этот эффект обусловлен отдельными аминокислотными заменами в определенных специфических местах ДНК-полимеразы (Reha-Krantz, Bessman, 1977; Пирузян, Кобец," Алиха-нян, 1977) . Обнаружены также мутанты по РНК-полимеразе с пониженной точностью синтеза РНК in vitro (Камзолова, Озолинь, 1981¡Blank et al., 1986) .

Роль ферментов в обеспечении правильности репликации и репарации ДНК, а также при ее транскрипции может быть обусловлена их способностью к узнаванию правильных уотсон-криковских А-Т(и)и G-C нуклеотидных пар в составе двуцепочечных НК и возможностью отличить их от неправильных пар. В настоящее время установлено, что это узнавание имеет многостадийный характер, причем, каждая стадия усиливает правильность, дает дополнительное увеличение точности копирования генетической информации. Следует различать по крайней мере три основных типа* 1) механизмы фермент-субстратного узнавания, предотвращающие появление ошибок при синтезе; 2) корректорные механизмы узнавания и исправления ошибок непосредственно при биосинтезе за счет 3'5'-экзонуклеазной активности полиме-

раз или сопутствующих ферментов - proof reading; 3) редакторские механизмы пострепликационного исправления ошибок и повреждений, включающие репарационные механизмы: гликозилазы, эндо- и экзонук-леазы, ферменты репарации ошибочных нуклеотидных пар и т.д.. В дальнейшем мы будем рассматривать узнавание ферментами правильных нуклеотидных пар лишь на первом этапе, хотя не исключено, что и на последующих этапах могут функционировать аналогичные механизмы.

3,3.Механизмы фермент-субстратного узнавания при биосинтезе НК

Чтобы понять механизмы узнавания, необходимо выявить, чем правильные нуклеотидные пары в составе ДНК отличаются от неправильных. В наших работах показано, что правильные нуклеотидные пары отличаются от всех неправильных нуклеотидных пар в обычных тауто-мерных формах наличием в комплементарных парах нуклеотидов инвариантных атомов и групп. Такими инвариантными атомами являются атомы ЫЗ-пуриновых и 02-пиримидиновых оснований, как акцепторные группы для образования Н-связей и С-Н группы в 6 положении пирими-динов и в 8 положении пуринов, способные, как показано выше, образовать слабые Н-связи в качестве гтротон-донорных групп. Именно это положено э основу концепции фермент-нуклеотидного узнавания при биосинтезе НК. Согласно этой концепции взаимодействие фермента с образованием Н-связей по инвариантным положениям правильных нуклеотидных пар, включая инвариантность сахаро-фосфатного остова ДНК, может служить механизмом фермент-нуклеотидного узнавания полимеразами, усиливающими включение правильного и ограничивающим включение неправильного нуклеотида (рис. 7).

I_I

АТ-гтврв

i_I

алл

CG -nspa

Рис.7.Схемы узнавания комплементарных пар оснований НК путем образования Н-связей между узнающим участком фермента и инвариантными атомами N3 пуринов и 02 пиримидинов (X и У) и С8-Н группами пуринов и С6-Н группами пиримидинов (г).

В этом случае узнающий участок фермента, взаимодействующий по инвариантным положениям нуклеотидов, играет роль дополнительной матрицы, которая уменьшает возможность встраивания неправильной нуклеотидной пары в синтезируемую полинуклеотидную цепь. Группы белка, взаимодействующие с инвариантными положениями нуклеотидных пар, целесообразно назвать узнающим центром фермента.

3.4. Стереохимическое усиление специфичности [8, 16, 27]

Матричный способ узнавания, рассмотренный выше, является необходимым, но недостаточным. Наряду с взаимодействием полимераз НК с основаниями должно осуществляться и их взаимодействия с сахаро--фосфатной частью нуклеотида. Оно приводит к селекции при биосинтезе НК дезокси- и рибонуклеотидов. Наличие двух разобщенных мест узнавания по основанию и сахаро-фосфатной части нуклеотида может при определенных условиях приводить к усилению правильности синтеза. Одним из таких условий является взаимодействие правильного нуклеотида сразу с двумя участками узнавания, а ошибочного - только по отдельности с каждым из них. При этом возникает эффект, названный стереохимическим усилением специфичности при узнавании. В случае, когда второй участок узнавания является неспецифическим,ошибки по специфическим группам в одном участке могут "компенсироваться" за счет взаимодействия с неспецифическими группами(рис.8}.

ы о> |с|

Рис.8. Схемы, иллюстрирующие эффект стереохимического усиления специфичности при взаимодействии с двумя изолированными участками (1 и 2) узнающего центра фермента, а) АВС- правильный комплекс. Взаимодействие происходит одновременно с участками 1 и 2 в результате конформационного перехода.Ь) основание ошибочно спаренного нуклеотида взаимодействует только с участком 1. с) сахаро-фосфат-ная часть нуклеотида взаимодействует только с неспецифическим узнающим участком 2.

Существование двух разобщенных участков узнавания требует существования стереохимических "включателей" или "выключателей" взаимодействия, делающих невозможным взаимодействие ошибочных моле-

кул одновременно по двум участкам. В простейшем случае такими "выключателями" взаимодействия могут быть стерические препятствия. Другим, более совершенным и универсальным типом "включателя" взаимодействия является конформационный переход в узнающей молекуле белка и (или) лиганда, срабатывающий только при правильном взаимодействии по специфическим узнаваемым группам. После этого становится доступным для взаимодействия - включается другой участок узнавания. Пороговый характер взаимодействия по принципу включателя ("все или ничего") является характерным признаком кодированного воздействия (Николаев, 1976) . В такой трактовке узнавания проявляется целесообразность биологических структур, обусловленная их естественным отбором в процессе биологической эволюции. Включение взаимодействия может быть обусловлено достаточно большим временем жизни правильного комплекса по специфическому участку узнавания. Оно должно быть больше, чем время, необходимое для конфор-мационного перехода в молекуле белка. В случае неправильного комплекса, когда время жизни этого комплекса меньше времени конформа-ционного перехода, он распадается до того, как включаются дополнительные неспецифические центры узнавания. Узнавание в такой интерпретации - это динамическая комплементарность, возникающая в молекуле белка в результате включения конформациоиного перехода. Такая трактовка близка к гипотезе индуцированного соответствия Кош-ланда при образовании фермент-субстратного комплекса (Koshland, 1958). Однако, отличие связано с выделением того обстоятельства, что оно представляет собой пороговый процесс, происходящий запрограммированным образом, и позволяет усилить специфичность за счет взаимодействия неспецифических групп. Эта трактовка сходна с представлениями, развиваемыми Влюменфельдом и др., о функционирующем ферменте как "машине", с включением конформационного перехода по выделенным степеням свободы (Блюменфельд, 1977).

3.5. Роль фермент-нуклеотидного узнавания в возникновении точечных мутаций

Концепция фермент-нуклеотидного узнавания естественным образом объясняет совокупность экспериментальных данных в области точечного мутагенеза и ошибок матричных синтезов НК in vitro. Так, мутации, приводящие к аминокислотным заменам в области узнающего центра днк-полимераз или вблизи него, делая его менее или более точным, будут приводить к мутаторному или антимутаториому эффектам. Нарушение узнающего центра полимеразы под действием у~излучения (Goddard et al., 1969) или метилирования (Saffhlll, 1974) могут объяснить существенное понижение точности синтеза в этих случаях.

Наличие узнающего центра в полимеразах способно различить и предотвратить частое включение в полинуклеотидную цепь ошибочных пар Т(U)—G или A*-G, энергия межмолекулярного взаимодействия которых близка к энергии комплементарной А-Т(О) пары. Включение пиримидин--пиримидиновых пар объясняется возможностью взаимодействия полиме-разы с 02 атомами пиримидинов в этих парах. На точность синтеза и мутагенез могут оказывать влияние не только воздействия, изменяющие узнающий центр фермента, но и влияющие на комплекс матрица-фермент-субстрат. К таким воздействиям, вероятно, относятся мутагенные эффекты ряда ионов металлов (Sirover, Loeb, 1976; Miyaki et at., 1977) и других соединений. Следует отметить, что механизм включения нуклеотидов в редких таутомерных формах для пурин-пири-мидиновых и пурин-пуриновых ошибочных пар не являются взаимоисключающими, Возможно включение нуклеотида в редкой таутомерной форме, как флюхтуациоиного события, и последующий переход основания в обычную таутомерную форму и наоборот,

3,6. Эвристическая ценность концепции фермент-нуклеотидного узнавания

Помимо объяснения совокупности имеющихся экспериментальных данных концепция фермент-нуклеотидного узнавания предсказывает ряд новых эффектов, доступных экспериментальной проверке. Так, например, аналоги нуклеотидов с замещениями в положениях, соответствующих N3 пуринов и 02 пиримидинов, но сохраняющие возможность комплементарного спаривания,должны обладать биологической активностью. Они должны за счет более слабого взаимодействия с узнающим центром полимаразы хуже включаться, ингибировать процесс и вызывать большее число ошибок при биосинтезе НК. Это предсказание экспериментально подтверждено. Установлено, что 3-дезазагуанин ингибиру-ет опухолевый рост. Причем, цитотоксическое действие этого аналога на раковые клетки связано с включением его в НК и ингибировани-ем биосинтеза ДНК (Pieper et at., 1986; Kennedy, Mandel, 1988), Другим предсказанием концепции является возможность ингибирования полимераэных реакций путем нарушения фермент-нуклеотидного узнавания рядом лигандов [22].

ЧАСТЬ 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ УЗНАВАНИЯ СУБСТРАТА РНК-П0ЛИМЕРА30Й E.ooli in vitro С ПСМО!ДЬЮ 8-ЗАМЕЩЕННЫХ АНАЛОГОВ ПУРИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ

4.1. Введение

Ввиду сложности структуры и малой изученности ферментов биосинтеза НК, одним из перспективных подходов к исследованию узнающего центра полимераз и определению химических групп и атомов, вовлеченных в узнавание, является анализ поведения в полимеразных реакциях нуклеотидов, модифицированных по различным положениям. Поведение 8-эамещенных аналогов пуриновых нуклеотидов в РНК-полимераз-ной реакции может служить средством определения двух возможных точечных центров взаимодействия фермента и субстрата. Заместитель в 8-положении делает нуклеотид конформационно ограниченным, препятствуя свободному вращению вокруг гликозидноп связи. Для 8-бром и 8-окси замещенных пуриновых нуклеотидов существуют две разновидности конформеров с син- и анти-ориентацией основания. Для этих аналогов нуклеотидов характерно существенное преобладание син-конфор-мера, в отличие от природных нуклеотидов, существующих почти исключительно в анти-ориентации (Uesugi, Ikehara, 1977). Наличие двух конформеров является структурной основой для проявления 8-эамещен-ными пуриновыми нуклеотидами двойственных свойств. С одной стороны, в случае анти-ориентации эти аналоги могут спариваться с матрицей аналогично природным субстратам и их поведение позволяет выявить возможность взаимодействия с ферментом С-Н группы в 8-положении основания нуклеотида. С другой стороны, в син-конформации при спаривании с нуклеотидом матрицы по хугстиновскому типу следует ожидать проявления этими аналогами свойств пиримидиновых нуклеотидов. В этом случае, согласно концепции фермент-нуклеотидного узнавания, поведение аналога выявляет возможность взаимодействия фермента с N3 атомом природных пуриновых нуклеотидов и инвариантным ему 02 атомом пиримидиновых нуклеотидов в комплементарных ну-клеотидных парах. Поскольку кислород в восьмом положении пуриновых нуклеотидов в син-ориентации занимает их место и может быть акцептором Н-связи. При исследованиях были использованы два подхода. Во-первых, классические методы исследования кинетики ферментативных реакций по включению радиоактивного субстрата в полинуклео-тидный продукт на матрицах ДНК-тимуса теленка и поли [d (AT) d (AT)] и ингибиторный анализ [24, 31, 34, 38]. Во-вторых, исследован абортивный синтез олиго нуклеотидов при неполном наборе субстратов на промоторе AI делеционного мутанта фага Т7ЛМ11 с известной синтезируемой последовательностью нуклеотидов pppApUpCpGpA... .

Эта матрица удобна тем, что абортивный синтез олигонуклеотидов с разделением продуктов методом электрофореза в полиакриламидном геле с разрешением в один нуклеотид, позволяет исследовать возможность конкуренции и замещения аналога нуклеотяда для всех четырех природных субстратов. Для этого случая проведен детальный кинетический анализ синтеза ди- и тринуклеотидов и построены их математические модели [35, 42] .

4.2Лолучение 8-бром- и 8-океи-замещенных производных АТР и GTP

8-бром-производные АТР и GTP и в-окси-GTP получали прямой модификацией соответствующих нуклеотидов. Получение, выделение и очистку проводили по модифицированным нами методикам. Образец 8-окси--АТР синтезирован и любезно предоставлен С.Г.Завгородним, 8-0ром--АТР синтезирован по методике (Ikehara, Uesugi, 1969) , а 8-бром--GTP по методике (Ikehara et al., 1969), Подбор оптимальных концентраций позволил достичь выхода бронированного продукта свыше 90%. Синтез 8-okch-GTP осуществляли по методу (Kasai, Nishimura, 1984), предложенной для получения B-okck-Guo при реакции куклеози-да с аскорбиновой кислотой и HjOj- Непосредственная модификация GTP в 8-okck-GTP с помощью этой реакции дает в оптимальных условиях существенно больший выход продукта, чем для нуклаозкда.Очистку модифицированных нуклеотидов проводили ионообменной хроматографией иа колонках с ДЕАЕ-ссфадексом А-25 и ДЕАЕ—гойоперл 650М в линейном градиенте ТЛС1 прк рН=4.1 ели 3.2. Фракции, соответствующие модифицированному нуклеоткду, засушивали в вакуумном роторном испарителе. Для удаления Li остаток растворяли в растворе спирта с ацетоном 1:1 и осандали аналоги нуклеотидов центрифугированием на холода дззажда. Аналогичным образом очвдалк от примесей все природные нуклсозидтрифосфаты. Выход продуктов в максимуме соответствовал слодуга^им концентрациям L1C1 в случае использования ионообмекника ДЕАЕ-тоВоперл С50И: б-бром-GTP ■ 0,19 М» 5-okch-GTP - 0.17 К; GTP - 0.16 К; OTP - 0.135 К; АТР - 0.105 М; GTP - 0,085 К.

4.3. Поведение 8-бром-АТР и 8-окск-АТР в РНК-полимераэной реакции [ 24, 31, 34 ]

При исследовании влияния 8-бром-АТР на синтез РНК РНК-полимера-зой E.colí на матрице ДНК тимуса теленка было показано, что этот аналог не является полноценным субстратом. При замене любого из четырех природных субстратов на 8-бром-АТР не происходит синтеза пол'инуклеотидного продукта. В присутствии всех природных субстратов 8-бром-АТР ингибирует полимеразиую реакцию, являясь конкурент-

3

ным ингибитором АТР. Использование меченого по тритию[2 HJ-8-

брсм-АТР показало, что аналог включается э РНК при концентрации

сех природных субстратов 0.2 мМ. Это включение описывается урав-

—4 -12

[ением Михаэлиса-Ментен с К^ = 3.6-10 Ни = 5.2-10 М/мин.

»то значение максимальной скорости в 25 раз меньше, а константа [ихаэлиса а 65 раз больше, чем для АТР. Хроматографический анализ (елочного гидролиэата продукта выявил, что 8-бром-АМР включается I середину цепи РНК. При сравнении влияния 8-бром-АТР и 8-окси-АТР на РНК-полимеразный синтез установлено, что 8-окси-АТР являйся в 4,7 раза более эффективным ингибитором реакции, чем 8-бром-■АТР. Абортивный синтез ди- и тринуклеотидов на промоторе AI ДНК 1утанта фага T7ÄD111 в присутствии аналогов показал, что они явля->тся ингибиторами этого синтеза. Причем, 8-окси-АТР подавляет синтез pppApU в 2.9 раза более эффективно, чем 8-бром-АТР. Установле-ю, что ни 8-бром-АТР, ни 8-окси-АТР не могут быть инициаторными :убстратами при синтезе олигонуклеотида. Эти аналоги частично, :ак и природная АТР, существуют в анти-ориентации, но тем не ме-iee, неспособны к инициации синтеза. Этот результат свидетельству-!т о том, что С-Н группа в восьмом положении АТР контролируется >ерментом при инициации синтеза.

Изучена кинетика и проведен детальный кинетический анализ ин--ибирования 8-окси-АТР синтеза динуклеотида рррАрЦ и сопряженно-'о синтеза тринуклеотида pppApUpC на промоторе AI ДНК мутанта фа-'а T7ÜD111 при ограниченном наборе субстратов [35]. В этих услови-IX 8-окси-АТР проявляет свойства конкурентного непродуктивного шалога как АТР, так и СТР. Сравнение констант диссоциации показы-зает, что 8-окси-АТР в 3.3 раза слабее связывается в АТР специфи-геском центре я в 540 раз слабее в СТР специфическом центре, чем зоотзетствующие природные субстраты. С центром связывания UTP 5-окси-АТР не взаимодействует. Таким образом, сохраняется способ-гость 8-окси-АТР х комплексообразованша с матрицей и РНК-полиме-зазой вместо АТР без зключения в продукт реакции. Этот результат юдтэерждает существование контроля со стороны РНК-полимеразы 38-Н группа пуринового нуклеотида в инициаторном центре. Слабое гвязывание в СТР связывающем центре, вероятно, обусловлено wobble гароЯ G-8-окси-АТР (сян), с образованием вместо трех Н-связей в 3-е паре двух С8-0 и N7-H окси-АТР с N1-H и Сб-О GMP и худшим ззаимодействием с узнающим центром РНК-полимеразы.

!.4.Проявление 8-окси GTP субстратных свойств UTP в реакции полину-клеотидного синтеза РНК-полимераэой В, coli на матрице поли [d (AT) d (AT)] [38]

Концепция* фермент-нуклеотидного узнавания предсказывает для

В-окси-GTP в син-ориентации проявление свойств UTP, В этом случае осуществляется как возможность образования неправильной пары А-ок-ch-G(chh) с матрицей, аналогичной комплементарной паре A-U, так и взаимодействие с предполагаемым узнающим центром полимеразы, поскольку атом кислорода в 8-положении окси-GTP в син-ориентации расположен аналогично положению 02 уридина в комплементарной паре ?i-U. В нашей работе впервые показано проявление 8-okch-GTP слабых субстратных свойств UTP в реакции полинуклеотидного синтеза РНК-

-полимеразой E.coli на матрице полк [d (AT) d (AT) J . При замене в ре-

32

акционной смеси UTP на 8-okch-GTP и использовании меченого [а- р}--АТР наблюдается включение метки в полинуклеотидный продукт реакции, тогда как с GTP и 8-6poM-GTP такого включения не происходит.

Уровень включения растет при увеличении концентрации в-окси-GTP,

2+

он значительно выше при 37 °С, чем при 30°С. При замене ионов Mg 2+

на ионы Мп включение 8-okch-GTP в продукт синтеза приблизительно в 2.7 раза выше. Наличие праймера ApU увеличивает уровень

2+ 2+

включения метки еще в 2 раза,как в случае ионов Mg так и Мп 32

При использовании [a- P}-okch-GTP происходит включение его в продукт синтеза вместо UTP, хотя частично он включается и вместо АТР.

Оценочные величины максимальной скорости V_„„ и констант Михаэли-

шах

са Ки показывают, что низкая эффективность включения обусловлена

снижением V , при сравнительно малом влиянии на К .

max m

4.5. Проявление в-окси-GTP неоднозначно субстратно-кодовых

свойств при абортивном синтезе олигонуклеотидов на

промоторе AI мутанта фага Т7ДР111 [41]

Исследовано поведение 8-бром и 8-окси замещенных аналогов GTP а реакции абортивного синтеза олигонуклеотидов РНК-полкмеразой Е.coli на промоторе AI мутанта фага T7AD111 с синтезируемой последовательностью AUCG и CAUCG в случае использования инициатора динуклео-тида СрА. Показано, что 8-6poM-GTP и 8-okch-GTP способны включаться в тетра, пента-нуклеотид вместо GTP. Это включение приводит к терминации дальнейшего синтеза. Возможно, что образованием абортивных продуктов объясняется неспособность этих аналогов полностью замещать GTP при синтезе РНК. Эти данные свидетельствуют также о важной роли инвариантной С8-Н группы гуанина в процессе биосинтеза РНК. в-окси-GTP, в отличие от 8-6pOM-GTP, способен также включаться в олигонуклеотид вмасто UTP при синтезе тетрануклеотида CpApOxyGpC и пенгануклеотида CpApOxyGpCpOxyG (рис, 9), Включение 8-okch-GTP вместо UTP подтверждено щелочным гидролизом тетрануклеотида ихроматографическим анализом продукта. Этот результат объясняется образованием пары А-окси G(chh) (рис. 10). Таким образом,

в соответствии с предсказыванием концепции узнающзго центра и фер-мент-нуклеотидного узнавания при биосинтезе НК 8-okch-GTP проявляет ярко выраженные неоднозначные субстратно-кодовые свойства, замещая как GTP так и UTP при абортивном синтезе олигонуклеотидов. Установлено также, что в-бром-GTP и 8-okch-GTP не способны замещать GTP при инициации синтеза олигонуклеотидов на D-промоторе с синтезируемой последовательностью GUUCG, как и при замене ATP на 8-бром-АТР и 8-окси-АТР на А1 промоторе. Это подтверждает вывод о том, что С8-Н группа пуринового нуклеотида контролируется РНК-по-лимеразой и может быть одним из точечных центров узнавания при -инициации синтеза РНК.

Рис.9. Радиоавтограф геля с продуктами синтеза олигонуклеотидов на промоторе А1 ДНК мутанта фага T7iDlll, инициированным динуклеотидом СрА.

1) замещение UTP на 8-okch-GTP,

2) а-бром-GTP, 3) GTP, 5) замещение GTP на 8-okch-GTP, 6) 8--бром-GTP, 4)нулевое время синтеза при полном наборе субстратов, 7) синтез протяженной цепи РНК при полном наборе субстратов. Все пробы содержали 5 МКМ [а-32Р] СТР и 50 мкМ СрА. Концентрации других субстратов: UTP 80 мкМ (5-8), GTP 1.2 мМ (3,7), 8-okch-GTP 1 ММ (1,5), в-бром-GTP 0.92 мМ (2,6). Соотношение фермент:ДНК равно 20:1. Т=37°С, время синтеза 20 мин.

РНК

CpApdpCprf «а

срярмрс О СрЯрС

CptpWCi".

О

U-»?!CTP

4 s е ? i

Рис.10.Проявление 8-окси--СТР неоднозначных субстратно-кодовых свойств в РНК-полимераэной реакции. Вверху - образование 8-ок-си-СТР в анти-ориентации комплементарной пары с ци-тозином матрицы. Внизу -включение 8-окси-СТР в син--ориентации вместо итр.Образование 8-окси-СТР (син) пары с аденином матрицы, аналогичной комплементарной паре А-и.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Хотя в целом проблема белково-нуклеинового узнавания все еще находится в стадии поисковых исследований, в настоящее время созданы необходимые условия для ее успешного решения в ближайшее время. В последние годы, благодаря успехам генной инженерии, стал доступным для структурных исследований целый ряд белков, осуществляющих функции узнавания НК. С другой стороны, успехи в области олигонуклеотидного синтеза с заранее заданной нуклеотидной последовательностью позволяют исследовать узнавание различных модельных участков ДНК [40]. Продолжается дальнейшее развитие и совершенствование методов исследования, среди которых особенно следует отметить метод ядерного магнитного резонанса. Использование последних достижений в области ЯМР-спектроскопии в сочетании с компьютерными методами расчета ближайших межпротонных расстояний, а также привлечение современных методов конформационного анализа или молекулярной динамики с использованием атом-атомных потенциальных функций, позволяет надеяться на получение деталькой атомио -молекулярной структуры ряда специфических белково-нуклеиновых комплексов в растворах, по степени детальности аналогичной той,ко торую дает метод рентгеноструктурного анализа для кристаллов. Эти результаты позволят детально понять физико-химические механизмы передачи информации от НК к белкам, природу кодов белке:; о-нук леи-нового узнавания и роль конформационных перестроек в этом процессе. Весьма актуальным является продолжение к расширение исследований фермант-нуклеотидного узнавания при биосинтезе НК. Здесь на иЗолее перспектив huí-i в ближайшие года будет модель но-теоретичее-кий подход, позволивший предложить концепцию узнающего центра по лкмераз и узнаваник по инвариантно расположенном атомам к х'рупцак в комплементарных парах иуклеотидов. Существенная роль икьариант-ных атомов и групп N3 к С8-Н пуринов и 02 к С6-Н пиримндкнов з комплементарных парах оснований НК получила экспериментальное под тверждение в данной работе при исследовании поведения 8-бром у. ■8-окси-замещенных аналогов АТР к GTP в РНК-полимеразной реакции. Актуально дальнейшее исследование поведения 8-окси-гуаниловых иу-клеозидов и нуклеотидов при биосинтезе НК in vivo. Образование та ких продуктов происходит под действием ионизирующего излучения или кислородных радикалов. Поэтому проявление 8-окси-гуаниловыми нуклеотидами неоднозначных кодовых субстратно-матричных свойств при биосинтезе НК возможно является одним из путей радиационного, химического и спонтанного мутагенеза и канцерогенеза. Дальнейшее исследование механизмов фермент-нуклеотидного узнавания при био-

янтеэе НК на атомно-молекулярном уровне физико-химическими мето-ами позволит осуществлять целенаправленный поиск новых биологи-ески активных соединений, в том числе конструирование новых ле-арственных средств, действующих на этапах биосинтеза НК и белков.

6. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Проведен анализ возможности узнавания боковыми радикалами минокислот отдельных оснований НК путем образования двух Н-свя-ей для карбоксильной, амидной, гуанидиновой, гидроксильной групп

белково-нуклеиновых комплексах. Показана возможность иэбиратель-зго взаимодействия карбоксилат-иона аспарагиновой и глутаминовой минокислот с Nl-Н и N2-H2 группами гуанина, гуанидиновой группы ргинина с Об, N7 атомами гуанина и 02, N3 атомами цитозина, а чидной и гидроксильной групп со всеми четырьмя основаниями, Экс-ерименталыю исследовано взаимодействие между основаниями НК и арбоксильной, амидной, гуанидиновой и аминогруппой аминокислот и ядом соединений, содержащих эти группы. Для пуриновых нуклеотидоз пиримидиновых оснований показано увеличение растворимости в при-утствии глицина, глутамина, глутамата Na, лизина, аргинина при бразовании комплексов. Определены кажущиеся константы ассоциации омплексов нуклеознд (о снование >-аминокислота. Эти данные демонстри-уют специфическое взаимодействие глутаминовой кислоты и глицина гуанозином, аргинина, лизина и глицина с гуанозином и цитозином, глутамина со всеми основаниями НК. Полученные данные по ксмплек-эобразсванию коррелируют со схемами образования Н-связей между минокислотамн и основаниями НК.

2. Методом протонного магнитного резонанса (¡IMP) исследована лецифцчность взаимодействия в диметилсульфоксиде (Me^SO) между /клеозидами и изобутиратом На - соединением, моделирующим карбок-ильную группу аминокислот, а также триптофаном и триптамином -эединениями, позволяющими вычленить влияние карбоксильной группы, элученные данные доказывают образование двух специфических Н-свя-ей между заряженной корбоксильной группой и Nl-Н и N2-H2 группа-и гуакина. Методом ПМР исследовано взаимодействие глицина и его

- и U-метил производных с основаниями НК. Показано, что метило-ай эфир глицина избирательно взаимодействует с цитозином в раст-эре Me2SO. При этом образуется комплекс, где -NH^ группа Гли-О-Че специфически взаимодействует с 02 и N3 атомами цитозина с од-эвременным образованием Н-связей между карбоксильной группой и 4-Н2 группой цитозина. Сравнение взаимодействия О- и N-метил про— зводных глицина с нуклеозидами в растворе Me2S0:H20 =» 3:1 показы-ает, что они образуют Н-связи с цитозином и гуанином, соотвегст-

венно, и конкурируют за образование гуанин-цитозиновнх пар. При этом Гли-О-Не образует комплекс главным образом с цитозином за счет -Ш^ группы, а Гли-Ы-Ие с гуанином за счет образования Н-свя-зей карбоксилат нона с М1-Н и Ы2-Н2 группами.

3. Исследовано влияние аминокарбокснльного диполя глицина на кривые термического плавления ДНК тимуса теленка при ионных силах от 10~4 до Ю-2 М НаС1 и Иа-цитрата. Особое внимание уделено устранению влияния примесей двухвалентных ионов металла. Полученные данные указывают на сложный характер взаимодействия глицина с ДНК. Глицин в определенных условиях приводит к дестабилизации структура ДНК. Уменьшение температурного интервала плавления &Т и термостабильности ДНК указывают на специфическое взаимодействие глицин/2 с гуанином и цитозином в односпкральных участках ДНК. С другой стороны, при более высоких концентрациях имеет место стабилизирующее действие глицина за счет взаимодействия с фосфатными группами ДНК. Кроме того, наблюдается конкурирующее влияние солей на эти взаимодействия. Глутамин оказывает дестабилизирующее действие на ДНК в узком диапазоне концентраций около 5-10 3 К, а при больших концентрациях увеличивает температуру плавления. Сравнение данных для глутамина и акриламида показывает, что эффект дестабилизации обусловлен амидйой группой. Дестабилизирующее действие амидной группы объясняется образованием К-связей с основаниями ДНК в одно-спиральных участках, а стабилизирующее обусловлено взаимодействием с фосфатными группами ДНК как аминокарбоксилъных, так и амид-ных групп глутамина.

4. Предложен и обоснован механизм стереохимического усиления специфичности при молекулярно-биологическом узнавании и рассмотрена роль белка в этом процессе как усилителя специфичности взаимодействия. Согласно этому механизму^разделение точечных мест узнавания на два разобщенных участка позволяет увеличить правильность комплексообразования. Если второй участок узнавания является неспецифическим, то при определенных условиях происходит компенсация ошибок по специфическому участку за счет неспецифического. Стереохимическое усиление специфичности осуществляется путем включения конформационного перехода в молекуле белка или "субстрата".

5. Предложена и обоснована концепция узнающего центра полиме-раз и фермент-нуклеотидного узнавания при биосинтезе НК как механизма селекции при включении в полинуклеотид комплементарного ну-клеотида. Согласно этой концепции, фермент-нуклеотидное узнавание осуществляется путем образования Н-связей по инвариантным положениям атомов и групп в комплементарных парах нуклеотидов в составе двухспиральных НК. Такими инвариантными атомами являются атомы N3

iy-риновых и 02 пиримидиновых оснований и С-Н группы в 8-положении 1уриновых и 6-положении пиримидиновых оснований, а также состав и <онформация сахаро-фосфатной части нуклеотида.. Группы белка, взаимодействующие с инвариантными положениями нуклеотидных пар, явля-этся узнающим центром фермента. Эта концепция хорошо согласуется 1 объясняет совокупность имеющихся экспериментальных данных и об-тадает эвристической ценностью, предсказывая ряд новых явлений, доступных экспериментальной проверке.

6. Методом ЯМР исследовано образование С-Н...О водородных свя-;ей метилированными производными урацила и кофеином в растворах ipn образовании димеров и взаимодействии с растворителем и получе-ш их термодинамические характеристики. Такие связи образуют С6-Н •руппы метилированных урацилоа и С8-Н группа кофеина. Происходит эбразование С6-Н...0 связей для m^^Ora и С8-Н...0 для кофеина в >астворе четыреххлористого углерода с кислородами ацетона и Me2SO гри добавлении последних. Участие карбонильных групп ацетона как 1кцепторов Н-связи показано методом ^С-магнитного резонанса. По-гучены константы ассоциации для комплексов m^'^Ura-Me2SO, та^'^^га-•ацетон, кофенн-Ме230, кофеин-ацетон при разных температурах. Ве-мчина энтальпии комплексов во всех случаях равна -2.0 + 0.1ккал/ моль. Расчеты методом атом-атомных потенциалов показали, что наиболее глубокие минимумы энергии межмолекулярного взаимодействия цетона с m^'^ra н кофеином в плоскости аналога основания соот-етствуют для кофеина С8-Н...0 связи с энергией -3.5 ккал/моль, а ля m2'3°ra С6-Н...0 связи с энергией -3.4 ккал/моль. Приблизи-ельный учет влияния растворителя на образование комплексов с -Н...0 Н-связями дает хорошее соответствие экспериментальных и асчетных величин.

7. С помощью 8-замещенных аналогов пуриновых нуклеотидов (8-бром-АТР, 8-окси-АТР, 8-6poM-GTP, 8-okch-GTP) проведено исследо-ание фермент-нуклеотидного узнавания при биосинтезе РНК РНК-поли-ераэой E.aoli, 8-бром-АТР и 8-окси-АТР не способны включаться место АТР в качестве инициаторного нуклеотида. Это свидетельству-т о возможности узнавания РНК-полимеразой С-Н группы в 8-положе-ии АТР при инициации синтеза. Эти аналоги АТР являются эффектив-ыми ингибиторами синтеза РНК и абортивного синтеза олигонуклеоти-эв. 8-бром-АТР является конкурентным к АТР ингибитором синтеза

НК и в присутствии АТР способен включаться в середину синтеэируе-эй цепи РНК. При абортивном синтезе динуклеотида pppApU и сопря-энном синтезе ди- и тринуклеотида pppApUpC на промоторе А1 ДНК /танта фага T7AD111 при ограниченном наборе субстратов 8-окси-АТР эоявляет свойства конкурентного непродуктивного аналога как АТР,

так и GTP, в то время как с центром связывания UTP 8-окси АТР не взаимодействует.

8. Обнаружено проявление в-окси-GTP субстратных свойств UTP в

реакции полинуклеотидного синтеза РНК-полимеразой E.ooli на матри

32

це поли [4 (AT) d (AT)] при замене UTP на в-окси-GTP. fa Р]-8-окси--GTP включается преимущественно вместо UTP, хотя происходит также его частичное включение вместо АТР, Проведено сравнение поведения 8-бром и 8-окси замещенных аналогов GTP в реакции синтеза олигону клеотидов на промоторе AI мутанта фага Т7Д0111 с синтезируемой по следовательностью AUCG и CAUCG при использовании инициаторного ну клеотида СрА. Показано, что в-окси-GTP и в-бром-GTP способны вклю чаться в тетра- и пента-нуклеогид вместо GTP. В-окси-GTP, в отличие от в-бром-GTP, включается также в олигонуклеотид вместо UTP, проявляя ярко выраженные неоднозначные субстратно-кодовые свойства, в-бром-GTP и в-окси-GTP не способны замещать GTP при инициаци синтеза олигонуклеотидов на D-промоторе с синтезируемой последова тельностью GUUGG... Эти результаты подтверждают вывод о контроле РНК-полимеразой С8-Н группы пуринового нуклеотида при инициации синтеза и узнавании ферментом инвариантных N3 и 02 атомов в комплементарных парах нуклеотидов.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1.Брусков В.И. Применение метода ядерного магнитного резонанса в биологических исследованиях.-Биофизика,1966, т ,11,№1,с.195-205.

2.Брусков В.И. Ядерный магнитный резонанс. В сб."Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот".Москва, "Наука", 1976, под ред. Ю.С.Лазуркина, с. 297-322.

3.Брусков В.И., Климов А.И. Исследование межмолекулярного взаимодействия аденина с аминокислотами в водном растворе.- Биофизика, 1972, т. 17, № 1, с. 151-153.

4.Брусков В.И., Полтев В.И.Узнавание ферментами комплементарных пар азотистых оснований и усиление специфичности взаимодействий в процессах матричного синтеза.- Докл.АН СССР,1974,т.219,й 1, с. 231-234.

5.Брусков В.И., Полтев В.И. Макромолекулярная структура как усиление специфичности в водных растворах.- Биофизика, 1974, т.19 В 6, с. 1095-1096.

6.Брусков В,И. Об узнавании азотистых оснований нуклеиновых кислот аминокислотами и пептидами с помочью водородных связей,-Мол. биол., 1975, т. 9, № 2, с. 304-309,

7.Брусков В.И., Бушуев В.Н. Специфичность взаимодействия аргинина и лизина с полинуклеотидами и их компонентами.- Биоорг. химия, 1975, т. 1, № 11, с. 1606-1615,

8.Брусков В.И. Стереохимическое усиление специфичности в биологических системах узнавания,- Биофизика,1976, т.21, »5, с,812-816

9.Полтев В.И., Брусков В,И. О молекулярных механизмах спонтанных трансверсий и транзиций,- Мол.биол.,1977,т.11, №3, с. 661-670.

10.Брусков В.И., Бушуев В.Н. Исследование методом протонного магнитного резонанса комплексообразования между нуклеоэидами и сое динениями, моделирующими аминокислотные остатки белков в диме-тилсульфоксиде.- Биофизика, 1977, т.22, »1, с. 26-31.

L1.Брус,ков В.И.,Полтев В.И. Роль ферментов в обеспечении точности матричных синтезов нуклеиновых кислот. В сб."Надежность клеток и тканей".Киев,"Наукова думка".1980,под ред.Д.М.Гродзинского,с.71-76.

L2.Брусков В.И., Полозов Р.В., Полтев В.И. О роли неспецифического комплексообразования в белково-нуклеиновом узнавании.- Биофизика, 1978, т. 23, №4, с. 610-613.

L3.Bruskov V,I. Specificity of interaction of nucleic acid bases with hydrogen bond forming amino acids.- Studia biophys., 1978, v. 67, S. 43-44 und Microfiche 2/27-34.

L4.Poltev V.I., Bruskov V.I. Contribution of specific DNA enzyme Interactions to fidelity of template directed nucleic acid biosynthesis.- Studia biophys., 1978, v, 67, S, 45-46.

15.Poltev V.I., Bruskov V.I. On molecular mechanisms of nucleic acid synthesis. Fidelity aspects. 1. Contribution of base interaction.- J.Theor. Biol., 1978, v. 70, p. 69-83.

.6.Bruskov V.I., Poltev V.I. On molecular mechanisms of nucleic acid synthesis.Fidelity aspects. 2.Contribution of protein-nuc-leotlde recognition.- J.Theor.Biol., 1979, v.78, p. 29-41.

17.Полтев В.И., Шулюпина Н.В., Брусков В.И. О молекулярных механизмах мутаций, индуцированных 2-аминопурином и 2,6-диаминопурином.-Мол. биол., 1979, т. 13, № 4, с. 822-828.

L8.Брусков В.И., Бушуев В.М., Полтев В.И. Исследование методом ядерного магнитного резонанса водородных связей типа С-Н...0 в аналогах оснований нуклеиновых кислот.-Мол.биол.,1980,т.14, № 2, с. 316-322.

L9.Брусков В.И.,Полтев В.И.Роль ферментов синтеза и репарации нуклеиновых кислот в мутагенезе.- В сб."Генетические последствия загрязнений окружающей среды",Вып.3,Москва,1980.Под ред. Н.П.Дубинина, с. 214-217.

!0.Poltev V.I.,Shulypina N.v.,Bruskov V.I.Molecular mechanisms of alkylation-induced transcription errors.Contribution of base-base interaction and protein-nucleotide recognition.- Studia biophys., 1980, v. 79, S. 45-46.

!1,Bruskov V.I.,Poltev V.I.Enzyme-nucleotide recognition in biosynthesis of nucleic acids.- Studia biophys.,1980,v.81,2/3,S.117-118.

>2.Брусков В.И.,Коробов В.И.,Полтев В.И. О молекулярных механизмах, обеспечивающих точность биосинтеза и репарации нуклеиновых кислот. Ингибирование полимераэных реакций путем нарушения белково--нуклеотидного узнавания,- В сб.: Повреждение и репарация ДНК. /Под ред. А.И.Гаэиева. НЦБИ, Пущине, 1980, с. 43-48.

!3.Полтев В.И.,Шулюпина Н.В.,Брусков В.И.Молекулярные механизмы ошибок биосинтеза нуклеиновых кислот,индуцированных алкилировани-ем азотистых оснований,- Мол.биол.,1981, т.15, №6, с.1286-1294.

!4.Bruskov V.I.,Grumbkova L.0.,Kuryavy V.V.Recognition of 8-bromo--ATP in the RNA-polymerase reaction.- Studia biophys.,1982, v. 87, S. 173-174.

!5.Bruskov V.I.,Bushuev V.N.,Poltev V.I. С-Н...0 hydrogen bonds in analogs of nucleic acid bases,- Studia biophys,, 1982, v, 87, 2/3, S. 245-246,

16.Poltev V.I., Chuprlna V.P., Shulyupina N.V., Bruskov V.I, Simulation of structure and functioning of nucelic acids by means of atom-atom potential functions,- Studia biophys.,1982,v,87, 2/3, S. 247-248.

!7.Брусков В.И. Проблема узнавания в молекулярной биологии,- Препринт, НЦБИ, Пущино, 1983, 19 с.

18.Брусков В.И. Механизмы узнавания при биосинтезе и репарации ДНК. - В сб.: Структурно-функциональные аспекты репликации и репарации ДНК. Под ред. А.И.Газиева, НЦБИ, Пущино, 1983, с. 90-101.

!9.Брусков В.И., Окон М.С. Термодинамические характеристики С-Н ...О водородных связей, образуемых аналогами оснований нуклеиновых кислот.- Докл.АН СССР, 1984, т.277, №6, с. 1482-1486.

30.Smolyaninova Т.I., Bruskov V.I. Investigation of interactions of amide and amino-carboxylate groups of amino acids with DNA in connection with the problem of nucleoprotein complexes.- Studia biophys., 1984, v. 101, S. 53-54.

31.Kuryavy V.V., Bruskov V.I. Effect of 8-bromo-ATP on RNA synthesis by Escherichia coli RNA-polymerase in vitro.-Studia biophys. 1984, v. 101, S. 165-166.

32.Смолянинова Т.И., Брусков В.И., Кашпарова Е.В. Модельные исследования ДНК-белковых взаимодействий. 1. Влияние аминокарбоксиль-ной и амидной групп аминокислот на термостабильность и конформа-цию ДНК,- Мол. биол., 1985, т. 19, с. 992-1000.

33.Микельсаар Р.Х.Н., Брусков В.И., Полтев В.И. Новые прецизионные атомно-молекулярные модели. Информационный материал. НЦБИ, Пувди-но, 1985, 40 с.

34..Курявый В.В., Брусков В.И. Влияние 8-Вг-АТР и 8-Оху-АТР на синтез РНК-полимеразой Escherichia coli.- Биохимия, 19 87, т. 52, В 1, с. 138-142.

35.Курявый В.В., Брусков В.И. Кинетика ингибирования 8-окси-АТР синтеза динуклеотида pppApU РНК-полимеразой Escherichia coli на промоторе А1 ДНК фага T7iDlll в условиях сопряженного синтеза ди- и тринуклеотида и ограниченного набора субстратов.- Мол. биол., 1987, т. 21, № 2, с. 462-471.

36.Bruskov V.I., Smoljaninova T.I. Features of glycine interaction with DNA as revealed by spectrophotometry thermal melting and nuclear magnetic resonance.- Studia biophys., 1987, v. 121,

N 2, p. 111-124.

37.Брусков В.И., Кутышенко В.П. Специфичность взаимодействия глицина и его метилпроизводных с основаниями нуклеиновых кислот по данным ядерного магнитного резонанса.- Биополим. и клетка,1987, т. 3, № 6, с. 294-301.

38.Брусков В.И., Куклина О.В. Проявление 8-окси-СТР субстратных свойств игр в реакции полинуклеотидного синтеза РНК-полимераэой Escherichia coli на матрице поли [d (AT) d (AT)] .- Мол. биол., 1988, т. 22, В 3, с. 726-730.

39.Bruskov V.I., Bushuev V.N., Okon M.S., Shulyupina N.V., Poltev V.I. C-H...О hydrogen bonding in solutions of methylated nucleic acid base analogs as revealed by NMR.- Biopolymers, 1989, v.28, N 2, p. 589-604.

40.Курочкин А.В., Чернов Б.К,, Кирпичников М.П., Кутышенко В.П., Брусков В.И. Полное отнесение сигналов в 1Д и 2Д ЯМР-спект-рах 17-членного олигонуклеотида - модельного симметричного аналога X-операторов,- Мол. биол., 1989, т. 23, № 1, с. 135-152.

41.Брусков В.И,, Курявый В.В., Усачева A.M. Неоднозначность субстратно-кодовых свойств 8-окси—GTP в реакции синтеза олигонуклео-тидов РНК-полимеразой Escherichia coli на матрице ДНК-мутанта фага T7AD111.- Докл. АН СССР, 1989, т. 307, В 1, с. 243-246.

42.Курявый В.В., Усачева A.M., Брусков В.И. Кинетика ингибирования 8—окси—GTP и в-бром-GTP синтеза динуклеотида pppApU РНК-полимеразой Escherichia coli на промоторе А1 ДНК фага T7ADlll при ограниченном наборе субстратов,- Мол. биол,, 1989, т, 23, В 3, с. 822-828.