ДНК/РНК-гидролизующий фрагмент фактора дифференцировки 8,2 кДа клеток линии HL-60 промиелоцитарного лейкоза человека тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ; ИХ РОЛЬ В АПОПТОЗЕ.

1. Проблема белково-нуклеинового узнавания.

1.1. Сайт-специфические ферменты.

1.2. Сайт-неспецифические белки.

2. Исследования молекулярного механизма функционирования нуклеаз.

3. Апоптоз - генетически контролируемая форма клеточной гибели.

4. Роль нуклеаз в апоптозе.

5. Активные формы кислорода (АФК) в апоптозе.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Идентификация фрагмента НЕБЕ, потенциально обладающего ДНК/РНК-гидролизующей активностью.

2. Клонирование кДНК Н1ЮР-8 в хорошо экспрессирующий вектор приводит к подавлению его экспрессии.

3. Определение нуклеотид связывающей способности синтезированных пептидов.

4. Исследование механизма нуклеолитической реакции.

5. Влияние Ни)Р-8 на клетки НЬ-60.

6. Использование поликлональных антител против НЬБР и НЬБР-8 в качестве иммуногистохимических маркеров ранних неопластических процессов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Материалы.

2. Методы.

2.1. Приготовление агарозного геля.

2.2. Выделение плазмидной ДНК Е. coli методом щелочного лизиса.

2.3. Рестрикция и картирование фрагментов ДНК.

2.4. Перенос ДНК на мембрану по методу Саузерна.

2.5. Иммобилизация ДНК из Е. coli на нитроцеллюлозных фильтрах.

2.6. Ник-трансляция ДНК.

2.7. Радиоактивное мечение олигодезоксирибонуклеотидных зондов.

2.8. Блот-гибридизация по Саузерну. Гибридизация in situ бактериальных колоний и фаговых бляшек.

2.9. Выделение ДНК из агарозы.

2.10.Лигировани е.

2.11 .Получение компетентных клеток Е. coli.

2.12.Трансформация компетентных клеток Е. coli.

2.13.Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

2.14.0тбор рекомбинантных клонов с помощью ПЦР.

2.15.Определение нуклеотидных последовательностей по методу Сенгера.

2.16.Продукция гибридного белка в клетках Е. coli В834.

2.17Лизис клеток-продуцентов.

2.18.Анализ продуктов экспрессии.

2.19.0пределение JV-концевых аминокислотных последовательностей.

2.20.Получение поликлональных антител.

2.21.Культивирование клеток HL-60.

2.22.0пределение дифференцирующей активности.

2.23.Синтез и очистка пептидов.

2.24.0пределение нуклеазной активности.

2.25.Частичная апуринизация ДНК плазмиды pSp65.

2.26.Спектр поглощения HLDF-8.

2.27.Хроматографический анализ взаимодействия синтетических пептидов с олигонуклеоти дами.

2.28. Введение флуоресцентных меток.

229.N- Концевой аминокислотный анализ.

2.30.Анализ деградации яДНК клеток HL-60 под действием различных индукторов.

2.31.МТТ-тес т.

2.32.0ценка количества клеток, вступивших в апоптоз с помощью проточного цитофлуориметра.

2.33. Прижизненное окрашивание клеток HL-60.

2.34.Иммуногистохимическое окрашивание клеток HL-60.

2.35.Трансфекция НЫ)Р в клетки НЬ-60 с помощью унифектина.

2.36.Имуногистохимический анализ среза ткани предстательной железы человека.

ВЫВОДЫ.

Поиск новых факторов, останавливающих злокачественный рост опухолевых клеток и вызывающих их дифференцировку, является одной из важнейших задач современной науки. Промиелоцитарная клеточная линия НЬ-60, полученная из крови больного острым лейкозом, является удобной моделью для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе процессов пролиферации и дифференцировки. Под действием различных индукторов клетки этой линии могут дифференцироваться как в моноцит/макрофаги (форболовые эфиры, витамин Бз) так и гранулоциты (ретиноевая кислота, диметилсульфоксид), теряя при этом способность к неограниченному росту [1].

Ранее из среды культивирования клеток НЬ-60, обработанных полностъю-транс-ретиноевой кислотой, нами был выделен и охарактеризован белковый фактор НЫЭР (.М 8,2 кДа), индуцирующий дифференцировку исходных клеток по гранулоцитарному пути и останавливающий их пролиферацию. Молекула НЬБР состоит из 54 а.о. и гликозилирована [2]. При компьютерном поиске в банке данных ЕМВЬ (www.embl-heildelberg.de) обнаружено, что последовательность кДНК НЬОР имеет значительную гомологию с последовательностью кДНК рибосомного белка Б21 (КР821) [3]. Однако никакой гомологии в первичных структурах зрелых белков не наблюдается.

Установление взаимосвязи структуры и функции белка имеет принципиальное значение для понимания молекулярных механизмов его функционирования. Незначительное содержание Ш^Б в клетках линии НЬ-60, а также низкий уровень продукции рекомбинантного белка в прокариотических системах затрудняют его структурно-функциональные исследования.

Перспективным подходом для изучения белков с низким уровнем экспрессии соответствующих генов является идентификация и детальное исследование сравнительно коротких фрагментов, обладающих биологической активностью, коим и является ДНК/РНК- гидролизующий фрагмент НЫЖ

Данная работа является частью структурно-функциональных исследований, проводимых в лаборатории белков гормональной регуляции ИБХ им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН по изучению эндогенного фактора дифференцировки клеток промиелоцитарного лейкоза человека линии НЬ-60 (НЬБР). Цель работы состояла в идентификации фрагмента НГЛЭР, потенциально обладающего ДНК/РНК-гидролизующей активностью, изучении свойств его синтетического аналога и возможной роли исследуемой аминокислотной последовательности в функционировании фактора дифференцировки.

Автор выражает глубокую признательность своим научным руководителям чл.-корр. РАН В.М. Липкину и к. х. н. И.А. Костанян за постоянное внимание к этой работе, ценные советы и поддержку.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ; ИХ РОЛЬ В АПОПТОЗЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

ПРОБЛЕМА БЕЛКОВО-НУКЛЕИНОВОГО УЗНАВАНИЯ

Белково-нуклеиновые взаимодействия лежат в основе большого числа фундаментальных процессов, протекающих в живой клетке, включая репликацию, рекомбинацию, расщепление рестриктазами, транскрипцию и трансляцию. Поэтому понимание природы и механизмов белково-нуклеиновых взаимодействий имеет первостепенное значение.

В настоящее время принято классифицировать взаимодействия белок -нуклеиновая кислота на специфические и неспецифические на основании

13 3 1 констант связывания, значения которых варьируют от 10 до 10 М" [4].

Такие белки как репрессоры, активаторы транскрипции, эндонуклеазы рестрикции, аминоацил-тРНК-синтетазы, ряд рибосомных белков проявляют экстремально высокое сродство к определенным нуклеиновым кислотам и способны узнавать специфические нуклеотидные последовательности, содержащие от 5 до 20 нуклеотидных звеньев. Эта группа белков и ферментов получила название «сайт-специфических». В комплексообразование протяженных РНК и ДНК с сайт-специфическими ферментами вовлечены, как правило, не все нуклеотидные звенья: узнавание основано преимущественно на образовании сильных контактов ферментов с отдельными структурными элементами или отдельными нуклеотидными звеньями специфических последовательностей [5].

К группе белков, образующих неспецифические комплексы с нуклеиновыми кислотами относятся белки, участвующие в процессах репликации и транскрипции (ДНК- и РНК- полимеразы), денатурации и ренатурации нуклеиновых кислот (ДНК- и РНК- геликазы), ферменты репарации, гистоны, белки, связывающие одноцепочечные ДНК, а так же ряд структурных белков Образование неспецифических комплексов характеризуется константами о / 1 связывания в интервале 1(Г - 10° М"\ Белки этой группы с большой эффективностью узнают определенные нуклеотидные последовательности, но по мере протекания процесса функционирования проявляют низкую специфичность (или не имеют ее вовсе), поскольку должны передвигаться вдоль молекул нуклеиновых кислот независимо от их первичной структуры. В основе белково-нуклеиновых взаимодействий двух этих групп лежат как общие, так и различные закономерности. Выявление возможного подобия и различия белково-нуклеинового узнавания этих групп ферментов представляет как чисто научный, так и сугубо практический интерес, поскольку на основании полученных результатов возможно создание новых селективных ингибиторов функционально-важных ферментов прокариот и вирусов.