Белково-инженерные исследования зрительного родопсина: роль отрицательно заряженных аминокислотных остатков трансмембранных доменов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им.М.М.ШЕМЯКИНА

на правах рукописи

ЗВЯГА Татьяна Александровна

БЕЛКОВО-ИНЖЕКЕРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЗРИТЕЛЬНОГО РОДОПСИНА: РОЛЬ ОТРИЦАТЕЛЬНО ЗАРЯЖЕННЫХ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ ТРАНСМЕМЕРАННЫХ ДОЖНОВ

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Пущино - 1991

Работа выполнена в Филиале Ордена Трудового Красного Знамени Института биоорганической химии им.М.М.Шемякина АН СССР

Научный руководитель: кандидат химических наук

С.А.Зозуля

Официальные оппоненты: чл.-корр. АН СССР,

доктор биологических наук М.А. Островский кандидат химических наук Г.С. Монастырская

Ведущая организация: Институт биологической физики

/ АН СССР, г.Пущино

Защита диссертации состоится '

991 г. в Ж

iac.

на заседании специализированного ученого совета Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии им.М.М.Шемякина АН СССР по адресу: 117871, ГСП-7, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им.М.М.Шемякина АН СССР

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

Актуальность проблемы. Зрительный родопсин является одним из дставителей большой семьи сопряженных с G-Селками мембранных рецеп-юв, имеющих сходную'структурно-функциональную организацию. Изучение ¡екулярных механизмов функционирования этих рецепторов и их роли в нсмембранной передаче сигналов является одним из важнейших и интен-яо развивающихся направлений современной биохимии. . Процесс трансмембранной передачи сигналов (световых, гормональ-:, нейромедиаторных и т.п.) рецепторами, сопряженными с G-белками, современным представлениям осуществляется в несколько стадий, вклю-щих:

¡осприятие сигнала молекулой рецептора и его активацию (конформаци-!ую перестройку),

взаимодействие активированного рецептора с гетеротримерным регуля-)ным G-Селком (Gap7) в GDP-форме, в результате которого он переходит жтивную GTP-форму и диссоциирует, освобовдая свою a-субъединицу в плексе с GTP,

ваимодействие активированной а-субъединицы G-белка (Ga»GTP) с моле-юй фермента-эффектора, в результате которого происходит изменение явности этого фермента и соответствующее изменение уровня концент-[ии вторичного посредника в клетке,

¡ызванное изменением концентрации внутриклеточного посредника дальнее развитие биохимических событий в клетке, приводящее, в конечном >ге, к физиологическому ответу на уровне организма.

Зрительный родопсин является одним из наиболее доступных и хорошо :ледованных рецепторов этой семьи, как в отношении его локализации в йране, так и участия в отдельных этапах преобразования рецепторного ■нала. Поэтому он является хорошим модельным объектом, удобным для ■чения детальных механизмов функционирования сопряженных с G-белками [епторов, которые до сих пор остаются не вполне понятными.

Одним из эффективных и популярных в настоящее время приемов, поз-[яющих исследовать механизмы функционирования белков, является метод сгонуклеотид-направленного мутагенеза. Важнейшим моментом в осущест-!нии этого подхода является получение функционально активного реком-[антного белка, то есть, выбор адекватной системы экспрессии. Одной перспективных и удобных является бесклеточная• система трансляции. [ того чтобы с ее помощью получить рекомбинантный белок, в количест-: достаточных для функциональных исследований, необходимо иметь [ыпие количества соответствующей мРНК. Ее получают In vitro с помо-) фаговых РНК-полимераз и специальных плазмидных (фаговых) векторов, [ержащих их промоторы. Одной из наиболее специфичных и эффективных

- г -

является РНК-полимераза бактериофага SP6 Salmonella typhlmurlvm. Од ко процесс получения SP6 РНК-полимеразы из зараженной фагом бактер: льной культуры довольно сложен и.капризен, и не позволяет получ этот фермент в больших количествах с необходимой высокой активность

В связи с этим клонирование гена РНК-полимеразы фага SP6 и соз ние штамма-суперпродуцента, э.того фермента, существенно упрощающее п цессы его наработки и выделения, представляется актуальным для при нения и дальнейшего развития системы экспресс™ белков in vit Кроме того, синтезированные In vitro специфические РНК имеют пшро сферу применения и в других областях молекулярно-биологических исс дований.

Цель работы. Настоящая работа является частью проводимого в им.М.М.Шемякина АН СССР комплексного структурно-функционального исс .дования белков, участвующих в процессах восприятия и преобразова зрительного сигнала.

Целью исследования являлось изучение функциональных свойств тантных форм зрительного родопсина быка, полученных методом олигон леотид-направленного мутагенеза, а также создание штамма-суперпро цента РНК-полимеразы бактериофага SP6 Salmonella typhlmurtvm, необ дамой для осуществления экспрессии рекомбинантного родопсина в бес» точной системе трансляции.

Научная новизна -и практическая ценность работы. Методом оли нуклеотид-направленного мутагенеза получены две мутантные формы j опсина быка, в которых отрицательно заряженные аминокислотные осте Asp83 во втором и G1U134 в третьем трансмембранных доменах заменень незаряженные Авп и Gin, соответственно. Охарактеризована функционЕ ная активность полученных мутантов по их способности стимулирог GTP-азную активность G-белка зрительного каскада - трансдуцина и aï вировать эффекторный фермент - фосфодиэстеразу cGMP.

Показано, что как одна (Asp83->Asn), так и другая (Glu134->C замены существенно не изменяют способности родопсина стимулиро! GTP-азную активность трансдуцина, однако полностью нарушают его спс бность активировать фосфодиэстеразу cGMP.

Осуществлено клонирование гена практически важного фермент ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага SP6 бактерии Salmonella typtiima (SP6 РНК-полимеразы, К.Ф. 2.7.7.6). Сконструирован экспрессионный ] тор pTISIDT и на его основе экспрессируицая плазмида pTISP6, коди] щая термоиндуцибельный синтез SP6 РНК-полимеразы в клетках E.col позволяющая существенно упростить процессы наработки и выделения э1 фермента. Созданный штамм-суперпродуцент позволяет получать неско.

итогов единиц активности фермента с 1л бактериальной культуры.

Публикации. По теме работы опубликовано 6 статей, в том числе 3 в кдународных научных журналах, получено авторское свидетельство на )бретени9. Результаты работы докладывались на Советско - Западаобер-JCKOM симпозиуме "Рецепторы и ионные каналы" (Зап. Берлин, 1989), шозиуме UCLA по молекулярной и клеточной биологии "Передача сигнала жтивация генов при дифференцировке" (США, 1990), на 4-ом Созетско-зманском симпозиуме "Рецепторы и ионные каналы" (Москва, 1991).

Объем работы. Диссертация содержит _ стр. машинописного текста

зостоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экс-

эиментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (_

¡в.). В обзоре литературы рассмотрены работы", посвященные структур-нфушшиональным исследованиям мутантных форм сопряженных с G-белками депторов, полученных белхово-инженершки методами. Обсуждается роль цельных структурных элементов молекул этих рецепторов в их функцио-эовании.

СОДЕРЖАНКЕ РАБОТЫ

I. Создание птамма-суперпродуцента РНК-полимеразы фага SP6 Salmonella typhlrcurluni

Введение. ДНК-зависимая РНК-полимераза фага SP6 S.typhinnirtvm юдит широкое применение в молекулярно-биологических исследованиях, зако ее использование лимитировалось высокой стоимостью, обусловлен-ï сложностью получения зараженной фагом бактериальной биомассы и зким содержанием в ней фермента (8000 е.а.Лг биомассы). Решение эй проблемы состоит в конструировании системы для суперэкспрессии за SP6 РНК-полимеразы в клетках E.coli.

В 1987 г. Котани с соавт. были опубликованы данные о клонировании за SP6 РНК-полимеразы и его экспрессии в клетках E.coli. Однако, у ясанной ими экспрессирущей плазмиды есть ряд недостатков, связанных использованием для контроля синтеза фермента lac-промотора, требую-го для индукции синтеза бежа дорогостоящего вещества - изопропил-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ), и ограничивающего круг возможных аммов-хозяев, которые должны обеспечивать высокий уровень синтеза з-репрвссора.

В связи с тем, что в данной работе экспрессия рекомбинантного ро-исина и его мутантных форм осуществлялась в бесклеточной системе

- А -

трансляции и требовала больших количеств индивидуальной мРНК опсш недоступность необходимых нам количеств SP6 РНК-полимеразы являлг серьезным лимитирующим фактором в осуществлении экспрессии рекомбинг тного родопсина in vitro и его белково-инженерных исследований. Поэт му нами была предпринята попытка, основываясь на данных Котани соавт., клонировать ген SP6 РНК-полимеразы и самостоятельно осущес вить его экспрессию в клетках E.coll, используя для этого экспрессис ный вектор'оригинальной конструкции.

1. Клонирование гена SF6 РНК-полиыеразы.

Клонирование гена SP6 РНК-полимеразы было 'осуществлено по модиЗ щрованной схеме, описанной Котани с соавт. (рис.1)

Рис.1 Схема клонирования гена БР6 РНК-полимеразы.

ДНК фага БР6, выделенная по стандартной методике из зараженны фагом клеток Б ЛурМтиг1т, была расщеплена рестриктазой Н1пс1111. полученной смеси фрагментов выделен фрагмент ДНК размером 6.2 т.п.о внутри которого локализован ген БР6 РНК-полимеразы. Для удален летальных нуклеотидных последовательностей, фланкирующих ген полимер зы и препятствующих его клонированию в составе удобных рестриктн фрагментов, ДНК выделенного Н1п<Ш1 -фрагмента была' обработана экз

шеазой Ва131, в предварительно подобранных контролируемых условиях. ;сь образовавшихся Ва131-фрагментов была лигирована с ДНК плазмидно-вектора рОС18, расщепленной эндонуклеазой рестрикции Smal. Получен-I после лигирования смесь была использована для трансформации компе-1тных клеток Е.соН.

- Отбор рекомбинантных клонов, содержащих интактные 5'- и 3' щевые последовательности гена РНК-ш.лишразы, осуществляли путем »ридизации колоний с двумя радиоактивно меченными олигонуклеотидами. ty из реплик гибридизовали с олигонуклеотидным зондом cl(TAGTACCGCATGAGGAT)-3', комплементарным нуклеотидной последова-ъности, прилегающей к инициирующему кодону полимеразы с 5'-конца, а гую - с зондом 5'-d(CGTATTTGCCIjl¡4Ti4GAAC)-3', комплементарным концевой последовательности гена. ДНК клонов, дающих положитель-гибридизационный сигнал с обоими олигонуклёотидами, далее подвер-ась рестриктному анализу для подтверждения интактности клонировано гена, определения его ориентации и примерного размера клонировано фрагмента. После чего был отбран клон, содержащий фрагмент фаго-ДНК наименьшей длины, и определена нуклеотидная последовательность цевнх участков клонированного фрагмента, содержащего ген полимера-

Таким образом, был получен клон pUSP6, содержащий 60 нуклеотидов, пегапцих к кодирущей последовательности полимеразы с 5'-конца, и зуклеотидов с 3'-конца. Плазмвдная ДНК этого клона была использова-сак источник тена SP6 РНК-полимеразы при конструировании экспресси-дей рекомбинантной плазмиды pTISP6.

2. Конструирование зкспресснонного плазыидвого вектора pTISIDT и зкспрессирукцей плазмиды pTlSPS"!

Для получения плазмиды, кодирущей синтез SP6 РНК-полимеразы в ■ках E.coli, был использован экспрессионный плазмидннй вектор HDT, схема конструирования которого приведена на рис.2А. Вектор 11DT представляет собой "ATG-вектор" для экспрессии эукариотических в в E.coli. Он сконструирован на основе мультикопийного репликона мид серии pUO с деле тированной 1ас~областыо и содержит следущие енты:

со RI/PvuII фрагмент ДНК плазмиды pUC, содержащий область начала икации плазмиды и ген ß-лактамазы (Ыа), определяший устойчивость пициллину;

glll/Pstl фрагмент ДНК фага X с геном термочувствительного репрес-

cl 857 и сильным ранним промотором PR;

- б -

вдц

оо Рг

Л йа

<1657

ЕсоЯ1, Ген

Рв« БрЫ

5' -ОАТСТАТААССАОСТТТТАААТ АТС -3'

3* -АТАТТССТССААААТТТА ТАС ТТАА -5 Вд1Н Е С О КI

синтетический сайт связывания рибосомы

5' -аЛОССССССТААТСЛССССЖСТТТТТТТТСАТС-З' 3' -АССТСТСаСгСССАТТАСТССССССАЛАА/ЛАА-^' Р!Л1 Эры

ш синтетический тешинатор

ш, транскрипции хгр А

Рис.2 Схема конструирования експрессионного вектора рТЮЮТ ( экспрессирующей плазмида рТ1БР6 (В), кодирующей синтез РНК-полимеразы.

BglII/Есо RI синтетический фрагмент, содержащий консенсусный учас-t Шайна-Дальгарно E.aoll и ATG-кодон;

химически синтезированный сильный терминатор транскрипции trp А, энированный в дистальную по отношению к PR промотору часть полилинза.

Экспрессирущая плазмида pTISP6 была получена клонированием n HI/SacI фрагмента плазмиды pUSP6, содержащего полный ген SP6 РНК-шшеразы с его собственным участком Шайна-Дальгарно, в плазмиду IS1DT, расщепленную рестриктазами SacI и Bglll (рис.2В).

Полученная нами экспрессирущая плазмида pTISP6 принципиально личается от экспрессирущей плазмиды pSF6 2, полученной Котани с авт., тем, что она содержит другие регуляторные элементы экспрессии: промотор ?к фага X с геном термочувствительного релрессора cl 857, зволяющего индуцировать синтез белка лишь повышением температуры, и синтетический терминатор транскрипции trp А, позволяющий повысить овень экспрессии клонированных генов и стабилизировать экспрессирую-ю плазмиду.

3. Экспрессия SP6 РНК-полиыеразы в клетках E.coli, ' ее выделение и очистка.

Синтез SP6 РНК-полимеразы в клетках Ксо~11 НВ101, содержащих репрессирующую плазмиду pTISP6, индуцируется повышением температуры с )°С до 37°С(42°С), когда растущая культура достигает оптической плот-)сти A6OO=0.G-0.8 . Выращивание клеток при этой температуре в течение )-60 мин приводит к накоплению в них больших количеств SP6 РНК-злимеразы. По данным лазерной денсйтометрии электрофореграммы образ-эв биомассы РНК-полимераза составляет не менее 10% от тотального бел-з клеток (рис.3).

Выделение фермента и его очистку проводили по стандартной методи-з, описанной в литературе. Она позволяет воспроизводимо получать с эльшим выходом препараты SPG РНК-полимеразы, отвечающие всем разумным ритериям функциональной и физической чистоты. Обычный выход полимера-ы составляет 1-1,5 млн.ед.акт. с 1г бактериальной биомассы.

Таким образом, разработанная нами система экспрессии .SP6 РНК-олимеразы позволяет достичь в два раза более высокого уровня ее син-еза, чем в лучшем из описанных ранее продуцентов (750 тыс.е.а./1 г иомассы). Кроме того, она существенно упрощает получение фермента за ;чет применения для индукции его синтеза повышения температуры, вместо убавления дорогостоящего химического индуктора ШИТ.

Рис.3 Электрофореграмма образц биомассы Е.соИ НВ101/pTISP6 суперпродуцента SP6 РНК-полимера и очищенного препарата фермента. А) E.eoll НВ101 /pTISPö, при 30 (без индукции).

Б) Е. coli НВ101/pTISP6, пос. индукции синтеза полимеразы, 1 ч; при 37 °С.

В) Очищенный препарат SP6'PHK-no. меразы.

Стрелками указаны положеш маркеров молекулярных масс (кДа),

II. Получение иутантных форы зрительного родопсина быка и изучение их функциональных свойств.

Введение. В ИБХ АН СССР при анализе клонотеки кДНК из сетчатв быка были идентифицированы клоны, содержащие частичные последователь ности кДНК копий гена родопсина. Из трех любезно предоставленны Б.Е.Клуклером плазмвдных клонов нами была собрана и секвенирована кДН копия гена родопсина, содержащая.его полную кодирующую последователь ность. В группе белковой инженерии Филиала ИБХ была разработана мето дика экспрессии родопсина в бесклеточной системе трансляции, позволяю щая получать функционально активный рекомбинантшй родопсин, котрацс ляционно встроенный в липосомы из фосфатидилхолина.

1. Экспрессия рекоыбинантного зрительного родопсина In vitro.

В качестве системы экспрессии была использована бесклеточная система трансляции в экстракте из зародышей пшеницы, адаптированная ране( в нашей группе для получения функционально-активного родопсина, ко-трансляционно встроенного в липосомы.

• Матричную РНК опсина, необходимую для этого, получали путем транскрибирования In vitro кДНК-копии его гена. Для этого она была переклонирована в специализированный вектор pGEM2 (Promega) под контролз промотора SP6 РНК-полимеразы (рис.4).

ЛЕВ

— 94

67

43

Поскольку в процессе трансляции нами использовалась "некэпиро-занная" мРНК, то для повышения уровня синтеза опсина in vitro был изменен нуклеотидный контекст инициирующего AUG-кодона. Методом олиго-ауклеотид-направленного мутагенеза были оптимизированы в соответствии з "консенсусом" два нуклеотида в наиболее важных положениях -3(G->A) и ^(A->G) (рис.4А). Кроме того по аналогии с 5'- нетранслируемыми областями наиболее эффективно транслирующихся вирусных мРНК была сконструирована, синтезирована и присоединена к кДНК опсина "идеализирования" 5'-нетранслируемая область (рис.4В). Полученная в результате иазмида pG2S6-I была использована в дальнейшем для получешя мРНК зпсина дикого типа, а также для получения мутантных кДНК копий его тена.

Таким образом в экстракте из зародышей пшеницы был достигнут достаточный для белково-инженерных исследований уровень синтеза рекомби-13нтного опсина, составляющий 35-40 мкг/мл трансляционной смеси. Для юлучения функционально активного рекомбинантного родопсина, встроен-юго в мембраны, синтезированную In vitro опсиновую мРНК транслировали з-присутствии липосом из фосфатидилхолина, в которые многие мембранные 5елки в определенных условиях встраиваются без участия белков аппарата гранслокации. При этом 15-20Ж синтезируемого опсина встраивается в ли-госомы, и не удаляется при отмывке мембран сильно щелочным буфером ;рН 11), что является общепринятым критерием истинной интеграции мем-5ранного белка в липидный бислой. Содержание опсина в липосомах сос-?авля9т более 12% от общего белка, что делает возможным функциональное тестирование рекомбинантного родопсина без его дальнейшей очистки.

На рисунке 5 представлен радиоавтограф электрофореграммы-продук-'ов трансляции опсиновой мРНК дикого типа и мутантов, а также' соответ-:твующего препарата липосом с котрансляционно встроенным опсином. Их >лектрофоретическая подвижность совпадает с таковой химически деглико-¡илированного природного родопсина. Синтезированный in vitro опсин :елективно иммунопреципитируется поликлональными кроличьими антитела и, полученными при иммунизации животных как очищенным природным род-псином, так и коныогатом синтетического додекапептида - SFFEAPQYYLAE 22-33 а.к.о.) - с бычьим сывороточным альбумином.

Синтезированный в бескле.точной системе трансляции и котрансля-донно встроенный в липосомы из фосфатидилхолина рекомбинантный родоп-ин по своим спектральным и функциональным свойствам практически не тличается от природного, что и позволило использовать этот метод экс-рессии для структурно-функциональных исследований зрительного родоп-ина быка методом олигрнуклеотид- направленного мутагенеза.

Есо И

рис-ш

I Есо И,Ват Н1

V

ген опсина

Ват Н1

I

Есо Н1

+4

► ген опсина

СААТТС___ААй ССССССАССС АТв ЛАССОй АОС...

олигонуклеотид-направленный мутагенез.

5'-ССССССААСС АТС САСССС-З'

тЕсО М

тИсо I

СААТТС...ААй ОСССССААССС АТО БАСОСй АСС...

Есо Н1 N00 I

-► ген опоина

Есо И

N00 I

-ААТТ СТТТТТТТТТТАААС САС-3' 3'-СААААААААААТТТССТССТАС-б'

ЭР6 промотор

г "

► СААТАСАССС +1

идеализированная

5'-нетранслируемая область * *

АТй С АССй___

-1

синтетическая идеализированная область

В«шН1 ЕсоШч_[__ ,ПШ111

ЕсоШ

Есо И,Ват Н1

ВатН1

А

Рис.4 Схема оптимизации структуры 5'-нетранслируемой области опсиновой мРНК и получения транскрипционной плазмиды рС2Бб-1.

г д

&РЩ sb*»®

48 —1

№ —. dRh — «Л «• 29 "

з

к

Glo — «о»

Рис.5 Радиоавтограф электрофореграмма (12% SDS-ПААГ) образцов 14С-меченных продуктов трансляции синтезированных in vitro транскрип-тов гена опсина: а) дикий тип, б) мутант D83N, в) мутант E134Q; фракций люто сом с котрансляционно встроенными опсинами: г) дикий тип, д) мутант D83N, е) мутант E134Q;

ж)продуктов совместной трансляции мРНК опсина дикого типа и глобина,

з) то же, что и ж) после иммунопреципитации поликлональными антителами к зрительному родопсину быка, и) то же, что и ж) после иммунопреципитации антителами к синтетическому додекапептиду SPPEAPQY5TLAE. Стрелками показано положение маркеров молекулярных масс (кДа), Glo-глобин, Rh- гликозилированный природный родопсин, dRh.- химически дегликозилированный природный родопсин.

2. Выбор аминокислотных остатков родопсина для мутагенеза.

Чрезвычайно консервативные отрицательно заряженные остатки аспа-рагиновой (глутаминовой) кислоты, расположенные во втором и третьем трансмембранных доменах родопсина и других сопряженных с й-белками рецепторов, давно привлекали внимание исследователей и наводили на мысль об их особой роли в функционировании этих рецепторов.

Первоначально предполагалось, что один из них выполняет роль про-тивоиона протонированного Шиффова основания ретиналя в родопсине или протонированной аминогруппы лигандов адренергических рецепторов. При проверке этой гипотезы рядом исследователей было установлено, что мутантные формы р2 адренергического (Азп79, АбгИЗО) и т, холинергичес-кого (Азп71, Азп122) рецепторов, в которых эти остатки заменены на незаряженные, вопреки ожиданиям, сохраняют нормальную способность связывать свои антагонисты, так же являющиеся протонированными аминами. А аналогичные мутантные формы родопсина (Абп83, Ип134, 1еи134) совершенно нормально регенерируются ретиналем и дают спектры. поглощения, не отличающиеся от такового родопсина дикого типа.

Однако, при исследовании функциональной активности мутантных р, адренергических и m1 холинергических рецепторов оказалось, что способность мутантов активировать эффекторный фермент (аденилатциклазу та фосфолипазу С) либо была существенно нарушена, либо полностью отсутствовала, что свидетельствует о нарушении цеш трансмембранной передач! сигнала. К сожалению, на основании имеющихся данных по свойствам этих мутантов трудно установить на. какой из стадий взаимодействия рецептора с G-белком (или G-белка с эффектором) происходит обрыв этой цепи.

Исследование аналогичных мутантов зрительного родопсина могло бы дать некоторую дополнительную информацию, позволяющую прояснить этот вопрос. Однако, анализ функциональных свойств аналогичных мутантных форм родопсина (Asn83, Gln134, Leu134), полученных тремя грушами ис следователей, был ограничен в основном исследованием их спектральных характеристик. Реконструкцию зрительного каскада усиления с мутантными родопсинами ни одна из групп авторов не проводила, что объясняется методическими особенностями выделения и очистки рекомбинантного родопсина из мембран эукариотических клеток, в которых осуществляется его экспрессия. В связи с этим, способность этих мутантов активировать эффекторный фермент - фосфодиэстеразу cGMP - осталась невыясненной.

Поскольку используемая нами система экспрессии позволяет получать рекомбинантный родопсин, встроенный в лилосомы и не требующий дальнейшей очистки с использованием детергентов, анализ его способности активировать фосфодиэстеразу не сталкивается с принципиальными трудностями.

Поэтому для проверки гипотезы об универсальной роли консервативных отрицательно заряженных остатков второго и третьего трансмембранных доменов в поцессе передачи рецепторного сигнала мы решили исследовать функциональные свойства соответствующих мутантных форм родопсина и выяснить -приведут ли замены остатков Asp83 и Glu134 к потере способности родопсина активировать фосфодиэстеразу cGMP. Заменяя выбранные остатки на незаряженные, мы стремились практически не изменять их стерические параметры, и поэтому остаток Азр83 был заменен на Asn, а G1U134 на Gin. •

3. Олигонуклеотид-направленный мутагенез зрительного родопсина.

Для введения мутации Asp83->Asn был использован 2Ь-членный олиго-нуклеотид следующей структуры: 5'~d(GGCCGTGGCCAACCTGTTCATGGTC)-3' (D83N), для введения мутации Glu134->Gln - 26-членный олигонуклеотид: 5 '-d(TGGCCATCCAGCGCTACGTGGTGGG)-3'(E134Q).

Обе мутации были введены методом дуплексов с брешью, описанным

>ис.6 Общая схема олигонуклеотид-направленного мутагенеза родопсина. R* - дополнительный рестриктный сайт, возникающий при введении мутации (Ball - D83N, Eco47III - E134Q).

Фосс и МакКлайн(рис.6). Для получения линейной формы плазмиды, содер жащей мутируемый ген, ДНК pG2S6-I была обработана рестриктазой Sali, для получения фрагмента с брешью - рестриктазой Sphl. Образующиеся пр Sphl-гидролизе фрагменты длиной 2519 п.о. и 830 п.о. смешивали с лине аризов'анной плазмидной ДНК и мутагенизирущим олигонуклеотидом в мо лярном соотношении 10:10:1:1000, и подвергали денатурации, нагрева смесь в кипящей водяной бане в течение 3 мин. Отжйг проводили, медлен но охлаждая смесь до 30°С в течение 4-6 часов.

Этой смесью трансформировали компетентные клетки E.colí . Поис: мутантных клонов проводили путем гибридизации радиоактивно меченны мутагенизирущих олигонуклеотидов с колониями. Плазмидную ДНК отобран них положительных клонов использовали для повторной трансформации Tori же штамма E.colt. Вторичные положительные клоны отбирали с помощь! рестриктного анализа их плазмидных ДНК. .

Для облегчения процедуры отбора мутантов и подтверждения кнтакт-ности других участков гена, не подвергавшихся мутагенезу, в обоих случаях вводимые нуклеотидные замены (либо мутирующая, либо молчащая приводили к возникновению дополнительного рестриктного сайта: Ball i случае Asp83->Asn и Eco47III в случае Glu134->Gln. В конечных клона] структура мутаций и интактность прилегающих участков гена еще ра: подтверждалась секвенированием по методу Сэнгэра.

4. Изучение влияния мутаций на функциональные свойства родопсина.

Мутантные формы родопсина экспрессировали параллельно с рекомби-нантным опсином дикого типа в абсолютно идентичных условиях в бесклеточной системе трансляции с - котраноляциошшм встраиванием в липссомь из фосфатидилхолина. Уровень экспрессии мутантных форм опсина и эффективность их встраивания в липосомы не отличались от таковых опсиж дикого типа и составляли 35-40 мкг/мл и 15-20%, соответственно. Электрофоретичеекая подвижность продуктов трансляции мутантных опсино-вых мРНК совпадает с таковой рекомбинантного опсина дикого типа i химически дегликозилированного природного родопсина (рис.5).

Поскольку тремя группами исследователей (Кораной с сотр., Де Грипом с сотр. и Натансом) уже-было продемонстрировано, что спектральные свойства мутантов Asn83 и Gln134 ничем не отличаются от таковых родопсина дикого типа, для функциональной характеризации мутантных форм родопсина нами были использованы два других функциональных теста. Первый - исследование светозависимой активации СТРазы трансдуцинЕ родопсином, позволяющий оценить способность родопсина катализировать обмен нуклеогидов на а-субъединице транедуцина, вызывая тем самым

ОВЫШ0НИ8 уровня етРазной активности. Второй - реконструкция зритель-ого каскада усиления, позволяющий исследовать способность .родопсина жтивировать фосфодиэстеразу сОМР, то есть, осуществлять трансмембран-;ую передачу светового сигнала.

Из представленных на рисунке 8 данных видно, что замены консерва-■ивных остатков Азр83 и С1и134 в молекуле родопсина привели к полному гарушеншо его способности активировать фосфодиэстеразу сСМР (Рис.7А), ¡ущественно не изменяя его способности стимулировать СТРазную актив-юсть трансдуцина (Рис.7В).

- родопсин, мкг родопсин, мкг

Рис.7 Зависимость активации фосфодазстеразы сСМР (А) и йТР-азы трансдуцина (В) от количества добавленного, родопсина: природного (1 ), рекомбинантного дикого типа (2), мутанта АзрвЗ-Аэп (3), мутанта 01и134-01п (4). Представленные данные отражают результаты, полученные в пяти независимых экспериментах - кавдый в трех параллельных измерениях (показаны средние значения + стандартное отклонение). Количества рекомбинантных родопсинов определяли по включению радиоактивной аминокислоты (1Д0-Ъеи) в кислотонерастворимуга фракцию.

A) К указанным количествам родопсина добавляли 5 мкг фосфодазстеразы сСМР и 10 мкг трансдуцина в присутствии (1,2,3,4) или в отсутствие (1 *,2*,3*,4») 50 мкМ негидролизуемого аналога ОТР -рЯНррО; инкубировали 20 мин при 4°С, затем добавляли [зН]сйМР до конечной концентрации 1 мМ и инкубировали еще 4 мин при 4«С.

B) К 4 мкг трансдуцина добавляли указанные количества родопсина или соответствующее количество контрольного препарата липосом (О*), реакцию вели в присутствии 10 мкМ [7-32Р]СТР при 25°С в течение 5 мин, на свету. Контрольные препараты инкубировали в тех ¡ке условиях в темноте (такие же величины получаются при добавлении соответствующих количеств контрольных липосом (О*) независимо от освещения).

Полученные нами данные о свойствах мутантных форм родопсин :вполне согласуются с данными, описанными в литературе для аналогична мутантных форм р2-адренорецепгора и ш1мускаринового ацетилхолиновог рецептора. Мутантные формы трех различных рецепторов, сопряженных G-белками, г Asn130 ßAR, AsnT9 ßAR, Asn71 т^СШ, включая получении нами Asn83 Rh и Gln134 Rh,- бесспорно разделяют одно общее свойство практически полное отсутствие -способности активировать эффекторны фермент.

Проведенные нами исследования стимуляции активности фосфодиэсте разы cGMP и СТРазной активности трансдуцина мутантными формами родоп сина Asn83 и Gln1,34, с одной стороны, подтверждают вовлеченность эти остатков в выполнение важнейшей функции рецептора - обеспечение эг-сопряжения с эффекторным ферментом; .а с другой стороны, более нагляд но, чем в случае ßAR, демонстрируют сохранение способности этих мутан тов образовывать тройной комплекс "лиганд-рэцептор-С-белок*СВР" ) катализировать GDP->GTP обмен на Ga, не препятствуя проявлению ei СТРазной активности.

Таким образом, полученные нами данные позволяют сделать предположение, что консервативные отрицательно заряженные остатки Asp/Glu вс втором и третьем трансмембранных доменах сопряженных с G-белкам! рецепторов участвуют в обеспечении дальнейшей способности активированного G-белка в GTP форме взаимодействовать с и/или регулирован активность аффекторного фермента.

ВЫВОДЫ

1. Клонирован ген практически важного фермента - ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага SP6 Salmonella typhlmuriiim. Сконструировав экспрессионный вектор pTISIDT и на его основе экспрессирующая плазмидг pTISP6, позволяющая получать термоиндуцибельную экспрессию SP6 РНК-полимеразы в клетках E.coll. Уровень экспрессии фермента составляет около 10% от общего белка и позволяет получать чистый фермент с выходом 3-5 млн.ед.акт. с одного литра бактериальной культуры.

2. Методом олигонуклеотид-направленного ' мутагенеза получены две мутантные формы зрительного родопсина быка: Asp83->Asn и Glu134->Gln. Осуществлена их экспрессия в бесклеточной системе трансляции и исследованы их функциональные свойства.

.3. Показано, что обе мутации приводят к полному нарушению способности родопсина активировать эффекторный фермент - фосфодиэстеразу cGMP, существенно не изменяя его способности стимулировать GTP-азную активность трансдуцина.

Юновные материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

Зозуля С.А., Гуревич В.В., Шмуклер Е.Е., Наточин М.Ю., Звяга А., Грязнов С.М., Широкова Е.П. Синтез зрительного родопсина в ¡склеточной системе трансляции. I. Влияние структуры синтетичес-)й мРНК зрительного опсина быка на эффективность ее трансляции.-юорган. химия, 1988, т. 14, N 12, с. 1663-1670. , Гуревич В.В., Зозуля С.А., Звяга Т.А., Наточин М.Ю., Широкова .П., Гарновская М.Н., Думлер И.Л., Шмуклер Б.Е., Короткова Н.В. щкциональная активность экспрессированного In vitro зрительного здолсина. - Биол. мембраны, 19Э9, т. 6, N 6, с. 647-649. . Zozulya S.A., Gurevich V.V., Zvyaga H.A., Dumler I.I., Garnovs-aya M.N., Shmukler B.E., Natochln M.Yu., Shirokova E.P., Badalov .R. In vitro synthesis of Visual rhodopsin for a protein englnee-lng study. - Abstracts oi Bilateral Symposium USSR- West Berlin Receptors and ion channels", J.Protein Chemistry, 1989, v. 8, 3, p. 380-382.

. Гуревич B.B., Зозуля С.А., Широкова Е.П., Звяга Т.А., Гарновс-ая H.H., Думлер И.Л., Бадалов П.Р., Наточин М.Ю., Покровская •Д., Шмуклер Б.Е. Синтез зрительного родопсина в бесклеточной истеме трансляции. II. Функциональные свойства рекомбинантного одопсина и его мутантных форм. - Биоорган, химия, 1990, т. 16, 3, с. 303-308.

. Zozulya S.A., Gurerich V.V., Pokrovskaya I.D., Zerf E.P., bükhova T.A., Badalov P.R. Liposome-coupled translation in Uro: a novel approach to functional receptor expression. -bstracts of UCLA Symposium "Signal transduction and gene activa-ion in development", - J.Cellular Biochemistry, 1990, Suppl.UE, i. 169.

i. Zozulya S.A., Gurevich V.V., Zvyaga T.A., Shirokova E.P., lumler I.L., Garnovskaya M.N., Natochin li.Yu., Shmukler B.E., iadalov P.R. Functional expression in vitro of bovine visual •hodopsin. - Protein engineering, 1990, v. 3, N 5, p. 453-458. '. Gurevich V.V., Pokrovskaya I.D., Garnovskaya IJ.N., Dumler I.L., )bukhova T.A., Zerf E.P., Zozulya S.A. Protein engineering study >i the role oi negatively charged residues in II ana III transmem-згапе domains of visual rhodopsin. - 7th International Conference if Young Scientists on Organic and Biological Chemistry, Sofia, 990, Abstracts, p. 125-127.

i. Gurevich V.V., Zozulya S.A., Zerf E.P., Pokrovskaya I.D., Dbukhova T.A., Garnovskaya H.H., Dumler I.L., Rychkova M.P. Visual rhodopsin: amino.acid substitutions Asp83-Asn and Glu134-Лп prevent activation of cGMP phosphodiesterase. - Biomedical Science, 1990, v. 1, N 5, p. 527-530.

3. Gurevich v'.v.', Pokrovskaya I.D., Obukhova T.A. and Zozulya S.A. Preparative in vitro mRNA synthesis using SP6 and T7 RNA polymerases. - Analytical Biochemistry, 1991, V.T95, p.207-213.

10. Zvyaga T.A., Gurevich V.V., Pokrovskaya I.D., Garnovskaya M.N. Dualer I.b., Zerf E.P., Rychkova Ii.P. and Zozulya S.A. Functional studies of visual rhodopsin by means of site-directed mutagenesis. -Abstracts of 4th Sovlet-FRG Symposium on "Receptors and Ion. Channels", Moscow, 1991, p.46-47.

11. Зозуля O.A., Широкова Е.П., Гуревич B.B., Харитонов С.И., Удовиченко И.П., Звяга Г.А., Наточин М.Ю., Бадалов П.Р. Рекомбинаят-ная плазмидная ДНК pTISP6, кодирующая синтез РНК- полимэразы фага SP6 Salmonella typhlmurivm, способ ее конструирования и штамм бактерий Escherichia coll - продуцент РНК-полимеразы фага SP6. -Авторское свидетельство на изобретение N I5473I3, 1989.

25.ГО.91 г. Зап. 3680Р 1Ур.ГСО экз. Уч.-изд.л. 1.0 Отпечатано на ротапринте в ОНИ ПНД АН СССР