Структурные исследования гуанилатциклазы из сетчатки быка тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ЭРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. М.М ШЕМЯКИНА И Ю.А.ОВЧИННИКОВА

Яа правах рукописи

Зубов Дмитрий Витальевич СТРУКТУРНЫЕ ИССВДОВАНИЯ ГУАШЛАТЦШШЗЫ ИЗ СЕТЧАТКИ БЫКА

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ.

АВТОРФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА - 1993

Работа выполнена в Институте Сиоорганической химиии им М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор химических наук, профессор, Н.Г. Абдулаев

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕШЫ: доктор биологических наук Деев С.М. доктор химических наук Ефимов В.А.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Центр биоинженерии РАН.

Защита состоится 23 июня 1993 г. в -4О час. на заседаний специализированного совета Д 002 35 01 по защите диссертаций ва соекание ученой степени доктора наук при Институте им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117871 ГСП Москва-437, ул. 'Миклухо-Маклая, 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан оС«?у< 1993г.

Актуальность проблемы. Одним из важных направлений биоорганической химии является изучение мэхашзмов передачи внешего сигнала внутрь клетки, осуществляющихся с помощью трансмембранных комплексов. К таким комплексам относится система белков зрительного возбуждения, локализованная в фоторецепторных метках. Уникальное свойство зрительной клетки животных генерировать нервный импульс в .ответ на поглощение кванта света уке многие года привлекает внимание исследователей.

Несмотря на достигнутые в последние года большие успехи в изучении молекулярных механизмов фототрансдукции, многие вопросы строения и функций фоторецелторных клеток остаются невыясненными.

Под действием света молекула родопсина претерпевает ряд конформационных перестроек. Эти перестройки изменяют сродство молекулы родопсина к ферментам наружных сегментов палочек сетчатки (НСП). При поглощении энергии кванта света молекула родопсина инициирует процесс фототрансдукции, запуская каскад ферментативных реакций. Последним этапом фототрансдукции является уменьшение концентрации циклического гуанозинш-нофосфата (цГ®), что приводит к закрытию ионных каналов в плазматической мембране. Вследствие этого происходит еб гиперполяризация.

Тесно связаны с процессом фотовозбуждения события, которые происходят в зрительных клетках после прохождения каскада ферментативных реакций, превращающих энергию кванта света в нервный импульс. Возврат в темновое состояние непосредственно сопряжен с активацией синтеза цГМФ. Синтезирующий цГМФ белок -гуанилатциклаза (ГЦ), в различных типах клеток существует в растворимой и мембранносвязанной формах, которые различается по структуре и регуляции. НСП позвоночных содержат мембранную форму ГЦ, которая в отличие от других ГЦ, активируется понижением концентрации Са2*, Несмотря на вахную роль ГЦ в передаче зрительного сигнала, до самого последнего времени было очень мало известно о ГЦ из фэтороцепторных клеток сетчатки. Попытки выделить фермент столкнулись со значительными сложностями, причем к трудностям солюбилизации фермента добавляется крайне высокая нестабильность выделяемых препаратов ГЦ. Вида-

мо, по этим' причинам в литературе имеются многочисленные противоречивые данные по выделению и характеризацш фермента, на основании которых строятся различные версии механизмов регуляции активности ГЦ в фоторецепторных клетках. Цель работы. Настоящая работа является частью исследований, проводимых в лаборатории белков светочувствительных систем по структурно-функциональным исследованиям белков, воовлеченных в метаболизм цГМФ в зрительных клетках.

Целью настоящей работы являся поиск клонов, содержащих фрагменты кДНН и гена гуанилатциклазы из сетчатки быка и определение их нуклеотидной последовательности. Научная новизна и практическая ценность работа. Обнаружена экспрессия мембранной гуанилатциклазы типа ЙС-В в сетчатке быка. Установлена частичная нуклеотидная последовательность кДНК данного фермента длиной 2848 п.о., которой в банке данных ЕМВЬ присвоен регистрационный номер Х66865. Выведенная на основе нуклеотидной частичная аминокислотная последовательность С-концевой и центральной части фермента содержит 869 аминокислотных остатка.

Был клонирован фрагмент гена СС-В длиной 1976 п.о. и изучена его экзон - интронная организация. Показано сходство эйзон - интрояной организации генов ОС-А и СС-В.

Показана высокая степень гомологии гуанилатциклазы из сетчатки быка с ранее известными мембранными формами гуанилат-циклаз и сделано предположение о том, что мембранная топография данного фермента не отличается от других известных представителей семейства мембранных гуанилатциклаз.-

Клонирование и определение нклеотидной последовательности кДНК гуанилатциклазы из сетчатки быка открывает возможность более детального изучения механизмов световой адаптации , происходящих в зрительных клетках позвоночных. Объем работы; диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы ( ссылка).

С0ДЕР1АНИЕ РАБОТЫ. I. Выбор стратегии структурных исследований гуанилатциклазы из

сетчатки быка.

Мембраносвязанная гуанилатциклаза из сетчатки быка (ЕС 4.6.1.2) - это фермент, катализирующий ресинтез цГМФ из ГТФ в процессе темновой адаптации. По сравнению с остальными участниками процесса передачи и амплификации зрительного сигнала, этот фермент наименее хорошо охарактеризован. Это объясняется трудностями, связанными с процессами выделения и очистки этого белка в нативном состоянии.

В связи с тем, что структурные исследования гуанилатциклазы из сетчатки быка методами белковой химии оказались сопряженными со значительными трудностями, было принято решение по поиску структурного гена данного фермента с целью определения его первичной структуры. Данные о первичной структуре гуанилатциклазы, экспрессирущейся в сетчатке крупного рогатого скота, должны пролить свет на решение ряда проблем, связанных с молекулярными механизмами процессов световой адаптации происходящих в зрительных клетках позвоночных.

Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей клонированных ранее мембрааосвязанннх гуанилатциклаз показывает, что в области каталитического домена имеются высокогомологичные участки. Опираясь на эти последовательности и учитывая частоту встречаемости кодонов в клонированных ранее кДНК нескольких белков из сетчатки быка были синтезированы (Быстров Н.С.) олигодезоксирибонуклеотодные зонды: 5'-ТАСААСС-Т^САСАССАТССС^АССССТАСАТССТ-З' (I) и 5'-ТАСТСССТСТТССС^аАСАСС-СТоАССАСССС-З* (II) соответствующие аминокислотным консенсусам YKШ!IGMYШ и УСдаотШРА, соответственно (рис:1).

2. Поиск фрагментов кДНК, кодарущкх гуанилятцкклазу из сетчатки быка в клонотэке яЩК ва основе вектора Л2А?.

Структурные исследования кДНК гуанилатциклазы из сетчад-

ки быка были начаты анализом амплифицированной клонотэни кДНК из сетчатки Сына на основе вектора A.ZAP (Stratagene, США). Клонотека была любезно предоставлена профессором М. Эпплбори из Чикагского университета. кДНК была синтезирована при помощи олиго-dT затравки, обогащена по размеру и клонирована по EcoRI сайту вектора A.ZAP.

(1 ) 523-DVYKVETIGDAYCVAGGIH-541.. .591-KMPRYCLFGMVTLANKFE-610 (2) 469-FVÏK7ETVGDKYMT7SGLP-487...53T-RMPRYCLPGNTVNLTSRTE-556 (3 ) 913-DVYKVEEIGDVïMWSGbP-931... 985-KMPRYCLFGDTVNTASRME-1003

(4) 902-DVYKVEEIGDAYMWSGLP-920.. .973-KMPRÏ0LFGDTVMTASRUE-991

(5) 867-DVYKVEEIGDAYVVASGIiP-885... 938-KMPRYCLFGDTVNTASRUE-956

(6) YKVETIGDAYHV YCItfGDTVNTA

Рис. 1. Сравнение фрагментов аминокислотных последовательностей различных представителей семейства гуанилатциклаз. 1,2 -соответственно аир- субъединицы растворимой гуанилатциклазы из легких быка. 3- GG-A из мозга крысы. 4- GC-B из мозга крысы. 5- GC-C из тонкого кишечника крысы. 6- аминокислотные консенсусы, использованные для синтеза олигонуклеотидных зондов I и II.

В работе использовали один из наиболее часто применяемых методов идентификаций рекомбинантных бактериофагов К - гибридизацию in sut! фаговых бляшек с ДНК-зондами, мечеными Р. Перед гибридизацией проводили амплификацию фагов прямо на нитроцеллюлозных фильтрах. При этом происходит увеличение количества ДНК в бляшке фага, в результате чего радаоавтог-рафичесгагй сигнал от положительных клонов становится более сильным.

С каждой чашки с рассевом библиотеки снимали по две реплики на стерильные нитроцеллюлозные фильтры ВА 85. После амплификации фагов реплики - дубликата подвергали стандартной обработке щелочным лизисом. После высушивания и запекания в вакууме фильтры инкубировали в промывающем растворе для удаления остатков бактерий, а затеи, в предгибридизационном растворе. Следующим этапом является стадия гибридизации с радиоак-

Р i

N £ i i

N

P BN

i u

N S

i 4

A

I

TK

u

E

'III

VI VII

ш ш

V IV

III

а

II

-500 п.о.

Ä.GC30

х-► <-х

;cei I-*•

Ч-х ■*-—х ' *

GCR4. A.GC15

GCP4

х-х-

■*-х ^

>ис.2. Локализация вставок из выделенных клонов на рестрикт-юй карте гу^нилатциклазы и стратегия определения нуклеотидной последовательности. Щ - протеинкиназный домен ГЦ. Щ - ката-гатичесний домен ГЦ. ■ - трансмембранный сегмент ГЦ. ¡ig§ -зедепторный домен ГЦ.Стрелками под фрагментами кДНК показаны управления и протяженность секвенирования. х*- - секвениро-эание по методу Сэнгера; }-v - секвестрование по методу Максама - ПШврга. А - Asel, В - ВаяйГ, В - ScoñI, К - JTpnl, ff -JcoI.P - Pstl, s - Sphl Г - терминатор трансляции. Квадраты [ - VIII обозначают положения нуклеотидных зондов, использовании в работе.

тивно - меченным зондом.

Преимуществом вектора Л,ZAP перед другими аналогичными векторными системами, созданными на основе фага Л, является возможность избежать значительного объема работ связанного с необходимостью моноклонизации искомого рекомбинантного фага. В этой системе имеется возможность проведения процедуры "excision", после чего поиск фрагмента кДНК ведут в виде рекомбинантных фагмид pBluescriptll, что значительно упрощает задачу исследователя. Кроме всего этого, исключаются стадии выделения фаговой ДНК с последующим переклонированием вставок в шгазмидаые вектора для определения их нуклеотидных последовательностей.

После проведения процедуры "excision" "сигналы" рассовали в виде колоний клеток ХЫ Blue, содержащих рекомбинантнне плазмиды pBluesoriptll.

После получения реплик и гибридизации с зондами идентифицировали отдельные клоны, гибридизуквдеся с этими зондами. Клоны использовали для выделения рекомбинантных плазмид. Ре-комбинангные плазмиды выделяли с использованием ионообменных .колонок фирмы Qiagen, в соответствии с рекомендациями изготовителя. Выделенные таким образом плазмиды использовались для определения нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов кДНК.

Нуклеотидаую последовательность вставок определяли по методу Сэнгера на двухдепочечной матрице, с использованием набора Sequenase, version 2.0 (фирма "USB") в соответствии с рекомендациями изготовителя. В качестве радиоактивной метки использовались [a-35S]dATP или [а-33Р]<ШТ. Нуклеотидные последовательности определялись также и . по модифицированному методу Максама-Гилберта (Чувлило и Кравченко 1984). Стратегия определения нуклеотидной последовательности представлена на рис..2.

При помощи зондов I и II был проведен скриннинг олиго-dT затравленной библиотеки кДНК из сетчатки быка в вэторе XZAP. Среди 1,5x1 С? клонов библиотеки было найдено 37, дававших положительные сигналы гибридизации. Определение нуклеотидных

последовательностей вставок нДНК из ряда клонов показало, что один из клонов, названный ЯСС15, содержит вставку, которая кодирует фрагмент мембраносвязанной гуанилатциклазы, имеющей 99% гомологии с гуанилатциклазами типа GC-B из крысы и человека. Длина вставки составила 1047 пэр оснований, причем 223 п.о. принадлежит З'-нетранслируемой области кДНК, а 827 п.о. кодирует 275 ак, которые соответствуют 750-1025 аминокислотным остаткам GC-B крысы и человека. Радиоактивно меченная ник-трансляцией вставка кДНК клона A.GCI5 была использована для отбора среди 37 получепшх клонов тех, которые содержат вставки, кодирующие ГЦ. Так был отобран клон \GC30, длина вставки которого составила 1733 п.о., из них 238 п.о. З'-нет-ранслируемой последовательности кДНК и 1495 п.о. кодирующей области, что соответствует 528-1025 аминокислотам GC-E крысы и человека. Повторный скршшинг этой >.е библиотеки с использованием вставки клона AGCI5 в качестве ник-транслированного зонда позволил выявить еще 18 клонов, которые давали сигнал гибридизации как в "жестких", так и в "мягких" условиях проведения эксперимента. Кроме того, все эти клоны давали сигнал гибридизации с олигонунлеотидннм зондом 5'-AGCGGCGAATGAAGCCC-TTAATCTGTCG-3' (III), синтезированным по структуре 5*~концевой области клона XGC-I5, в которой не наблюдается заметной гомологии меаду аминокислотными последовательностями различных форм гуанилатциклаз. Зонду III соответствует аминокислотный консенсус 555-NHLTHFIGACI-565. Результаты этих гибридизаций позволяют сделать вывод, что вставки кДНК всех этих клонов кодируют фрагменты гуанилатциклазы формы GC-B.

ЕЩе один скриннннг данной библиотеки был проведен при помощи радиоактивно-меченного ник-трьнсляцией фрагмента ЕсоН1 - Sph1 из клона A.GC30 длиной 460 и.о. Этой гибридизацией было отобрано 3 клона, которые входили в число ранее найденных 18™, однако, определение концевых нуклеотидных последовательностей вставок кДНК этих клонов показало, что они идентичны клону ЯССЗО.

3. Создание клонотеки кДНК из сетчатки быка при ношщи рассеянной затравки на основе плазшдного вектора pSP65 и ее скришвшг.

В связи с тем, что в олиго-(Ы затравленной клонотеке не удалось обнаружить ни одного клона, кодирующего N-концевую область фермента, было решенио создать клонотеку с использованием в качестве затравки статистической смеси гекса-дезоксирибонуклеотидтрифосфатов.

3.1. Выделение ыРНК и синтез иДНК.

Нами была проделана стандартная процедура выделения мРНК с использованием на первой стадии обработки измельченных в жидком азоте сетчаток быка буферным раствором на основе хлорида лития и мочевины. Для ингибирования рибонуклеаз и выделения нэдеградированных молекул РНК был использован ванадшгрибонуклеозидный комплекс.

Дальнейшая очистка мРНК проводилась с помощю аффинной хроматографии полученного препарата тотальной РНК на олиго(йТ) целлюлозе. Выделенная после двух циклов хроматографии поли(А+) мРНК составила 3,6% от количества выделенной суммарной РНК, что , сответствует- литературным данным. За нативжстью препаратов РНК в процессе выделения . следили при помощи электрофореза в агарозном геле. Критерием нативности РНК служило наличие недегр.адированных полос, соответствующих I8S и 28S рибосомных РНК. . -

В качестве затравки при синтезе кДНК была использована статистическая смесь гексадезоксирибонуклеотвдтрифосфатов. При синтезе первой цепи кДНК использовали десятикратный весовой .избыток рассеянной затравки по отношению к мРНК. Выход синтеза первой цепи составил 19%.

Продукты синтеза первой и второй цепей анализировали с помощью электрофореза в щелочном агарозном геле. ,

3.2. Создание клонотеки кДНК.

В качестве вектора для клонирования была выбрана плазмида pSP65. В качестве метода клонирования - лигирование по тупым концам. Для этого полученная кДНК обрабатывалась ДНК-полимеразой фага Т4 в присутствии смеси всех четырех дезокси-рибонуклеозидтрифосфатов. ПлазМиднуго ДНК предварительно гидро-лизовали рестриктазой HincII и для уменьшения выхода нереком-бинантных клонов дефосфорилировали. Для снижения вероятности образования при датировании рекомбинантннх молекул со вставками нескольких молекул кДНК, вектор брали в десятикратном весовом избытке. Полученным набором рекомбинантных молекул трансформировали компетентные клетки E.coll штамм HH-I. Выход рекомбинантов составлял обычно 1С? на I мкг кДНК. Количество нерекомбияантных клонов не превышало 10%.

3.3. Поиск фрагментов кДНК гуанилвтциклазы.

Скриншпшг полученой клонотеки кДНК репрезентативностью 4х105 клонов был проведен с использованием в качестве зонда для гибридизации в "жестких" условиях фрагмента EcoRl~Sph.1 длиной 460 п.о. В результате был получен один клон GC4, 5'-конец вставки кДНК которого соответствовал 518 аминокислоте в структурах GC-B крысы и человека. Остальная нуклэотидаая последовательность клона GC4, длиной 603 п.о. полностью совпадала с ранее определенной структурой клона ÀGC30. Иными словами, клон GC4 позволил добавить к ранее определенной структуре клонов MJC15 и XGC30 дополнительно 32 п.о., однако нуклеогидная последовательность этого клона оказалось полезной для подтверждения ранее определенной структуры.

4. Поиск фрагментов кДНК гуанилатцкклазы из сетчатка быка при помощи полимеразноЯ цепной реакции.

4.1. Постановка реакций.

Для прдвижения к 5'- концу структурного гена гуешмат-циклазы била предпринята попытка клонирования данного участка кДНН гуанилатциклазы при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР). С этой целью были синтезированы олигонуклеотидаые зонда 5' -ACGAGGA0AATACTCGGTGAC-3' (IV) и Б' -GO j-jGAGAACGAGATTTGGTG-GAG-3' (V). Зонд IV был синтезирован на основании определенной нуклеотидной последовательности клонов A.GC30 и GCR4. Зонд V был синтезирован на основании известных первичных структур GC-B из крысы и человека. Для этого был выбран один из фрагментов аминокислотной последовательности гуанилатциклаз крысы и человека, содержащий аминокислотные остатки с наименее вырожденными кодонами, соответствующий последовательности 392-AENEIWWI-399. При составлении нуклеотидной последовательности зонда V учитывалась частота встречаемости кодонов в ряде известных на сегодняшний день структурных генов белков из сетчатки быка.

В качестве матрицы для PCR использовали кДНК, полученную при помощи рассеянной затравки. В реакцию брали 1нг кДНК. Подбор температурных условий и составление нуклеотидных последовательностей зондов для проведения реакций амплификации осуществляли суммированием экспериментальных данных и результатов компьютерной обработки данных с применением программ "Oligo" (США, 1990) и "Зонд" (Россия,1992). Реакции амплификации проводились с использованием автоматического программируемого термостата фирмы "Ferteln Elmer Cetus" (США) при следующих параметрах температурного цикла: 15 секунд денатурация при температуре Э5°С, 15 секунд отжиг с праймерами при температуре 50°С и, наконец, непосредственно амплификация, 30 секунд при 72?С. Всего проводилось 30 циклов амплификации. В результате амплификации с зондами IV и V был получен фрагмент кДНК, кодирующий искомую последовательность длиной 564 п.о. (GCP4). После определения нуклеотидной последовательности клона GCP4- были синтезированы олигонуклеотидаые зонды VII и VIII. Зонд VII (5'-AGGAxGGGTСGICСATGTСAAAGG-3') был синтезирован на основании последовательности 5'- концевой области клона GCP4. Зонд VIII (5'-CCTCACTACTICACCATCGA^GG-3') на основании

-ir-

аминокислотных последовательностей GO-B крысы и человека, в соответствии с аминокислотным консенсусом I57-PHYFTIEG-164. При составлении нуклеотидных последовательностей зондов VII и VIII использовался тот зге подход, что и для зондов V и VI. Амплификация проводилась в тех же температурных условиях. В результате амплификации кДНК с использованием зондов VII и VIII бил клонирован фрагмент GCE1 длиной 885 п.о.

4.2. Клонирование амплифицировэншх фрагментов и определение их нуклеотидных последовательностей.

После окончания амплификации реакционные смеси подвергали зкстракцш фенолом и амплифицированная ДНК осаздалась этанолом. Затем фрагменты обрабатывали Т4—полинуклеотид-киназой в присутствии АТФ, вновь переосаждали этанолом и обрабатывали Т4 ДНК-полимэразой в присутствии четырех дезок-синуклеотидтрифосфатов, экстрагировали фенолом и после осавде-ния этанолом клонировали в плазмиду pSF65 по сайту HincII. Отбор клонов, несущих продукты ПЦР синтезированных в реакциях амплификации с использованием зондов IV и V производили при помощи олигонуклеогвда 71 (5'-ATGCAGGCACCAArGAAGCGAGTGAG-ATGG-3'), синтезированного на основании 5'- концевой последовательности клона XGG30. В результате был получен клон GCP4, кодирующей соответствунций фрагмент нДНК фермента. Нуклеотид-ная последовательность клона GCP4 определялась по методу Сэн-гера. Для отбора рекомбинантных плазмид, содержащих продукты ТЦР полученных в реакции с зондами VII и VIII использовали зонд V. В результате был отобран клон GCE1 и определена его нуклеотидная последовательность по методу Сэнгера. Для получения достоверной первичной структура амплифицированных участков КДНК определяли нуклэотидные последовательности аналогичных продуктов полученных в трех независимых реакциях ПЦР.

5. Анализ определенной последовательности кДНК и выведенной аминокислотной последовательности гуанилатциклазы из сетчатки быка.

В результате проведенной работы удалось определить

15Т 160 170

PHYPTIEGVFEALQGSNLSY CCIÜ^CWOrrC^CArCGiGGGAGTCTCTGAGGCCGTGCAGGGCAGOAAOOTCAGTGTA 60

."180 . 190

QHQVYAREPGGPEQATHFIR CAGOACCAGGTGTAÏGCCCGTGAGCCGGGGGGOCCCGAGCAGGCTACCCAOÎTCAÎCCGG 120 200 210 AKGRIVYI CGPLEMLHEI1L GCOAAGGGGCGOATTGTGTACATCTGTGGCOCTCTGGAGATGCTGCATGAGATCCTGCTG 180 220 230

QAQREHLTNGDYVPFYbDVP OAGGCCGAGAGGGAGAACCTGACGAACGGGGACTACGTCTTGTTmCCTGGATGTCTTT 240

240 # * 250

GES1RAGPTRSMGRPWQBNR GGGGAGAGTCTCCGIGCAGGCCCCACACGCTCCATGGGCCGGCCCTGGCAGGATAATCGC 300

260 2T0

TREQAQALREAFQTVL VITY ACCCGGGAACAGGCCOAGGCGCTCAGAGAAGCATTTCAGACGGTATÏGGTCATCACATAC 360 280 290

REPPNPEYQEFQNRLIIRAR CGAGAACCCCCGAATCCTGAGTACGAGGAATTCCAGAATCGTOTTCTGATTAGAGCACGG 420 300 * 310

E DFGVELAPSLMNLIAGCFY GAGGATTTrGGTGTGGAGOTGGCCCCTrCGTTGATGAACCTCATTGGTGGCTGCTTCTAC 480

320 330

DGI1LYAEVLHETIQEGGTR GATGGGATCCTTGTGTATGCCGAAGTCCTGAACGAGACCATACAGGAGGGAGGOACCCGG 540 340 350 *

EDGLRIVEKMQGRRYRGVTG GAAGATGGACTTCGAATTGTTGAGAAGATGCAAGGACGAAGATACCGTGGTGTAACTGGA 600 360 370

LVVMDKNNDRETDÏVLWAMG CTGGTCGTTATGGACAAGAACAATGACCGGGAGAGTGATTTTGTCCTGTGGGCCArGGGA 660

* 380 . _____________390

D L V S G D F Q F AAHYSGAEKQI GACCTGGTTTCCGGGGACTTTCAGGCTGCAGCCCACTACTCGGGAGCCGAGAAGCAGATT 720 400 410

WViTGRPIPWVKGYPPSDNPP ТОГЛСаАСАСОАСОССССАТССССТСССТОААССаССТОССАСССТСССАСААГСССССС 780 420 » 430

OSFDMDDPSCDKTPLSTLAI TGTTCCTÍÍGACATGGAGGAGCGATCCTGTGATAAAACTCCACTTTCAACTCTGGGAATÍ 840 440 450

V A L G Г G I T T IMFGVSSFIIF GTGGOACTGGGCACAGGAAÏCAGCTTCAÏCATGTTTGG'ÎGTTTCCAGCTECCTCATTTTC 900 460 470

RKLMLEKE-LASM1WRIRWEE CGAAAACTGATGCTGGAGAAGGAGCTGGCCAGCATGTÎGTGGCGCATCCGCTGGGAAGAG 960 480 * 490

LQP'GNS ERCHKGAGSRLTLS CTGCAGWCGGCAATTCAGAGCGATGr AGAAGGGTGCAGGCAGTCGCCTCACGCTGÎCG 102(

500 510

LRGSSYGSIJÍTAHGKYQ'1'FA TTGCGGGGATCCAGTTACGGCTGGCTCATGACAGGGCATGGGAAATACCAGATCTTTGCC 1C8(

520 530

NTGHÏKGWYVAIKHVNKKRI AACACCGGTCAGTTCAAGGGAAACGTTGTGGCCArCAAGCATGTGAATAAGMGCGCATO 1140

540 550

ELTRQYbïELKHMRDVQPNH GAGCTGACCCGGCAGGrrCTGTTTGAACTGAAACAmGAGAGATGTTCAGTTTAACCAT 1200

560 . 570

l T HÏIGACIDPPNICIVTEY CTCACTCGCTTCATTGGTGCCTGCATAGACCCTCCCMCATTTGCATTGTCACCGAGTAT 1260

580 590

CPRGS1QDILENDS INLDWM TGTCGTCGTGGGAGTTTACAGGATATTCTGGAAAATGAGAGCATCAACCTGGAGTGGATG 1320 600 610 FRYSLINDLVKGMAFbHNSI TTTCGTTATTCACTCATTAATGACCürGTTAAGGGCATGGGCTETGTCCATAACAGCArr 1380 * 620 630

IASHGSbKSSHCVVDSRFVL ATTGCATCOCATGGGAGTCTCAAGTCCTCAAACTGTGTGGTGGATAGTCGTTTCGTGCTC 1440 640 650

KITDYGLASFRSTAEPDDSH AAAATGACAGACTATGGCCrGGCGÁGGTTCCGArCAACTGCTGAACCrGATGAOAGCCAT, 1500 660 670

AIYAK.XLWTAPEILSGNPbP GCCCTCIATGCOAAGAAGCTGTGGACTGCCGCAGAACTGCTCAGÏGGGAACCCCCTGCCA 1560

680 • 690

TTGMQKADVYSFGIIbQEIA ACCACAGGCATGCAGAAGGCTGATGTGrATAGOTTTGGGATCATGTTACAGGAGATAGCA 1620

700 710

LRSGPPYLEGLDLSPKEIVQ CnCGCAGTGGGCCmCTACTTGGAGGGCCTGGATCTCAGCCCCAAAGAGATTGTCCAG 16S0

720 730

KVRNmQRPYFRPS IDRTQ1N AAGGTCCGAAATGGTGAGCGGCCTTATTTCCGGGGAAGTATTGACCGGAGGCAACTGAAT 1740

740 750

EELVL LMERCWAQDPAERPD GAAGAGCTAGTTTTGCIGATGGAGCGAÎGTTGGGCCCAGGACCCAGCTGAACGACCAGAC 1800

760 770

FGQIKGFIRRPHKEGGT SII TTTGGACAGATTAAGGGCrTCATTCGCCGCTTTAACAAGGAAGGAGGCACGAGTATATTG 1860 780 790

D N1LLRM EQYAKNIEKLVEE GACAACCTCCTGTTGCGCATGGAGCAGTATGCCAACAACCTGGAGAAGCTGGTGGAGGAG 1920 800 810 ' RTQAYLEEKRKAEALLYQIL CGGACACAGGCCl'ACCrGGACGAGAAACGCAAGGGTGAGGCTCTGCTCTACCAAATTCrA 1980

■ 820 830

PHSVAEQIiKRGETVQAEAFD CCCGATTCAGTGGCAGAGCAGTTAAAACGGGGAGAGACrGTACAGGCTGAGGCCTTTGAO 2040

840 S50

SVTIYÍSDI VGPTALSAEST AGCGTTACCAMTACTTCAGTGACATCGTTGGCTTCACAGCTTTGTCGGCAGAGAGCACC 2100 860 870

PMQVVÏLINDLYTCFDAIID CCCATGCAGGTGGTGACACTTCTTAACGATCTATATACATGCTTGGATGCCATAA'CTGAC 2160

880 890

NFDVYKVETIGDAYMVV3GL AAGTTTGACGrCTACAAGGTAGAGACGATTGGAGATGCGrACfiTGGTGGIATCTGG'rGTC 22 .'900 910

PGHNGQRHAPEIARMAlALb GCAGGCAGAAATGGTCAGGGTCATGCCCCAGAAATTGCTGGTATGuCCCTGGCAT'rACTG 22

920 930 *

DAVSSFRIRHRPHDQLRLRL GATGCAGmCTTCCTTCCGCATCCGCCACCGACCCCATGACCMCTGCGGÜTAGGACTA 23

940 95G

GVHTGPVCAGVVGLKMPRYC GGGGTCCACACAGGGCCCGTCTGTGCTGGGGTCGTTGGCCTGAAGATGCCCCGGTATTGT 24 960 970

LFGDTVNTASRMESNGQALK CTCTTTGGAGACACAGTGAACACTGCTTGCCGAATGGAGTCTAACGGrCAAGCCCTGAAG 24 980 990

1HVSSTTKDALDELGCFQLE ATTCATGTCTCGTCTACCACCAAGGATGCCGTGGATGAACTTGGATGCTTGCAGCTAGAG 25 1000 1010 LRGDVEMKGKGKMRTYWL1G CTTCGAGGGGAI'Ga'GGAGATGAAGGGAAAAGGAAAGA'rGCGAAGTTATrGGCTCCTAGGA 25 1020 * E R- К G P A G 1 L Тег

GAGCGGAAAGGACCTGCTGGGCTCCTATAAACCCTACTTCTTCCCAAGTCAGACAGTCCC 26

CTGGTGCTGGTACGTGGGTGGGGAGTAGCGA'ECATCTCTCCAGACATCAG/iAGTGGACAT Z?i

TGTGACATGACATGGAAATCAACATGCATAAAACCCCGACCTTATATGGAAGCTGTTGGG 27i

OTTrGCAGOTCAG'rcmTACA'rATAGCTGTOCCTCrCTCGCCTGGTCTCraTCCTCGCT 28

AT0T1CTGTAAATATCTGTATCTAGACC 28

Рис.3. Нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующая С-кон-цевую и центральную часть гуанилатциклазы из сетчатки быка и выведенная аминокислотная последовательность. Амиинокислотные остатки, не совпадавдие с соответствующими в структурах GC-B крысы и человека, отмечены звездочками. Курсивом выделена нуклеотидная последовательность зонда VIII.

нуклеотидную последовательность около 85% кДНК гуанилатциклазы из сетчатки быка, но тем не менее, полученные нами результаты делают очевидным тот факт, что в клетках сетчатки быка экс-прессируется мембраносвязанная гуанилатциклаза формы GC-B, в то время, как в сетчатке крысы была детектирована гуанилатцик-лаза типа GC-A (Kutty R.K. et. al.,1992), а в сетчатке человека была обнаружена специфическая форма мембраносвязанной гу-

анилатциклазы, названная авторами твХЪО (Бйу^ап АЛ. et.al.f 1992). По сравнению с вС-В крысы и человека выведенная нами аминокислотная последовательность содержит десять замен: в позициях 247 (А > Б), 248 (Т *■ М), 334 (в * А), 352 (Н Н), 379 (Б V), 421 (Ь ♦ М), 485 (У + С) 618 (Б * А), 936 (I * Ь) и 1022 (Г *- -А) на участке длиной 869 аминокислотных остатков. Нуклеотидная последовательность ЙС-В из сетчатки быка имеет 89,5% гомологии с кДНК крысы и 94,0% с кДНК человека, в то время, как аминокислотные последовательности СС-В крысы и человека идентичны, а гомология их нуклеотидных последовательностей составляет 91,5%.

Полученные нами данные показывают, что в сетчатке быка экспрессируется мембранная гуанилатциклаза типа СС-В, в то время, как другие формы гуанилатциклаз нами не обнаружены.

3.2. Анализ нуклеотидаой последовательности фрагмента гена гуанилатциклазы типа СС-В из сетчатки быка.

Поскольку в литературе приведены данные по экзон - инт-ронной организации гена йС-А, но, на сегодняшний день отсутствует информация об. организации гена СС-В, было решено клонировать фрагмент гена СС-В для сравнения экзон - интронной организации генов СС-А и СС-В.

С этой целью при помощи полимеразной цепной реакции был амплифицирован фрагмент гена СС-В, длиной 1976 п.о. .кодирующий аминокислотную последовательность с 392 по 579 аминокислотный остаток по структкрам СС-В крысы и человека и определена его нуклеотидная последовательность. Реакция амплификации проводилась с использованием олигонуклеотидных зондов IV и V. В качестве матрицы служила ДНК из тимуса теленка. Параметры температурного цикла использовались те же, что и при амплификации фрагментов кДНК, за исключением того, что время непосредственно амплификации (72°С) было увеличено до двух минут. ^ -

Анализ определенной нуклеотидаой последовательности показал, что данный фрагмент содержит 6 экзонов разделенных пятью интронами. Структура экзонов полностью совпала с ранее опреде-

AlaGla^sGlnlleTi^roThxKîlyAr^rollepTOTrpVallyaGlyValîroPro GCTGAGAAGGAGATTTGGTGGAGAGGACGGOCCâTCGGGTGGGTGAAGGGGGTGGGACGG 60

429

SerAspAsnProProCysSerPheAspMetAspAspProSerCysAapLysr TCGGACAArCCCCCCTGrrCGTTTGACATGGAGGAGGOATCCTGTGAÎAAAAgtgggtgt 120

gigcagggaclgggagcagctcttcctcccttttctttcctttctcftattcctcctcat 180

gcaccccctgcccccgactctttgctctgtttcacctgtctcctctaccccctccctcct 240

ctctagcctcgagatgggtcfgctcoctgcacctaagagcatcgcccccttctggctcac 300

429

hrProLeuSerThrle aaggccacacacagtctttctcagggtccccctctccccttcagCTCCACTTTCAACTCT 360

uAlalleValAlaLeuGlyThrGlylleTiirPhelleMetPlieGlyValSerSerPlieLe GGCAATTGTGGCACTGGGCAGAGGAATCACCrTCArOATGrTTGGTGTITCCAGCTTGCT 420 457

uIlePheAr

CATïTICCGgtgagttctgagctttccgctgacaggctcccttagctgtaactccgtcgt 480 ctctaacctttcttgtcatttgtcttttagccttggtottgtttccccgccccgactttg 540 gtctggactgggtacactagtttagaattactgattttgagtggggtcttctatgggcaa 600 aggtgaacUtccatggatgctaccatggcactagtgctaccacctgccagtgcaggaga 660 cataagagatgtgggttcaattccctggaggagggtatggctacccactccactgt-tctt 720 gccttgagaattccatggacagaggagcctggtgggctgtagtccatagggttgcaaaga 780 gtcgggcagcattttaagcaggtactttattttcagcctctgtgîttttacataagcaca 840 gggct tgtgt ccgac ccacagagagtgc 11cact с tet с t ctgt cc tgte te t cggtgtg 900 acaactgcagcctcaagagctgccaggaagcccccgccaccctgca|ctggcttctgggg 960

gLysLeuMetLeu

■tggtaggatcgggcttgocagtcagctgaggggtgcagtcct-tacagAAAACTGA'TGCTG 1020

GliiLysGluLeuAlaSerMetLeulTOArgIleArgîrpGluGluLeuGInPtieGlyAsn GAGMGGAGCTGGCCAGCATGïTGrGGCGCATCCGCTGGGMGAGCTGCAGîTCGGCAAT 1080

497

SerGluArgCysHisXysGlyAlaGlySerArgbeuIhrleuSerLeu TCAGAGCGATGCGACAAGGGTGCAGGCAGTCGCGTCAGGCTGrCGTTGgtgagCCCtcct 1140

ctcagctgcccctccgcttccctctgagtgcctgtcctttcataccctggacctttccca 1200

gcacatcagcctgtaatgatagcgcctgcaccaccaccaccatctaatgttcctttcatc 1260

498

ArgGlySerSerTyrGlySerleuMetThrA CftccgcctCCa-tgttgcccttggcccagCGGGGATCCA&TTACGGGTCGCTOATCACAG 1320

laHlsGlyLysTyrGlnllePheAlaAsnThrGlyHlsPheLys

CCCATGGGAMTACCAGATCTTrGCCAACACCGGTCACTTCAAGgtgaacagtcatccgc 1380

ctattctggtccccaccatttcaccctgtctcatcctcatctttcacctcttcccgtgac 1440

cctctgccccttgtcagcctcctctctctgtccagctgagctcctgggtgctcccacagt 1500

tctctagtctttccca|cacccagaggctccttcagagattcatgttcctcttccccttt 1560

GlyAsnValValAlalleLysHlaValAsnlysLysArglleGlu cacccctaccctcagGGAAACGTTGTGGCCATCAAGCATGTGAATAAGAAGCGGATCGAG 1620

548

LeuThrArgGlnValbeuPheGluleuIysHis

CTGACCCGGCAGGTTCTGTTTGAACTGAAAGATgtaagtcctggtgîatgggttgagggc 1680

ccaggatagacacggatgtggaaggggaaggagaggactagggaatagtaatactggctg 1740

ggagggcaagtgggtcgtUgtaaatgactttgagttgtgagtacaattaagagaaaggt 1800

cctctcctgtagtggtagatttctgtatctaatttttagctctttgaattctcttttctt 1860

549

MetArgAspValGlnPîieAsnHlsLeuThrArgPhel CCtttttttttccttttggctagATGAGÄGATGTTCAGMTAACCATCTOACTCGCTTCA 1920

579

leGlyAlaCysIleAapProProAsnlleCysIleValThrGluTyrCysProArg TTGGTGGCTGCATAGACCOTCCOAACATTTGCATTGTCAGCGAGrATTGrOCTCGT 19T6

Рис.4. Нуклеотидная последовательность фрагмента гена гуанилатциклазы типа GC-B из сетчатки быка.

ленной нунлеотидной последовательностью соответствующего фрагмента кДНН. Структура участков границ нитронов и экзонов (структура 5'- и 3'- сплайс-сайтов) совпадает с канонической последовательностью, приведенной в литературе и отвечает GT/AG правилу (рис. 5 и таблица I). Сравнение клонированного фрагмента гена GC-B из быка с соответствующим фрагментом гена GC-A крысы показало определенный уровень сходства в экзон - интронной организации (рис. 5). Сходство заключается в одинаковой (в пределах исследованго фрагмента гена ) разбивке экзонов интронами, а различие заключается в протяженности соответствующих нитронов.- Интересно отметить, что в генах GC-A и GC-B трансмэмбранный домен кодируется одним экзоном. Из сравнительного анализа генов GC-A и GC-B можно сделать вывод, что данные ферменты кодируются различными генами и не могут быть продуктами альтернативного сплайсинга.

Уа1 А вр Аг 390 435 435 463

6

97Ьр

85Ьр 7

_1_222Ь£_

463

* I

01у Aгg 1ув б1у Шв Ме-Ь 011 503 504 528 529 554 555

"""Тм"™Тими 299Ьр^«»^

121 Ър 8

75Ьр 9

78Ьр 10

105Ьр 11

I" -

ЕсоКЕ

ВагаНХ

ЕсоЫ

Т 11Г Аг 429 429 457

1 А I

А 85Ьр

е 457

578Ьр

Г2ТБр

Ьеи Агё Ъув С1у Н1в Ыet 497 498 522 523 548 549

д 1 61Ьр ДД 211 Ьр ДД 2 3 ОЬР д С 75Ьр Р 78Ьр Е

Рис. 5. Сравнение экзон - интронной организации клонирозанного фрагмента гена гуанилатциклазы из сетчатки быка (вС-В) с соот-ветствувдим фрагментом гена гуанилатциклазы из мозга крысы (вС-А). Стрелками показаны направления и протяженность секве-нирования. >*• - секвенирование по методу Сэнгера; (-»• - секве-нирование по методу Ыаксама-Гилберта. На схеме фрагмента СС-В приведены сайты рестрикции, использованные для секвенирования по методу Максама-Гилберта.

Интрон

(см. Рис.5)

Последовательность в области участка сплайсинга

Экзон

Интрон

5'-донорная 3'-акцепторная

Экзон

429 Т

457 Аг

TTCCGgtgagtt.

497 Ьеи

CGTГCgtgagcc.

522 1уз

548 Н1з

AACATgtaagtc.

... 232 п.о.

.. 578 п.о..

,. 161 п.о.

.. 211 П.о.

230 п.о.

429 Ьг

. ссПсаеСТССА

457

.сиас

С

498 Агя

.ggcccagCGGGG 523

.ccctcagGGAAA

549 Мег

А

В

о

Б

Е

Таблица I. Участки сплайсинга исследованного фрагмента гена

выводы.

1. В сетчатке быка обнаружена экспрессия мембраносвя-занной. гуанилатциклазн типа ДС-В.

2. Клонирован ряд фрагментов кДНК гуанилатциклазн из сетчатки быка и определена их нуклеотидаая последовательность суммарной длиной 2848 п.о., что дало возможность реконструировать 85% кодирующей области кДНК данного фермента. На основании нуклеотидной- последовательности кДНК выведена соответствующая аминокислотная последовательность общей длиной 869 аминокислотных остатков.

3. На основании изучения гомолсгий ряда представителей семейства мембранных гуанилатциклаз сделано предположение о мембранной топографии клонированной ГЦ.

4. Методом голимеразной цепной реакции клонирован фрагмент гена■гуанилатциклазы из сетчатки быка, длиной 1976 п.о. и определена его нуклеотидаая последовательность. В пределах исследованного фрагмента гена, было обнаружено сходство в экзон - интронной организации генов вС-А крысы и СО-В быка.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Gaidarov 1.0., Shmukler В.Е., Zubov D.V., Suslov O.K., and Abdulaey N.G. Structure - functional study of proteins, ivol-ved In cGMP metabolism in bovine photoreceptor cell. Proceedings of 18^ Taniguchl symposium on biophysics, 8-13 November, 1992, Kyoto, Japan p. 61-T6.

2. Шмуклер Б.E., Зубов Д.В., Абдулаев Н.Г. Обнаружение экспрессии мембранной формы гуанилатциклазы типа GC-B в сетчатке быка. Биоорган, химия, 1993, том 19, N 6, с. 682-685.