Бета-субъединица фосфодиэстразы циклического ГМФ из сетчатки быка: нуклеотидная последовательность центральной и 3'-областей кДНК тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М.М.ШЕМЯКИНА.

АТАБЕКОВА Надежда Владимировна

р-СУБЪЕДИНИЦА Ф0СФ0ДИЭСТЕРАЗЫ ЦИКЛИЧЕСКОГО ГМФ ИЗ СЕТЧАТКИ БЫКА: НУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ЦЕНТРАЛЬНОЙ И 3'-ОБЛАСТИ кДНК

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1991

Работа выполнена в лаборатории белков гормональной регуляции Ордена Трудового Красного Знамени Институте бю0ргаш1ЧЗСК0й хишк ем. М.М.Шемякина АН СССР.

Научный руководитель - кандидат химических наук Храмцов Н.В.

Ведущая организация: Межфакультетская проблемная научно - исследовательская лаборатория молекулярной биологии и Оиоорганической

химии им.А.Н.Белогерского МГУ им.М.В.Ломоносова.

Защита состоится "15 ''¿иа^ 1991 г. в 10 часов на заседании специализированного совета Д 002.35.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР по адресу: 117871 ГСП-7, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина АК СССР.

Автореферат разослан " /«£ " СшрР-Щ 1991 г.

Ученый секретарь

Официальные оппоненты: доктор химических наук Будовский Э.И. кандидат химических наук Ревердатто C.B.

кандидат химических наук

Специализированного совета

Актуальность проблемы. Одним из актуальных направлений Оиоорганической химии является структурно - функциональное исследование белков, "принимающих участие в процессах восприятия, передачи и усиления зрительного сигнала. Ключевыми белками зрительного каскада позвоночных, локализованными в фоторецепторных клетках, являются такие белки как родопсин, трансдуцин и фосфодиэстераза циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ). Активируемая фотовозбувденным родопсином дри посредстве ГТФ. - связывающего белка трансдуцина, цГМФ фосфодиэстераза (цШ ФДЭ) быстро гвдролизует вторичный мессенджер ЦГМФ,что приводит к закрытию большого числа натриевых каналов в цитоплазматической мембране, ее гшерполяризациии возникновению электрического сигнала, который передается другим клеткам.

цГМФ фосфодиэстераза палочек сетчатки состоит из двух больших родственных субъединиц а- и р, с молекулярными массами, по данным электрофореза в эоз-полиакряламидном геле 84 и 88 кДа, соответственно. Маленькая субъединица - т (II кДа) -является внутренним ингибитором фермента: Для детального выяснения механизмов функционирования белков зрительного каскада необходимо иметь полную информацию об их структурной организации.

Ранее методами белковой химии были изучены первичные структуры родопсина и т-субъединицы трансдуцина. Генно-инженерными методами оцределена нуклеотидная последовательность генов родопсина, а- , р- и т-субъединиц трансдуцина. Параллельным анализом белка и соответствующей ему кДНК также были установлены полные первичные структуры а, г-субъеди-ниц цГМФ фосфодиэстеразы из палочек сетчатки быка и нуклео-

тидная последовательность 5'-области кДНК /з-субъединицы.

Цель работы. Дашая работа является частью исследований, проводимых в лаборатории белков гормональной регуляции Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР, по комплексному структурно - функциональному изучению цГМФ фосфодиэстеразы из сетчатки крупного рогатого скота. Целью представленной работы являлось клонирование кДНК из сетчатки быка; поиск клонов, содержащих фрагменты кДНК /з-субъеди-ницы цГМФ фосфэдиэстеразы и выведение на основании полной нуклеотвдной последовательности кДНК аминокислотной последовательности данной субъединицы.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе клонированы фрагменты кДНК, содержащие 45 % структурной части гена е-субъединицы фосфодаэстеразы циклического гуанозинмонофосфата ( 1196 п.о.), а также З'-нетрансли-руемая область (400 п.о.) и определена их полная нуклеотидная последовательность.

С учетом ранее клонированных в лаборатории 'фрагментов кДНК была реконструирована полная нуклеотидная последовательность кДНК р-субъединивд цГМФ ФДЭ длиной ЗОН п.о. Выведенная на основе нуклеотвдной, аминокислотная последовательность фермента содержит 853 аминокислотных остатка. Вычисленная молекулярная масса - 98 308 Да.

Показана высокая степень гомологии с а-субъединицей фермента и о'-субъединицей цГМФ ФДЭ из колбочек сетчатки быка, также с рядом других представителей семейства фосфодиэстераз циклических нуклеотидов. На основании выявленной гомологии в С-концевой области £-субъединицы локализован район, в котором

располагается каталитический центр гидролиза цГМФ. Полученные результаты позволили начать работы по реконструкции полноразмерной кДНК э-субъединицы цГМФ ФДЭ и ее экспрессии. Кроме того, клонированные фрагменты дают возможность вести работы го исследованию структуры фосфодиэстераз из различных организмов и, прежде всего, из человека.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 2 статьи. Результаты работы докладывались на 5 и 6 Конференциях молодых ученых социалистических стран (Пущино, 1988г. и Прага, 1989г.), на 14 Международном конгрессе по биохимии (Прага, 1988г.) и на Всесоюзном симпозиуме го химии белков (Тбилиси, 1990г.).

Объем диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсувдения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы ( ссылок).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

I.Введение

Ранее в лаборатории белков гормональной регуляции ИБХ АН СССР была сконструирована клонотека кДНК из сетчатки быка (к.х.н. Заграничный В.Е., к.х.н. Василевская И.А.). В качестве вектора была использована экспрессирувдая плазмида рис 8, позволившая провести скрининг библиотеки как при помощи синтетических олигодезоксирибонуклеотидных зондов, так и с использованием поликлональных антител к цПВ ФДЭ. В результате проведенного скрининга был выделен клон рВ9. Далее с помощью синтезированных на основании структуре кДНК этого

№11 ВоЩ ЕсоИ N¡»1 р£|1

I 500 Г ' I «Ю 600 I аго | 2500_ЗОСОпо

и)-200зоо«ю5сюбоо7ооеоо

" 5 Ш Г/УЙЙГш К

рВ57'-' ГПТТ1 ' -

р612 рВ22

рЫ2е=

;рВЮ0

рВЗЗс:

Рв2<-;-- рВ53н

рВ11"-

рв% рВ17|

Рис.1. Частичная рестрикционная карта кДНК /з-субъединицы фосфодиэстеразы цГМФ из сетчатки быка и стратегия определения ее нуклеотидной последовательности. На координатной линейке заштрихована кодирующая /з-субъединицу область: Черными прямоугольниками обозначены олигонуклеотиды, использованные при скрининге библиотек. Длина'стрелок соответствует участкам ДНК, по которым выводилась структура. Незачерненный участокГ'клона рВ42 соответствует не найденной в реконструированной структуре последовательности.

клона олигодезоксирибонуклеотидных зондов I(5'-cagaaccccggctt cgcg-3') и 11(5'-tgcccctgccgacgaaattgttcaat-3') (рис.1), щж повторном скрининге этой же библиотеки были идентифицированы еще ряд клонов рВ67, рВ12, рВ22, рВ2 и pBII.

Определение первичной структуры вставок этих клонов в совокупности с информацией о структуре клона рВ9 позволило установить последовательность фрагмента кДНК /з-субъединицы длиной 1472 п.о. (структурная часть кДНК длиной 1424 п.о. и • 5'-нетранслируемая область длиной 48 п.о.).

Фрагмент имеет непрерывную рамку считывания с инициирующим кодоном в положении 49-51, кодирует полшептид длиной 474 аминокислотных остатка и содержит информацию о _50 % последовательности кДНК ß-субъединицы цГМФ ФДЗ.

Целью представленной работы было установление полной нуклеотидной последовательности кДНК /з-субъединицы цГМФ фосфодиэстеразы и анализ первичной структуры фермента.

II. Поиск фрагментов кДНК, кодирующих центральный участок ß-субъединицы ЦГМФ фосфодиэстеразы

и определение их нуклеотидной последовательности.

4 .Для нового скрининга сконструированной нами ранее клонотеки кДНК, синте зированной с помощью рассеянной затравки, был получен зонд III (к.х.н. БЫстров Н.е.).Структура этого зонда (5'- agagaacgcctcggg - 3') соответствует 3'-концевым областям клонов рВ2 и pBII, выделенных и исследованных ранее.

Скрининг осуществляли путем гибридизации колоний е.сои , выращенных после трансформации компетентных клеток (шташ

MH-I), рекомбинантными плазмидами. Колонии переносились на нитроцеллшозные фильтры, лизировались и инкубировались с

Р-меченным зондом III. Метка вводилась при помощи -полинуклеотидкиназы фага Т4 и [г- Р]АТР. Анализ 5x10 трансформантов позволил выделить клоны рВ29 и рВ17, отобранные нами после повторной гибридизации с зондом III и давшие наиболее интенсивные сигналы . Из клонов были выделены плазмиды, определен размер содержащихся в них вставок и проведен их рестриктный анализ.

Определение нуклеотидной последовательности клонированных вставок кДНК проводили по модифицированному методу Макса-ма - Гилберта в твердофазном варианте, разработанному Чувпило и Кравченко (Чувпило и др., 1984).

Стратегия определения нуклеотидной последовательности представлена на рис.1. После расщепления плазмидной ДНК соответствующей рестриктазой метка вводилась в рестриктные

??

фрагменты при помощи соответствующего [a- P]dNTP и фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I е. сои . Далее меченые по обоим

концам фрагменты расщеплялись одной или несколькими

\

подходящими рестриктазами для получения гомогенно меченых" укороченных фрагментов, которые после этого разделялись электрофорезом в 5-8% ПААГ. В ряде случаев вместо дополнительного расщепления рестриктазами использовали процедуру разделения комплементарных цепей полярно меченых фрагментов. Выделенные после элюции из ПААГ гомогенно меченые одно- и двухцепочечные фрагменты использовали для непосредственного определения их нуклеотидной последовательности.

Размер вставок клонов рВ29 и рВ17 составил 430 и 750 я.о. соответственно. Определение их последовательности позволило продолжить выявленную ранее непрерывную рамку считывания на 317 п.о. в сторону 3'-конца. Анализ структур клонов рВ29 и рВ17 показал, что до положения 1789 со стороны 5'-конца идет совпадение их последовательностей между сооой и со структурой остальных клонов.

Для дальнейшего продвижения в направлении 3'-конца кДНК цГМФ ФДЭ на основе структур 3'-концевых областей кДНК клонов рВ29 и рВ17 были синтезированы зонды iv(5'-ctgggtgtggttcga-B'), v(5'-cctgttctccgtgagcaa-з'), vi(5'-ttcacgctgctcatg-3'). Было также решено создать новую клонотеку кДНК, используя в качестве затравки при синтезе первой цепи кДНК олиго (dT)I2_jg. Мы полагали, что в такой клонотеке с большей вероятностью будут представлены фрагменты кДНК, кодирующие С-концевую область ß-субъединицы фермента.

III.Выделение мРНК и синтез кДНК.

Нами была цроделана стандартная процедура выделения мРНК с использованием на первой стадии обработки измельченных в 'жидком азоте сетчаток быка буферным раствором на основе хлорида лития и мочевины. Для- ингибирования рибонуклеаз и выделения недеградированных молекул РНК был использован ванадилрибонуклеозидный комплекс. Отсуствие при выделении заметной деградации РНК определяли по наличие в злектрофоре-граммах агарозного геля четко выраженных полос 28s и íes рРНК (рис.2).

Дальнейшая очистка мРНК проводилась с помощью аффинной

хроматографии полученного препарата тотальной РНК на олиго(ат) целлюлозе. Выдокнная после двух циклов хроматографии поли(А+)мРНК составила 3,5% от общего содержания РНК в клетке, что согласуется с литературными данными.

В качестве затравки при синтезе первой цепи кДНК использовали олито(йт) 12-18"

А Б В Г Д '

Рис. 2. Электрофоре грамма выделенной РНК в 1% агарозном геле: А - поли(А)- - фракция РНК; Б -промывка колонки 0,1 М раствором Nací; В - поли(А)+ фракция РНК; Г - несвязавший-ся материал после нанесения на колонку поли (А)+ фракции; Д - поли(А)+ фракция РНК после двух циклов хроматографии.

Проведение аналитических экспериментов по синтезу первой цепи показало, что наибольший выход продукта наблюдается при двухкратном избытке затравки по отношению к мРЖ, поэтому это

соотношение было использовано нами для получения препаративного количества первой цепи кДНК. Реакцию вели с применением обратной транскриптазы из вируса миелобластоза птиц в присуствии всех четырех дезоксирибонуклеозидтрифэсфа-тов. Выход первой цепи составил 21%, длина полученных фрагментов по данным щелочного электрофореза в среднем составила 500-1500 п.о.(рис.З).

-6557 п.о. -4361 п.о.

-2322 п.о. "2027 п.о.

-564 и.о.

А Б В

Рис. 3. Авторадиограмма продуктов, синтезированных на мРНК и первой цепи кДНК, разделенных в 1,4% щелочном агарозном геле: А - синтезированная двухцепочечная кДНК; Б - первая цепь кДНК, синтезированная с затравкой олиго(<1т)12_18: в ~ ДНК фага х, гидролизован-ная рестриктазой н!пс! их.

- 10 -

Синтез второй цепи проводили с использованием ДНК-полимеразы I е.со-и и РНКазы Н. Выход второй цепи составил 90%, средняя длина полученных фрагментов - 500-1500 п.о. (рис.3).

iv. Создание клонотеки кДНК. В качестве вектора для клонирования была выбрана успешно используемая нами плазмида pues . в качестве метода клонирования - лидирование по тупым концам. Для этого полученная кДНК обрабатывалась ДНК-полимеразой фага Т4 в присуствии всех четырех де зоксирибонукле озидгрМо сфа тов. Плазмидную ДНК предварительно гидролизовали рестриктазой smai и для уменьшения выхода нерекомбинантных клонов дефосфорили-ровали. Для снижения вероятности образования при лигировании рекомбинантных молекул со вставками нескольких молекул кДНК вектор брали в десятикратном избытке. Полученным набором рекомбинантных молекул трансформировали компетентные клетки

С

е.coi i штамм MH-I. Выход рвкомбинантов обычно составлял 10 на I мкг кДНК. Количество нерекомбинантных клонов не цревыша-ло 10%.

.v.Поиск клонов, содержащих фрагменты 3'-области кДНК g-субъединицы фосфодиэстеразы циклического ГМФ и определение их нуклеотидной последовательности. Скрининг полученной библиотеки кДНК, репрезентативностью 3x10 клонов, радиоактивномечеными зондами iv и v выявил 15 клонов, дающих положительный сигнал гибридизации. Размер содержащихся в них вставок в среднем составлял 300-400 п.о. и

лишь один клон рВ42 имел вставку размером 780 и.о.. Для исследования первоначально были выбраны клоны рВ42, рВЗЗ, рВ82, рВЮО. Было найдено, что плазмида этап, клонов несут вставки длиной 750 , 390 , 283 и 512 п.о. соответственно. Определение и анализ нуклеотидной последовательности этих вставок показали, что фрагменты клонов рВЗЗ, рВ82 и рВ100 практически целиком лежат в исследованной ранее структуре. Таким образом, от положения 1789 в направлении 3'-области кДНК удалось продвинуться лишь на 106 п.о. до положения 1895. Далее до положения 1916 следует продолжение клона рВ82. Необходимо отметить, что последовательность полипептидной цепи, выведенная на основе нуклеотидной, проявляет высокую степень гомологии с последовательностью а-субьединицы цГМФ ФДЭ. Причем эта гомология обнаруживается до положения 1916 в координатах кДНК. Определение нуклеотидной последовательности вставки клона рВ42 показало ее полное совпадение с уже известной структурой кДНК, кодирующей р-субъединицу непосредственно с 5'-конца вставки (координаты 1701 ) только до положения 1862. В направлении 3'-области вставка клона рВ42 цродолжается еще на 619 п.о. Эта область кДНЕС клона рВ42 не 4 проявляла гомологии со структурой кДНК а-субъединицы фермента, поэтому мы предположили, что кДНК этого клона, начиная с положения 1862 не принадлежит структуре, кодирующей р-субъединицу фосфодиэстеразы. Остается неясным, по какой причине в скринированных банках кДНК не обнаруживаются полноразмерные клоны с фрагментами, кодирующими р-субъединицу фермента. Интересно, что наш соавторе из Чикагского Университета, параллельно с наш исследовавшие р-субъединицу

цГМФ ФДЭ, столкнулись с подобной проблемой, несмотря на то, что в качестве вектора для клонирования кДНК ими было использовано одно из производных фага л, потенциально способного к встраиванию вставок гораздо большей длины, чем использованный наш шазмщщый вектор. Из 100 положительных /з-клоноз, отобранных ими при скрининге 2x10е фаговых бляшек, лишь один клон оказался полноразмерным.

Для дальнейших исследований было решено синтезировать еще два олигонуклеотидных зонда vii (5'-ggtgactgccggcctgtg-3') и viii (5 '—tcggggcaccaacañ—3 '), СООТВеТСТВуЮЩИХ 3'-концввой

области установленной структуры с координатами I8I8-I835 и I85I-I865 п.о. соответственно. С помощью этих радиоактивно-меченых зондов было обнаружено 8 гибрздизующихся клонов. Выявленные клоны также гибридизовали с зондами ш, iv, v, vi и, после установления размера содержащихся в них вставок, для определения нуклеотидной последовательности был отобран один клон рВЗб, содержащий вставку длиной 1450 п.о..

Определение и анализ нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента подтвердили наши первоначальные предположения о несоответствии полученной нами ранее структуры 3'-области кДНК клона рВ42, начиная с положения 1862 и далее в направлении 3'-конца, истинной структуре кДНК /з-субъединицы ЦГМФ ФДЗ. Наличие негомологичного участка в структуре этого клона видимо можно объяснить лигированием по тупым концам разных молекул кДНК с одной молекулой вектора.

■ Таким образом установлено, что клон рВЗб содержит вставку кДНК, в ico торой 679 п.о. кодируют неизвестную ранее

С-концевую область структурного гена /з-субъедишщы. На протяжении всей длины кДНК этого клона проявляет существенную гомологию со структурой кДНК а-субъединицы фермента, а до положения 1916 со стороны 5'-области кДНК совпадает со структурой найденных наш ранее клонов. Однако, в определенной структуре терминирующего кодона обнаружено не было. На основании гомологии со структурой , кодирующей С-концевую область а-субъединицы, можно было ожидать нахождение терминирующего кодона в пределах 10-20 последующих нуклеотидов. В структуре последних 3'- концевых нуклеотидов клона рВЗб был выбран участок длиной 19 п.о., обладающий минимальным сходством со структурой соответствующего участка кДНК а-субъединицы, и на основе его последовательности был СИНТеЗИрОЕЗН зонд ix (5'—tctgcaacggcggcccggc—3').

Скрининг 150 ООО новых трансформантов из имевшейся у нас клонотеки радиоактивномеченым зондом ix, позволил обнаружить десять клонов, дававших положительный сигнал гибридизации. Для определения нуклеотидной последовательности было отобрано два клона рВ44 и рВ53, со вставками 135 и 1270 п. о. соответственно. Структура вставки клона рВ44 совпадала со структурой 3'-концевой части кДНК клона рВЗб и продолжалась далее , включая терминирующий кодон и 27 п. о. 3'-нетранслируемой области. Анализ установленной структуры клона рВ53 показал ее полное совпадение с установленной ранее стру к турой, начиная с положения 1741 в направлении 3'-конца, включая терминирующий кодон. Также была получена информация о структуре 3'-нетранслируемой области кДНК с положения 2636 до положения ЗОН.

- 14 -

vi.Анализ и реконструкция полной нуклеотидной последовательности кДНК ß-субъединицы фосфодиэстеразы циклического ТШ из сетчатки быка.

Таким образом, определение нуклеотидной последовательности выделенных клонов, в совокупности с полученной ранее информацией о клонах рВ9, рВ67, рВ12, рВ22, рВ2 и pBII, позволило реконструировать структуру кДНК р-субъединицы фосфодиэстеразы циклического ГМФ из сетчатки быка длиной ЗОН п.о. (структурная часть 49 - 2606 п.о.)(рис.4).

Триплет atg, находящийся в положении 49-51, является, по всей вероятности, инициирующим кодоном. Во-первых, он входит в состав последовательности puccatg, типичной для сайта инициации трансляции (Козак, м. 1984). Во-вторых, его положение совпадает с соответствующими инициирующими кодонами. а- и а'- субъединиц ЦГМФ фосфодиэстераз из палочек и колбочек сетчатки быка.

Терминирующий кодон находится в положении 2607-2609, а на расстоянии 369 п.о. от него в положении 2978-2983 3'-нетранслируемой области расположен сигнал полиаденилирования ААТААА, после которого через 8 нуклеотидов начинается последовательность поли А.

Выведенная из нуклеотидной последовательности, аминокислотная последовательность фермента содержит 853 аминокислотных остатка. Рассчитанная молекулярная масса белка составляет 98 308 Да. Правильность полученной структуры подтверждается ее соответствием аминокислотным последовательностям большого количества пептидов бромцианового и триптического гидролизатов смеси а- и ß-субъединиц. Ряд из

,гдст7Тбм*5а*дб::б*бСйУ«а:5ТбИУи1: а » * • »

•стк

9 I I > I < и 1 О 1 и • Т « ТОР » * £ с » * г $ I ' А 0 £ V ГОТ»Т«Я11А т » ! ■

I М и ; и 1 н о г я к * * т т т I 111км ; 1 г, ? I.

I г < м к н

ч

Т I £ к

1 И М I И ( И 1 ( 11 { И М I I 1 « I I М П И I М ( ( > и И И ! I с I ( I'

I п I I I И ? г 1 т 8 » « Т Г т ■ « СВ«С^#вС0в£»1И1$1Т9Г1$¥$»1«ТЭТ

< Н II ( Г. С > И « 1 к П я у 1 т « т I СС*С<!01!1>1!С11«СС'А0С!£б( А

I • * I I < г у I » < * » < I \ 1 у < с 8 I в и г I * ' О

Ата^й^т^ткттеттстбпетсатьцещаастобь^тотсйц*«

I * в £ » » « * 1 » * 1 * « 6 * Ч I 1 т т * « у « и 6 ' ■ V 4 О Т я I ? « I ■ т «>_«*«« Т Е

гт&ыав^ттттмдтыг гкг«8ггтстся»«тыг ""ГШТСГ?!' •'¡СТОШТТСГТГ УПТТИМСВ Г1''Т ^^•ТТ''«-'-^ '1

I И » » М ! * I I с Я И N1 < | I 1 ? > I ( н Н I и I я 8 * I ! I » > »"Л ?

---- -——-

*1»11£Т1»:гд«1«1»С»1£и»1«1Р1 у I » Т у П ( I И ! И ( I 1 ' И ( 1 Н ЩТаышс: дсиалг ия 1 ^»г.-тййвтббцтцдтреепс^-мту1»мча и диатаетмгалп-.т^г цту. ^ни^^д^т^!^-«-^. иягг ШДМЫИТТ ЙГГГК I 5 ( » ! { О I И И С ! I I I I И » I Г 1 Ч ^ И НП » С ( I и П С П I П

I I ( 1 I { И и ( М и 1 <1

Рис. 4. Нуклеотидная последовательность кднк, кодирующая субъединицу фосфодиэстеразы из сетчатки быка и соответствующая ей аминокислотная последовательность. Подчеркнута последовательность аминокислот, установленная путем анализа пептидов Сромцианового гидролизата смеси а- и э-субъединиц фермента : одной чертой - пептиды уникальные для б-субъединицы; двумя чертами - пептиды найденные как в £-,так и в а-субъединицах.

этих пептидов не обнаружен в а-субъединице (подчеркнуты на рис. 4 одной чертой).

Сравнение структур кДНК выделенных клонов выявило ряд точечных различий между ними, не вызывающих замены кодируемой аминокислоты. Кроме того ранее была выявлена гетерогенность в аминокислотных последовательностях э-субъединицы, кодируемых разными клонами: в положении 40 полипептидной цепи в клонах рВ9 и рВ22 кодируется аргинин, а в клонах рВ12 и рВ67 -цистеин. Вероятно, в данном случае мы имеем возможность наблюдать явление полиморфизма, обусловленное существованием аллельных вариантов бежа в пределах популяции.

VII.Анализ аминокислотной последовательности р-субъединицы цГМФ фосфодиэстеразы из сетчатки бык£.

ы-концевая аминогруппа /з-субъединицы блокирована. К сожалению, не удалось выделить и-концевой пептид фермента из продуктов расщепления и поэтому природа блокирующей группировки не установлена. В а-субъединице цГМФ ФДЭ из палочек в процессе посттрансляционной модификации наблюдается отщепление к-концевого остатка метионина и ацетилирование последующего остатка глицина. Таким же образом в /з-субъединице трансдуцина отщепляется и-концевой остаток метионина и ацетилируется следующий за ним остаток серина. Ввиду того, что ацетилирование ы-концевого серина - довольно широко распространенное явление для эукариотических белков, вполне вероятно, что аналогичный процесс характерен и для р-субъединицы фосфодиэстеразы .

- 17 -

Аминокислотная последовательность /з-субъединицы цГМФ фосфодиэстеразы из палочек имеет 72% гомологии с а-субъедини-цей и 62% гомологии с а'-субъединицей колбочек сетчатки. Наименее консервативными участками являются ы- и с-концевые фрагменты (аминокислотные остатки 1-95 и 825-853).

Недавно в ы-концевой области /з-субъединицы был обнаружен домен, являющийся центром некаталитического связывания цГМФ, аналогичный обнаруженному (Чарбони и соавт. 1989) в <*-, <*'-субъединицах цГМФ ФДЭ и цГМФ-стимулируемой фосфэдиэстеразе из сердца быка. Он включает в себя около 300 аминокислотных остатков. Отмечено наличие двух участков внутренней гомологии по 120 остатков каждый. Для /з-субъединицы это последовательность в положении 125-241 и 330-454 полипептидной цепи, гомология между ними составляет 29 %.

Еце раньше на основании сравнения аминокислотных последовательностей ряда фосфодиэстераз циклических нуклеотидов был выявлен строго консервативный, протяженный участок гомологии длиной около 250 остатков. Данные о каталитической активности и иммунологические исследования этого домена, позволили охарактеризовать этот участок как каталитический центр гидролиза циклических нуклеотидов. Наш была проанализирована аминокислотная последовательности /з-субъединицы ЦГМФ ФДЭ. При сравнении ее со структурой консервативных участков других фосфодиэстераз циклических нуклеотидов в С-концевой области нами был также обнаружен высокогомологичный охарактеризованным выше областям домен (рис.5). Каталитический центр предположительно локализован нами на участке полипептидной цепи /з-субъединицы, имеющем координаты 550-790 аминокислотных

Рис. 5. Гомология аминокислотных последовательностей фосфодиэстераз циклических нуклеопадов. Alpha, beta, а- и р-субъединицы цГМФ ФДЭ из палочек сетчатки быка; cone, а'-субъединица цП4Ф ФДЭ из колбочек сетчатки быка; ces - ЦГМФ стимулируемая ФДЭ из сердца быка; Са /Cam - кальмодулинзависимая ФДЭ ИЗ мозга быка; dnc - ЦАЙФ ФДЭ из Drosophila; Ye - ФДЭ 2 ЦИКЛИЧеСКИХ нуклеотидов из дрожжей Saccharomyces cererisiae. В рамку заключены аминокислотные остатки, идентичные у трех и более цредставителей семейства фосфодиэстераз. Области I и II являются участками внутренней гомологии в пределах некаталитического центра связывания ЦГМФ. В пределах каталитического центра ферментов отмечены потенциальные элементы гуанинсвязывапцих центров. Последовательность аминокислот СААХ предопределяет посттрансляционный цроцессинг бежа.

остатков.

В пользу такого Предположения свидетельствует наличие в фоторецепторных ферментах в пределах этого участка трех элементов гуанидинсвязывавдих центров : глицин богатой петли сх30(А)хдск(К), мд^+-связывающего элемента ох2с и участка цкхо, предположительно участвующего в связывании гуанинового кольца (рис.5). Однако, в структуре э-субъединицы элемент июсю заменен на икха. Исходя лишь только из сходства структур каталитических доменов исследованных ферментов, нельзя сделать вывод о том, какие именно аминокислотные остатки вовлечены в функционирование активного центра. ; Однако, в пределах консервативных областей высокореакционноспособные остатки гистидина являются постоянными. Все они занимают различные позиции, тем не менее они являются наиболее вероятными кандидатами на участие в функционирование активных центров этих ферментов.

Известно, что полипептидная цепь а-субъединицы цГМФ фосфодиэстеразы подвергается посттрансляционной модификации на С-конце. В канонической последовательности СААХ (суэ-(алифатическая аминокислота)2-Х), представленной в а-субъединице как суз-суэ-Уа1-с1п, происходит протеолитическое отщепление 2 или 3 концевых аминокислот и карбоксиметилирование концевого остатка цистеина. В С-концевой последовательности а'-субъединицы также имеется последовательность СААХ, определяющая модификацию. В этом случае концевой остаток цистеина модифицируется в изопренильный тиоэфир. В отличие от указанных случаев, С-концевая последовательность /з-субъединицы - сув-дгд-Ие-ьеи.

Так как отсуствуют данные о модификации полипептидной цепи ß-субъединицы цГМФ ФДЭ, то в настоящее время трудно судить о том, ведет ли наличие Arg в составе этой последовательности к ингибированию С-концевого цроцессинга /з-субъединицы или не ведет.

ВЫВОДЫ

1. Создана представительная библиотека кДНК из сетчатки быка и получена серия рекомбинантных плазмвд, содержащих фрагменты кДНК, кодирующие центральную и С-концевую область /з-субъединицы фосфодиэстеразы циклического ГМФ.

2. Установлена нуклеотидная последовательность фрагментов кДНК выделенных клонов, что, в совокупности с полученной ранее информацией, позволило реконструировать полную первичную структуру кДНК длиной ЗОН п.о., содержащих) структурный ген /з-субъединицы фермента, состоящий из 2559 п.о.

3. На основе полученной структуры выведена аминокислотная последовательность ß-субъединицы цГМФ фосфодиэстеразы из сетчатки быка длиной 853 остатка.

4. Выявлена существенная гомология между выведенной аминокислотной последовательностью /з-субъединицы и соответствующей последовательностью а-субъединицы фермента, составляющая 69,9 %.

5. На основании изучения гомологии ряда представителей семейства фосфодиэстераз циклических нуклеотидов сделано предположение о существовании'в С-концевой области /з-субъеди-

- 21 -

ницы каталитического центра гидролиза цГМФ.

Основные результаты диссертации изложены в следующих

публикациях:

1. Структурные исследования цикло-ГМФ-фосфодиэстеразы из сетчатки быка. Василевская И.А., Атабекова Н.В., Заграничный В.Е., йценко К.А., Мурадов Х.Г., Храмцов Н.В..Губанов В.В. - Сборник тезисов v конференции молодых ученых социалистических стран по биоорганической химии, Пущино, 1988, с.88.

2. Structural investigations of cyclic GMP phosphodiesterase from cattle retina. Ishchenko K.A., Zagranichny V.E., Gu-banovV.V., Khramtsov N.V., Vasilevskaya I.A., Atabekova N.V., Rakitina T.V., Feshchenko E.A., Muradov Kh.G., Shu-vaeva T.M., Surina E.A., Lipkin V.M. - Abstracts of 14th International Congress of Biochemistry, Prague (Czechoslovakia), 1988, v.4, p.140.

3. Structural investigations of cyclic GMP phosphodiesterase from cattle retina. Ishchenko K.A., Zagranichny V.E., Gu-banov V.V., Khramtsov N.V., Vasilevskaya I.A., Atabekova N.V. - Abstracts of the 6th International conference of

'■young scientists on organic and bioorganic chemistry, Prague (Czechoslovakia), 1989, p.90.

4. Фосфодиэстераза циклического ГМФ из сетчатки быка. Аминокислотная последовательность /з-субъединицы и нуклеотидная последовательность соответствующей кДНК. Липкин В.М., Губанов В.В., Храмцов Н.В., Василевская И.А..Атабекова Н.В., Мурадов Х.Г., Шуваева Т.М., Сурина Е.А., Заграничный В.Е., Ли Т. - Биоорган, химия, 1990, т.16, nI, с.118-120.

5. The (?-subun.it of bovine rod photoreceptor cGMP phosphodiesterase. V.M. Lipkin, N.V. Khramtsov, I.A. Va-silevskaya, N.V. Atabekova, K.G. Muradov, V.V. Gubanov, T. Li, J.P. Johnston, K.J. Volpp, and M.L. Applebury -J. Biol. Chem., v.265, No.22, pp.12955-12959.