Структурно-функциональное исследование фосфодиэстразы cGMP палочек сетчатки быка тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ А К А Д Е М И Я Н А УК

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ Ш1. М.М.ШЕМЯКИНА

На правах рукописи УДК 577.112.7

БОНДАРЕНКО ВЛАДИМИР АЛЕКСАНДРОВИЧ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ Ф0СФ0ДИЭСТЕРАЗЫ с(ШР ПАЛОЧЕК СЕТЧАТКИ БЫКА

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия" природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Пущино - 1992

Работа выполнена в Филиале Ордена Трудового Красного Знамени института биоорганической химии имени М.М.Шемякина Российской АН

Научный руководитель: , доктор химических наук, профессор

Лшпшн В.М:

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Алахов Ю.Б. , кандидат химических наук Каламкаров Г.Р.

Ведущая организация: Институт биофизики клетки

Российской АН, г- Пущино.

Защита диссертации состоится в 11 час." 14 " " октября " 1992 г. на заседании специализированного совета Д 002.35.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина Российской АН по адресу: 117871, ГСП-7, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина Российской АН.

■Автореферат разослан / У > И1992 г.

/

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

/'/') г" // Несмеянов В.А.

! Н /■ /

[г//

ч I/

Актуальность проблемы. Клетки палочек сетчатки являются чрезвычайно чуствительнши детекторами. Проводимые полвека назад физиологические исследования показали, что клетка палочек может Сыть возбуждена единичным фотоном. Обладая столь уникальной способностью к детекции единичного фотона, палочки сетчатки способны более чем в десять тысяч раз изменять свою чуствитель-ность, адаптируясь к разным уровням фоновой освещенности- Биохимические и физиологические исследования последующих десятилетий привели к открытию того, каким образом достигается такая высокая чуствительность. Фотоактивация родопсина приводит к обмену связанного с а-субьединицей трансдуцина ГДФ на ГТФ. ГТФ-форма а-субьединицы (Та-ГТФ) трансдуцина активирует фосфоди-эстеразу цГМФ (ФДЭ), состоящую из трех субьедениц: а (98 кДА), р (98 кДА) и 7 (10 кДА). Активность каталитических ар субьеди-ниц (ФДЕар) неконкурентно ингибируется 7 субьединицей (ФДЕ7). Ингибирущий эффект 7 субьединицы реципрокно снимается (Та-ГТФ) .Вызываемое светом снижение уровня цГМФ закрывает кати-онные каналы, что приводит к гиперполяризации плазматической мембраны и генерации потенциала действия.

В настоящее время определены первичные структуры ФДЭ7 из сетчаток быка, мыши и человека. Сравнение этих структур показало высокую степень гомологии менаду ингибиторными субъединицами ФДЭ7 (две аминокислотные замены). ФДЗ7 является небольшим (87 аминокислотных остатков) сильноосновным белком (р1=10,5), содержащим большое количество остатков аргинина и лизина в центральной части молекулы (24-45).

Получение рекомСинантных мутантных форм методом направленного мутагенеза и изучение их функциональной активности представляется наиболее перспективным способом для идентификации функционально важных аминокислот ФДЭ7.

Цель работы. Эта работа является частью проводимого в ИБХ им. М.М.Шемякина Российской АН комплексного структурно-функционального изучения белков, участвующих в процессе восприятия и преобразования зрительного сигнала. Целью исследования явилось изучение структурно-функциональных свойств рекомбинант-ных мутантных форм ФДЭ7, полученных методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза.

Научная новизна и практическая ценность работы. Методом олигонуклеотпд-направленного мутагенеза впервые были получены 14 рексмбинантных мутанта форм ФДЗ7. Была получена экспрессия этих мутантных форы последовательной in vitro транскрипцией и трансляцией. Были изучены ингибиторные свойства этих мутантов, и их взаимодействие с каталитическими субьединицами ФДЭ и а-субьединицей трансдуцина. На основании полученных экспериментальных данных сделан вывод, что в процессе взаимодействия ФДЭ7 с каталитическими субьединицами существует две стадии: первичное связывание и ингибирование. В первичном связывании принимает участие центральный участок 7-субьединицы богатый основными аминокислотными остатками, а в процессе ингибирования основная роль принадлежит С-концевому участку. Важное значение для процесса ингибирования имеет пространственная ориетация С-концево-го участка 7-субьединицы - так замена пролина в положении 69 привела к значительному снижению ингибиторных свойств ФДЗ7. Кроме того, С-концевой участок оказывает влияние и на процесс связывания с каталитическими субьединицами ФДЭ. Можно предположить, что при активации ФДЭ а-субьединица трансдуцина непосредственно взаимодействует с каталитическими субьединицами ФДЭ.

Публикации. По теме диссертации опубликованы четыре статьи, полученные результаты докладывались на Симпозиуме UCLA по молекулярной и клеточной биологии "Белковая и фармацевтическая инженерия" (Парк-Сити, США, 1989), Советско-Западногерманском симпозиуме "Рецепторы и ионные каналы" (Западный Берлин, 1989), Симпозиуме UCLA по молекулярной и клеточной биологии "Передача сигнала G-белками" (Тамарок, США, 1990), Международном симпозиуме по исследованию глаза (Хельсинки, Финляндия, 1990), Советско-Германском симпозиуме "Рецепторы и ионные каналы" (Москва, 1991), Российско-Израильском по пептидам и^ белкам (Москва, 1992).

Объем работы. Диссертация излокена на 98 страницах машинописного текста. Она состоит из введения, литературного обзора "Методы олигонуклеотид-направленного мутагенеза", 4 глав, посвященных результатам и их обсуждению, экспериментальной части и выводов. Список цитируемой литературы включает Иб наименований. В обзоре литературы рассмотрены работы, посвященные методам олигонуклеотид-нацравленного мутагенеза.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Введете

Ранее в нашей лаборатории на основе анализа клонотеки кДНК из сетчатки <5ыка был идентифицирован клон (плазмида ру20), содержащий кодирующую последовательность гена ФДЭ7, и впервые установлена первичная структура ФДЗ7 из палочек сетчкатки быка. Это позволило приступить к работе по олигонуклеотид-направленному мутагенезу гена ФДЭ7. 1. Синтез ФДЭу in vitro.

Поскольку ФДЭ7 является небольшим сильноосновным белком, ее экспрессия in viva представляет собой сложную задачу в связи с высокой вероятностью деградации синтезируемого продукта внутриклеточными протеазами. Именно поэтому для экспрессии ФДЗ7 была выбрана система трансляции in vitro в экстракте зародышей пшеницы. К ее достоинствам относится простота и отсутствие в ней многих регуляторных клеточных механизмов, которые, по-видимому, и являются во многих случаях ггршпшой низкой эффективности экспрессии чужеродных белков в интактных клетках различной природы. Для экспрессии рекомбинантной ФДЭ7 в бесклеточной системе трансляции комплементарную ДНК, содержащую кодирующую часть гена , клонировали в вектор pGEM2 под контролем SP6 промотора. Транскрипция in vitro с использованием РНК-полимеразы фага SP6 позволяла получить из 10 мкг линейной плазмидной ДНК около 500 мкг РНК. Трансляцию проводшш в экстракте зародышей пшеницы в присутствии С14С]-аминокислот.Транскрипцию и трансляцию всех мутантных форм ФДЭ7 осуществляли аналогично.

Ранее было показано, что в результате электрофореза продуктов трансляции in vitro в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-1ШГ), переноса белков на нитро-целлюлознуго мембрану с последующей авторадиографией обнаруживается только одна радиоактивная белковая зона, имеющая такую же, как и природная 7-суйьвдиница подвижность.

Функциональная активность синтезированной in vitro 7-субьединицы проверялась по способности ингибировать ею каталитические 'субьединицы, активированные кратковременной обработкой трипсином. Сравнение ингибиторных свойств рекомбинантной и выделенной из сетчатки ФДЭ7 позволило определить количество функционально активной рекомбиннангной 7-субьединицы, которое

оказалось равным 27-5 мкг/мл трансляционной смеси. Уровень трансляции различных мутантных форм ФДЭ? был одинаков и не зависел от характера мутаций.

2. Олигонуклеотид-направленный мутагенез ФДЭу.

Ранее, при использовании моноклональных . антител узнающих участок 24-45 полипептидной цепи ФДЭ7 была показана важность этой области при взаимодействии 7-субьединицы с каталитическими субьединицами и с а-субьеданицей трансдуцина. Кроме того, удаление 7 С-концевых аминокислотных остатков карбоксипептида-зой У приводило к значительному снижению способности ФДЭ7 инги-бировать каталитические сф-субьедишщы фосфодиэстеразы. Поэтому для мутагенеза были избраны центральный, обогащенный основными аминокислотами и, С-концевой участки молекулы ФДЭ7. Были также произведены замены трех остатков пролина в положениях 23, 55 и 69 на лейцин и делеция шести 1*-концевых аминокислот (рис.1). На

1С

Ш I Е Р Р К|А Е I Я 5 А Т ЯУМСв Р УТР Я-Н

1--23 | .

1Т тяте ТТ ТТ к

К|/ I V I II II к

н)К0Р РКРК<аИСЛ11<ЗРК8КРРК:КСУС}

С 25 29 31 33 УЭ 41 «445

& Ь Б Ь

I I I

СРСООIРвМЕСЬСТОI ТУ ICPWEA

С 55 А ««

| I Л 81-«7

Р NН Ь Е ь н е|Гаоус1]Т]

и

Рис.1. Первичные структуры ФДЭ7 из сетчатки быка и изученных мутантов. Аминокислотные замены в точечных мутациях указаны сверху, снизу или сбоку основной цепи, делетированные аминокислотные остатки у делеционных мутантов обведены рамкой, (рисЛ) и в таблице I. наряду с новыми мутациями (Д2-711, Р23, Н24Н, Ш4К, К25Н, К251, К25Й, К255, К25Т, К31Н, К31Т, Р55Ь,

C68S и P69L) представлены также мутации (R24G, К29Т, R33G, К45Т, E77G, Y84A и А7С), полученные ранее, но впервые исследованные описываемыми нике методами.

Олигонуклеотид-направленный мутагенез проводили по методу "дуплекс с брешью" (рис.2). Структура использованных в мутагенезе синтетических олигодезоксирибонуклеотидов приведена в таблице I. Плазмидную ДНК pGEG2 обрабатывали в одном случае PyuII для получения линейной формы, в другом случае Smal с вырезанием гена ФДЭ7. После денатурации и отжига двух линейных форм плазмидной ДНК с олигонуклеотидом-мутагеном этой смесью трансформировали клетки Е. coli. Скрининг мутантных клонов проводили гибридизацией на нитроцвллшгозных фильтрах с Р-меченным олигонуклетидом-мутагеном. Нуклеотидную последовательность мутантных генов определяли по модифицированному методу Максама и Гилберта.

Продукты синтеза рекомбинантных мутантных форм ФДЭ7 в экстракте из зародышей пшеницы обладали электрофоретической подвижностью сходной с ФДЭ7, выделенной из сетчатки.

тршнумтм хдяток X. eolt

Рис.2. Общая схема олигонуклеотид-направленного мутагенеза. Условные обозначения: 3=3та1, Р=Руи11.' Кодирующая последовательность кДНК ФДЭ7 закрашена черным .цветом.

Таблица 1. Сшсок мутантов ФДЗ7, полученных олигонуклеотид-направ-ленным мутагенезом.

№ Мутант Положе- Амино- Замена Олигонуклеотид, использо-

№ ние в кислот- ванный для мутагенеза*

струк- ный

туре остаток

ФДЭт

быка

1 Д2-7Н 2-7 деления 5 -GGTTTTAAATATGGCAGAGATCCGGT*

2 Р23Ь 23 Pro Leu 5 -AC CCGTCACTCTGAGGAAAGGGCC

3 Е240 ' 24 Arg Gly 5 -CCCGTCACÇCCGGGAAAAGGGCC

4 В2АЕ 24 Arg His 5 -CCGTCACTCCCÇAÇAAAGGGCCCCC

5 Н24К 24 Arg Lys 5 -CCGTCACTCCCAAÇAAAGGGCCCCC

б К25Н 25 Lys His 5 -TCACTCCCAGGÇAÇGGGCCCCCGAA

7 К251 25 lys Ile 5 -TCACTGCCAGGATÇGGGCCCCCGAA

8 К25И 25 Lys Arg 5 -TCACTCCCAGGÇGÇGGGCCCCCGAA

9 К25Б 25 Lys Ser 5 -TCACTGCCAGGAGÇGGGCCCCCGAA

10 К25Т 25 Lys Thr 5 -CACTCCCÇGTAÇTGGGCCCCCG

11 К29Т 29 Lys Thr 5 -GGGCCCCCGAÇTTTTAAACAGC

12 КЭШ 31 Lys Arg 5 -CCCGAAATTTAGACAGCGGCAAAO

13 К31Т 31 Lys Thr 5 -CCCGAAATTTAÇACAGCGGCAAAC

14 ИЗЗС 33 Arg Gly 5 -AAATTTAAACAAGGTCAAACCAGG

15 К45Т 45 Lys Thr 5 -CCCCCCAAGAÇÇGGGGTCCAAG

16 Р551 55 Pro Leu 5 -TGATGACATCCTGGGAATGGAAGG

17 С683 68 Cys Ser 5 -CACCGTCATCTGACCGTGGGAGGC

18 Р69Ь 69 Pro Leu 5 -CGTCATCTGCCTTTGGGAGGCCTT

19 те 77 Glu Gly 5 -AACCACCTGGGTTTACACGAGCT

20 У84А 84 Туг Ala 5 -GCTGGOCCAGGÇAGGCATCATCT

21 Д7С 81-87 деления 5 -AACCACCTGGAGTAGCCCTGGACC * * *

* Замененные нуклеотиды подчеркнуты;

** Нуклеотидная последовательность, расположенная между итальянскими буквами <30, 5'-ААТТТАОААССАССАААА кодирущая 2ой-Той аминокислотные остатки была делетирована;

***Нуклеотидная последовательность, расположенная между итальянскими буквами бГ, 5'-СТСССССАСТАССССАТСАТС кодирущая 81ой-87ой аминокислотные остатки была делетирована.

3. Изучение функциональных свойств мутантных форы ФДЭ7.

Для- изучения рекомбинантных мутантных форм 7-субьединицы были использованы три подхода: I) конкурентное встраивание радиоактивной ФДЭ7 в мембраны; 2) ингибирование активированной трипсином ФДЭ (ФДЭсф); и 3) активация фосфодиэстеразы, ингиби-рованной мутантными формами ФДЭ7 а-субьединицей трансдуцина в комплексе.с GTP7S.

7-субьединица конкурентно встраивается в мембраны НСП, содержащие эндогенную фосфодиэстеразу. Поскольку экспресси-рованная in vitro 7-субьединица является радиоактивно меченным белком, ее встраивание в НСП мембраны легко определить путем отделения связавшегося белка центрифугированием и просчета связавшейся радиоактивности. Количество рекомбинантной 7-субьединицы, связанной с мембранами НСП прямо зависело от ее добавленного количества. Для связывания ФДЭ7 и ее мутантных форм (рис.3) с мембранами НСП брали 4 пмоля каждого образца.

Рис.3. Относительное связывание мутантных форм ФДЭ7 с мембранами НСП в сравнении со связыванием рекомбинантной 7-субьединицей, которое принято за 100%.

При этом с мембранами НСП, содержавшими около 5 мкг ФДЭ, связывалось около 20% рекомбинантной ФДЭ7, что составляло приблизительно Ъ% от количества эндогенной 7-субьединицы. Из рис.3 видно, что хуже всего с мембранами взаимодействуют мутанты E24G и H3IT. Понижено сродство к мембранам у мутантов:К29Т, K3IR, R33G, P55L и Y84A, а также при делеции ' С-концевой части молекулы. Замена остатка цистеина в 68 положении на серин привела к некоторому увеличению связывания этой мутантной формы с мембранами НСП. У остальных мутантов (A2-7N, Р231, R24K, R24H, К25Н, K25I, K25R, K25S, К25Т, К45Т, P69L и E77G) сродство к мембранам не изменилось относительно сродства рекомбинантной ФДЭ7.

Наиболее изученная функция 7-субьединицы - неконкурентное ингибирование каталитических субьединиц. Кинетика ингибирования имеет сложный характер видимо в следствии того, что в состав голофермента входит две молекулы 7-субьединицц, причем связывание первой из них ведет к ухудшению связывания второй. Поэтому мы сравнивали активности полученных мутантных форм ФДЭ7 и рекомбинантной 7-субьединицы при нескольких значениях концентрации. Были выбраны такие концентрации рекомбинантной 7-субьединицы (0.1, 0.2, 0.4 и 0.8 нмоля), при которых остаточная активность каталитических субьединиц равнялась 80, 60, 32 и 18% соответственно. Исследованные мутантные формы 7-субьединицы, за исключением четырех (R24G, P69L, C68S и А7С), можно разделить на две группы. В первую (рис.4а) входит 10 мутантных форм, которые при всех концентрациях проявляли такую же способность ингибировать тФДЭ, как и рекомбинантная 7-субьединица. Во вторую группу (рис.46) входит семь мутантных форм: К29Т, K3IR, K3IT, R33G, Р55Ъ и Y84A. Они сохраняют такие т, как и у ФДЭ7 ингибиторные свойства при низких концентрациях и ухудшают их при более высоких. Две мутантные формы - P69L и A7N при всех концентрациях проявляли значительно сниженную по сравнению с рекомбинантной 7-субьединицей активность, а у одной - R24G, она отсутствовала вовсе (рис.5). G другой стороны у мутанта C68S при всех концентрациях ингибиторная активность оказалась несколько повышенной (рис.4а).

- э -

Рис.4. Относительное ингибирование тФДЭ мутантными формами ФДЭ7 при указанных концентрациях (нМ). Ингибиторный эффект рекомби-нантной ФДЭ7 принят за 100%.

У. МОТИВИРОВАНИЯ

128

га. в

8.5

-ту

-Ю46

1.5 2

ДОБАВЛСВНЫЙ ННГНЕНТОГ (мМ)

-»- Р6ЗД. Л7С

Рис.5. Ингибирование тФДЭ мутантными формами: 11240, Р691, Д7С. По оси ординат откладывалась остаточная активность фосфодиэсте-разы (%).

а-субьединица транедуцина в комплексе СТР7Б (Та-ОТРтБ) при концентрации 0.2 мкмоля в отсутствии мембран НСП обладала стимулирупцим действием на ФДЭ, которая была ингибирована рекомбинантной ФДЭ7 до разной степени (рис.6). Изученные мутантные формы ФДЭ7 имели различную ингибиторную активность (рис.4). Тем не менее оказалось, что в присутствии их. различных количеств Та-СТРтБ активирует ФДЭсф так же, как и в присутствии рекомбинантной 7-субьединицы. Мутангные формы 15246, Р69Ь и Л7С не исследовались этим способом из-за того, что их ингибиторная активность была значительно снижена по сравнению с активностью ФДЭ7. "Полученные данные позволяют предположить, что 'либо изменения в структуре 7-субьединицы не повлияли на ее взаимодействие с Та-СТ?73, либо такое взаимодействие, если оно имеет место, не является решающим для активации сф-субьединиц фосфодиэстеразы Та-СТРТБ.

V. НЯГНБИРОВАННЯ

Рис.6. Ингибирование тФДЗ 7-субьединицей фосфодиэстеразы в присутствии (0.2 мкмоля) и отсутствии . ТоиЗТР75. По оси ординат отложена остаточная активность МДЭ.

4. Влияние аминокислотных зацен и делеций в структуре 7-субъедишще на ее взаимодействие с каталитическими субьедини-цаш и а-субъединицей трансдуцина.

Связывание мутантных форм ФДЭ7 с мембранами по крайней мере в основном характеризует их сродство к каталитическим субьеди-ницам. Ранее нами было показано, что химическая кросс-сшивка радиоактивно меченой ФДЭ7 в мембранах НСП приводит к образованию ее комплексов только с ар-субъединицами. Кроме того, отмывка мембран НСП гипотоническим буфером (удаление ФДЭ) приводила к значительному снижению связывания с ними рекомби-нантной 7-субъединицы (данные не приводятся). Сравнивая результаты по связыванию с мембранами НСП мутантных форм ФДЭ7 с результатам^ по ингибированию ими каталитических субъединиц, можно сделать вывод о роли отдельных аминокислотных остатков ФДЗ7 в том или ином процессе.

Восемь мутантов в разной степени ухудшили свои свойства связываться с мембранами НСП: Н24С, К29Т, К31Н, К31Т, КЗЗС, Р55Ь, У84А и А7С. Особенно, значительно снижено сродство к

мембранам НСП у R24G что и является, очевидно, причиной отсутствия ингибирования этим мутантом каталитических субъединиц (рис.5). Столь резкое изменение свойств у этого мутанта с точечной заменой заставило нас обратить более пристальное внимание на остаток аргинина-24. Действительно ли он так важен для связывания каталитических субъединиц или изменение свойств мутанта R24G связано с резкими конформационными изменениями молекулы 7 субъеданицы? Две другие замены Arg в 24 положении -на His и Lys не привели к измененениям h^i в связывании с мембранами НСП, ни в ингибировании каталитических субъединиц. Следовательно, можно предположить, что замена Arg*Gly приводит к таким нарушениям третичной структуры 7-субъединицы, которые прекращают взаимодействие ее с aß-субъединицами ФДЭ, и что остаток Arg-24, по-видимому, не принимает участия в связывании каталитических субъединиц ФДЭ.

Остальные семь мутантов также имели ухудшенные ингибитор-ные свойства, однако до разной степени. Так, встраивание в мембраны НСП у К29Т, K31R и R33G было приблизительно таким же, как и у Д7С. В то же время ингибиторные свойства Л7С были повреждены в значительно большей степени (сравните рис.ББ и рис.6). Отсюда можно сделать вывод о том, что делеция с С конца 7-субъединицы приводит не только к ухудшению связывающих свойств, но и одновременно ингибиторных. Замена Суа на :ег в 68 положении привела к некоторому улучшению встраивания в мембраны НСП данного мутанта 7-субъединицы и, видимо, как следствие этого, к усилению его ингибиторных свойств.

Два мутанта - К45Т и P69L, полностью сохранив способность встраиваться в мембраны НСП, в то же время показали снижение ингибиторных свойств, незначительное в случае К45Т, и очень сильное в случае P69L. В случае последнего мутанта можно предположить, что замена Pro на Leu привела к изменению ориентации С-концевого участка молекулы, необходимой для ингибирования каталитических субъединиц. В пользу такого предположения свидетельствует тот факт, что согласно вторичной структуре ФДЭ7, рассчитанной по методу Chou-Fassman в 69 положении обнаруживается ß-изгиб, который отсутствует у мутанта P69L. На основании полученных результатов мы предлагаем следующую модель взаимодействия 7 субъединицы фосфодиэстеразы с каталитическими

субъединицами: в процессе взаимодействия существует две стадии - первичное связывание и ингибирование; в первичном связывании принимает участие центральный участок молекулы 7-субъединицы, богатый основными аминокислотными остатками и, в частности, остатки лизина 29 и 31 и остаток аргинина 33, а в процессе ингибирования основная роль принадлежит С-концевому участку 7-субъединицы. При этом на процесс ингибирования, по-видимому, главное влияние оказывает правильная пространственная ориентация С-концевого участка 7-субъединицы. В тоже время некоторое влияние С-концевой участок оказывает и на связывание 7-субъединицы с каталитическими субъединицами.

Другое изученное нами свойство 7-субъединицы - взаимодействие ее с а-субъединицей трансдуцина в процессе активации фосфЬдаэстеразы. Возможные механизмы такой активации предусматривают либо уход 7-субъединицы в комплексе с трансдуцином, либо перестройку голофермента фосфодиэстеразы таким образом, что 7-субъединица перестает оказывать свое ингибиторное действие на каталитические субъединицы в присутствии TCI-GTP7S, хотя и остается в комплексе с ними. В пользу существования как того, так и другого механизма в настоящее время собран ряд доказательств. В пользу модели, предполагающей освобождение 7-субьединицы из голофермента ФДЭ в комплексе с а-субьединицей трансдуцина, говорит тот факт, что а-субьединица трансдуцина обладает способностью связываться с ингибиторной субьединицей ФДЭ как в растворе, так и на плашках для ELISA. Существуют также данные, что при активации ФДЭ TCI-GTP7S в мембранах НСП происходит образование стабильного комплекса Та-ФДЭар72, связанного с мембраной; комплекса же Та-ФДЭ7 как мембраносвя-занного, так и растворимого не образуется. Более того, было показано, что Ta-GTP связывается с мембранами только в присутствии ФДЭ, которая, в свою очередь, увеличивает скорость гидролиза GTP. В свете вышеизложенного наши результаты, согласно которым активация трансдуцином тФДЭ, ингибированной мутантами 7-субъединицы, происходила практически до одинаковой степени, позволяют предположить, что имеет место прямое активирующее действие T01-GTP7S на ФДЭ» сопровождающееся удалением 7-субъединицы из ингибиторного центра на сф-субъединицах в отсутствие мембран НСП. При этом а-субъеданица трансдуцина в

основном взаимодействует только с каталитическими субьединицами ФДЭ, что и объясняет нечуствительность процесса активации к мутациям в структуре 7-субъединицы. В пользу такого предположения свидетельствует и факт отсутствия кросс-сшивок ФДЭ7 с а-субьединицей трансдуцина. Однако нельзя исключить и того, что активация каталитических субъединиц ФДЭ связана с взаимодействием 7-субьединицы с а-субьединицей трансдуцина, но полученные мутации не затрагивают участок взаимодействия этих двух субьединиц. Не исключено также, что взаимодействие трансдуцина с 7-субъединицей многоточечно и изменение одного аминокислотного остатка в 7-субъединице при точечных мутациях не оказывает заметного влияния на силу такого взаимодействия. Таким образом, чтобы сделать окончательный выбор между этими альтернативными механизмами необходимо дальнейшее исследование.

ВЫВОДЫ.

1. Методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза получено 14 рекомбинантных мутантных форм ФДЭ7.

2. В процессе взаимодействия 7-субьединицы ФДЭ с каталитическими субьединицами существует две стадии - первичное связывание и ингибирование. В первичном связывании!! принимает участие центральный участок молекулы богатый основными аминокислотными остатками, и в частности: К29Т, К31И и ИЗЗв.

3. В процессе ингибирования основная роль принадлежит С-концевому участку. Большое значение для процесса ингибирования имеет пространственная ориентация С-концевого участка 7-субьединицы. Некоторое влияние С-концевой участок оказываети на процесс связывания с каталитическими субьединицами.

4. Высказано предположение, что при активации фосфодиэстеразы а-субьединица трансдуцина непосредственно взаимодействует с каталитическими субьединицами ФДЭ.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях.

1. Skiba N. P., Udoviohenko I. P., Bondarenko V. A., Shirokova Е. P., Zozulya S. A., Lipkin V.M. Expression and site-speoific alteration of oGMP phosphodiesterase 7 subunit from oattle retina. - J. Cell. Bioohem., 1989, Supplément 13A, p. 100.

2. Lipkin V.M., Shamborant 0. N., Gubanov V. V., liuradov K. G., Udoviohenko I.P., Bondarenko V.A., Natochin M.Yu., Skiba N.P. Struotural and functional studies of cyolib GîfP phosphodiesterase. - J. Protein Chemistry, 1989, v. 8, No 3, p. 406-408.

3. Skiba N. P., Udoviohenko I. P., Natoohin M. Yu., Bondarenko V.A., liuradov H.G., Yurovskaya A.A. , Telnykh E.V., Lipkin V.ÎJ. G-protein - effector coupling: interaction of recombinant inhibitory 7 subunit and its mutant forms with transduoin and oatalitio subunits of the cGffi? phosphodiesterase. - J. Cell. Bioohem., 1990, Supplement 140, p. 119.

4. Xipkin V.M., Udoviohenko I.P., Bondarenko V.A., Yurovskaya A.A., Telnykh E.Y., Skiba N.P. Site-directed mutagenesis of inhibitory subunit of retinal rod cyclic GMP phosphodiesterase. - Biom. Soi., 1990, v. 1, No 3, p. 305-308.

5. Скиба H.П., Удовиченко И.П., Бондаренко В.А., Наточин М.Ю., Юровская А.А., Зозуля С.А., Широкова Е.П. , Липкин В.М. Экспрессия гена 7-субъединицы фосфодиестеразы cGMP наружных сегментов палочек сетчатки быка в клетках Escherichia call. - Биол. мембраны, 1990, т. 7, No 3, о. 230-24.2.

6. Мурадов Х.Г., Наточин М.Ю., Бондаренко В.А., Скиба Н.П., Липкин. В.М. Взаимодействие субьединиц фосфодиестеразы CGMP из палочек сетчатки быка.- Биол. мембраны, 1990, т. 7, № 6, с. 565-571.

7. lipkin V.M., Udoviohenko I. P., Bondarenko V.A., Yurovskaya A.A., Telnykh E.V., Khramtsov N.V., Skiba N.P. Site-direoted mutagenesis of inhibitory subunit of retinal rod oyolio GMP phosphodiesterase. - 9'th International congress of eye researoh, Helsinki, Finland. Abstracts, 1990, p. 53.

8. Наточин М.Ю., Мурадов Х.Г., Бондаренко В.А., Добрынина Л.Н., Скиба Н.П., Лкпкин В.М. Значение отдельных аминокислотных, остатков ингибнторной 7-субьединицы в ее взаимодействии с каталитическими а-, р-субьединицами фосфодиэстеразы CGMP из палочек сетчатки. - Виол, мембраны, 1991, т. 8, Ко 4, с. 443-444.

9. Muradov Kh.G., Bondarenko Y.A., Natochin M.Yu., Udovichenko I.P., Dobrynina L.N., Skiba N.P., lipkin У.М. Site-directed mutagenesis and ohemioal modification of. the retinal rod oGTP phosphodiesterases.- 8th symposium on ohemistry of peptides and proteins FRG-USSR, Aaohen, FRG. Abstracts, 1991 , p. 70.

10.V.A.Bondarenko, N.P.Skiba, L.N.Dobrynina, Kh.G.Muradov, M.Yu.Natochin, V.M.Lipkin Site-direoted mutagenesis of the bovine rod outer segment cGMP phosphodiesterase 7 subunit. -2th Russian-Israel symposium on peptides and proteins, Moscow, Russia, 1992, p. 39.

4.09.92 г. Зак. 5077P Тир. 125 экз. Уч.-изд.л. 1,0 Отпечатано на ротапринте J ОНШ ПНЦ РАН