Взаимодействие субъединиц фосфодиэстеразы цГМФ в мембранах дисков наружных сегментов палочек сетчатки тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им.М.М.ШЕМЯКИНА

на правах рукописи УДК 577.112.7

НАТОЧИН Михаил Юрьевич

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СУБЪЕДИНИЦ Ф0СФ0ДИЭСТЕРАЗЫ цГМФ В МЕМБРАНАХ ДИСКОВ НАРУЖНЫХ СЕГМЕНТОВ ПАЛОЧЕК СЕТЧАТКИ

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природннх и физиологически активных веществ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Пущино - 1990

Работа выполнена в Филиале Ордена Трудового Красного Знамени Института биоорганической химии им.М.М.Шемякина АН СССР

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

В.М. Липкин

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

заседании специализированного ученого совета Д002.35.01 при Институте биоорганической химии им.М.М.Шемякина АН СССР по адресу: 117871, ГСП-7, Москва, В-437, ул.Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в бибилиотеке Института биоорганической химии им.М.М.Шемякина АН СССР.

Автореферат разослан "¿У" о^-^а^Л 199^г.

П.П.Филиппов

кандидат химических наук О.Ю.Чертов

Ведущая организация: Институт белка АН СССР

Защита состоится

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

В.А.Несмеянов

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Система, осуществляющая передачу зрительного возбуждения, является уникальной по своей чувствительности. Она способна, как показано Зелигом Хечтом около 50 лет назад, стимулироваться даке одним квантом света. Однако, кроме такого совершенства в детекции света, у этой системы есть еще и способность изменять свою чувствительность более чем в десять тысяч раз, адаптируясь'к различным уровням фоновой освещенности. Это, наряду с высокой воспроизводимостью при передачи информации, делает понятным важность исследований, направленных на понимание механизмов, лежащих в основе восприятия и трансдукции светового сигнала.

Большая часть этих процессов происходит в наружных сегментах палочек сетчатки - специальных клеточных компартмен-тах, отделенных от остальной части палочек (внутренних сегментов) перетяжкой. Хорошо понят к настоящему времени основной путь передачи зрительного сигнала у позвоночных. Квант света, попадая в молекулу родопсина, изомеризует ее хромофор - 11-цис-ретиналь, вследствие чего образуется активный интер-медиат - метародопсин II, который обладает способностью активировать следующий белок каскада - трансдуцин, относящийся к классу О-белков. Активация заключается в обмене ГДФ на ГТФ у а-субъединицы трансдуцина, которая после этого становится способной взаимодействовать с фосфодиэстеразой цГМФ, либо образуя с ней комплекс, либо приводя к удалению ингибиторной 7-субъеди-ницы от каталитических ар-субъединиц.

К настоящему времени в лаборатории химии белка ИБХ им.М.М. Шемякина АН СССР определены первичные структуры всех трех субъединиц бычьей фосфодиэстеразы ЦГМФ и встал вопрос о механизме их взаимодействия мезэду собой и с а-субъединицей трансдуцина. Решение этого вопроса позволило бы объяснить особенности структуры фосфодиэстеразы, делающие ее уникальной среди ферментов этого класса и обеспечивающие столь важную функцию как быструю передачу зрительного сигнала со значительным коэффициентом усиления.

Одним из подходов к выполнению такой задачи является химическая кросс-сшивка субъединиц фосфодиэстеразы и анализ получаемых белковых комплексов с целью определения их субъединичного состава. Этот метод, наряду с методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза молекулы фосфодиэстеразы, позволяет локализовать участки первичной структуры ее субъединиц, ответ ственные за взаимодействие.

Цель работы. Настоящая работа является частью проводимого в Филиале ИБХ им.М.М.Шемякина АН СССР структурно-функциональв го изучения белков, отвечающих за передачу зрительного возбук дения.

Целью исследования являлась разработка метода химической кросс-сшивки субъединиц фосфодиэстеразы цГМФ в дисках наружны сегментов палочек сетчатки быка, определение состава полученк комплексов и идентификация участков ингибиторной у-субъединии важных для образования таких комплексов.

Научная новизна и практическая ценность работы. Функционг льно активная ингибиторная 7-субъединица фосфодиэстеразы и се ее мутантных форм экспрессированы in vitro в системе экстрам зародышей пшеницы. Подобраны оптимальные условия их экспресс! Получены моноспецифические поликлональные кроличьи антитела б обеим каталитическим субъединицам фосфодиэстеразы, используя качестве антигенов синтетические пептиды, соответствующие уш кальным участкам каждой из субъединиц. Разработан метод химической кросс-сшивки фосфодиэстеразы бифункциональным реагенте - N-гидроксисукцинимидным эфиром 3-малеимидобензойной кислоть мембранах дисков наружных сегментов палочек сетчатки.

С помощью антител к каталитическим субьединицам и авторадиографии меченой ингибиторной 7~субъединицы и ее мутантных форм определен субъединичный состав кросс-сшитых комплексов. Показана возможность раздельного существования каталитически? субъединиц в мембранах дисков. Каждая из каталитических субъ« диниц оказалась способна к образованию гомодимеров (ot^ и ß2) .к связыванию с 7-субъединицей.

Методом олигонуклеотиднацравленного мутагенеза показано, что замена в структуре 7-субъединицы Arg 24 * Gly приводит к

практически полной потере способности этого мутанта связываться с каталитическими субъединицами. Мутант Arg 33 *- Gly теряет эту способность только частично. Сравнение способности мутантов связываться с каталитическими субъединицами фосфодиэстера-зы с их ингибиторными свойствами позволило локализовать участки в молекуле 7-субъединицы, ответственные как за ту, так и за другую функцию. ;.■•..

Публикации. По теме диссертации опубликовано две статьи, результаты докладывались на Советско-Западноберлинском симпозиуме "Рецепторы и ионные каналы" (Западный Берлин, 1989), на Всесоюзном симпозиуме по химии белка (Тбилиси, 1990) и на э Международном конгрессе по исследованию глаза (Хельсинки, 1990).

Объем работы. Диссертация содержит 107 стр.. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (131 назв.). В обзоре литературы рассмотрены работы, посвященные механизмам регуляции фэсфодиэс-теразной активности в наружных сегментах палочек сетчатки, значению такой регуляции для передачи светового сигнала.

II. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Экспрессия рекоибинантной 7-субъединицы фосфодиэстеразы In vitro.

Для"экспрессии рекомбинатной 7-субъединицы фосфодиэстеразы в бесклеточной системе трансляции комплементарную ДНК, содержащую кодирующую часть гена, выделяли из плазмиды Р720, которую обрабатывали эндонуклеазами рестрикции BamHI и EcoRI. После электрофореза в агарозе фрагмент кДНК выделяли электроэлюцией Линейную форму вектора pGEM2 получали после обработки его эндонуклеазами рестрикции BamHI и EcoRI и затем бактериальной щелочной фосфатазой.

Клонирование- гена 7-субъединицы проводили, лигируя выделенный фрагмент ДНК с линейной формой экспрессируицего вектора pGEM2 (рис.1). Лигазной смесью трансформировали штамм Е.соП

НБ101• После скрининга бактериальных колоний был выделен клон содержащий плазмиду с геном 7-субъединищ, находящимся под ко тролем промотора РНК-полимеразы фага БР6 (рСЕ02). Структуру клонированного гена подтверждали анализом нуклеотидной послед вательности.

Ват Н|

СКРИНИНГ j

Рис.1. Схема клонирования гена 7-субъединицы для транскрипщ in vitro FHK-полимеразой фага SP6.

Транскрипция In vitro с использованием РНК-полимеразы фага SP6 позволяла в типичном эксперименте из 10 мкг плазмида pGEG2, переведенной в линейную форму обработкой ее эндонуклеазой рестрикции Hind III, получать около 500 мкг РНК. Оптимальное время трансляции для получения максимального количества 7-субъединицы определяли при инкубации смеси различное время при температуре 23°0. Оно оказалось равным 1.5 часам (рис.2). Транскрипцию и трансляцию семи мутантных форм 7-субъединицы проводили аналогично. Уровень синтеза белка определяли по включению восьми [14СJ-аминокислот - лейцина, глутаминовой кислоты, валина, аргинина, изолейцина, пролина, фенилаланина и треонина (уд.акт. 0.2 Ки/ммоль) в высаживаемый трихлоруксусной кислотой материал

Рис.2. Зависимость уровня трансляции 7-субъединицы от времени.

(белки).

Электрофорез продуктов трансляции in vitro в полиакрилами ном геле (градиент акриламида 7-30%) в присутствии додецилсул фата натрия (ДЦС-ПААГ) и электроперенос белков на нитронеллю-лозную мембрану с последующей авторадиографией выявил наличие единственной радиоактивной белковой зоны, имеющей подвижность идентичную бычьей 7-субъединице (рис.3, дор.2).

Экспрессированная радиоактивно меченная 7-субъединица был иммунопреципитирована антителами (7ФДЭ6), полученными к пепти ду, содержащему 73-87 аминокислотные остатки структуры 7-субг диницы. Эти антитела были любезно предоставлены д-ром Д.Таке» то (Канзасский университет, США). Комплекс 7-субъединица-ант1 тело связывался с белком А, иммобилизованным на Sepharose 4В-После этого Центрифугированием он отделялся от несвязавшегосг материала. Связанные со смолой белки денатурировали в Kmmet водяной бане в присутствии ДДС-Na и 2-меркаптоэтанола, смолу отделяли центрифугированием, а в сугорнатанте выявляли после электрофореза и окраски Кумасси только легкие и тяжелые цепи антител. Электроперенос и авторадиография продемонстрировали

Рис.3. Авторадиограмма электрс форе за в ДЦС-ПААГ продуктов т] нсляции in vitro мРНК т-субъе ницы: 1 - экстракт пшеницы в < сутствии мРНК 7-субъединицы; : то же, что и 1, в присутствии мРНК 7-субъединицы; 3 - то же что и 2, после обработки мура вьиной кислотой ; 4 - то же, и 2, после иммунопреципитации тителами 7ФДЭ6; 5 - мембраны : еле инкубации с меченой 7-суб единицей и отмывки; 6 - то же что и 2, после обработки трип ном.

наличие в оупернатанте также и радиоактивно меченной 7-субъеди-ницы (рис.3, дор.4).

Когда к трансляционной смеси добавляли 0.1 М муравьиную кислоту, прогревали при 70°С в течение 3 минут и центрифугировали, то радиоактивно меченая 7-субъединица оставалась в супернатанте (рис.3, дор.З). Кроме того, экспрессированный белок сохранял описанную для 7-субъедивицы чувствительность к трипсину. Обработка им в течение 3 минут при 0°С приводила к исчезновению ис-. ходной радиоактивно меченной белковой зоны и образованию диффузной зоны меньшей молекулярной массы (рис.3, дор.6).

Наконец, экспрессированная радиоактивно меченная 7-субъединица обладала способностью связываться с мембранами. Многократные отмывки их изотоническим буферным раствором после инкубации с трансляционной смесью (5°С, 20 мин) не приводили к удалению 7-субъединицы (рис.3, дор.5). Отмывка же мембран гипотоническим буферным раствором приводила, однако, к быстрой элюции из них меченой 7-субъединицы.

Функциональная активность экспрессированной 7-субъединицы была выявлена по ингибированию ею каталитических субъединиц, предварительно активированных кратковременной обработкой трипсином. Сравнение ее с активностью известных количеств 7-субъединицы позволило определить количество получаемой in vitro функционально активной 7-субъединицы. Оно оказалось равным 27-5 мкг/мл трансляционной смеси, т.е. в одном микролитре находилось приблизительно 2.7 пикомоля активного белка.

Зная удельную радиоактивность использованных меченных по углероду аминокислот и их количество в структуре синтезируемого in vitro полигоптида (45 остатков), т определили удельную радиоактивность 7-субъединицы теоретически, при условии, что холодных аминокислот - аналогов меченых в системе трансляции нет. Удельная радиоактивность 7-субъединицы в этом случае: 0.2 Ки/ммоль * 45 = 9 Ки/ммоль.

С другой стороны, было неожиданно обнаружено, что 7-субъеди-ница обладает способность» полностью сорбироваться стеклянными фильтрами GP/C. 5 мкл трансляционной смеси, содержащей 7-субъе-

диницу, наносили на фильтр GF/C и отмывали от аминокислот. Радиоактивность препарата составляла 54 ООО расп/мин*мкл, что со ответствует 24x10~9 Ки. Зная концентрацию функционально активной 7-субъединицы (2.7 пикомоля/мкл), можно определить значение удельной радиоактивности препарата экспрессированного белка. Оно оказалось равно 8.9 Ни/ммоль.

Как видно, и теоретическое, и экспериментальное значения удельной радиоактивности препарата у-субьединицы практически совпадают. Из этого следуют, что, во-первых, холодных аминокислот - аналогов радиоактивных в трансляционной смеси нет, а во-вторых, вся эксцрессированная 7-субъединица - активна.

Совокупность приведенных выше фактов позволяет утверждать, что нами экспрессирована In vitro функционально активная 7-субъединица .

2. Получение антител к каталитическим суСъединицаы фосфода эстеразы.

Для получения антител, специфичных к каждой из каталитичес ких субъединиц, использовали химически синтезированные пептида соответствующе N-концевым участкам субъединиц, в которых имее ся минимальная гомология: а-субъединица:

1. AcGly-Glu-Val-Thr-Ala-Glu-Glu-Val-Glu-Lys (остатки 1-1С

2. Arg-Ala-Lys-Val-Ile-Ser-Asp-Leu-Leu-Gly-Pro-Arg-Glu-Ala Ala-Val (остатки 28-43).

р-субъединица:

1. Asp-Gln-Tyr-Phe-Gly-Arg-Lys-Leu-Ser-Pro-Glu-Asp-Yal-Ala-Asn-Ala (остатки 20-35);

2. Glu-Asp-Gly-Arg-Pro-Glu-Gly-Oys-Thr-Ser-Phe-Arg-Glu-bei. (остатки 37-50).

Синтез пептидов осуществлен в груше пептидного синтеза Ф' им.М.М.Шемякина АН СССР. Каждый пептид в отдельности конъюгирс вали с альбумином глутаровым альдегидом. Для иммунизации крода ликов конъюгаты пептидов каждой субъединицы были объединены.

Моноспецифические антитела для каждой субъединицы фосфоди-

эстеразы были получены на носителе А1П-ае1 15 с пришитыми к нему пептидами. Полученные таким образом антитела к а- и (З-субъе-диницам - аФДЭп и рФДЭп не обладали взаимным перекрестом. Антитела использовали для идентификации каждой каталитической субъединицы и в свободном виде, и после химической кросс-сшивки.

3. Получение и анализ кросс-сшитых комплексов субъединиц фосфодиэстеразы в мембранах наружных сегментов палочек.

Химическую кросс-сшивку субъединиц фермента проводили прямо в мембранах. Для идентификации субъединиц, входящих в состав ко-валентно связанных Н-гидроксисукцинимидным эфиром 3-малеимидо-'бензойной кислоты (мвз) комплексов, проводилось разделение продуктов сшивки электрофорезом либо в 15% ДДС-ПААГ (0=0,53), (рис.4), либо в 8% ДДС-ПААГ (0=2,6) (рис.5).

1 2 3

65"

■ ¥.1

205 •180

92

' V .1

-205 -1Б0

-92

Рис.4 и 5. Электрофорез продуктов кросс-сшивки субъединиц фосфодиэстеразы в мембранах. Нитроцеллюлоза после электропереноса: 1 - окрашена антителами аФДЭп; 2 - антителами ¡ЗФДЭп; 3 - авто-радиографирована.

При этом оказалось, что в 8% ДЦС-ПААГ (рис.5) взаимное ра положение а- и (3-субъединиц меняется по сравнению с 15% (рис. гелем на обратное, т.е. а-субъеданица в этом случае обладает большей электрофоретической подвижностью, чем |3-субъединица.

Комплексы фосфодаэстеразы, содержащие меченую 7-субъедини цу, получали, инкубируя (5°С, 20 мин) в изотоническом буферно растворе 20 мкл суспензии мембран с 5-10 мкл трансляционной смеси. Мембраны после этого осаждали центрифугированием. Отде ление неспецифически связанного материала осуществляли путем пятикратного суспендарования мембран в изотоническом буферном растворе и последующего центрифугирования. Количество меченой (экзогенной) 7-субъединицы, связанной с мембранами, определял просчетом их суспензии в счетчике радиоактивности, а количест холодной (эндогенной) 7-субъединицы - по активации фэсфодиэст разы обработкой мембран трипсином. Доля меченой 7-субъединицы составляла около 5% от ее общего количества в мембранах.

Окрашиванием антителами 7ФДЭ6 (данные не приводятся) и ав торадиографией (рис.4(3) и рис.5(3)) показано, что в аддуктах сшивки также присутствуют оба вида 7-субъединицы. Субъединич! состав аддуктов сшивки приведен в табл.1.

Как видно из рис.4, 7-субъединица связывается и с а-, и с р-субъединицами, образуя огу- и (^-комплексы (зоны 3,4). Кроме того, (З-субъединица образует с 7-субъединицей второй комплекс с молекулярной массой около 150 кДа (зона 6). Однако образова ние аналогичного комплекса а- и 7-субъединиц наблюдалось толь ко в 8% ДЦС-ПААГ (рис.5, зона 7). Представляет особый интерес количественный субъединичный состав комплексов, соответствую!] зонам 5,6 и 7 (рис.5). Известно, что электрофоретическая подвижность кро.сс-сшитых комплексов значительно увеличивается, вследствие чего значения их кажущейся молекулярной массы силь занижаются. Учитывая этот факт, можно предположить, что зоне (масса 135 кДа) соответствует комплекс р2, а зонам 6 и 7 (мол кулярные массы 150 и 190 кДа) - комплексы р2Т и с^Т-

Следует отметить тот факт, что ни в одном случае не проис

Таблица 1. Субъединичный состав белковых зон на рис.4 и рис.5.

Электрофорез в 15% ДДС-ПААГ Электрофорез в 8% ДЦС-ПААГ

№ БЕЛКОВОЙ МОЛ.МАССА СОСТАВ № БЕЛКОВОЙ МОЛ.МАССА СОСТАВ

ЗОНЫ (КДа) ЗОНЫ (кДа)

1 85 Р 1 90 а

2 92 а 2 92 Р

3 105 Р.7 3 100 а,7

4 110 а, 7 4 108 Р.Т

5 135 Р 5 135 Р

6 148 Р.Т 6 150 Р.Т

7 190 а,7

ходило образования сшитых комплексов между разными каталитическими субъединицами вплоть до молекулярной массы 200 кДа. Полученные результаты свидетельствуют либо об отсутствии доступных для сшивающего агента реакционных амино- и тиольных групп в комплексах сф-субъединиц, либо об отсутствии таких комплексов в мембранах и, как следствие, о существовании независимых форм фосфодиэстеразы, имеющих состав с^т и р2Т или c^g и Р272*

Необходимо также отметить, что при инкубации мембран и трансляционной смеси происходила значительная активация фосфодиэстеразы, которая мало снижалась от присутствия в трансляционной смеси эксцрессированной 7-субъединицы, хотя то же самое ее количество практически полностью ингибировало активированную три-, псином фосфодиэстеразу в отсутствии мембран.

Этот факт объясняется наличием в трансляционной смеси креа-

тинфосфата и креатинфосфокиназы - системы, поддерживающей ко] центрацию ГГФ на постоянном уровне. Поскольку инкубация пров! далась на свету, то в присутствии ГТФ происходила активация трансдуцина и, соответственно, фосфодиэстеразы. Факт сохране сшивки меченой 7-субъединицы в этих условиях, видимо, говори' в пользу представления о том, что активация фосфодиэстеразы ] связана с физическим удалением от неё ингибиторной субъедини

4. Влияние аминокислотных замен в структуре 7-субъединшд на ее связывание с каталитическими субъединицаыи.

Ране© в нашей,лаборатории были получены мутантные формы ' субъединицы и определены их кинетические характеристики. Обозначение мутантов с указанием места мутагенеза приведено в табл.2. Мы также экспрессировали эти мутанты с целью измерен! их сродства к мембранам и способности образовывать кросс-сшич комплексы (рис.6).

Интенсивность полос в этих комплексах отражает сродство му тантных форм к каталитическим субъединицам. Сродство к мембрг нам определяли по радиоактивности после инкубации их с каждой мутантной формой 7-субъединицы (табл.3). Уровень экспрессии к зависел от мутаций, и это позволяло прямо сравнивать активное мутантов с активностью рекомбинантной 7-субъединицы при их се зывании с мембранами и кросс-сшивке с а- и с р-субъединицами.

Рис.6. Авторадиограмма электр фореза в 15% ДЦС-ПААГ (С=0.53 продуктов кросс-сшивки субъе? ниц фосфодаэстеразы в мембран после инкубации с мутантами 7 субъединицы: 1 - 724; 2 - 729 3 - 7ЗЗ; 4 - 745; 5 - 7ТТ; 6 784; 7 - 7Д81-87; 8-7.

?

Таблица 2. Обозначение мутантов 7-субъединицы.

МЕСТО МУТАГЕНЕЗА ОБОЗНАЧЕНИЕ МУТАНТОВ

Arg24 Gly 724

Ly¿29 => Thr 729

Arg33 =*> Gly 733

Lys45 =» Thr 745

Glu77 =» Gly 777

Tyr84 => Ala 784

Делеция 81-87 остатков 7Ä81-87

Так как радиоактивность белковых зон в кросс-сшитых комплексах мутантов коррелировала с их связыванием с мембранами, то можно сделать вывод о том, что взаимодействие с каталитическими субъединицами является необходимым и достаточным условием связывания 7-субъединицы с мембранами.

Полученные результаты по химической кросс-сшивке мембран с мутантами 7-субъединицы позволяют локализовать участки, важные

для взаимодействия с каталитическими субъединицами:

1. Замена Arg в 24 положении на Gly приводит к практичеет полной потере способности 724 взаимодействовать с каталитичес кими субъединицами (рис.6, дор.1).

2. Замена Arg в 33 положении на Gly (рис.6, дор.З) приво, к количественному уменьшению интенсивности радиоактивных поле кросс-сшитых комплексах 7ЗЗ по сравнению с рекомбинантной 7-е бъедиотцей (рис.6, дор.8).

Мутантные формы 729, 745, т77, 784 и 7А81-8У (рис.6, дор. 4,5,6,7) показывают идентичную с рекомбинантной 7-субъединице интенсивность полос в кросс-сшитых комплексах. .

Таблица 3. Функциональная характеристика мутантов 7-субъединицы.

ОБОЗНАЧЕНИЕ СВЯЗЫВАНИЕ КОНСТАНТЫ

МУТАНТОВ МУТАНТОВ С ИНГИБИРО-

7-СУББЕДШИЦЫ МЕМБРАНАМИ 1 ВАНИЯ, нМ2

724 0.7 30 ± 10

729 126 0.5 ± 0.1

733 25 0.2 i 0.1

745 134 0.1 ± 0.05

777 110 0.06± 0.02

784 119 1.0 ± 0.2

7A8I-87 80 5.0 ± 0.8

1- в процентах по отношению к связыванию 7-субъединицы

о 1

- Значение К{ для 7-субъединицы равно 0.05-0.02 нМ

Сравнительный анализ полученных результатов и данных по определению констант ингибирования тех же мутантов приводит к более детальным выводам о роли отдельных аминокислотных остатков в структуре 7-субъединицы, важных для связывания и ингибирования каталитических субъединиц (табл.3). Сопоставление результатов, приведенных в этой таблице, позволяет сделать заключение о по меньшей мере двух аминокислотных остатках в молекуле 7-субъединицы, отвечающих за ее связывание с каталитически® субъединицами (24 и 33 положения), и двух других участках, отвечающих за ингибирование каталитических субъединиц (29 и 81-87 положения).

ВЫВОДЫ

1. Экспрессирована in vitro функционально активная радиоактивно меченная ингибиторная 7-субъединица фосфодиэстеразы цГ<ЛФ и получены моноспецифические поликлональные антитела к каждой из ее каталитических субъединиц.

2. С помощью антител и радиоактивно меченной 7-субъединицы определен состав комплексов фосфодиэстеразы, полученных методом химической кросс-сшивки субъединиц этого фермента в мембранах дисков наружных сегментов палочек сетчатки.

3. Показано, что замена в 24 положении аминокислотной последовательности 7-субъединицы остатка аргинина на остаток глицина приводит к практически полной потере способности этой му-тантной форш к связыванию с каталитическими субъединицами, а аналогичная замена в 33 положении - только к частичной потере этой способности.

Описок работ, опубликованных по теие диссертации:

1. Llpkln V.M., Shamborant O.N., Gubanov V.V., Muraclov K.G., Udovichenko I.P., Bondareriko V.A., Natochin M.Yu., Sklba N.P. Structural and functional studies of cyclic GMI phosphodiesterase.- J.Protein Chemistry, 1989, y.8, № 3, p.406-408.

/2. Мурадов Х.Г., Наточин М.Ю., Бондаренко В.А., Скиба Н.П., Липкин В.М. Взаимодействие субъединиц фосфодиэстеразы cGffl из палочек сетчатки быка. - Виол, мембраны, 1990, т.7, № стр. 565-572.

3. Наточин М.Ю., Мурадов Х.Г., Бондаренко В.А., Скиба Н.П., Липкин В.М. Экспрессия ингибиторной субъединицы фосфодиэс1 разы cGMP из палочек сетчатки быка и ее взаимодействие с : талитическими субъединицами. - Всесоюзный симпозиум "Хими белков", Тбилиси, 1990, стр.143.

4. Muradov Kh.G., Natochin M.Yu., Bondarenko V.A., Sklba N.P Llpkln V.M. Interactions between bovine retinal rod cGMP phosphodiesterase subunlts. - 9th International congress Eye research, Helsinki, 1990, Abstracts, p.54.

5. Наточин М.Ю., Мурадов Х.Г., Бондаренко В.А., Добрынина Л. Скиба Н.П., Липкин В.М. Значение отдельных аминокислотных остатков ингибиторной у-субьединицы в ее взаимодействии с каталитическими а-,р-субъединицами фосфодиэстеразы cGMP i палочек сетчатки. - Биол. мембраны, 1991, т.8, № 2, стр.

28.11.90 г. Зак. 30I9P Тир.125 экз. Уч.-изд.л. 1,0 Отпечатано на ротапринте в 0НТ11 НИБИ