Бета-субъединица фосфодиэстеразы циклического ГМФ из сетчатки быка: нуклеотидная последовательность центральной и 3'-области кДНК тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

п П

АКАДЕМИЯ ОРДЕНА ТРУДОВОГО ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ

НАУК СССР КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ХИМИИ им. М.М.ШЕМЯКИНА

АТАБЕКОВА Надежда Владимировна

Э-СУБЪЕДИНИЦА Ф0СФ0ДИЭСТЕРАЗЫ ЦИКЛИЧЕСКОГО ГМФ ИЗ СЕТЧАТКИ БЫКА: НУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ЦЕНТРАЛЬНОЙ И 3'-ОБЛАСТИ кДНК

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1991

Работа выполнена в лаборатории белков гормональной регуляции Ордена Трудового Красного Знамени Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР.

Научный руководитель - кандидат химических наук Храмцов Н.В.

Официальные оппоненты: доктор химических наук Будовский Э.И. кандидат химических наук Ревердатто C.B.

Ведущая организация: Межфакультетская проблемная научно - исследовательская лаборатория иэлекулярной биологии и биоорганической

химии им.А.Н.Белогерского МГУ им.М.В.Ломоносова.

Защита состоится "<Р~ лсСЩ 1991 г. в 10 часов на заседании специализированного совета Д 002.35.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР по адресу: II787I ГСП-7, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. Ы.М.Шемякина All СССР.

Автореферат разослан " <¡2. " CUu-l£JiiS -I"! г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

В.А.НЕСМЕЯНОВ

;<г- ; : Актуальность проблемы. Одним из актуальных направлений "Ойооргашпесхой химии является структурно - функциональное исследование белков, ' принимающих участие в процессах восприятия, передачи и усиления зрительного сигнала. Ключевыми белками зрительного каскада позвоночных, локализованными в фоторецепторных клетках, являются такие белки как родопсин, трансдуцин и фосфодиэстераза циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ). Активируемая фотовозбужденным родопсином при посредстве ГТФ. - связывающего белка трансдуцина, цГМФ фосфодиэстераза (цГйФ ФДЭ) быстро гидролизует вторичный мессенджер цГМФ.что приводит к закрытию большого числа натриевых каналов в цитоплазма тиче с кой мембране, ее гиперполяризациш возникновению электрического сигнала, который передается другим клеткам.

цГМФ фосфодиэстераза палочек сетчатки состоит из двух больших родственных субъединиц а- и э, с молекулярными массами, по данным электрофореза в Бпз-полиакриламидном геле 84 и 88 кДа, соответственно. Маленькая субъединица - г (II кДа) -является внутренним ингибитором фермента: Для детального выяснения механизмов функционирования белков зрительного каскада необходимо иметь полную информацию об их структурной организации.

Ранее методами белковой химии были кзучены первичные структуры родопсина и г-субъединицы трансдуцина. Генно-инженерными методами определена нуклеотидная последовательность генов родопсина, а- , я- и 7-субьедишщ трансдуцина. Параллельным анализом белка и соответствующе® ему кДНК также были установлены полные первичные структуры а, г-субъеди-ниц цГМФ фосфодиэстеразы из палочек сетчаткж быка и нуклео-

тидная последовательность 5'-области кДНК /з-субъединицы.

Цель работы. Данная работа является частью исследований, проводимых в лаборатории белков гормональной регуляции Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР, по комплексному структурно - функциональному изучению цГМФ фосфодиэстеразы из сетчатки крупного рогатого скота. Целью представленной работы являлось клонирование кДНК из сетчатки быка; поиск клонов, содержащих фрагменты кДНК э-субъеди-ницы цГМФ фосфодиэстеразы и выведение на основании полной нуклеотидной последовательности кДНК аминокислотной последовательности данной субъединицы.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе клонированы фрагменты кДНК, содержаще 45 % структурной части гена 0-субъединицы фосфодиэстеразы циклического гуанозинмонофосфата (1196 п.о.), а также З'-нетрансли-руемая область (400 п.о.) и определена их полная нуклеотидная последовательность.

С учетом ранее клонированных в лаборатории фрагментов кДНК была реконструирована полная нуклеотидная последовательность кДНК 0-субъединицы цГМФ ФДЭ длиной ЗОН п.о. Выведенная на основе нуклеотидной аминокислотная последовательность фермента содержит 853 аминокислотных остатка. Вычисленная молекулярная масса - 98 308 Да.

Показана высокая степень гомологии с а-субъединицей фермента и а'-субъединицей ЦГМФ ФДЭ из колбочек сетчатки быка, также с рядом других представителей семейства фосфэдиэстераз циклических нуклеотидов. На основании выявленной гомологии в С-концевой области э-суОъединицы локализован район, в котором

располагается каталитический центр гидролиза цГМФ. Полученные результаты позволили начать работы по реконструкции полноразмерной кДНК 0-субъединицы цГМФ ФДЭ и ее экспрессии. Кроме того, клонированные фрагменты дают возможность вести работы по исследованию структуры фэсфодиэстераз из различных организмов и, прежде всего, из человека.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 2 статьи. Результаты работы докладывались на 5 и 6 Конференциях молодых ученых социалистических стран (Цувдно, 1988г. и Прага, 1989г.), на 14 Международном конгрессе по биохимии (Прага, 1988г.) и на Всесоюзном симпозиуме по химии белков (Тбилиси, 1990г.).

Объем диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсувдения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литератур! ( ссылок).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

I.Введение

Ранее в лаборатории белков гормональной регуляции ИБХ АН СССР была сконструирована клонотека кДНК из сетчатки быка (к.х.н. Заграничный В.Е., к.х.н. Василевская И.А.). В качестве вектора была использована экспрессирущая плазмида рис 8, позволившая провести скрининг библиотеки как при помощи синтетических олигодезоксирибонуклеотидных зондов, так и с использованием поликлональных антител к ц[1й ФДЭ. В результате проведенного скрининга был выделен клон рВ9. Далее с помощью синтезированных на основании структура кДНК этого

Pstl Boin EccRI Ncol Pstl I 500 Г " I *}00 EDO 1 2X0 | 2503_XCOno

тюамхомюяюбоогооеоо I я ш r" vwwTvm ix

pB67<---pB29i—

pB9 pBI2 pB22

paut

«peno

pB33t=

pB2<-;-i p853;

рви--

pBSZc рД'7.

рй-Tfif—

pBUfcsa

Рис.1. Частичная рестрикционная карта кДНК /з-субъздиницы фэсфодиэстеразы цГМФ из сетчатки быка и стратегия определения ее нуклеотидной последовательности. На координатной линейке заштрихована кодирувдая э-субъединицу область. Черными дрямоугольниками обозначены олигонуклёотиды, использованные при скрининге библиотек. Длина стрелок соответствует участкам ДНК, по которым выводилась структура. Незачерненный участок клона рВ42 соответствует не найденной в реконструированной структуре последовательности.

клона олигодезоксирибонуклеотидных зондов I(5'-cagaaccccggctt

cgcg—3') и 11(5'-tgcccctgccgacgaaattgttcaat-3') (рис.1), щш

повторном скрининге этой же библиотеки были идентифицированы еще ряд клонов рВ67, рВ12, рВ22, рВ2 и pBII.

Определение первичной структуры вставок этих клонов в совокупности с информацией о структуре клона рВЭ позволило установить последовательность фрагмента кДНК /з-субъединицы длиной 1472 п.о. (структурная часть кДНК длиной 1424 п.о. и • 5'-нетранслируемая область длиной 48 п.о.).

Фрагмент имеет непрерывную рамку считывания с инициирующим кодоном в положении 49-51, кодирует голипептид длиной 474 аминокислотных остатка и содержит информацию о „50 % последовательности кДНК ß-субъединицы цГМФ ФДЭ.

Целью представленной работы было установление полной нуклеотидной последовательности кДНК /з-субъединицы ЦГМФ фосфодиэстеразы и анализ первичной структуры фермента.

II. Поиск фрагментов кДНК, кодиругщих центральный участок ß-субъеданицы цГМ5 фосфодиэстеразы

и определение их нуклеотидной последовательности.

4 .Для нового скрининга сконструированной нами ранее клонотеки кДНК, синтезированной с помощью рассеянной затравки, был получен зонд III (к.х.н. Еыстров Н.С.).Структура этого зонда (5'- agagaacgcctcggg - 3') соответствует 3'-концевым областям клонов рВ2 и pBII, выделенных и исследованных ранее.

Скрининг осуществляли путем гибридизации колоний е.сои , выращенных после трансформации компетентных клеток (штамм

MH-I), рекомбинантными плазмидами. Колонии переносились на нитроцеллюлозные фильтры, лизировались и инкубировались с

Р-меченным зондом III. Метка вводилась при помощи -полинуклеотидкиназы фага Т4 и [г- Р]АТР. Анализ 5x10 трансформантов позволил выделить клоны рВ29 и рВ17, отобранные нами после повторной гибридизации с зондом III и давшие наиболее интенсивные сигналы . Из клонов были выделены плазмиды, оцределен размер содержащихся в них вставок и проведен их рестршстный анализ.

Определение вуклеотидной последовательности клонированных вставок кДНК проводили по модифицированному методу Макса-ма - Гилберта в твердофазном варианте, разработанному Чувпило и Кравченко (Чувпило и др., 1984).

Стратегия определения нуклеотидной последовательности представлена на рис.1. После расщепления плазмидной ДНК'соответствующей рестриктазой метка вводилась в рёстриктные

<зо

фрагменты при помощи соответствующего [а-Р]сШтр и фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I е.coli. Далее меченые по обоим

концам фрагменты расщеплялись одной или несколькими

1

подходящими рестриктазами для получения гомогенно ' меченых" укороченных фрагментов, ■ которые после этого разделялись электрофорезом в 5-8% ПААГ. В ряде случаев вместо дополнительного расщепления рестриктазами использовали цроцедуру "разделения комплементарных цепей полярно меченых фрагментов. Выделенные после элюции из ПААГ гомогенно меченые одно- и двухцепочечные фрагменты использовали для непосредственного определения их нуклеотидной последовательности.

Размер вставок клонов рВ29 и рВ17 составил 430 и 750 и.о. соответственно. Определение их последовательности позволило продолжить выявленную ранее непрерывную рамку считывания на 317 п.о. в сторону 3'-конца. Анализ структур клонов рВ29 и рВ17 показал, что до положения 1789 со стороны 5'-конца идет совпадение их последовательностей между сооой и со структурой остальных клонов.

Для дальнейшего продвижения в направлении 3'-конца кДНК цГМФ ФДЭ на основе структур 3'-концевых областей кДНК клонов рВ29 и рВ17 были синтезированы зонды iv(5'-ctgggtgtggttcga-3'), v(5'—cctgttctccgtgagcaa—3'), vi(5'—ttcacgctgctcatg—3'). было

также решено создать новую клонотеку кДНК, используя в качестве затравки при синтезе первой цепи кДНК олиго (dT)i2-I8- ^ полагали, что в такой клонотеке с большей вероятностью будут представлены фрагменты кДНК, кодирупще С-концевую область /з-субъединицы фермента.

III.Выделение иРНК и синтез кДНК.

Наш была проделана стандартная процедура выделения мРНК с использованием на первой стадии обработки измельченных в 'жидком азоте сетчаток быка буферным раствором на основе хлорида лития и мочевины. Для ингибирования рибонуклеаз и выделения недеградированных молекул РНК был использован ванадилрибонуклеозидный комплекс. Отсуствие при выделении заметной деградации РНК определяли по наличию в электрофоре-граммах агарозного геля четко выраженных полос 28s и íes рРНК (рис.2).

Дальнейшая очистка мРНК проводилась с помощью аффинной

хроматографии полученного препарата тотальной РНК на о лито (с!т) целлюлозе. Выделенная после двух циклов хроматографии поли(А+ )мРНК составила 3,5% от общего содержания РНК в клетке, что согласуется с литературными данными.

В качестве затравки при синтезе первой цепи кДНК использовали олиго(ат)£2_|д.

А Б В Г Д '

Рис. 2. Электрофоре грамма выделенной РНК в 1% агарозном геле: А - поли(А)- - фракция РНК; Б -промывка колонки 0,1 М раствором Nací; в - поли(А)+ фракция РНК; Г - несвязавший-ся материал после нанесения на колонку поли (А)+ фракции; Д - поли(А)+ фракция РНК после двух циклов хроматографии.

Проведение аналитических экспериментов по синтезу первой цепи показало, что наибольший выход продукта наблюдается при двухкратном избытке затравки по отношению к мРНК-, поэтому это

соотношение было использовано наш для получения препаративного количества первой цепи кДНК. Реакцию вели с применением обратной транскриптазы из вируса миелобластоза птиц в присуствии всех четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфа-тов. Выход первой цепи составил 21%, длина полученных фрагментов по данным щелочного электрофореза в среднем составила 500-1500 п.о.(рис.3).

-6557 п.о. -4361 п.о.

-2322 п.о. "2027 п.о.

-564 п.о.

А Б В

Рис. 3. Авторадиограмма продуктов, синтезированных на мРНК и первой цепи кДНК, разделенных в 1,4% щелочном агарозном геле: А - синтезированная двухцепочечная кДНК; Б - первая цепь кДНК, синтезированная с затравкой олиго ( йт ) 22—18 ■ в ~ Ф31"3 гидрэлизован-ная рестриктазой нлпа ш.

- 10 -

Синтез второй цепи проводили с использованием ДНК-полимеразы I е.со-и и РНКазы Н. Выход второй цели составил 80%, средняя длина полученных фрагментов - 500-1500 п.о. (рис.3).

IV. Создание клонотеки кДНК. В качестве вектора для клонирования была выбрана успешно используемая нами плазмида риса . в качестве метода клонирования - лигирование по тупым концам. Для этого полученная кДНК обрабатывалась ДНК-полимеразой фага _Т4 в присуствии всех четырех дезоксирибонуклеозидгрифэсфатов. Плазмадную ДНК предварительно гидролизовали рестриктазой эта! и для уменьшения выхода нерекомбинантных клонов дефосфорили-ровали. Для снижения вероятности образования при лигировании рекомбшантных молекул со вставками нескольких молекул кДНК вектор брали в десятикратном избытке. Полученным набором рекомбинантных молекул трансформировали компетентные клетки

с

е. соа штамм МН-1. Выход рекомбинантов обычно составлял 10 на I мкг кДНК. Количество нерекоибшантных клонов не превышало 10%.

V.Поиск клонов, содержащих фрагменты 3'-области кДНК р-субъединицы фосфодиэстеразы циклического ГМФ и определение их нуклеотидной последовательности. Скрининг полученной библиотеки кДНК, репрезентативностью 3x10 клонов, радиоактивномечеяыми зондами IV и V выявил 15 клонов, дающих положительный сигнал гибридизации. Размер содержащихся в них вставок в среднем составлял 300-400 п.о. и

лишь один клон рВ42 имел вставку размером 780 п.о.. Для исследования первоначально были выбраны клоны рВ42, рВЗЗ, рВ82, рВЮО. Было найдено, что плазмиды этих клонов несут вставки длиной 750 , 390 , 283 и 512 и.о. соответственно. Определение и анализ нуклеотидной последовательности этих вставок показали, что фрагменты клонов рВЗЗ, рВ82 и рВЮО практически целиком лежат в исследованной ранее структуре. Таким образом, от положения 1789 в направлении 3'-области кДНК удалось продвинуться лишь на 106 п.о. до положения 1895. Далее до положения 1916 следует продолжение клона рВ82. Необходимо отметить, что последовательность полипептидной цепи, выведенная на основе нуклеотидной, проявляет высокую степень гомологии с последовательностью а-субъединицы цГМФ ФДЭ. Причем эта гомология обнаруживается до положения 1916 в координатах кДНК. Определение нуклеотидной последовательности вставки клона рВ42 показало ее полное совпадение с уже известной структурой кДНК, кодирующей <з-субъединицу непосредственно с 5'-конца вставки (координаты 1701 ) только до положения 1862. В направлении 3'-области вставка клона рВ42 продолжается еще на 619 п.о. Эта область кДНК клона рВ42 не 4 проявляла гомологии со структурой кДНК а-субъединицы фермента, поэтому мы предположили, что кДНК этого клона, начиная с положения 1862 не принадлежит структуре, кодирующей ß-субъединицу фосфодиэстеразы. Остается неясным, по какой причине в скринированных банках кДНК не обнаруживаются полноразмерные клоны с фрагментами, кодирующими /з-субъединицу фермента. Интересно, что наши соавтор! из Чикагского Университета, параллельно с нами исследовавшие р-субъединицу

дГЫФ ФДЭ, столкнулись с подобной проблемой, несмотря на то, что в качестве вектора для клонирования кДНК ими было использовано одно из цроизводных фага л., потенциально способного к встраиванию вставок гораздо большей длины, чем использованный нами плазмидный вектор. Из 100 положительных д-клонов, отобранных ими при скрининге 2x10® фаговых бляшек, лишь один клон оказался полноразмерным.

Для дальнейших исследований было решено синтезировать еще два олигонуклеотидных зонда VII (5 '-сстсастсссссссгстс-з ') и VIII (5'—тссссосассаасаа—з'), соответствующих 3'-концевой области установленной структуры с координатами 1818-1835 и 1851-1865 п.о. соответственно. С помощью этих радиоактивно-меченых зондов было обнаружено 8 гибридизующихся клонов. Выявленные клоны также гибридизовали с зондами ш, IV, V, VI и, после установления размера содержащихся в них вставок, для определения нуклеотидной последовательности был отобран один клон рВЗб, содержащий вставку длиной 1450 п.о..

Определение и анализ нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента подтвердили наши первоначальные предположения о несоответствии полученной наш ранее структуры 3'-области кДЕК клона рВ42, начиная с положения 1862 и далее в направлении 3'-конца, истинной структуре кДНК /з-субъединицы ЦШФ ФДЭ. Наличие негомологичного участка в структуре этого клона видимо можно объяснить лигированием по тупым концам разных молекул кДНК с одной молекулой вектора.

Таким образом установлено, что клон рВЗб содержит вставку кДНК, в которой 679 п.о. кодируют неизвестную ранее

С-концевую область структурного гена g-субъединицы. На протяжении всей длины кДНК этого клона проявляет существенную гомологию со структурой кДНК а-субъединицы фермента, а до положения 1916 со стороны 5'-области кДНК совпадает со структурой найденных наш ранее клонов. Однако, з определенной структуре терминирующего кодона обнаружено не было. На основании гомологии со структурой , кодирующей С-концевую область а-субъединицы, можно было ожидать нахождение терминирующего кодона в пределах 10-20 последующих нуклеотидов. В структуре последних 3'- концевых нуклеотидов клона рВЗб был выбран участок длиной 19 п.о., обладающий минимальным сходством со структурой соответствующего участка кДНК а-субъединицы, и на основе его последовательности был СИНТеЗИрОЕЗН зодд ix (5'—tctgcaacggcggcccggc—3').

Скрининг 150 ООО новых трансформантов из тлевшейся у нас клонотеки радиоактивномеченым зондом ix, позволил обнаружить десять клонов, дававших положительный сигнал гибридизации. Для определения нуклеотидной последовательности было отобрано два клона рБ44 и рВ53, со вставками 135 и 1270 п. о. соответственно. Структура вставки клона рВ44 совпадала со структурой 3'-концевой части кДНК клона рВЗб и продолжалась далее , включая терминирующий кодон и 27 п. о. 3'-нетранслируемой области. Анализ установленной структуры клона рВ53 показал ее полное совпадение с установленной ранее стру к турой, начиная с положения 1741 в направлении 3'-конца, включая терминирующий кодон. Также была получена информация о структуре 3'-нетранслируемой области кДНК с положения 2636 до положения ЗОН.

- 14 -

vi.Днализ и реконструкция полной нуклеотидной последовательности кДНК р-субъедешицы фосфодиэстеразы циклического ГМФ из сетчатки быка.

Таким образом, определение нуклеотидной последовательности выделенных клонов, в совокупности с полученной ранее информацией о клонах рВ9, рВ67, рВ12, рВ22, рВ2 и рВП, позволило реконструировать структуру кДНК /з-субъединицы фосфодиэстеразы циклического ГМФ из сетчатки быка длиной ЗОН п.о. (структурная часть 49 - 2606 п.о.)(рис.4).

Триплет атс, находящийся в положении 49-51, является, по всей вероятности, инициирующим кодоном. Во-первых, он входит в состав последовательности рчссатс, типичной для сайта инициации трансляции (Козак, м. 1984). Во-вторых, его положение совпадает с соответствующими инициирующими кодонами а- и а'- субъединиц ЦГМФ фосфодиэстераз из палочек и колбочек сетчатки быка.

Терминирующий кодон находится в положении 2607-2609, а на расстоянии 369 п.о. от него в положении 2978-2983 3'-нетранслируемой области расположен сигнал полиаденилирования ААТААА, после которого через 8 нуклеотидов начинается последовательность поли А.

Выведенная из нуклеотидной последовательности аминокислотная последовательность фермента содержит 853 аминокислотных остатка. Рассчитанная молекулярная масса белка составляет 98 308 Да. Правильность полученной структуры подтверждается ее соответствием аминокислотным последовательностям большого количества пептидов Оромцианового и триптического гидролизатов смеси а- и э-субъединиц. Ряд из

* I I. I Е 5 в « " > * Р 0 ч ■ 3 Гэ а ' « •, I I I I » { Е * * » » ? « ^ > ■ с « т » » * | '- « * ; :

I »

с е

Э!»Г1|Я1А0!1<1> I ■ > » м * ( С » » * }|'«0С1ТвТ1Т11;1А т> ». !. » * 5 С 2 »4

э > » » » ; » л|акк04'2?т}С0(бУГ1*т11Г(Т1 ■ с с 1 т и 1 I I 1 мисс Т1* и*

I I III ; П П ( С Г о К М ' > » I 1 т I « С в I * ) г и т < | х

4шкт т ьассатутцтмдц цди, те гст гст1с*?дктатцстг>тетссдгбйСА1бьць<д гсд/ «тслтегтьс^ссз :: и

I Г ' С I П Т I « 8 ? < И ¡> > > > « « Т Р 9 I I I 1 I Р Т С т 1 9 т 1 ч * 6 С [ I ! ^ ¿»4

е.—^т£л.-_-~тте~. ~ 1.гутг^- уут^тгитгтетчт.тт»^ —ГУ1** "Ч " 1 ЧТ^ТТГТТ Г1 № '«У ГГТГТ Ух *П ГТГУп^'^У"1' Ч' ИМ

*8пмд|.А1С1'Т*1гдС}*'1Са1*адрдрС11#1Г0(«г1091вм1 » * « » I • л<

I I М I I « I » Г » т < ч I т г т М (б«КГГО£О0£?1ХС!1Т0Г1СИ1У1*Т0Т 04

т I С я I ( I { I I К О 1 А о в Я ч 1 т т ■ СВ1(С1О111>7агЯ1<К(ГДОСС£0С Ш А

« « » V « ! » I » 8 » » К Г Н т Е м М 1 и С 1 [ I ? 1 У < с • I О И Т ' • 1 6 Ч Ч % к * О Ц4

I ' с И 1 » « * 1 * * * < < « Т < * 1 т т >1 ■ у ч II н П м Т I « Т '■ I ■ Т 8 < ж ч * » т Р »4

гацасттт^тетцек^а^бтгат 19 50

I I 1 И » » М » I с П ! Й « I < т>,« р 8 I ( п П I < ( I » 8 1 ш

нее

' I И I ( I I I I I м I М М II Е " I I II I I Р 1 * ? 1 1 ! 1 I * П ' ( ( I г II М I ! п Ш

£гкжт!еас|у«стк!1сттяс г т ? « иитпии: кшпн т > г ?я

11А»|*¥£В601£«Т11в00^1»И11В»»*АД1».Р*1в»»Г1в»ТСТГ»ТС 7М 1

ибттгеагтт— пг«гилг Л ЦЦУГЬУ ЧТ "Й ^ *-Г 8 ?!Ы>

' * " ■ Т ? ^ ' * ии I » I « п I » [ » 1 п ( т I I и I I п п И м и и ш

б • I : : » » « • * • « I « : : « : I • ш

Рис. 4. Нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующая *з-субъединицу фосфодаэстеразы из сетчатки быка и ссответствущая ей аминокислотная последовательность. Подчеркнута последовательность аминокислот, установленная путем анализа пептидов бромцианового гкдролнзата смеси сс- и /з-субъедишц фермента : одной чертой - пептида уникальные для /з-субъединщн; двумя чертами - пептиды найденные как в /з-,так и в а-субъединицах.

этих пептидов не обнаружен в а-субъединице (подчеркнуты на рис. 4 одной чертой).

Сравнение структур кДНК выделенных клонов выявило ряд точечных различий мевд ниш, не вызывающих замены кодируемой аминокислоты. Кроме того ранее была выявлена гетерогенность в аминокислотных последовательностях (З-субъединицы, кодируемых разными клонами: в положении 40 полипептидной цепи в клонах рВ9 и рВ22 кодируется аргинин, а в клонах рВ12 и рВ67 -цистеин. Вероятно, в данном случае мы имеем возможность наблюдать явление полиморфизма, обусловленное существованием аллельных вариантов белка в пределах популяции.

VII.Анализ аминокислотной последовательности (з-субъединицы цГМФ фосфодиэстеразы из сетчатки быка.

ы-концевая аминогруппа /з-субъединицы блокирована. К сожалению, не удалось выделить ы-концевой пептид фермента из продуктов расщепления и поэтому природа блокирующей группировки не установлена. В а-субъединице цГМФ ФДЭ из палочек в процессе посттрансляционной модификации наблюдается отщепление ы-концевого остатка метионина и ацетилирование последующего остатка глицина. Таким же образом в 0-субъединице трансдуцина отщепляется и-концевой остаток метионина и ацетилируется следующий за ним остаток серина. Ввиду того, что ацетилирование ы-концевого серина - довольно широко распространенное явление для эукариотических белков, вполне вероятно, что аналогичный- процесс характерен и для 0-субъединицы фосфодиэстеразы .

- 17 -

Аминокислотная последовательность з-субъединицы цГМФ фосфэдиэстеразы из палочек имеет 72% гомологии с а-субъедини-цей и 62% гомологии с <*'-субъединицей колбочек сетчатки. Наименее консервативными участками являются n- и с-концевые фрагменты (аминокислотные остатки 1-95 и 825-853).

Недавно в ы-концевой области /з-субъединицы был обнаружен домен, являющийся центром некаталитического связывания цГМФ, аналогичный обнаруженному (Чарбони и соавт. 1989) в <*-, «'субъединицах цГМФ ФДЭ и цГМФ-стимулируемой фосфодиэстеразе из сердца быка. Он включает в себя около 300 аминокислотных остатков. Отмечено наличие двух участков внутренней гомологии по 120 остатков кавдый. Для з-субъединицы это последовательность в положении 125-241 и 330-454 полипептидной цепи, гомология мезду ними составляет 29 %.

Еце раньше на основании сравнения аминокислотных последовательностей ряда фосфодиэстераз циклических нуклеотидов был выявлен строго консервативный, протяженный участок гомологии длиной около 250 остатков. Данные о каталитической активности и иммунологические исследования этого домена, позволили охарактеризовать этот участок как каталитический центр гидролиза циклических нуклеотидов. Нами была проанализирована аминокислотная последовательности з-субъединицы цГМФ ФДЭ. При сравнении ее со структурой консервативных участков других фосфодиэстераз циклических нуклеотидов в С-концевой области нами был также обнаружен высокогомологичный охарактеризованным выше областям домен (рис.5). Каталитический центр предположительно .локализован нами на участке полипептидной ' цепи з-субъединицы, имеющем координаты 550-790 аминокислотных

ы iitiiti»ieiH«i«iii|^ytf»*f iii*§y»syit«y*«)Mj^U.,ee y

aiaïaatti^"aaaiat^JacIgaa.4JcчуniiîH5№nacUfflatk M

. ...................................... . .... .. ...

raTtaTaTaliaïaaitcalataa

kiiQaite-ijiterj«- ¡¿¿aeiiEi "h i *m%t aij*|t a a a • «Jr

F se. 5. Гомология аминокислотных последовательностей фосфодиэстераз циклических нуклеотвдов. Alpha, beta, а- и э-субъединицы цГМФ ФДЭ из палочек сетчатки быка; cone, а•-субъединица цПЮ ФДЭ из колбочек сетчатки быка; ces - цПЮ стимулируемая ФДЭ из сердца быка; Са /Cam - кальмодулинзависимая ФДЭ из мозга быка; dne - ЦАМФ ФДЭ из Drosopbila; Ye - ФДЭ 2 циклических нуклеотвдов из дрожжей Saccbaromyces cerevisiae. В рамку заключены аминокислотные остатки, идентичные у трех и более представителей семейства фосфодиэстераз. Области I в II являются участками внутренней гомологии в пределах некаталитического центра связывания цГМФ. В пределах каталитического центра ферментов отмечены потенциальные элементы гуанинсвязывапдих центров. Последовательность аминокислот СААХ предопределяет посттрансляционный процессинг белка.

остатков.

В пользу такого предположения свидетельствует наличие в фоторецепторных ферментах в пределах этого участка трех элементов гуанидинсвязываицих центров : глицин богатой петли сх3о(А)хдск(К), мд^-связывавдего элемента ох2с и участка шоси, предположительно участвующего в связывании гуанинового кольца (рис.5). Однако, в структуре /з-субъединицы элемент июш заменен на нкха. Исходя лишь только из сходства структур каталитических доменов исследованных ферментов, нельзя сделать вывод о том, какие именно аминокислотные остатки вовлечены в функционирование активного центра. ' Однако, в пределах консервативных областей высокореакционноспособные остатки гистидина являются постоянными. Все они занимают различные позиции, тем не менее они являются наиболее вероятными кандидатами на участие в функционирование активных центров этих ферментов.

Известно, что полипептидная цепь а-субъединицы цГМФ фосфодиэстеразы подвергается посттрансляционной модификации на С-ковде. В канонической последовательности СААХ (суэ-(алифатическая аминокислотапредставленной в а-субъединице как суз-суБ-Уа1-с1п, происходит протеолитическое отщепление 2 или 3 концевых аминокислот и карбоксиметилирование концевого остатка цистеина. В С-концевой последовательности а'-субъединицы также имеется последовательность ' СААХ, определяющая модификацию. В этом случае концевой остаток цистеина модифицируется в изопренильный тиоэфир. В отличие от указанных случаев, С-концевая последовательность э-субъединицы - сув-Агд-Ие-ьеи.

Так как отсуствуют данные о модификации полипептидной цепи 3-субъедишщы цГМФ ФДЭ, то в настоящее время трудно судить о том, ведет ли наличие Arg в составе этой последовательности к ингибированию С-концевого цроцессинга з-субъединицы или- не ведет.

ВЫВОДЫ

1. Создана представительная библиотека кДНК из сетчатки быка и получена серия рекомбинантных плазмвд, содержащих фрагменты кДНК, кодирующие центральную и С-концевую область З-субъединицы фосфодиэстеразы циклического ШФ.

2. Установлена нуклеотидная последовательность фрагментов кДНК выделенных клонов, что, в совокупности с полученной ранее информацией, позволило реконструировать полную первичную структуру кДНК длиной ЗОН и.о., содержанию структурный ген ß-субъединицы фермента, состоящий из 2559 п.о.

3. На основе полученной структуры выведена аминокислотная последовательность р-субъединицы цГМФ фосфодиэстеразы из сетчатки быка длиной 853 остатка.

4. Выявлена существенная гомология между выведенной аминокислотной последовательностью з-субъединицы и соответствующей последовательностью а-субъединицы фермента, составляющая 69,9 *.

5. На основании изучения гомологии ряда представителей семейства фосфодиэстераз циклических нуклеотидов сделано предположение о существовании'в С-концевой области з-субъеди-

- 21 -

ницы каталитического центра гидролиза ЦГМФ.

Основные результаты диссертации изложены в следующих

публикациях:

1. Структурные исследования цикло-ГМФ-фосфодизстеразы из сетчатки быка. Василевская И.А., Атабековз Н.В., Заграничный В.Е., Ищенко К.А., Мурадов Х.Г., Храмцов Н.В..Губанов В.В. - Сборник тезисов v конференции молодых ученых социалистических стран по биоорганической химии, Пупдано, 1988, с.88.

2. Structural investigations of cyclic GKP phosphodiesterase from cattle retina. Ishchenko K.A., Zagranichny V.E., Gu-banovV.V., Khraaitsov N.V., Vasilevskaya I. A., Atabekova N.V., Rakitina T.V., Feshchenko E.A., Muradov Kh.G., Shu-vaeva T.M., Surina E.A., Lipkin V.M. - Abstracts of 14th International Congress of Biochemistry, Prague (Czechoslovakia), 1988, v.4, p.140.

3. Structural investigations of cyclic GMP phosphodiesterase from cattle retina. Ishchenko K.A., Zagranichny V.E., Gu-banovV.V., Khramtsov N.V., Vasilevskaya I.A., Atabekova N.V. - Abstracts of the 6th International conference of

4 young scientists on organic and bioorganic chemistry, Prague (Czechoslovakia), 1989, p.90.

4. Фосфодиэстераза циклического ГМФ из сетчатки быка. Аминокислотная последовательность /з-субъединицы и нуклеотидная последовательность соответствующей кДНК. Липкин В.М., Губанов В.В., Храмцов Н.В., Василевская И.А..Атабекова Н.В., Мурадов Х.Г., Шуваева Т.М., Сурина Е.А., Заграничный В.Е., Ли Т. - Еиоорган. химия, 1990, т.16, Nl, с.118-120.

5- The (3-subunit of bovine rod photoreceptor cGMP phosphodiesterase. V.M. Lipkin, N.V. Khramtsov, I.A. Va-silevskaya, N.V. Atabekova, K.G. Muradov, V.V. Gubanov, T. Li, J.P. Johnston, K.J. Volpp, and M.L. Applebury -J. Biol. Chem., v.265, No.22, pp.12955-12959.