Конструирование реагентов для направленного расщепления рибонуклеиновых кислот тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Список принятых сокращений

ВВЕДЕНИЕ

I. КАТАЛИЗАТОРЫ ГИДРОЛИТИЧЕСКОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ СВЯЗИ Р-О В НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТАХ И МОДЕЛЬНЫХ СУБСТРАТАХ Ф (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР)

1.1. Конструирование реагентов для направленного 12 расщепления нуклеиновых кислот

1.2. Гидролитический механизм расщепления Р-О связей 14 1.2.1. Гидролитическое расщепление фосфодиэфирных связей в РНК

1.3. Расщепление Р-О связей различных субстратов природными биокатализаторами

1.3.1. Расщепление Р-О связей в каталитических центрах ферментов

1.3.2. Расщепление фосфодиэфирных связей в присутствии НК-зимов

1.4. Расщепление Р-О связей под воздействием неприродных агентов

1.4.1. Расщепление Р-О связей ионами металлов и металлокомплексами

1.4.2. Расщепление Р-О связей аминосоединениями и короткими пептидами

1.5. Моделирование каталитических центров металлозависимых ферментов, гидролизующих Р-О связи в различных субстратах

1.6. Моделирование каталитических центров металлонезависимых рибонуклеаз ф 1.7. Реагенты, расщепляющие РНК по определенным участкам структуры

1.7.1. Конъюгаты на основе полициклических соединений

1.7.2. Конъюгаты на основе поликатионов

1.8. Сверхспецифичные рибонуклеазы на основе конъюгатов олигонуклеотидов с каталитическими группами

1.9. Методы синтеза олигонуклеотидных конъюгатов, содержащих реакционноспособные группы 93 Заключение

II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

III. КОНСТРУИРОВАНИЕ ОРГАНИЧЕСКИХ КАТАЛИЗАТОРОВ ГИДРОЛИТИЧЕСКОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ РНК. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

III. 1. Синтетические катализаторы на основе полициклических ароматических соединений

III. 1.1. Конструирование и синтез РНКазомиметиков на основе полициклических ароматических соединений

III. 1.2. Гидролитическая активность РНКазомиметиков на основе полициклических ароматических соединений

III.2. Синтетические катализаторы на основе поликатионных соединений

111.2.1. Конструирование и синтез РНКазомиметиков на основе коротких катионных пептидов и пептидоподобных молекул

111.2.2. Гидролитическая активность РНКазомиметиков на основе коротких катионных пептидов и пептидоподобных молекул

111.2.3. Конструирование и синтез РНКазомиметиков на основе бис-четвертичных солей 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана

111.2.4. Гидролитическая активность РНКазомиметиков на основе четвертичных солей 1,4-диазабицикло[2.2.2]-октана. Зависимость гидролитической активности от строения

111.2.4.1. Сравнение рибонуклеазной активности соединений с различным доменным составом

111.2.4.2. Сравнение рибонуклеазной активности соединений с различными каталитическими группами

111.2.4.3. Влияние количества положительных зарядов в РНК-связывающем домене на эффективность расщепления

111.2.4.4. Влияние длины линкера, связывающего каталитическую группу с диазабициклоокановым фрагментом, на эффективность расщепления фосфодиэфирных связей

111.2.4.5. Влияние строения алифатического остатка в РНК-связывающем домене РНКазомиметиков на эффективность расщепления фосфодиэфирных связей

111.3. Предполагаемый механизм гидролиза РНК химическими рибонуклеазами

111.4. Высокоспецифичные катализаторы расщепления РНК на основе конъюгатов олигонуклеотидов с РНК-гидролизующими конструкциями

III.4.1. Синтез и свойства олигонуклеотидных конъюгатов, содержащих каталитические группы, присоединенные к олигонуклеотидам через 5'- или 3'- концевые фосфамидные группы

III.4.2. Синтез и свойства олигонуклеотидных конъюгатов, содержащих каталитические группы, присоединенные к олигонукпеотидам через 5'- концевые фосфодиэфирные группы

Ф III.4.3. Синтез и свойства олигонуклеотидных конъюгатов, содержащих каталитические группы, присоединенные к 5'- или 3'-концевым фосфамидным группам через промежуточные полициклические соединения

III.4.4. Другие подходы к конструированию олигонуклеотидных конъюгатов, содержащих каталитические группы

111.4.4.1. Синтез и свойства олигонуклеотидных конъюгатов, содержащих каталитические группы на основе дендримерных конструкций

111.4.4.2. Конструирование конъюгатов, содержащих каталитические группы в середине олигонуклеотидного 259 адреса

Одним из основных научных направлений биоорганической химии и молекулярной биологии является разработка теории и методов направленного воздействия на биополимеры. Среди объектов для адресованного химического воздействия особый интерес представляют нуклеиновые кислоты, являющиеся носителями генетической информации. Создание реагентов, избирательно взаимодействующих с определенными видами нуклеиновых кислот, открывает возможность селективного воздействия на функционирование отдельных генов с целью коррекции протекающих в организме биохимических процессов и возможность селективного повреждения находящихся в организме чужеродных нуклеиновых кислот для подавления размножения инфекционных агентов (бактерии, вирусы, микоплазмы и т.д.). Такие реагенты окажут революционизирующий эффект на стратегию лечения практически всех заболеваний, поскольку открывают возможности воздействия на самые глубинные источники патологических состояний.1,2,3'4'5

Наиболее эффективным подходом к конструированию реагентов, направленных на определенные нуклеиновые кислоты, является синтез реакционноспособных производных олигонуклеотидов.6 Перспектива создания рациональных подходов в химиотерапии, основанных на применении производных олигонуклеотидов, вызвала в последние годы появление большого количества работ, связанных как с синтезом такого сорта реагентов, так и с изучением их химической и биологической активности.

Если на первом этапе развития исследований в этой области стоял вопрос о принципиальной возможности избирательных воздействий на нуклеиновые кислоты посредством реакционноспособных олигонуклеотидных производных, то после доказательства этой возможности встал вопрос о выборе реакционных групп, обеспечивающих высокоэффективную и селективную модификацию нуклеиновых кислот.

Известен широкий спектр реакционноспособных соединений, вызывающих деструкцию нуклеиновых кислот. Для расщепления ДНК в настоящее время используются главным образом соединения, несущие в качестве реакционноспособных групп комплексы металлов с переменной валентностью, способные катализировать процессы, ведущие к разрушению нуклеозидов;7'8'9 ен-дииновые соединения, способные в определенных условиях генерировать бирадикальные частицы, реагирующие с обеими цепями ДНК и вызывающие их одновременный ю разрыв; а также алкилирующие соединения, реакция с которыми приводит к модификациям нуклеозидов, вызывающим ослабление гли'козидных связей и, как следствие, их разрушение.11'12 В последние годы широкое распространение получили реагенты, расщепляющие ДНК по фотоокислительному механизму,13'14 а также реагенты на основе природных и синтетических металлонезависимых антибиотиков, генерирующих гидроксильные радикалы (варацин, лизоклинотоксин и др.).

7,15,16

В отличие от ДНК, РНК проявляют значительно большую устойчивость к окислительному расщеплению.17 Деградация РНК под действием металлозависимых антибиотиков, таких как блеомицин18'19и ен-дииновые антибиотики (неокарциностатин, эсперамицин и др.),20 протекает со значительно меньшей эффективностью по сравнению с ДНК. В то же время РНК гораздо легче подвергается гидролитическому расщеплению. Чрезвычайно интересным направлением в области создания реагентов для направленного гидролитического расщепления нуклеиновых кислот является конструирование катализаторов на основе РНК и ДИК.21'22'23'24,25

Всем перечисленным выше реагентам характерен ряд существенных недостатков. В частности, как отмечалось выше, наиболее широко используются соединения, расщепляющие нуклеиновые кислоты по радикальному механизму. Однако образующиеся высоко реакционноспособные радикальные частицы обладают низкой избирательностью, что приводит как к разрушению нецелевых биополимеров, так и к быстрой инактивации самих реагентов. Низкой специфичностью обладают также соединения, несущие алкилирующие группы, которые способны реагировать со многими функциональными группами белков. Реагенты на основе ионов металлов находят широкое применение в структурных исследованиях, однако их высокая токсичность делает такие реагенты малоперспективными для их применения в биологических системах. Необходимость формирования сложноорганизованного комплекса между протяженными участками РНК-мишени и нуклеотидной последовательностью катализаторов на основе нуклеиновых кислот приводит к тому, что такие соединения, обладая очень высокой специфичностью, имеют крайне невысокую эффективность по сравнению с белковыми катализаторами.26

При создании реагентов на основе олигонуклеотидных конъюгатов с природными белковыми катализаторами ' также возникает ряд проблем. Природные нуклеазы помимо каталитических центров содержат собственные аффинные центры, что неизбежно сказывается на специфичности таких конъюгатов. Другой важной проблемой является сохранение каталитической активности фермента или антибиотика в процессе получения его конъюгата с олигонуклеотидом.

Идеальным решением в плане разработки химических реагентов для расщепления нуклеиновых кислот явилось бы создание синтетических катализаторов, имитирующих процессы, которые протекают в активных центрах природных катализаторов, расщепляющих Р-0 связи.

Структурный анализ активных центров таких ферментов29 приводит к обнадеживающему выводу. Ферменты бесконечно вариабельны по структурам аффинных центров, но в значительной степени консервативны по структурам каталитических центров. Таким образом, можно надеяться, что, имея в своем распоряжении знания по строению каталитических центров ферментов и механизмам их функционирования, при использовании современного арсенала органической химии удастся создать высокоэффективные синтетические катализаторы, расщепляющие нуклеиновые кислоты с эффективностью, близкой или даже превосходящей эффективность природных ферментов. При этом предпочтение следует отдавать максимально простым соединениям, которые в минимальной степени будут вносить искажения в нативную структуру нуклеиновых кислот.

Целью настоящей работы является разработка общих подходов к конструированию высокоактивных катализаторов расщепления фосфодиэфирных связей в рибонуклеиновых кислотах путем моделирования каталитических центров природных ферментов, расщепляющих Р-0 связи в различных субстратах; создание с помощью таких подходов реагентов, способных осуществлять направленную деструкцию РНК в физиологических условиях; исследование способности таких соединений катализировать расщепление нуклеиновых кислот; изучение механизма функционирования полученных соединений с целью создания на их основе сверхспецифичных синтетических рибонуклеаз, пригодных для структурных исследований и биомедицинских приложений.

I. Катализаторы гидролитического расщепления связи Р-О в нуклеиновых кислотах и модельных субстратах (литературный обзор) 1. Конструирование реагентов для направленного расщепления нуклеиновых кислот

Соединения, способные избирательно расщеплять нуклеиновые кислоты по определенным участкам структуры, должны, подобно ферментам, содержать в своей структуре два домена: связывающий, способный образовывать специфический комплекс с определенными участками нуклеиновых кислот (целевыми участками), и каталитический, осуществляющий гидролиз фосфодиэфирных связей вблизи или в пределах участков связывания.

Селективность связывания с нуклеиновыми кислотами могут обеспечивать некоторые пептиды, образующие комплексы с определенными нуклеотидными последовательностями или элементами трехмерной структуры РНК, а также низкомолекулярные органические соединения, такие как интеркаляторы,30 поликатионы31 и аминогликозиды.32,33 Некоторые аспекты взаимодействия низкомолекулярных лигандов с нуклеиновыми кислотами рассмотрены в работах.34'35'36

Наибольшей избирательностью при связывании с РНК-мишенью обладают олигонуклеотиды и их аналоги. Теоретически, комплементарный олигонуклеотид может быть направлен на любую представляющую интерес нуклеотидную последовательность РНК. Дополнительным преимуществом таких реагентов является то, что все они могут быть синтезированы по универсальной технологии. Нуклеотидные последовательности длиной 20 звеньев являются уникальными даже в сложноорганизованных геномах. При этом такой длины комплементарных олигонуклеотидов оказывается достаточно для обеспечения узнавания и эффективного связывания с РНК-мишенью в физиологических условиях. В последние годы разработан ряд аналогов олигонуклеотидов, устойчивых к действию клеточных ферментов и способных образовывать с нуклеиновыми кислотами комплексы более прочные, чем комплексы природных олигонуклеотидов.37,38,39'40,41'42 Все это позволяет считать синтетические олигонуклеотиды (или их аналоги) наиболее перспективными аффинными структурами для направленного воздействия на нуклеиновые кислоты.

В качестве групп, расщепляющих РНК, могут быть использованы природные РНК-гидролизующие соединения - ферменты и антибиотики. Так, были получены конструкции на основе олигодезоксирибонуклеотидов и блеомицина,43 природных ферментов -рибонуклеазы S,44 и РНКазы Н,45 способные избирательно расщеплять РНК вблизи последовательностей, связывающих конъюгаты. Однако ферменты, так же как и антибиотики, помимо каталитических центров содержат собственные РНК(ДНК)-связывающие структуры, что неизбежно сказывается на специфичности таких конъюгатов и вызываемых ими эффектах в биологических системах. Это обстоятельство, а также сложность сохранения каталитической активности фермента (антибиотика) во время синтеза таких конъюгатов позволяют считать использование в качестве реакционноспособных групп ферментов и природных антибиотиков малоперспективным.

Предпочтительными являются более простые соединения, не содержащие собственных аффинных центров и в то же время обладающие высокой каталитической активностью. Создание эффективных низкомолекулярных катализаторов является многоплановой задачей, включающей как поиск эффективных реакционноспособных групп для построения каталитического центра, так и выбор наиболее эффективного механизма расщепления фосфодиэфирных связей.

Как уже отмечалось выше, в отличие от ДНК, РНК обладает существенно более высокой стабильностью по отношению к реагентам, расщепляющим нуклеиновые кислоты с участием различных радикальных частиц.16'46'47 В то же время в силу своего строения РНК склонна к гидролитическому расщеплению.

Заключение

В настоящей работе впервые реализован комплексный подход к созданию синтетических катализаторов расщепления рибонуклеиновых кислот, основанный на структурно-функциональном анализе каталитических центров природных ферментов, расщепляющих фосфодиэфирные связи, и конструирование на основе такого анализа структур, обладающих высокой каталитической активностью. Введение таких групп в молекулы, обладающие сродством к различным элементам РНК, и исследование каталитической активности полученных конъюгатов в реакциях с различными РНК-субстратами и модельными соединениями в широком диапазоне условий позволили выявить ряд закономерностей "структура-свойства", определяющих эффективность и селективность функционирования искусственных рибонуклеаз. Коррекция структур с учетом полученных результатов тестирования каталитической активности позволили создать соединения, не имеющие аналогов среди синтетических органических соединений по эффективности и селективности гидролиза РНК в физиологических условиях.

Полученные в результате настоящей работы РНКазомиметики являются новым классом структурных зондов, являющихся стабильными химическими соединениями, функционально активными в широком диапазоне условий, и в то же время обладающими высокой специфичностью и эффективностью, сопоставимыми по этим параметрам с природными рибонуклеазами.

Предложены оригинальные методы синтеза конъюгатов дезоксирибоолигонуклеотидов с каталитическими группами. Разработанные подходы позволяют существенно расширить спектр модифицированных олигонуклеотидов за счет введения в их структуру группировок, лабильных в условиях олигонуклеотидного синтеза. Разработанные методы отличаются простотой, что позволяет получать модифицированные олигонуклеотиды различной структуры с широким спектром лигандов в лабораториях, не имеющих опыта в органическом синтезе. Основным преимуществом предложенных методов является возможность получения широкого ряда модифицированных олигонуклеотидов при использовании ограниченного набора исходных соединений. Данное преимущество было использовано при оптимизации ' строения каталитических центров сверхспецифичных РНКазомиметиков.

Конъюгаты дезоксирибоолигонуклеотидов с предложенными каталитическими группами проявляют каталитическую активность, сопоставимую с каталитической активностью природных рибозимов, однако, в отличие от природных рибозимов, РНКазомиметики содержат более короткую нуклеотидную последовательность.

Полученные результаты открывают новые перспективы в конструировании эффективных и малотоксичных терапевтических препаратов на основе производных олигонуклеотидов.

1. D.G. Knorre, V.V. Vlassov, V.F. Zarytova, A.V. Lebedev, O.S.

2. Fedorova. Design and targeted reactions of oligonucleotidederivatives. CRC, Boca Raton, 1994.

3. D.S. Sigman, T.W. Bruice, A. Mazumder, C.L. Sutton. Targeted

4. Щ( chemical nucleases. //Ace. Chem. Res. 1993. V. 26. P. 98-104.

5. H.E. Moswr, P.B. Dervan. Sequence-specific cleavage of doublehelical DNA by triple helix formation. // Science. 1987. V. 238. P. 645-650.

6. P.D. Cook. Antisense research and applications. (Eds. S.T. Crooke B,1.bleu) CRC, Boca Raton, 1993.

7. С Helene, J.-J. Tulme. Oligodeoxynucleotides. Antisense inhibitors of^ gene expression. (Ed. J.S. Cohen) Macmillan Press, London, 1989.

8. N.I. Grineva, G.G. Кафоуа, L.M. Kuznetsova, T.V. Venkstem, A.A.

9. Bayev. Complementary addressed modification of yeast tRNA Val 1with alkylating derivative of d(pC-G)-A. The positions of the alkylated nucleotides and the course of the alkylation in the complex. // Nucleic.

10. Acids Res. 1977. V. 4. P. 1609-1631.

11. Д.Г. Кнорре, O.C. Федорова, Е.И. Фролова. Окислительнаядеградация нуклеиновых кислот. // Успехи химии. 1993. Т. 62. ^ 70-91.

12. K.W. Pogozelski, T.D. Tullius. Oxidative Strand Scission of Nucleic

13. Acids: Routes Initiated by Hydrogen Abstraction from the Sugar

14. UoiQXy.//Chem. Rev. 1998. V. 98. P. 1089-1108.

15. C.J. Burrows, J.G. Muller. Oxidative Nucleobase Modifications1.ading to Strand Scission. // Chem. Rev. 1998. V. 98. P. 1109-1152.

16. J.L. Hue, Y.C. Xue, M.Y. Xie, R. Zhang, T. Otani, Y. Minami, Y.

17. Yamada, M. Casaazza. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1993. V. 90. P.2822-2831. ® ^