Комплементационная точность сайт направленной модификации на примере взаимодействия 16S pPHK ESCHERICHIA COLI с алкилирующими производными олигонуклеотидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ЮВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

На правах рукописи УДК 577.113.7; 547.963.32

Зенкова Марина Аркадьевна

КОМПЛЕМЕНТАЦИОННАЯ ТОЧНОСТЬ САЙТ

НАПРАВЛЕННОЙ МОДИФИКАЦИИ НА ПРИМЕРЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ 16S рРНК ESCHERICHIA COLI С АЛ КИЛ И РУ ЮЩИ М И ПРОИЗВОДНЫМИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ

(02.00.10 биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации па соискание ученой степени кандидата химических па\к

Новосибирск 1990

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО АН СССР

Научный руководитель - кандидат химических наук

Карпова Г.Г.

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Защита состоится

доктор химических наук Кулико1 В. Ф. кандидат химических наук Каргинов В.А.

Химический факультет Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова

|990 года в. ^

на заседании Специализированного совета К 003.52.01 в Новосибирском институте биоорганической химии по адресу: 6300Э0. Новосибирск-90, проспект акад.ЛаврентьеЬа 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО АН СССР

Автореферат разослан " .

Ученый секретарь Специализированного совета,

кандидат химических наук , Федорова О.С.

Актуальность проблемы. Основной принцип взаимодействия нуклеиновых кислот - принцип комплементарное™ - положен в основу подхода для направленной модификации нуклеиновых кислот, предложенного Н.И.Гриневой и названного комплементарно адресованной модификацией. Благодаря многочисленным интересным возможностям, открываемым этим подходом, включая направленное воздействие на внутриклеточные процессы, а также благодаря успехам в области олигонуклеогидного синтеза, метод комплементарно адресованной (сайт-направленной) модификации привлекает в последние годы все Возрастающее внимание. В основу этого подхода положены два процесса: первый - реакционноспособкое производное олигонуклеотида (адреса), комплементарного определенному участку молекулы нуклеиновой кислоты (матрицы), образует с этим участком специфический комплекс и таким образом направляет действие (адресует) ре-акциониоспособной части молекулы; второй - непосредственно химическая реакция функциональной части реагента (алкилирование, фотомодификация, расщепление) с каким-либо основанием вблизи этого участка. Таким образом, комллементационная точность взаимодействия является<определяющей для успешной сайт-направленной модификации молекулы нуклеиновой кислоты.

Первые работы по сайт-направленной модификации, выполненные под руководством Н.И.Гриневой, продемонстрировали высокую эффективность реакции в комплексе на примере алкилирования I6S+23S ррнк е. col i бензилиденовнми производными олигоаденилатов, а данные по локализации точек модификации тРНК >СНЕС1 и ciROHgNH- производными олигонуклеотидов показали, что комллементационная точность узнавания несовершенна и может приводить к множественной модификации нуклеиновых кислот.

Наиболее простыми моделями для изучения процесса сайт-направленной модификации оказались фрагменты одноцепочечной ДНК с маловыраженной пространственной структурой или отдельные оли-голезсксирибонуклеотиды. С использованием этих моделей в качестве матриц для комплементарно адресованной модификации было продемонстрировано высокоселективное алкилирование нуклеотидных остатков вблизи участков связывания реагентов, образующих с ним совершенные комплексы. На основании этого можно было полагать, что несовершенная комллементационная точность является характерной чертей комплементарно адресованной модификации нуклеиновых кислот, обладающих достаточно сложной пространственной организацией.

Реакционноспособные производные олигонуклеотидов широко используются в настоящее время не только для сайт-направленной модификации нуклеиновых кислот , но и в качестве зондов для молекулярной гибридизаци, ингибиторов трансляции и транскрипции нуклеиновых кислот in vitro и in vivo. Кроме того, производив олигонуклеотидов начинают приобретать все большее значение как диагностические и лекарственные средства. В связи с этим, компле-ментационная точность взаимодействия олигонуклеотидов и их производных с участком связывания становится чрезвычайно важной проблемой сайт-направленного воздействия на нуклеиновые кислоты.

Цель работы. Целью работы является изучение комплементацион-ной точности сайт-направленного воздействия на нуклеиновую кислоту с известной первичной структурой, обладающей достаточно сложной простраь^твенной структурой; оценка уровня адресованнос-ти, а также факторов, позволяющих повысить комплементационную точность взаимодействия. В качестве матрицы была выбрана I6S рРНК Escherichia coli и четыре реагента dípCCTACGCTT>rA>CKRCl (I), d(pACCTTGTT)rA>CHKCl (XI). dtpTTACGACT)rU>CHKCl (III), d(pTTTGCTCCCC)r.A>CHKCi (iv), комплементарные участкам I6S рРНК, различающимся по характеру участия в формировании вторичной структуры молекулы I6S РНК.

Научная новизна. Впервые на примере сайт-направленного алки-лирования бензилиденовыми производными дезоксирибоолигонуклео-тидов высокомолекулярной РНК, обладающей ярко выраженной пространственной структурой, идентифицированы все комплексы, в составе которых протекает алкилирование РНК. Оценена комплементацион-ная точность модификации и определены относительные стабильности ■несовершенных комплексов, в которых протекает эффективное алкилирование матрицы. Кроме того, исследовано влияние термодинамических и кинетических факторов, а также стабилизирующих комплекс олигонуклеотидов-эффекторов на специфичность сайт-направленного алкилирования. Впервые показана принципиальная возможность расщепления молекулы РЖ в составе ковалентных аддуктов - продуктов сайт-направленной модификации - с помощью РНКазы Н. Показана принципиальная возможность использования программы контекстного анализа для предсказания сайтов модификации.

Практическая ценность. Предложен метод расщепления РНК в составе ковалентных аддуктов, образующихся в результате комплемен-

тарно адресованной модификации, который может быть эффективно использован для сайт-направленного расщепления молекулы РНК по всем участкам связывания, "адресованного" реагента. Разработан подход к идентификации участков взаимодействия РНК с реакционно-способными производными олигонуклеотидов, который в настоящее время интенсивно используется для идентификации участков алкили-рования 18s рРНК в составе 80S рибосом человека аналогами мРНК. Апробация работа. Результаты работы докладывались на 20М (Новосибирск, 1985 г.), Зем (Тбилиси, 198?) и 40М(Киев, 1989) рабочих совещаниях "Органическая химия НК-дуплексов." и на международном рабочем совещании "Perspectives in Therapeutic and diagnostic application of oligonucleotide derivatives (Новосибирск,1988). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 статей. Объем и структура работы. Диссертация изложена на 221 странице машинописного текста, состоит из трех глав, введения, выводов, списка цитируемой литературы из 267 наименований и содержит 28 рисунков и 16 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Выбор модели для изучения комплементационной точности сайт-направленной модификации.

В настоящей работе в качестве модели для изучения комплементационной точности (.селективности ) сайт-направленной модификации была выбрана I6S рРНК Escherichia coli - высокомолекулярная РНК (длина 1542 нуклеотидных остатка), для которой известна первичная структура, достаточно хорошо изучена вторичная структура и предсказаны некоторые элементы третичной структуры (Brimacombe and Steige,1985). В качестве реагентов для комплементарно адресованной модификации были выбраны бензилиденовые производные четырех олигодезоксирибонуклеотидов: d((рССГАССИТТ)rA>CHRCl (I), d(pACCTTGTT)rA>CHRCl (II), d(pTTACGACT )rU>CHKCl (III), d(pTTTGC-Tcccc)rA>CHRCi (IT), комплементарных районам I6S рРНК, различающимся по характеру участия в формировании вторичной структуры молекулы. При выборе участков I6S рРНК, к которым адресовались реагенты I - IV, исходили из модели вторичной структуры I6S рРНК, предложенной в работе (Noller and Woese,i98i). Схематическое изображение участков I6S рРНК, выбранных для сайт-направленной модификации, представлено на рис.1.

с, /а"

Л-U C-G C-G А-С C-G G-A G-C G • А A-G G' U U-A. G-C G'U G'U U-A a-G G-V C-G A-U A-U .A-U„

II

-1500

•UAACCGUAGG0

GWGGCGUCC,

G A

А

U

С

А

С

С

U

С

С

0 -1540 U

790

Рис Л. Схематическое изображение участков, к которым адресовались реагенты 1-17 (обозначены сплошной линией) и участок связывания олигонуклео-тида-эффектора (обозначен пунктирной линией).

Кинетические характеристики алкилирования I6S рРНК реагентами I - IV.

Адресованное алкилирование I6S рРНК реагентами I - IV проводили при концентрации РНК ("0,8 - 1,0 МО"6 М; использование более высоких концентраций приводит к резкому снижению доступности молекулы РНК для алкилирования вследствие ее самоагрегации (Гринева и др,1978). По количеству радиоактивности во фракции I6S рРНК (отделение фракции рРНК от не вступившего в реакцию реагента проводили с помощью гель-фильтрации; количество рРНК определялось по площади пика ) легко определяется степень модификации РНК.

Реакция комплементарно адресованной модификации I6S рРНК реагентами ] - IV исследовалась при 20° и 40°С. Для достижения предельной во времени степени модификации реакцию проводили 170 ч при 20°С и 12 ч при 40°С, что соответствует 5-6 периодам полупревращения реагента в его активное производное эти-лениммониевый катион (Власов и др,1969). Степень модификации РНК возрастает с увеличением избытка реагента, имея тенденцию к насыщению,и падает с повышением температуры алкилирования, что характерно для реакций, протекающих в комплексе. Дополнительным подтверждением того, что модификация 16s рРНК протека-

ет в комплексе, является состав продуктов алкилирования 16Э рРНК реагентами II - IV. Алкилировашт реагентами II и IV подвергаются в основном остатки гуанина, аденина и в небольшой степени остатки цитидина. Среди продуктов алкилирования 16В рРНК реагентом III были найдены 7-р-0иа и Е-Айе. Во всех случаях небольшое количество радиоактивности до 24£ было обнаружено во фракции, которая была нами отнесена я продуктам превращения алк*яированных оснований в условиях жесткого кислотного гидролиза (Гринева и Карпова,1975).

Было обнаружено, что стехиометрия коваленгного присоединения реагентов II - IV к 1бэ рРНК превышает единицу. Это указывало на существование в РНК других участков связывания для каждого из реагентов, которые образуют комплексы, где не все основания олигонуклеотидной части реагента комплементарны участку связывания в 16б рРНК, то есть несовершенные комплексы. Такие комплексы могут образовываться между реагентами I -IV и районами 16Б рРНК, являющимися несовершенными прямыми повторами выбранных участков комплементации. Поиск таких повторов осуществлялся с помощью программы контекстного анализа "Сото1", разработанной Соловьевым В.В. с соавтор. При этом отыскивались все прямые повторы в 16Э рРНК, которые могли бы формировать несовершенный дуплекс с данным олигонуклеотидом, содержсаий не менее 6 нормальных Уотсон-Криковских пар. Число участков связывания реагентов I - IV, рассчитанное по изотермам модификации, хорошо коррелирует с возможным числом участков связывания олигонуклеотидов I - IV, найденным с помощью программы "Сошо1".

Быстрые нековалентные взаимодействия Г6Б рРНК с реагентами II - IV при 0°С.

При изучении кинетических характеристик комплементарно адресованной модификации 16Э рРНК реагентами II - IV было замечено, что смешивание растворов 163 рРНК и >СНКС1-реагентов при 0°С с последующим алкилированием при 20°С, приводит к аномально высокой степени включения реагентов в рРНК (степень включения - моль реагента/моль РНК ) за короткие времена реакции. Так, степень включения реагентов II, III, и IV в 16Б рРНК после смешивания растворов при 0°С в течение 10 мин и инкубации при 20°С в течение 15 мин примерно на порядок превышала степень превращения реагентов в этилениммониевый катион (не более 0,5« .). Если раствор рРНК и реагентов смешивали при 20°С, то через 15 мин после

начала инкубации при 20°С включение [14С]-радиоактивности во фракцию I6S рРНК практически не наблюдалось. Реагенты II, III, IV, взятые после предварительной очистки с помощью обращенно-фазовой хроматографии, также не включались в I6S рРНК через 15 мин инкубации при 20°С, даже если смешивание рРНК и реагентов проводили при 0°С.

Для выяснения природы такого взаимодействия, I6S рРНК выдерживали с препаратами реагентов II - IV, неподвергавшимися очистке при 0°С. Максимальная степень включения составляет 0,5, 1,6 и 1,2 моль реагента/моль РНК для реагентов II, III и IV, соответственно за 10 мин. На основании полученных данных можно было предположить, что при 0°С происходит алкилирование I6S рРНК в комплексах "особой конформации", как ранее наблюдалось для 23S рРНК, с ускорением на несколько порядков по сравнению с константой скорости ионизации >снеса-реагентов при 0°с.

При идентификации продуктов модификации I6S рРНК ( со степенями включения 0,5, 1,6, 1,2 для реагентов II - IV, соответственно) оказалось, что ни один из нуклеотидных остатков I6S рРНК не подвергается модификации препаратами реагентов II - IV при 0°С за 30 мин. В кислотном гидролизате I6S рРНК после инкубации с препаратами реагентов при 0°С было обнаружено единственное соединение, содержащее метку [14С], которое было идентифицировано, как оснкх (X = Cl, ОН ), так как в используемых условиях эти два соединения не разделяются.

Дополнительный анализ I6S рРНК, выдержанной с реагентами II -IV при 0°С центрифугированием в градиенте плотности сахарозы 3 -20% в денатурирующих условиях ( в присутствии 0,5Ï SDS) показал наличие одного пика, соответствуюцего по положению I6S рРНК и практически не содержащего радиоактивной метки. Практически вся 1 J-метка была сосредоточена на верху градиента для всех трех реагентов. Таким образом, полученные результаты позволяют заключить, что присутствие радиоактивной метки в I6S рРНК, инкубированной с препаратами реагентов II - IV при 0°С, не связано с алкилированием РНК по быстрому механизму и имеет нековалентную природу. Такие нековалентные взаимодействия возникают, по-видимому, между I6S рРНК и препаратами реагентов из-за присутствия гидрофобных примесей в препаратах реагентов II - IV.

Расщепление модифицированной I6S рРНК по участкам связывания адресованных реагентов с помощью РНКазы Н.

В настоящей работе, для того чтобы идентифицировать участки

связывания и алкилирования 16Э рРНК реагентами II - IV, мы использовали подход, основанный на свойстве РНКазы Н расщеплять РНК в составе гетеродуплекса РНК - ДНК, впервые предложенный в работе (31ерапоуа et.al.1979).

Комплементарно адресованная модификация нуклеиновых кислот приводит к образованию продуктов, содержащих ковалентно связанный с мишенью (за счет алкилирования) реагент. В дальнейшем продукты сайт направленной модификации, в которых олигонуклеотидный адрес связан с модифицированным основанием РНК через модифицирующую группу реагента, будут называться ковалентными аддуктами.

8 9 10 11

Рис. 2. Разделение продуктов гидролиза РНКа-зой Н I6S рРНК в соста-таве гетеродуплекса с IV* и в ковалентных аддуктах с реагентами II и IV с помощью электрофореза в 6Í ПААГ (7 U мочевина), окраска метиленовым синим. Концентрация I6S рРНК 0,5-ICT6 М. Соотношение I6S рРНК : IV* равно: 1 ' - (1:5), 2 - (1:10), 3 - (1:20),4 - (1:50), 5 i а - (1:юо), б - I6S i рРНК в отсутствие IV*,

7 - I6S рРНК без обработки РНКазой Н, 9 -ковалентный аддукт I6S- IV (ао=0,70), 11 -ковалентный аддукт I6S рРНК-П (« =0,58), 8 и Ю - такие же ад-дукты с реагентами IV и II соответственно, без гидролиза РНКазой Н; ХС - ксилен цианол, BP-бромфеноловый синий.

Дезоксиолигонуклеотид II полностьо комплементарен З'-конце-вому фрагменту I6S рРНК (1497-1505), а IV* - последовательности 771-781. Кроме этих участков, образующих совершенные комплексы с II* и IV*, с помощью метода контекстного анализа был выявлен целый ряд последовательностей, способных образовывать с э+ими

олигонуклеотидами несовершенные комплексы.

На рис.2 (дорожки 1-7) показано расщепление I6S рРНК в составе гетеродуплекса с олигонуклеотидом IV* в зависимости от концентрации олигонуклеотида IV*. Уже при концентрации IV* в 10 раз превышающей концентрацию I6S рРНК (0,5'10~6М) наблюдается количественное расщепление I6S рРНК по участку 771-781. Однако, даке *

при концентрации IV , равной 5'10 М, в данных условиях практически не происходит расщепления I6S рРНК по другим участкам, способным образовывать несовершенные дуплексы с олигонуклеотидом IV*. Аналогичная картина наблюдается при гидролизе I6S рРНК РН-Казой H в комплексе с олигонуклеотидом II*.

На рис.2 (дорожки 9 и 11) приведено разделение фрагментов I6S рРНК, полученных в результате гидролиза РНК в составе ковалент-ш аддуктов, образующихся при алкилировании I6S рРНК реагентами II и ^.соответственно. Степень модификации (aQ) I6S рРНК реагентами II и IV составила 0,58 и 0,70 моль остатков реагента, хова-лентно связанных с I моль I6S рРНК, соответственно. Из приведенных данных видно, что даже при такой достаточно низкой степени модификации, происходит множественное расщепление I6S рРНК РНКа-зой H в составе ковалентных аддуктов (особенно для реагента IV), которое легко объясняется существованием наряду с совершенными гетеродуплексами, целого ряда несовершенных комплексов, в которых также происходит эффективное алкилирование I6S РНК реагентами II и IV.

Идентификация участков I6S рРНК, взаимодействующих с бензилиденовыми производными олигодезоксирибонуклеотидов

d ( pACCTTGTT ) ГА, d ( pTTACGACT ) rU, ¿(pTTTGCTCCCC )гА. Для идентификации участков I6s pFHK, взаимодействующих с реагентами II - IV, была проведена препаративная модификация I6S рРНК этими реагентами (концентрация I6S рРНК МО"6 M ) при концентрации реагентов II и IV, равной. 2-10 М, и реагента III -З'Ю"5 M при 20°С в- течение 150 ч. Выделенный ковалентный ад-дукт гидролизовали РНКазой Н. В используемых нами условиях происходит количественное расщепление цепи I6S рРНК в составе ковалентных аддуктов. По З'-ОН группам образовавшихся фрагментов I6S

ор ор

рРНК вводили Р-метку с помощью [ Р]-рСр и Т4 РНК-лигазы. По-

ор

лученную таким образом смесь p-фрагментов I6S рРНК использовали далее для идентификации сайтов разрезания РНКазой H .с помощью блот-гибридизации с фрагментами рестрикции плазмиды рКК 3535, содержащей полный олерон ггпВ рРНК E.coli.

«эр

Фильтры после гибридизации со смесью р-мечешх фрагментов 16Б рРНК обрабатывали РНказой А. После такой обработки связанными с фрагментами ДНК на фильтре остаются только те части меченых фрагментов РНК, которые полностью защищены комплексообразовани-ем. Обнаружение радиоактивной метки в месте, соответствующем какому-либо определенному фрагменту рестрикции, свидетельствует о положении сайта связывания реагента внутри участка РНК, соот-ветствущего данному фрагменту рестрикции. Радиоавтограммы фильтров, сканировали с помощью лазерного сканера и определяли распределение радиоактивной метки между фрагментами на каждой дорожке (скане). Данные отнесения сигналов гибридизации и сканирования приведены на рис.З-(а-б) для реагентов IV,II,III, соответственно. Как видно из рисунка З-(а-б), модификация 16Б рРНК реагентами II - IV происходит по нескольким участкам для каждого из реагентов.

Определение основного участка взаимодействия 168 рРНК с реагентом II проводили в независимом эксперименте с помощью прямого секвенирования по методу (Попп1з-Ке11ег,1977) основных фрагментов РНК; образующихся в результате гидролиза ковалентного аддук-та 163 рРНК-П РНКазой Н. Поскольку последовательность 16Э рРНК известна, для идентификации участка расщепления достаточно провести секвенирование по пуриновым основаниям (Т1 и и2 - реакции). Оказалось, что эти фрагменты соответствуют модификации 163 рРНК по участку 1487-1505 в составе совершенного комплекса, на их до-

ор

лю приходится 50$ РЬрадиоактивности, включившейся только в специфические фрагменты. Таким образом, при сайт-направленной модификации 16в рРНК реагентом II алкилирование на 50» протекает в совершенном комплексе реагента с выбранным участком.

Для того, чтобы более точно локализовать сайты связывания 163 рРНК с реагентами II - IV в несовершенных комплексах, с помощью программы контекстного анализа "Сото1" (Соловьев и др,1985) был проведен поиск участков 1бэ рРНК, которые могут образовывать несовершенные комплексы с олигонуклеотидной частью реагентов II-IV, внутри каждого из фрагментов рРНК, гибридизупцихся с фрагментами рестрикции рДНК.

В сумме для молекулы 163 рРНК было выявлено 82 таких участка для реагента II, 93 - для реагента III и 75 - для реагента IV. Затем по программе "Епег^" (Соловьев и др,1987) была оценена величина яз^, где дс^. - изменение свободной энергии при образовании д - несовершенного дуплекса.

»500 ,Э'-конец

110 108 135 29"' 166 81 341

жтжтл"\ |...о| 16.«

366 167 204 317 I6t34 210 68 181 254

Нае и: ¡шав.7 | 1С., |20.7 |( 8*7 | |и.о| г..

1 7.С. | té.7 | »б.7| в.г р.л iT

сайты

модификации

Б(п>

Мер i

Илг

110 »Об 1 36 2ЬО 166 в' 341

о | 1д| 1Э| Ю.4 117.г| | го.г

ШЕПИПШЖ

210 68 181 14.1|1б|5. б]

526 86 42

ШГ

361 210 7.6 | в.9~Г

207 в. 9|

В(Ш)

Мер I Нае III_

110 108 135 280 166 61 341

,9|17| 1В| 20.9

гол_317 161 3 210 68 181

6.4| 9.8 |17-в 11 U.qi5|l7.5|

Рис.3 Определение фрагментов I6S рРНК, взаимодействуюцих с реагентами II-IV, с помощью блот-гибриди-зации: данные сканирования радиоавто-грамм фильтров: вертикальные линии внутри прямоугольников указывают сайты рестрикции, шкала соответствия с последовательностью I6S рРНК приведена в верхней и нижней частях рисунка; цифрами внутри прямоугольников указаны величины относительной интенсивности сигнала гибридизации (I*), над прямоугольниками заштрихованы фрагменты, гибриди-зующиеся и в опыте, и в контроле; знаком + -на шкале I6S рРНК внизу каждого из рисунков указаны сайты модификации для каждого из реагентов, определенные с помощью сопоставления экспериментальных данных и результатов теоретической оценки стабильности несовершенных гетеродуплексов, знаком * указано положение совершенного дуплекса.

Реагент. IV._ Кроме выбранного участка 771-781 по совокупности данных блот-гибридизации и оценке дс^ было выявлено еще 3 сайта прочного связывания реагента IV с 16S рРНК: 442-452, 663-673, 883-893, которые соответствуют основным сигналам гибридизации. Сопоставление экспериментальных данных, полученных с помощью гибридизации, и ДС^ позволяет точно локализовать 12 комплексов (включая 771-781), в которых протекает модификация I6S рРНК реагентом IV.(см. рис.3). При сопоставлении полученных результатов С моделью вторичной структуры I6S рРНК (Moazed et.al.1986) было обнаружено, что все участки связывания реагента IV ( в том числе

;гб еб

ги го7

|'?.г|

размеры фрагмента рестрикции;

и 771-781) находятся в областях I6S рРНК, занятых в образовании вторичной структуры (петля +шпилька). Таким образом, независимо от вторичной структуры РНК (множественные короткие шпильки и петли) происходит связывание реагента iv с участками I6S рРНК, образующими с ним наиболее прочные комплексы, и алкилирование в этих комплексах.

Реагент_ П_. В отличие от реагента IV, только один участок i6s рРНК 895-903 образует достаточно прочный комплекс с реагентом ii ( üg=-12,4 ккал/моль)(кроме выбранного сайта 1497-1505): все остальные комплексы обладают примерно одинаковой стабильностью. Небольшие различия в интенсивности сигналов гибридизации для участка i6s рРНК 895-903 и участков 324-333, 813-821, ii74-ii82, 1233 —1241, I428-1436, которые образуют значительно менее стабильные дуплексы с реагентом ii, объясняются тем, что все эти участки, так же как и выбранный участок 1497-1505, не заняты в образовании вторичной структуры и более доступны для реагента II, чем остальные и 895-903 в частности (см.рис.З-б).

Реагент. 111_. Сопоставление экспериментальных данных со значениями дс. и -lgK /К позволило идентифицировать следующие учас-

J ИЗ

тки как сайты связывания реагента III: 58-66,181-189, 422-430, 564-572, 655-663, 727-735, 871-866, 1058-1066, I09I-I099, I29I-1299, I33I-I339. Наибольшее несоответствие интенсивности сигнала гибридизации и относительной стабильности гетеродуплексов наблюдается для участков 727-735 (-1^/^=5,7) и 871-879 (-lgKn/Ks=2,9). Это связано с тем, что участок 727-735 находится в петле, а 871-879 - в двуспиральной области согласно модели вторичной структуры I6S рРНК. Кроме выбранного участка (I491-1499) и участка 727-735 в одноцепочечной области находятся также фрагменты I6S рРНК II3Í-I339 и 58-66. Эти фрагменты алкилируются реагентом III в большей степени, чем участки I6s рРНК, образующие примерно такие же по стабильности несовершенные комплексы с реагентом, но находящиеся в двуспиральных областях I6S рРНК.

Исследование факторов, влияющих на селективность сайт-направленной модификации I6S рРНК.

Для того, чтобы изучить влияние времени протекания реакции на селективность сайт-направленного алкилирования I6S рРНК. были получены 6 ковалентных аддуктов i6s рРНК-реагент-Ii. различающихся по условиям получения (времени протекания реакции). Степень ионизации C-CI связи и степень модификации РНК (<*0) для каждого ковалентного аддукта приведены в табл.1.

Таблица I.

Влияние времени протекания реакции на селективность комплементарно-адресованной модификации. [16Б рРНК]=0,8-Ю~6 М: [реагент Ш=1,5-Ю"5 М.

* Степень опыта ионизации а* 1" г 3

С-С1 связи

__«_%_|_|_

I 10 0,18 39 28 50,8д

2 17,6 0,22 32 30,5 44,9

3 36,5 0,35 29 29,8 45,1

г32+2,5

4 50 0,57 33 33,4 50,0

5 75 0,69 30 34,8 49,7

6 87,5 0,86 34; 35,7 54,9

а - степень модификации 16Э рРНК (моль реагента/моль РНК);

я?

' - 1 - содержание С Р]-метки (в % ) во фрагментах, образующихся и в оште, и в контроле в результате повреждения молеку-

оо

лы 16Б рРНК следами нуклеаз; 2 - содержание [ Р]-метки (в %) во фрагментах с Е- 0,83-0,88, соответствующих модификации в

ор

совершенном комплексе; 3 - содержание [ Р]-метки (в %) во фрагментах с Е^ 0,83-0,88 относительно общего количества радиоактивной метки, включившейся только в специфические фрагменты ( соответствующие модификации 16б рРНК реагентом II), йоторое равно;

величина 2**/(1СКЖ- величина 1**).

ор

Наибольшее количество [^РЗ-метки (до 50«) приходится на группу из четырех фрагментов №г= 0,83-0,88 ), которая соответствует расщеплению 16Б рРНК по участку 1497-1505 в составе совершенного комплекса. Из данных, приведенных в табл.1, отчетливо видно, что при 20°С и концентрации реагента II 1,5-Ю-6 М независимо от глубины протекания реакции алкилирование происходит сразу во всех возможных комплексах; то есть с увеличением времени протекания реакции степень модификации 163 рРНК увеличивается одновременно по всем участкам.

Зависимость селективности комплементарно адресованной модификации от температуры была изучена на примере модификации 16г рРНК реагентом IV. Поскольку метод блот-гибридизации не позволяет точно определить степень модификации по каждому из 12 участков 163 рРНК, способных связываться с реагентом IV, в таблицах приведены следующие величины; общая степень модификации 1бг рРНК (а = моль остатков реагента 1У/моль 163 рРНК), степень

модификации I6s рРНК реагентом IV по выбранной последовательности 771-781 в составе совершенного комплекса (а.), которая легко определяется по количеству Р-метки, гибридизупцейся с фрагментом рестрикции длиной 135 п.о. (MspI рестрикция), а также суммарная степень модификации I6S рРНК по 3 участхам, образующим с реагентом IV наиболее прочные несовершенные комплексы (663-673, 442-452, 883-893 ), и по выбранному участку (771-781) (og). Общая степень модификации I6S рРНК (о„) определялась по количеству 14

[ С]-радиоактивности, содержащейся в I6S рРНК после алкилирова-ния и отделения от избытка реагента IV Степени модификации I6S рРНК а1 и cig определяли по площади пика, соответствушего фрагменту рестрикции, включающему данный участок, при сканировании радиоавтограммы фильтра после блот-гибридизации, отмывки и обработки РНКазой А.

В качестве меры селективности сайт-направленной модификации были выбраны: а) относительная степень модификации I6S рРНК по выбранному участку (771-781) {«^/а ); б) относительная степень модификации I6S рРНК в трех наиболее стабильных несовершенных комплексах и по выбранному участку (<*z/aо

Было обнаружено, что с повышением температуры алкилирования до. 40°С относительная степень модификации I6S рРНК по выбранному участку (a1/aQ) увеличивается в 1,5 раза ( от 20$ до 30$), однако абсолютная степень модификации I6S рРНК реагентом IV по выбранной последовательности (о^ ) при этом уменьшается от 0,63 до 0,23. Следует отметить, что при 20°С хотя и удается получить высокий уровень алкилирования I6S рРНК по выбранной последовательности, однако селективность процесса при этом не превышает 24$.

Влияние концентрации реагента на селективность комплементарно-адресованной модификации было исследовано на примере алкилирования I6S рРНК реагентами II и IV. В случае реагента II в качестве меры селективности адресованного алкилирования I6S рРНК

ор

было выбрано количество РЬметки, включающейся во фрагменты с Е- 0,83-0,88, соответствующие модификации по выбранному участку

ор

1497-1505. При этом относительное количество [Р]-радиоактивности во фрагментах с Ef 0,83-0,88 (селективность модификации) возрастает примерно в 1,5 раза (от 31$ до 50%) при повышении концентрации реагента от 1,0' 10 до I,5'I0 М. При дальнейшем увеличении концентрации реагента II (до 2,5'10 М) не происходит заметных изменений в селективности комплементарно адресованного алкилирования I6S рРНК реагентом II. Анализ селективности

сайт-направленной модификации 16Б рРНК в зависимости от концентрации реагента IV проводили при более низкой концентрации 163 рРНК, равной 2,5'Ю"8 М, по сравнению с концентрацией 16Э рРНК, использованной во всех предыдущих экспериментах и равной 0,5-Ю-6Ч. (см. табл. 2)

Таблица 2.

Влияние концентрации реагента IV на селективность сайт-направленной модификации при 20°с; [16Б рРНК]=2,5-10~8 М.

т) Селективность сайт-направленной № [IV] модификации_

М "1J) W* 4' W*

1 1,3' Ю"7 0,05 0,02 38,3 0,046 92

2 2,5- ю-' 0.10 0,025 25,1 0,088 88

3 1,3- ю-6 0,34 ■ 0,067 19,6 0,29 86,7

4 2,5- ю-6 0,62 0,13 21,9 0,50 80,7

1'обозначения приведены в тексте.

Видно, что при понижении концентрации реагента примерно в 20 раз происходит резкое возрастание селективности алкилирования: реакция протекает в основном ( на 90% ) в четырех наиболее стабильных комплексах, включая комплекс с участком 771-781, и на 40% по выбранному участку (771-781). Однако общая степень модификации I6S рРНК (а I при этом не превышает 0,05. С увеличением концентрации реагента IV и ростом orQ происходит постепенное снижение селективности процесса и при концентрации реагента, равной 2,5-Ю~6М, происходит снижение селективности реакции до 20%. Таким образом, при низких концентрациях реагента IV можно получить высокоселективную модификацию НК-мишени, однако степень модификации РНК при этом будет невысокой. Полученные результаты хорошо согласуются с выводами, представленными в работах (Hearst,1УЬ7; Ferelroyzen and Vologodskii,1988).

В р-лота/ |Зарытова и др,1986; Krtiavin et.al,1988) была про-демонстриронана высокоселективная сайт-направленная модификация 302-членного фрагмента ДНК 6-звенными "адресованными" реагентами в присутствии 8-ЗЕенного олигонуклеотида-эффектора, несущего N-(2-оксиэтил i-феназиниевые группы на 3'- и 5'- концах. Согласно данным работы iKr-tiavin et.al.1988) эффектор увеличивает эффективность комплементарно адресованной модификации в том случае, когда он комплементарен последовательности НК-мишени, вплотную

прилегавшей к участку связывания реагента, и обеспечивает кооперативное связывание реагента.

В качестве олигонуклеотида-эффектора для реагента IV был выбран 8-звенный олигонуклеотид рТААТССТСр, несущий остатки м-(2-оксиэтил)- феназиния на обоих концах, комплементарный последовательности 163 рРНК 782-789, прилегапцей с З'-конца к выбранной для реагента IV последовательности 771-781 (см. рис.1), данные по изменению селективности сайт-направленной модификации 16Э рРНК в присутствии эффектора, полученные с помощью блот-гибридизации, приведены в таблице 3.

Таблица 3.

Влияние олигонуклеотида-эффектора на селективность комплементарно адресованной модификации 16Б рРНК реагентом IV ([163 рРНК]= 0.5-1СГ6 М).

а [IV] ГЕЯ «J1 Селективность сайт-направленной модификации

М М „ I) 1 W* а2П W*

i 2 0,5'Ю-6 5' 10" -Ь 0,64 0,25 0,24 0,048 38,8 0,47 20,0 0,17 73 68

3 4 1,5-Ю"6 5' 10" -Ь 0,92 0,51 0,42 0,10 45,0 0,66 20,5 0,33 72 65

5 6 5,0' 1СГ6 5-10" -ь 1,18 0,60 0,62 0,13 54,0 0,85 24,5 0,35 72 60

1 все обозначения приведены в тексте.

Как видно из данных табл.3, увеличение степени модификации (<*0) I6S рРНК в присутствии эффектора обусловлено приростом степени модификации по выбранному участку (а1). При сайт-направленном алкилировании íes рРНК реагентом IV в отсутствие эффектора на долю модификации по участку 771-781 приходится приблизительно 20í, тогда как в присутствии эффектора эта величина возрастает в 2 раза.

Таким образом, при 20°С и концентрации РНК, равной 0,5' Ю-6 М, олигонуклеотид-эффектор за счет стабилизации совершенного дуплекса значительно увеличивает степень модификации РНК по выбранному сайту, не затрагивая при этом модификацию I6S рРНК в составе несовершенных дуплексов с реагентом IV.

выводы

I. Исследованы физико-химические характеристики комплементарно адресованной модификации I6S рРНК Escherichia coli 2',3'-0-[Д-Ы-метил-N- (2-хлорэтил)-амино]бензилиденовыми производными олигодезоксирибонуклеотидов d(pCCTACGGTT)rA (I), d(pACCTTG-TT)rA (II), d (рТТ ACGACT) rtl (III), dtpTTTGCTCCCC)гА (IV).

2. Впервые получены прямые доказательства эффективной сайт-направленной модификации I6S рРНК в составе как совершенных, так и несовершенных дуплексов.

3. Впервые показано, что РНКаза Н способна расщеплять РНК в составе ковалентных аддуктов - продуктов сайт-направленной модификации, образующихся в результате алкилирования РНК в совершенных и несовершенных дуплексах.

4. С помощью блот-гибридизации фрагментов, полученных в результате гидролиза I6S рРНК РНКазой Н в составе ковалентных аддуктов, с фрагментами рестрикции рДНК идентифицированы все участки связывания I6S рРНК с реагентами II - IV.

5. Показано влияние вторичной структуры на сайт-направленную модификацию высокомолекул.трной РНК. Установлено, что образование как совершенных, так и несовершенных комплексов происходит преимущественно по участкам I6S рРНК, не занятым в формировании вторичной структуры.

6. Проанализированы различные подходы к повышению селективности сайт-направленной модификации. Показано, что существенное повышение селективности модификации происходит как при значительном снижении концентрации реагента, так и при использовании стабилизирующего дуплекс олигонуклеотида-эффектора. В последнем случае сохраняется высокая эффективность сайт-направленной модификации I6S рРНК.

7. Продемонстрировано хорошее соответствие полученных результатов с данными контекстного анализа и оценками относительной стабильности несовершенных комплексов по программе "Energy" и по методу (Perelroyzen and Vologodskii,1988), что позволяет использовать эти теоретические подходы для предсказания уровня модификации нуклеиновых кислот-в составе несовершенных комплексов .

По теме диссертации опубликованы следующие работы

X. Горшкова И.И., Зенкова М.А., Карпова Г.Г., Левина A.C., Соловьев В.Б. Комплементарно-адресованное алкилирование I6S рРНК Escherichia coli 2',3'-0-[4-М-(2-ХЛ0рэтил)-Н-метиламИН0]-бензилиденовыми производными дезоксиолигонуклеотидов. I.Кинетические характеристики алкилирования. // Молекуляр. биология

- (1986) - Т.20 - вып.4 - С.1084-1096.

2. Зенкова М.А., Карпова Г.Г., Левина A.C. Комплементарно-адресованное алкилирование I6S рРНК Escherichia coli 2',3'-0-[4-N-(2-хлорэтил)-Ы-метиламино]-бензилиденовыми производными дезоксиолигонуклеотидов. II. О природе быстрого взаимодействия при 0°С. // Молекуляр. биология - (1987) - Т.21 - вып.4

- C.II30-II36.

3. Зенкова М.А., Карпова Г.Г., Левина A.C. Комплементарно-адресованное алкилирование I6S рРНК Escherichia coli 2',3'-0-[4-N-(2-хлорэтил)-ы-метиламино]-бензилиденовыми производными дезоксиолигонуклеотидов. III. Участки I6S рРНК, взаимодействующие с бензилиденовым производным d(paccttgtt)га. // Молекуляр. биология - (1989) - Т.23 - вып.4 - C.I056-I067.

4. Зенкова М.А., Карпова Г.Г., Левина A.C. Расщепление алкили-рованной I6S рРНК по участкам связывания адресованных реагентов - производных олигодезоксирибонуклеотидов - с помощью РНКазы Н. // Биоорган, химия - (1990) - Г.16 - N.6 -С.780-787.

5. Зенкова М.А., Карпова Г.Г., Левина A.C., Мамаев С.В., Соловьев В.В. Комплементарно-адресованное алкилирование I6S рРНК Escherichia coll 2',3'-О-[4-N-(2-хлорэтил)-N-MeTWiaMHHO]-бензилиденовыми производными дезоксиолигонуклеотидов.

IV. Определение участков связывания I6S рРНК с бензилиденовыми производными d(рACCTTGTT)rA, d(pTTAC GACT)rU, d(pTTTGCTC-ССС)гА. // Биоорган, химия - (1990) - Т.16 - N.6 - С.788-800.

6. Zenkova М.А., Fedorova O.S., Levina A.S., Mamaev S.V., Karpova G.G. The influence of oligonucleotide-effector on the selectivity of sequence specific modification of 16S rRNA. II FEBS Lett. - (1990) - V.269 - N.1 - P.26-28.