Новые двухкомпонентные конструкции на основе ДНКзима "10-23" тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

ФОКИНА АЛЕСЯ АНАТОЛЬЕВНА

НОВЫЕ ДВУХКОМПОНЕНТНЫЕ КОНСТРУКЦИИ НА ОСНОВЕ

ДНКзима «10-23»

02 00 10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

□ ОЗ

Новосибирск-2008

003171843

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный руководитель к х н, доцент Веньяминова Алия Гусейновна

Официальные оппоненты д б н, доцент Бунева Валентина Николаевна

к х н, доцент Халимская Людмила Михайловна

Ведущая организация Химический факультет МГУ

имени МБ Ломоносова

Защита состоится « Ь? » СЛ^О/^СлЛ 2008 г в /О часов на заседании диссертационного совета Д 003 045 01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу 630090, Новосибирск, пр акад Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

С авторефератом можно ознакомиться на сайте www mboch nsc ru

Автореферат разослан « » iJ->*Cb2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета к х н , доцент

Коваль В В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Разработка эффективных подходов к направленному воздействию на нуклеиновые кислоты является актуальной проблемой современной химической биологии, биотехнологии и фундаментальной медицины Большой интерес исследователей вызывает поиск агентов, способных избирательно взаимодействовать с определенными последовательностями мРНК, с целью создания на их основе инструментов молеку-лярно-биологических исследований и новых терапевтических средств для лечения вирусных, онкологических и других заболеваний Одним из перспективных подходов к селективному воздействию на РНК, имеющим как фундаментальное, так и прикладное значение, является использование ДНКзимов - олигодезоксирибонуклеотидов с характерной вторичной структурой, способных специфично катализировать гидролиз фосфодиэфир-ных связей в РНК Наиболее эффективным среди них является ДНКзим «10-23», полученный методом SELEX (SantoroS IV, Joyce G F, 1997) и представляющий собой консервативный каталитический домен, фланкированный двумя вариабельными субстрат-узнающими участками Простота синтеза и высокая каталитическая активность ДНКзимов «10-23» позволили использовать их для расщепления множества РНК-мишеней как т vitro, так и in vivo В настоящее время интенсивно ведется поиск новых вариантов каталитически активных конструкций на основе ДНКзима «10-23» с комплексом улучшенных физико-химических и биологических свойств Решающими факторами, которые нужно учитывать при конструировании ДНКзимов «10-23», являются высокая эффективность расщепления, устойчивость к нуклеазам и способность воздействовать на природные РНК, имеющие сложную пространственную структуру Цель и задачи исследования

Целью данной работы было создание новых устойчивых в биологических средах и эффективно расщепляющих протяженные структурированные РНК двухкомпонентных ДНКзимов, которые состоят из ДНКзима «10-23» и олигонуклеотидов-эффекторов, связывающихся с РНК-субстратом вблизи 3'- или 5'- конца ДНКзима В ходе исследования решались следующие задачи

• разработка стратегии конструирования двухкомпонентных ДНКзимов, устойчивых в биологических средах,

• конструирование двухкомпонентных ДНКзимов, направленных па мРНК генов множественной лекарственной устойчивости MDR1 и инсулиноподобного фактора роста IGF-I,

• исследование закономерностей расщепления протяженных структурированных фрагментов MDR1 мРНК и IGF-I мРНК созданными двухкомпонентными конструкциями

Научная новизна и практическая ценность работы. Разработана стратегия конструирования устойчивых в биологических средах двухкомпонентных ДНКзимов для эффективного расщепления протяженных структурированных РНК-мишеней, основанная на использовании ДНКзима «10-23» и олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов)-эффекторов, которые связываются с РНК «встык» с 3'- или 5'-концом ДНКзима, «разворачивая» ее вторичную структуру и облегчая тем самым ассоциацию ДНКзима с мишенью

Впервые созданы и исследованы ДНКзимы и двухкомплектные конструкции на их основе, направленные на короткие и протяженные фрагменты мРНК генов множественной лекарственной устойчивости MDR1 и инсулиноподобного фактора роста IGF-I Показано, что ДНКзимы, содержащие дополнительный З'-концевой тимидин, присоединенный 3' -З'-фосфодиэфирной («инвертированной») связью, и 2'-0-метилрибонуклеотиды в суб-страт-связывающих участках и неконсервативных положениях каталитического кора, обладают наибольшей устойчивостью в биологических средах и высокой каталитической активностью при расщеплении протяженного транскрипта Наличие дополнительного «инвертированного» тимидина на З'-конце ДНКзима не снижает активности двухкомпо-нентных систем Изучено влияние типа эффектора и наличия в нем концевых модификаций на расщепление РНК созданными конструкциями Показано, что оптимальным вариантом эффекторов являются олиго(2'-0-метилрибонуклеотиды), содержащие З'-концевой «инвертированный» тимидин Созданные двухкомпонентные ДНКзимные конструкции эффективно расщепляют фрагменты MDR1 и IGF I мРНК, обладающие сложной пространственной структурой Эффекторы обладают более высокой скоростью ассоциации с мишенью, и их наличие в системе в 10-20 раз повышает скорость связывания ДНКзима с РНК-транскриптом Общая каталитическая эффективность ДНКзимов в присутствии оли-гонуклеотидов-эффекторов возрастает в 10-100 раз за счет увеличения сродства ДНКзимов к протяженной РНК Полученные результаты позволяют рассматривать созданные ДНКзимные конструкции как перспективные инструменты для подавления экспрессии генов на уровне мРНК

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ Результаты работы были представлены на конференциях Nucleic Acids Chemical Biology (NACB) PhD Summer School, Оденс, Дания, 2003 г, HUPO 2nd Annual and IUBMB XIX World Congress, Монреаль, Канада, 2003 г, XVI International Roundtable on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, Миннеаполис, CHIA, 2004 г, 1st International Symposium on Biomolecules and Related Compounds, Монпелье, Франция, 2005 г, 13th Annual Congress of the European Society of Gene Therapy, Прага, Чехия, 2005 г, Международной конференции по химической биологии, Новосибирск, Россия, 2005 г, Международной конференции «Физико-химическая биология», посвященной 80-летию академика Д Г Кнорре, Новосибирск, Россия, 2006 г, XVII International Roundtable on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, Берн, Швейцария, 2006 г, Международной конференции "Фундаментальные науки - медицине", Новосибирск, Россия, 2007 г и др Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов, списка цитированной литературы и приложения Работа изложена на 166 страницах, содержит 68 рисунков и 15 таблиц Библиография включает 272 литературных источника

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Разработка стратегии конструирования двухкомпонентных ДНКзимных систем 1.1 Создание модельных двухкомпонентных ДНКзимов

Разработку стратегии конструирования двухкомпонентных ДНКзимов мы проводили на модельных системах с последующим применением этой стратегии для создания ДНКзимных конструкций, эффективно расщепляющих протяженные фрагменты MDR1 и

IGF-I мРНК В качестве основы для двухкомпонентных конструкций на первом этапе работы был создан ДНКзим «10-23» (Dz-120), направленный на синтетический фрагмент MDR1 мРНК1 (рис 1)

120 i 137 120 i 137

5' UCCAAGGAGCGCGAGGUC 5' UCCAAGGAGCGCGAGGUC 3'AGGTTCCT GCGCTCCA 3'Tln/.GGTTCCT GCGCTCCA

GA GG„ , GA GG

С с I ce

A / 4o- Ад A

CatC fL CatC

Dz-120 ^ Dz-120-T,„

Рис 1 ДНКзим «10-23» (Dz-120) и ero 3'-«инвертированный» аналог (Dz-120-Ti„v) для расщепления РНК18 (участок 120-137 MDR1 мРНК), N - дезоксирибонуклеотид, N- рибонуклеотид Стрелкой указан сайт расщепления Число в обозначении ДНКзима (здесь и далее) соответствует порядковому номеру нуклеоти-да в транскрипте MDR1 мРНК (рис 8), комплементарного первому нуклеотиду З'-субстрат-узнающего участка ДНКзима

Рис 2 Кинетические кривые расщепления РНК18 ДНКзимом йг-ИО (□) и его З'-модифицированным аналогом Ог-ПО-Т,,,, (ж) Условия расщепления 50 мМ Трис-НС1 (рН 7 5), 10 мМ Г^С12, 37 °С А Расщепление в условиях избытка ДНКзима по отношению к РНК 100 нМ РНК, 1000 нМ ДНКзим Б Расщепление в условиях недостатка ДНКзима по отношению к РНК 100 нМ РНК, 10 нМ ДНКзим

Для повышения устойчивости ДНКзима в биологических средах его З'-конец был «кэпирован» путем введения остатка тимидина посредством З'-З'-фосфодиэфирной («инвертированной») связи (Тшу) Эта минимальная модификация привела к 9-кратному повышению времени полужизни 3'-«инвертированного» ДНКзима в культуральной среде, содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки ДНКзим Вг-120 и его 3'-модифицированный аналог Ог-120-Т,„у были способны расщеплять РНК18 как при избытке (рис 2, А), так и при недостатке (рис 2, Б) ДНКзима по отношению к субстрату в условиях, близких к физиологическим

Единственным сайтом расщепления 18-звенной РНК-мишени во всех случаях была связь 09-С10 (рис 3)

Все использованные в работе очигонуклеотиды и их производные были синтезированы в Лаборатории химии РНК ИХБФМ СО РАН твердофазным фосфитамидным методом на автоматических синтезаторах А8М-102и и АЯМ-вОО («Биоссет», Россия)

1 23456789 10

!

Рис. 3. Расщепление РНК18 ДНКзимом 1^-120Т„.,, (50 мМ Трис-НС1, рН 7.5, 10 мМ 37 °С). Кон-

центрации РНК и ДНКзима в реакционной смеси 100 нМ. Дорожка 1 - ограниченный гидролиз РНК18 0.05 М ИаИСО, (рН 9.5, 90 °С, 10 мин); дорожка 2 -РНК после 4 ч инкубации в отсутствие ДНКзима; дорожка 3 - РНК после 4 ч инкубации с ДНКзимом в отсутствие дорожки 4-10 - РНК после 0, 5,

15,30, 60, 120 и 240 мин инкубации с ДНКзимом.

Таблица 1. Кинетические параметры расщепления РНК18 ДНКзимами Dz-120 и Dz-120-T¡„

ДНКзим МИН"' K„„ нМ ик„-10', нМ"'-мин"'

Dz-120 9.6t0.3 50±7 0.19

Dz-I20-Tim 14.7±ü.5 63±и 0.24

Условия реакции: 50 мМ Трис-HCI (р|1 7.5). 10 мМ MgCI2, 37 "С: 50 нМ РНК18. 1001600 нМ ДНКзим.

Найденные значения кинетических параметров реакций расщепления РНК18 ДНКзимами Dz-120 и Dz-120-T¡nv были сравнимы с приводимыми в литературе значениями К.,,, и kcat для расщепления коротких РНК-субстратов ДНКзимами «10-23» (Ota N. et al., 1998).

Таким образом, мы показали, что созданные ДНКзимы «10-23» эффективно расщепляют короткий субстрат РНК18 и могут быть использованы при конструировании модельных двухкомпонентных ДНКзимов. содержащих ДНКзим «10-23» и олигонуклеотид-эффектор. который связывается с РНК «встык» с З'-концом ДНКзима. Мы предположили, что использование эффектора может привести к повышению каталитической активности ДНКзима вследствие увеличения как скорости формирования ДНКзим-субстратного комплекса, так и его стабильности, обусловленной кооперативными взаимодействиями в области контакта ДНКзима и эффектора в комплексе РНК'ДНКшм-эффектор. Нами было предложено использовать в качестве эффекторов олиго(2'-0-метилрибонуклеотиды). содержащие 3'-«инвертированный» тимидин. Олиго(2'-0-метилрибонуклеотиды) обладают высоким сродством к РНК и более высокой по сравнению с олигодезоксирибонуклеотидами устойчивостью к эндонуклеазам, а также способностью образовывать комплексы с протяженными высокоструктурированными природными РНК.

Были сконструированы модельные тандемные ДНКзимы, комплементарные синтетическому фрагменту MDR1 мРНК и состоящие из ДНКзима «10-23» или его 3'-«инвертированных» аналогов и 2'-0-метил-олигорибонуклеотидов-эффекторов или их производных, способных связываться с РНК-мишеныо «встык» с З'-концом ДНКзима (рис 4). Для того чтобы действие олигонуклеотидов-эффекторов на каталитическую активность ДНКзима проявлялось особенно заметно, в данной модельной системе был использован ДНКзим с пониженной каталитической активностью, а именно ДНКзим Dz-124, представляющий собой укороченный с З'-конца ДНКзим Dz-120, и его 3'-«инвертированные» аналоги Dz-124illv и Dz-124-Tinv. Уменьшение длины субстрат-связывающего участка ДНКзима должно было привести к снижению эффективности

расщепления РНК В качестве эффекторов в данной модельной системе были использованы гекса-, окта- и дека(2'-0-метилрибонуклеотиды), а также их аналоги, содержащие 3'-концевой «инвертированный» тимидин Для дополнительной стабилизации комплекса РНК'ДНКзим'эффектор на 5'-конец олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов)-эффекторов вводили остаток интеркалятора >Ц2-гидроксиэтил)феназиния Такое расположение фена-зиниевой группы на стыке компонентов олигонуклеотидного тандема является наиболее выгодным для стабилизации дуплекса (Лохов С Г и др, 1995)

зХсааддиЯ зХддсаадди!? зХссддсааддиЯ |

113 i 137

5' ивВССвииССААввАвСвСвАваиС

З'ТССТ ССССТССА 02-124

-А С,

С А А

' А Т С

С т А

в

зХсааддиЯ зХддсааддиР эХссддсааддиИ |

113 1 137

5' иввссвииссААввАаСвсаАввис

3'Т,„,ССТ ССССТССА 02-124,, 3'Т.,ТССГ ССССТССА 0г-124-Т1п,

,А С,

С А А

Г* —о-р-о — о-р-КН(СН2)2НН о о

САТС

СН2СН2ОН

с Т А в

«а,

РПП

Рис 4 Двухкомпонентные ДНКзимы для расщепления синтетического фрагмента МБК1 мРНК (нуклеоти-ды 113-137) (РИК25) N - Дезоксирибонуклеотид, п - 2'-0-метилрибонуклеотид, N - рибонуклеотид (здесь и далее по всему тексту)

Созданные двухкомпонентные ДНКзимы были использованы для сравнительного исследования их способности расщеплять синтетический 25-звенный фрагмент МОК) мРНК (РНК25)

1.2. Влияние строения олигонуклеотидов-эффекторов на эффективность расщепле-ння синтетического РНК-субстрата двухкомпонентными ДНКзимами

Для демонстрации преимуществ олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) как эффекторов мы провели сравнительное изучение каталитической активности ДНКзима Ог-124 в присутствии дезоксирибо- и 2'-0-метилрибо-октамеров (рис 5)

Добавление эффекторов обоих типов приводило к повышению эффективности расщепления РНК ДНКзимом, однако в случае 2'-0-метилрибо-эффектора это влияние было значительно более выраженным Так, в присутствии дезоксирибо-октамера степень расщепления составляла 75 % за 6 ч инкубации только при 100-кратном избытке эффектора по отношению к мишени В то же время для (2'-0-метилрибо)-октамера повышение степени расщепления было отмечено даже при 10-кратном недостатке эффектора Уже при эквивалентном соотношении эффектора и мишени степень расщепления достигала 85 % и практически не изменялась при дальнейшем повышении концентрации (рис 5)

3'GGCAAGGTp 8d

ggcaaggup 8m | m

5' UGGCCGUUCCAAGGA (JCGCGAGGUC

3'TCCT GCGCTCCA

ga gg с с

A Dz-124 T A rA

Степень расщепления за 6 ч, %

ш

ffl

i

Степень расщепления за 6 ч, % 100

60 40 -

I

D/-124 75 150 300 600 1200 2400 -1800

18(11, им

10 25 50 75 60(1 4800 18ml, нМ

Рис. S. Расщепление РНК25 ДНКзимом Dz-124 при различных концентрациях эффекторов 8d (А) и 8т (б) (50 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 10 мМ MgCl2, 37 °С). Концентрации РНК и ДНКзима в реакционной смеси 50 нМ и 500 нМ, соответственно.

Значення кинетических параметров (табл. 2) говорят о том. что общая каталитическая эффективность (kcat/Km) системы, содержащей 2'-0-метилрибо-эффектор. была в 30 раз выше по сравнению с системой, содержащей дезоксирибо-октамер. в основном за счет снижения константы Михаэлиса. Мы изучили также влияние концентрации MgCl2 на реакцию расщепления РНК двухкомпонентными ДНКзимами Dz-124+8m и Dz-124+Sd. Способность катализировать расщепление РНК при низких концентрациях ионов магния является необходимым условием применения НК-энзимов in vivo. Известно, что концентрация Mg2+ в «живых» системах находится в пределах 1-2 мМ (Santero S. W., Joyce G. F., 1997). При 2 мМ MgCl2 заметное расщепление РНК (50 % за 6ч инкубации) было возможным только в случае системы Dz-124+8m.

Таким образом, в присутствии 2'-0-метилрибо-октамера происходит значительное усиление сродства ДНКзима к РНК. Это вызвано, по-видимому, улучшенными гибриди-зационными свойствами окта(2'-0-метилрибопуклеотида) и убедительно доказывает несомненное преимущество 2'-0-метилрибо-эффекторов перед их дезоксирибо-аналогами.

На следующем этапе работы было исследовано влияние длины олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов)-эффекторов на каталитическую активность двухкомпонентных систем. С увеличением длины эффектора повышалась и эффективность расщепления РНК двухкомпонентными системами (рис. 6. А). Использование гексамера в качестве эффектора не приводило к существенному повышению степени расщепления, а присутствие окта или декамера повышало ее с 35 % до 85-87 % за 6 ч инкубации, что связано, очевидно. с усилением комплексообразуюшей способности эффектора. В данной модельной системе использование окта- и дека(2'-0-метилрибонуклеотидов) в качестве эффекторов обеспечивало максимальную эффективность расщепления РНК двухкомпонентной конструкцией. но, скорее всего, для каждой конкретной системы требуется экспериментальный подбор длины олигонуклеотида-эффектора.

Рис 6 Влияние длины (А) и типа концевой модификации (Б) олиго(2'-0-метилрибонуклеотида)-эффектора на расщепление РНК25 двухкомпонентиым ДНКзимом

(Т) - Расщепление РНК ДНКзимом Ъг-124 в отсутствие эффекторов, условия реакции 50 мМ Трис-НС1 (рН 7 5), 10 мМ 37 °С, концентрации РНК25, ДНКзима Ог-124 и эффекторов в реакционной смеси

50 нМ, 500 нМ и 75 нМ, соответственно, гп - (2'-0-метил)олигомер, т-Тш„ - (2'-0-метил)олигомер с «инвертированным» тимидином на З'-конце, Р1т-т - (2'-0-метил)олигомер с >Г-(2-гидроксиэтил)феназинием на 5'-конце

Было изучено влияние наличия «инвертированного» тимидина на З'-конце и остатка интеркалятора на 5'-конце олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов)-эффекторов (рис 4) на каталитическую активность двухкомпонентных ДНКзимов

В отличие от гексамерных эффекторов, в случае окта- и декамеров мы наблюдали более выраженную зависимость степени расщепления РНК от типа концевой модификации эффектора В качестве примера на рис 6, Б приведены кинетические кривые расщепления РНК25 ДНКзимом Вг-124 в присутствии 2'-0-метилоктамера и его 5'- и/или 3'-модифицированных аналогов Из этих кинетических кривых видно, что введение на 5'-конец эффектора остатка феназиния приводило к снижению скорости реакции, но не предельной степени расщепления Можно предположить, что при добавлении ДНКзима и эффектора к РНК первоначально образуется неактивный комплекс, который затем претерпевает дополнительные конформационные превращения с образованием активного комплекса, в котором и происходит расщепление Возможно, остаток феназиния стабилизирует неактивную форму комплекса, замедляя переход в активную конформацию и приводя тем самым к снижению скорости расщепления РНК Значения кинетических параметров расщепления РНК25 двухкомпонентными ДНКзимами Вг-124+РЬп-8ш и 1)г-124+8ш подтверждают это предположение (табл 2)

Наличие на З'-конце эффекторов «инвертированного» тимидина не снижало каталитической активности двухкомпонентных конструкций, как это видно из представленных кинетических кривых (рис 6, Б) и значений кинетических параметров расщепления РНК системами Ог-124+8ш и Вг-124+8т-Т,„ (кса,/Кш) (табл 2)

На основании полученных результатов можно сделать заключение, что оптимальным вариантом эффекторов являются устойчивые в биологических средах олиго(2'-0-метилрибонуклеотиды), содержащие 3'-«инвертированный» тимидин

1 3. Влияние «инвертированного» тимидина на З'-конце ДНКзима на эффективность расщепления РНК двухкомпонентными конструкциями

С целью повышения стабильности ДНКзимов в биологических средах их З'-конец был «кэпирован» «инвертированным» тимидином (Ог-\24,ш или Вг-124-Тт„ рис 4) Введение на З'-конец ДНКзимов «инвертированной» межнуклеотидной связи привело к значительному снижению его активности в отсутствие эффекторов, при этом эффективность расщепления РНК ДНКзимом Ьг-124тУ была наименьшей по сравнению с ДНКзи-мами Г)г-124 и Вг-124-Тшу В присутствии эффекторов эффективность расщепления РНК была существенно выше (рис 7)

Рис 7 Расщепление РНК25 3'-«инвертированными» ДНКзимами в отсутствие и в присутствии эффектора 8т-Т1п»

Условия реакции 50 мМ Трис-НС1 (рН 7 5), 10 мМ Х^СЬ, 37 °С, концентрации РНК, ДНКзима и эффектора в реакционной смеси 50 нМ, 500 нМ и 75 нМ, соответственно

60 120 180 240 300 Время, мин

(Ж)Рг-124 (•) т-124-Т111У (■) Ш-124,„у

(Д) Пг-124+8ш-Т1пу (о)Ог-124-Т,„у+8т-Т,„» (□) 02-124|ПУ+8т-Т,„у

Закономерности расщепления РНК25 3'-«инвертированными» ДНКзимами Ог-1241ПУ и Ог-124-Тшу в присутствии олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов)-эффекторов в зависимости от длины и типа концевой модификации эффектора совпадали с ранее описанными закономерностями для системы Бг-124+эффектор (стр 6-7) В качестве примера на рис 7 приведены кинетические кривые расщепления РНК25 3'-«инвертированными» ДНКзимами в присутствии эффектора 8ш-Т111У

ДНКзим кс„ 103, мин1 К„, нМ кса,/Кга 106, нМ' мин 1

1)2-120 6 32±0 37 198±39 32

Ъг-Ш 1 86±0 19 2113±333 09

Бг-Ш+ва 4 01±0 26 910±116 4

Ог-124+8т 4 56±0 05 39±3 117

Пг-124+8т-Т1л, 4 10±0 08 39±6 105

Ог-Ш+РЬп-вт 2 3±0 04 35±4 66

Ог-124|„+8т 1 00±0 03 179±20 6

1>2-124|„+8т-Т|„ 1 17±0 03 98±7 12

П2-124-Т|„,+8т 2 60±0 04 30±4 87

П1-124-Т1пу+8т-Т,„У 3 00±0 05 28±4 107

Кинетические расщепления

Таблица 2

параметры РНК25 ДНКзимными конструкциями

Условия реакции 50 мМ Трис-НС1 (рН 7 5), 10 мМ МеСЬ, 37 °С, 50 нМ РНК25, 100-1600 нМ ДНКзим, 75 нМ 8т, 8т-Т|„у и РЬп-8т, 4800 нМ 8(1

Сравнение значений констант Михаэлиса для двухкомпонентных ДНКзимов на основе Бг-124, В2-124-Тшу и В2-124шу (табл 2) позволяет предполагать, что изменение полярности 3'-5' концевой связи в последовательности ДНКзима на З'-З' связь (Бг-124шу) дестабилизирует комплекс РНК-ДНКзим -эффектор, введение же дополнительного 3'-«инвертированного» тимидина (02-124-Тшу) не приводит к его дестабилизации

Возможно, что при добавлении эффектора происходит вытеснение дополнительного «инвертированного» тимидина из комплекса РНК-Ог-124-Т,„г-эффектор, тогда в такой

системе будет реализовываться выгодный для нее кооперативный контакт, аналогичный тому, который возникает на стыке дуплексов в комплексе РНК-Ог-124-эффеьтор Системы, содержащие ДНКзимы Иг-\24 и Т)г-\24-Т,т, обладали наибольшим значением общей каталитической эффективности расщепления (табл 2)

На основании всей совокупности данных можно сделать заключение, что оптимальным вариантом двухкомпонентной конструкции, обладающей высокой эффективностью расщепления РНК и стабильностью в биологических средах, является сочетание ДНКзима и олиго(2'-0-метилрибонуклеотида), содержащих дополнительный «инвертированный» тимидин на З'-конце

2. Двухкомпонентные ДНКзимы для расщепления мРНК гена множественной лекарственной устойчивости \1DR1

Способность двухкомпонентных ДНКзимов расщеплять протяженную структурированную РНК была продемонстрирована на примере 190-звенного 5'-концевого фрагмента МОЯ) мРНК, обладающего выраженной вторичной структурой (рис 8 А) Эта работа проводилась совместно с Лабораторией биохимии нуклеиновых кислот ИХБФМ СО РАН

еАиии СС иив р 112- I

Аси»ддо "о"

Я с с» С в

Ог-127-Т|л, Ог-127

3' 5'

.11 Ч Г5 ^ С и г

"С «А и" о"

6С А

,4 ¡¡. «о

в С А

ли с

АО в, д

ДАА О ССАдд. А АСа

02-127-Т,„„ 02-127-Т,„

и ДНКзимы

с З'-Т, ТСССССТС АССССТАС-5' З'-ТСССССТС АССССТАС-5'

сР* Ч <Р* Ч

с а А Т А Т

. р

Ча сасо»о? 02-127-Т,„, Ог-127

«еду

Эффекторы

Р' ш"Т„. 3'-Т1П„сассддсааддиисс-5' Я' ,4) 3'-сиадаасииссссид-5' ДНКзим Р5,44 -Т,„„ 3' -Т1т,сиадаасииссссид-5'

Рис 8 Двухкомпонентные ДНКзимы для расщепления 190-звенного фрагмента М0Я1 мРНК (РНК190) А Вторичная структура 190-звенного фрагмент М0К1 мРНК (Ко$1епко Е V й а1, 2000, Куликов Р Н и др, 2003) Стрелкой указан сайт расщепления Цветом выделены области связывания ДНКзима и эффекторов Б Двухкомпонентные системы Число в нижнем индексе обозначения эффектора соответствует номеру нуклеотида \1DR1 мРНК, комплементарного первому нуклеотиду с З'-конца последовательности олиго-нуклеотида-эффектора

На основе разработанной стратегии были созданы двухкомпонентные ДНКзимы «1023», направленные на участок 112-158 в области инициации трансляции М1Ж1 мРНК с сайтом расщепления 5'-Ои-3' (рис 8, Б) Эти конструкции представляли собой 3'-«инвертированный» ДНКзим Вг-127-Т1ПУ и 3'-«инвертированные» 15-звенные олиго(2'-0-

метилрибонуклеотиды)-эффекторы F3ii2-T,„v или F5j44-T,„v, связывающиеся с РНК «встык» с 3'- или 5'-концом ДНКзима

С целью выяснения влияния «инвертированного» тимидина в области контакта ДНКзима и эффектора на каталитическую активность двухкомпонентных систем в качестве контроля были использованы ДНКзим Dz-127 и эффектор F5144, не содержащие дополнительного «инвертированного» тимидина на З'-конце олигонуклеотидной последовательности

Сначала нами была изучена эффективность расщепления РНК190 ДНКзимами Dz-127 и Dz-127-Tlnv в отсутствие эффекторов Введение дополнительного «инвертированного» тимидина на З'-конец ДНКзима приводило к снижению степени расщепления РНК (рис 9) Анализ значений кинетических параметров расщепления мРНК-транскрипта ДНКзимами Dz-127 и Dz-127-Tinv (табл 3) позволил заключить, что введение модификации на З'-конец ДНКзима не снижало его сродства к РНК-субстрату, о чем говорили близкие значения параметра Кт Снижение значения константы kcat свидетельствовало о некотором отрицательном влиянии З'-модификации на конформационные изменения, реализующиеся в комплексе РНК-ДНКзим в процессе его перехода из неактивного состояния в активное, либо о нарушении активной конформации этого комплекса

Присутствие в системе 15-звенных олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов)-эффекторов значительно повышало эффективность расщепления протяженного структурированного транскрипта Двухкомпонентные ДНКзимы расщепляли РНК-субстрат на 70-80 % за 10 мин (рис 9)

Рис 9 Расщепление РНК190 ДНКзимами Ш-127 (А) и Вг-127-Т,„, (Б) в отсутствие и в присутствии эффекторов (•) ДНКзим, (■) Д[1К'зни+Г>'|12-Т|„,, (Д) ДНКзим+Г^'щ-Тш, Условия реакции 50 мМ Трис-НС1 (рН 7 5), 10 мМ MgUг, 37 °С Концентрации РНК, ДНКзима и эффекторов в реакционной смеси 50,500 и 500 нМ, соответственно

Сравнивая значения кинетических параметров расщепления (табл 3), можно видеть, что основное влияние эффекторов заключается в повышении сродства ДНКзима к РНК-субстрату Уменьшение значения константы Михаэлиса от 30 доЮО раз, скорее всего, вызвано повышением стабильности ДНКзим-субстратного комплекса в присутствии эффекторов за счет возникновения кооперативного контакта на стыке дуплексов, а также увеличением скорости ассоциации ДНКзима и РНК Общая каталитическая эффективность ДНКзимов в присутствии олигонуклеотидов-эффекторов возрастала в 10-100 раз и зависела от наличия дополнительного «инвертированного» тимидина на З'-конце как эффектора, так и ДНКзима, а также от расположения эффектора в системе

ню-, А

100-, Б

Время, мин

0 20 40 60 80 100 120 Врем», мин

Таблица 3 Кинетические параметры расщепления PIIKI90 ДНКзимными конструкциями

Условия реакции 50 мМ Трис-НС1 (рН 7 5), 10 мМ MgCh, 37 °С " 50 нМ PHKJ90, 250-8000 нМ ДНКзим,

6) 10 нМ РНК190, 100 нМ эффектор, 50-2000 нМ ДНКзим

Максимальную каталитическую активность в данных системах обеспечивало использование З'-эффектора, гибридизующегося с РНК «встык» с З'-концом ДНКзима, что связано, по-видимому, с различной вторичной структурой РНК-транскрипта в области гибридизации эффекторов Наличие 3'-«инвертированного» тимидина в области контакта ДНКзима и эффектора не снижало каталитической активности двухкомпонентных систем

Полученные нами результаты говорят о том, что использование устойчивых в биологических средах конструкций, представляющих собой тандем из 3'-«инвертированных» ДНКзима и олиго(2'-0-метилрибонуклеотида)-эффектора, является особенно выгодным для расщепления протяженных структурированных РНК

3 Двухкомпонентные ДНКзимы для расщепления мРНК гена инсулиноподобного фактора роста IGF-I

Универсальность предложенной нами стратегии конструирования двухкомпонентных ДНКзимов была продемонстрирована на примере мРНК гена инсулиноподобного фактора роста IGF-I, вторичная структура которой не установлена Нам предстояло выбрать участки IGF-I мРНК для расщепления ДНКзимами, а также оптимизировать структуру ДНКзимов с целью повышения их каталитической активности и стабильности в биологических средах Эта работа проводилась совместно с доктором Франсуа (Лаборатория регуляции и динамики генома Национального музея естественной истории, Париж)

3 1. Выбор участков IGF-I мРНК для расщепления ДНКзимными конструкциями. Оптимизация длины субстрат-связывающих участков ДНКзимов Инозннсодержа-щие аналоги ДНКзимов

Для расщепления были выбраны 3 области IGF-I мРНК - GAEL, KPT и FRS, расположенные в 3-ем и 4-ом экзонах этой мРНК

Были созданы 4 серии ДНКзимов (GAEL, KPT, FRSco FRSgu), комплементарных выбранным участкам IGF I мРНК с сайтами расщепления 5-GC-3' и 5-GU-3' (рис 10, табл 4), с различной длиной фланкирующих доменов (8-10 нуклеотидов) Длину этих доменов выбирали согласно оптимальному для каталитической активности ДНКзимов расчетному значению свободной энергии Гиббса (-ДО°з7=8-Ю ккал/моль) (Joyce G F, 2001), характеризующему каждый из дуплексов, образованных 3'- и 5'-субстрат-связывающими участками с РНК

ДНКзим km, мин 1 Kmi mkM ktal/iv,,!, мин 1 mkM 1

Dz-127" 0 53±0 05 7 4±1 2 0 07

Dz-127-Tinv" 0 25±0 01 8 9±0 6 0 03

Dz-127+F5112-TjnvfiJ 0 26±0 02 0 11±0 03 24

Dz-127-Tlnv+FJ112-T,„v6) 0 17±0 01 0 06±0 01 28

Dz-127-Tinv+F5 i44-Tln»6) 0 16±0 01 0 26±0 06 0 62

Dz-127-T|„,+ F5 и/' 0 17±0 01 0 50±0 11 0 34

5 GAGACCCUUUGCGGGIjCUGAGCUGG 3't gaaacgccc gactcgacc

g* °g„ С с

(• M I A T

A *

= atc°

6 AAGCCCAGAGdcUAUGGCUCC 3 t^ttcgggtgtc gafaccgagg g„

5 UGCU(JCCGGA(^CUGUGAUCUGAGG 3' t acgaaggcct gacactagac

ga °G с с

а дт пк,

CATC°

6 UGCUIJCCGGAGCuduGAUCUGAGG

3 t aaogcctcga actagaotcc Or,

мм

i ks,,

Рис 10 ДНКзимы для направленного расщепления синтетических фрагментов ЮР-1 мРНК (приведены ДНКзимы с максимальной длиной фланкирующих участков) Стрелками указаны сайты расщепления Подстрочный двухбу-квенный индекс означает сайт расщепления

aj с

-атс-

Таблица 4 Каталитическая активность 3'-«инвертированных» ДНКзимов серий KPT, GAEL, FRSgc и

ДНКзим -AG °,7, ккал моль1 375' W v0 10,'51

375' мин 1 нМ мин 1

3'-T„„CGGGTGTCLGATACCGA-5' KPT8/8 9 5/7 4 0 010±0 003 0 26±0 01

3'-T„„TCGGGTGTCLGATACCGAG-5' KPT9/9 113/8 9 0 024±0 007 0 80±0 05

3'-TlllvTTCGGGTGTCLGATACCGAGG-5' KPT10/10 12 3/11 0 036±0 008 0 76±0 04

3'-T,mAAAGCCCCLGACTCGAC-5' GAEL8/8 9 1/7 7 - 0 068±0 003

3 -1 „„GAAAGCCCCLGACTCGACC-5' GAEL 9/9 10/10 6 0 064±0 009 2 l±0 I

3'-T„„CGAAGGCCTLGACACTAGA-5' FRSGt9/9 10 2/6 7 0 015±0 002 0 8U0 01

3'-T,„,CGAAGGCCTLGACACTAGAC-5' FRSgc-9/Ю 102/8 3 0 024±0 004 090±0 02

3,-T„lvACGAAGGCCTLGACACTAGAC-5' FRSra-10/10 118/8 3 0 026±0 005 0 71±0 01

3'-T„„ AGGCCTCGALACTAG ACT-5' FRSg!9/8 118/6 018±0 01 3 0±0 1

3'-T,mAGGCCTCGALACTAGACTC-5' FRS019/9 118/7 8 0 70±0 07 12 7±0 6

3'-Tm,AAGGCCTCGALACTAGACTCC-5' FRS6C10/10 12/10 7 2 0±0 2 22±2

РНК, 10 нМ ДНКзим L - Последовательность каталитического кора 5'-GGCTAGCTACAACGA-3' (здесь и далее по тексту) Цифрами в обозначении ДНКзимов указана длина 3'- и 5'-субстрат-узнающих участков

З'-Конец каждого ДНКзима был «кэпирован» «инвертированным» тимидином, поскольку ранее (стр 3) нами было показано, что такая модификация увеличивает устойчивость ДНКзимов в биологических средах Изучена эффективность расщепления синтетических фрагментов РНК GAEL, KPT и FRS созданными ДНКзимами как при их избытке, так и при недостатке по отношению к мишени Как видно из представленных в табл 4 значений параметров наблюдаемых констант скорости расщепления (kobs) и начальных скоростей расщепления (v„), ДНКзимы с максимальной длиной субстрат-связывающих доменов обладали наибольшей каталитической активностью

Необходимо отметить, что во всех случаях максимальной скоростью расщепления обладали ДНКзимы серии FRS6£/, направленные на сайт 5-GU-3', что совпадает с литературными данными о наиболее «чувствительных» к расщеплению ДНКзимами сайтах в РНК Для повышения каталитической активности ДНКзимов серий KPT, GAEL и FRS(,r, направленных на менее чувствительный к расщеплению сайт 5-GC-3', нами были сконструированы инозинсодержащие аналоги этих ДНКзимов Согласно литературным данным (Cairns М J et al, 2003% замена дезоксигуанозина, примыкающего к каталитическому кору ДНКзима, на дезоксиинозин увеличивает каталитическую активность ДНКзима Сравнение значений констант скорости расщепления фосфодиэфирной связи (kcieav) (табл 5) позволяет заключить, что в нашем случае такая модификация в 6-8 раз увеличивает скорость расщепления

Таблица 5 Каталитическая активность 3'-«инвертированных» дезоксиинозинсодержащих ДНКзимов серий

ДНКзим l^tlcav, мин 1

3 '-T.nvTTCGGGTGTCLGATACCGAGG KPT10/10 0 046±0 009

3'-T,„.TTCGGGTGTCLIATACCGAGG KPT10/10I 0 31±0 05

3 '-T,„VGAAAGCCCCLGACTCGACC GAEL9/9 0 063±0 011

3'-T,„.GAAAGCCCCLIACTCGACC GAEL9/9I 0 48±0 06

3'-Ti„vACGAAGGCCTLGACACTAGAC FRSccl0/10 0 032±0 003

3'-T,„.ACGAAGGCCTLIACACTAGAC FRScclO/lOI 0 14±0 02

Условия реакции 50 мМ Трис-HCl (рН 7 5), 10 мМ MgC!2, 37 "С, 10нМ РНК, 8000 нМ ДНКзим 1-дезоксиинозин

Таким образом, нами были впервые сконструированы ДНКзимы, направленные на различные участки ЮМ мРНК, и показана возможность эффективного расщепления синтетических фрагментов этой РНК созданными конструкциями

3.2. ДНКзимы «10-23» для расщепления IGF-I мРНК, содержащие модификации в каталитическом коре и субстрат-связывающих участках

С целью усиления сродства ДНКзимов к РНК и дополнительного повышения устойчивости к нуклеазам были созданы модифицированные ДНКзимы, содержащие помимо З'-концевого «инвертированного» тимидина 2'-0-метилрибонуклеотиды в 3'- и 5'-субстрат-связывающих участках, а также в неконсервативных положениях каталитического кора (табл 6)

Таблица 6 Каталитическая активность 3'-«инвертированных» ДНКзимов серий KPT, GAEL, FRScc и

ДНКзим liclcav, ' мин 1 kl й) ^■obsj мин 1 v„ 10,"' нМ мин 1

3 '-T,„,cgggTGTCLGATAccga КРТ878Т 0 036±0 004 0 030±0 008 1 02±0 07

3'-T,„cgggTGTCLmGATAccga KPT878mLm 0 040±0 004 0 035±0 007 1 01±0 05

3'-T„,»uucgGGTGTCLGATACCgagg KPT10710T 0 042±0 009 0 034±0 007 0 71±0 02

3'-T,„uucgGGTGTCLn1GATACCgagg KPT10710mLm 0 045±0 007 0 037±0 007 0 73±0 04

3,-T,nvgaaaGCCCCLIACTCgacc GAEL979'"IL 0 5±0 1 0 40±0 03 8 2±0 2

3'-T,„,GAAAGCCCCLIACTCGACC GAEL9/9I 0 48±0 06 0 31±0 05 12 3±0 2

3'-T,„gaaaGCCCCLmIACTCgacc GAEL9m/9™ILm 0 22±0 04 0 23±0 01 5 0±0 1

3'-T,„»cgaaGGCCTLGACACuaga FRScc979mL 0 033±0 004 0 026±0 004 0 68±0 02

3'-TmvcgaaGGCCTLmGACACuaga FRScc979'nLm 0 030±0 003 0 031 ±0 004 0 84±0 02

3'-T,nvcgaaGGCCTLGACACTagac FRScci>710mL 0 035±0 004 0 031 ±0 007 0 75±0 01

3'-T,„vcgaaGGCCTLmGACACTagac FRScc9710mLm 0 033±0 003 0 032±0 005 0 62±0 01

3'-T,„,aggcCTCGALACTAgacu FRSC[,978™L 6 8±0 5 1 5±0 2 12 5±0 2

3'-Tm»aggcCTCGALmACTAgacu FRSC„978"L™ 4 1±0 3 1 2±0 1 14 5±0 2

3'-TimaggcCTCGALACTAGacuc FRSG{,979mL 8 3±0 7 2 4±0 2 21 0±0 4

3'-Tm,aggcCTCGAL"'ACTAGacuc FRSw9m/9mLm 4 0±0 3 1 7±0 I 9 l±0 2

Условия реакции 50 мМ Трис-НС1 (рН 7 5), 10 мМ 37 °С, " ЮнМ РНК, 8000 нМ ДНКзим,ЮнМ

РНК, 100 нМ ДНКзим, 100 нМ РНК, 10 нМ ДНКзим Ь"1 - Последовательность модифицированного каталитического кора 5'-GgCTAGcuACaACga-3' (здесь и далее по тексту), п - 2'-0-метилрибонуклеотид, N -дезоксирибонуклеотид Цифрами в обозначении ДНКзимов указана длина 3'- и 5'-субстрат-узнающих участков, надстрочный индекс ш указывает на присутствие в субстрат-связывающих участках или каталитическом коре 2'-0-метилрибонуклеотидов

На примере ДНКзимов серии FRS^ нами было показано, что эта дополнительная модификация каталитического кора и субстрат-связывающих участков в два раза увеличивает время полужизни 3'-«инвертированного» ДНКзима в среде, содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки

Сравнивая кинетические параметры расщепления, представленные в табл 4 и 6, можно заключить, что замены дезоксирибонуклеотидов на их 2'-0-метил аналоги в суб-страт-связывающих участках ДНКзима КРТ8/8 и ДНКзимов серии FRS^ способствуют повышению эффективности расщепления РНК как в условиях избытка, так и в условиях недостатка ДНКзимов В остальных случаях введение модификаций во фланкирующие домены практически не сказывалось на значениях начальных скоростей реакций расщепления и наблюдаемых констант скорости расщепления Дополнительная модификация каталитического кора несколько снижала эффективность расщепления РНК ДНКзимами серий FRSgu и GAEL. В этих случаях можно было наблюдать примерно двукратное снижение значения константы скорости расщепления фосфодиэфирной связи (kcieav) Были определены также кинетические параметры расщепления синтетических фрагментов РНК этими ДНКзимами (табл 7)

Таблица 7 Кинетические параметры расщепления синтетических фрагментов IGF-I мРНК ДНКзимами серий FRSf, t> и GAEL(I)

Условия реакции 50 мМ Трис-HCl (рН 7 5), 10 мМ MgCl2,37 °С ■> 10 нМ РНК, 50-1600 нМ ДНКзим б> 1 нМ РНК, 5-200 нМ ДНКзим

Определение кинетических параметров проводилось в условиях избытка ДНКзимов по отношению к РНК с предварительным отжигом ДНКзим-субстратного комплекса, поэтому кинетическую константу кса, можно рассматривать как эквивалент константы расщепления фосфодиэфирной связи Как видно из данных, приведенных в табл 6 и 7, значения к^ практически совпадают с определенными ранее значениями к^^ Учитывая снижение значения параметров к^ и kdeav, можно заключить, что модификация каталитического кора приводит к частичному искажению структуры активной конформации ДНКзим-субстратного комплекса, в которой происходит расщепление Тем не менее, модифицированные ДНКзимы, содержащие 3'-«инвертированный» тимидин и 2'-0-метилрибонуклеотиды одновременно и в субстрат-связывающих участках, и в каталитическом коре, обладают более высокой каталитической активностью и стабильностью в биологических средах по сравнению с аналогами, содержащими только «инвертированный» тимидин на З'-конце

Обладающие максимальной каталитической активностью на коротких РНК-мишенях ДНКзимы из всех серий были использованы для расщепления транскрипта IGF-I мРНК длиной 364 нуклеотида (РНК364)

3 3 Расщепление протяженного транскрипта IGF-I мРНК наиболее эффективными ДНКзимами

Для того, чтобы оценить доступность для связывания с ДНКзимом каждого из участков IGF-I мРНК-транскрипта (KPT, GAEL и FRS), было проведено расщепление

ДНКзим k,.,,, мин 1 Km, нМ kcat/Km, мин 1 нМ'

FRSct/WL"' 11 5±0 5 312±37 0 037

FRS<;i/9m/9mLm 5 6±0 2 201±24 0 028

FRScii9"78mL"' 10 3±0 5 500±61 0 02

FRSr;(/9nVSmL"1 ^ 5 4±0 1 346±26 0016

GAEL9m/9raILb) 0 7±0 1 22 9±6,7 0 03

GAEL9"V9mILm l>) 0 36±0 02 U 9±2 2 0 03

РНК364 РНКазой Н в присутствии комплементарных соответствующим областям РНК-транскрипта антисенс-олигодезоксирибонуклеотидов. а также мутантных версий ДНКзимов. не обладающих собственной каталитической активностью расщепления РНК из-за замены дезоксигуанозина в шестой позиции каталитического кора на дезоксиадено-зин (7.аЬого\у$ка 7.. еI а!., 2002). Доступность участков РНК понижалась в ряду САЕЬ>П*8№>РК8(,с>КРТ

со ОС — —

j j j

Ь О ^

Ожидаемые продукты расщепления IGF-I мРНК транскрипта

On о о О

■у /

** -г < а. се.

w W w

А т» Ш • т

тш 4»

ffbobii'oio-0!0;^-- _ IXXin I7bni

!А У ~ I- S. s~ S~ yf I- У? ш к щ !- у" yf ... .

к^^а.а.^аазга.^-'-г-Гй.^а: _. '¿¿in _24Zni ,,.-,■

■ ™ 11 Kl 1

IXSiri I7')in ш-1-- I RS

55m 309н i

—II (.AKI.

Рис. 11. Расщепление ДНКзимами транс* ** — крипта РНК364. меченного в процессе реакции транскрипции с использованием a['2P]UTP (радиоавтограф 8 %-нош денаау-рирующего ПААГ после разделения продуктов расщепления).

Условия реакции: 50 мМ Трпс-HCI (рН 7.5). 10 мМ MgCl2; 37 °С; 4 ч: 20 нМ РНК364. 1000 нМ ДНКзим. Дорожка к - РНК после инкубации в буфере в течение 4 ч.

Оценка эффективности расщепления транскрипта РНК364 выбранными ДНКзимами представлена на рис. II. Из данного радиоавтографа видно, что созданные ДНКзимы специфично расщепляли РНК по единственному сайту с образованием ожи-» даемых 3'- и 5'-продуктов расщепления. Как

и в случае синтетических РНК-мишеней, максимальной активностью обладали ДНКзимы серий GAEL и FRS<yt'. Все ДНКзимы серии КРТ обладали низкой эффективностью расщепления РНК364. С целью получения более точных данных дальнейшие исследования расщепления IGF-1 мРНК-трапскрипта проводили с исследованием 5'-[~'2Р]-меченого субстрата.

Полученные результаты позволяют заключить, что обладающие наиболее высокой каталитической активностью ДНКзимы серии GAEL и FRS«/ направлены на более доступные для связывания участки IGF-I мРНК-транскрипта. Наличие 2'-0-метилрибонуклеотидов в субсграт-связывающих участках и/или каталитическом коре этих ДНКзимов. а также замена в последовательности ДНКзима серии GAEL дезоксигуанозина. примыкающего к каталитическому кору, на дезоксирибоинозин увеличивали эффективность расщепления РНК364 (рис. 12). Таким образом, максимальной эффективностью расщепления протяженного IGF-I мРНК-транскрипта обладали 2'-О-

модифицированные ДНКзимы GAEL9ra/9mIL, GAEL9m/9mILm, FRS6t/9m/9mL и FRS(?£/9m/9mLra

; loo

j 80 !

; 60

2 40 &

J

5 20

с

u

fi 0

(o) GAEL9m/9n'ILm (■) GAEL9°'/9mIL (Л) GAEL9/9I (T) GAEL9/9

0 60 120 180 240 300 360 420 480 Время, мин

£ 100 к

g 80 aj

1 60

3

2 40

20-

(о) FRSc(£m/9mLm (о) FRSf,i/9m/9mL (A)FRScü10/10

60 120 180 240 300 360 420 480 Время, мин

Рис 12 Расщепление РНК364 ДНКзимами серии GAEL и FRSci; Условия расщепления 50 мМ Трис-НС1 (pH 7 5), 10 мМ MgCl2, 200 мМ KCl, 37 °С, 100 нМ РНК, 5000 нМ ДНКзим

ДНКзим мин 1 КП1, МКМ мин ' мкМ'

FRS,;u979raL 0 20±0 01 18 0±2 2 001

FRSoüWL"' 017±0 01 5 1±0 6 0 03

Условия реакции 50 мМ Трис-HCl (pH 7 5), 10 мМ MgCl2, 200 мМ KCl, 37 °С, 100 нМ PI1K364, 1000-40000 нМ ДНКзим

Анализ значений кинетических параметров расщепления РНК364 ДНКзимами ГК8(",1'9,79ПЧ, и РК8,-,(/9т/9тЬт (табл 8) показывает, что модификация каталитического кора ДНКзима не изменяет значения константы кса, Следует заметить, что, вероятно, параметр кса, в данном случае, в отличие от расщепления коротких РНК-субстратов, уже нельзя рассматривать как эквивалент константы скорости расщепления фосфодиэфирной связи, поскольку, как это было показано для рибозимов (Наттапп С, ЬШеу О М, 2002), этот параметр включает в себя также константы скорости конформационных перестроек в НК-энзим-субстратном комплексе в процессе его перехода из неактивной конформации в активную Поскольку в случае протяженного РНК-субстрата скорость таких конформационных переходов снижается, лимитирующей стадией реакции становится не расщепление, а образование активного комплекса ДНКзим-субстрат Сглаживание разницы в значениях константы кса1 ДНКзимов ГЯ8(уС/9,79тЬ и РЯ8(/(/9т/9П1Ьт может свидетельствовать о том, что в случае ДНКзима, содержащего 2'-0-метилрибонуклеотиды в каталитическом коре, скорость конформационных переходов выше

Сравнивая значения констант Михаэлиса Оабл 8), можно заключить, что ДНКзим ГЯ8(,(/9"79П1Ьт обладает большим сродством к протяженному ЮР-1 мРНК-транскрипту по сравнению со своим аналогом FRS(7l/9m/9mL, содержащим немодифицированный каталитический кор

Следует отметить, что эффективность расщепления коротких РНК-мишеней ДНКзимами была существенно выше, по сравнению с расщеплением протяженного РНК-транскрипта Эти различия объясняются не только снижением скорости конформационных переходов, необходимых для достижения активной конформации ДНКзим-субстратного комплекса, но и значительным снижением доступности участка расщепления протяженной РНК, обладающей сложной вторичной структурой, для ДНКзимов Для

того, чтобы увеличить доступность мРНК в участке связывания ДНКзимов, мы использовали предложенный и апробированный при расщеплении MDR1

мРНК подход, основанный на применении 3'-«инвертированных» олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов)-эффекторов, связывающихся с РНК-субстратом «встык» с 3'- или 5'-концом ДНКзима и способных к «разворачиванию» участка его связывания с РНК

3.4. Конструирование двухкомпонентных ДНКзимов «10-23» для расщепления IGF-I мРНК-транскрипта н изучение их свойств

Новые двухкомпонентные конструкции для направленного расщепления IGF-I мРНК состояли из модифицированного ДНКзима «10-23» и 20-звенных олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов)-эффекторов, содержащих на З'-конце дополнительный «инвертированный» тимидин (Tinv) (рис 13)

GAEL(L) или CACL(L").

FJ F'

1 cael 1 gael

3'-Tl[waucuccgcccuggucucugg 3'-Tlnvaccugcgagaagucaagcac

5' UAGAGGCGGGACCAGAGACCCUUUGCGGGCjCUGAGCUGGUGGACGCUCUUCAGUUCGUG 3' 3'-T|nvgaaaCGCC£ IACTCgacc-5'

L галитическД ДНКЗНМ

I --op J GAEL9"V9'"IL или GAEL979"'IL"' \L или L J

FRS,,(L) или FRS,,(L").

F3 F^

r fbs r fr.s

З'-Т^диаасассиасисасаасда , 3'-Tlnycuccgaccucuacaugacac

5' CAUUGUGGAUGAGUGUUGCUUCCGGAGCUGUGAUCUGAGGAGGCUGGAGAUGUACUGUG 3' 3'-T(nvaggcCTCGA ACTAGacuc-5'

ДНКзим

FRS(,l9"V9mL или FRSf,[9'79"'Ln>

Рис. 13 Двухкомпонентные ДНКзнмы для расщепления IGF-I мРНК-транскрипта F3 и F4 - эффекторы, связывающиеся с РНК «встык» с 3'- или с 5'-концом ДНКзима, соответственно Стрелкой указан сайт расщепления Каталитический кор L 5-GGCTAGCTAC A ACG А-3', Lm 5'-GgCTAGcuACaACga-3'

На примере системы FRS&i/(L) нами были определены константы скорости ассоциации двухкомпонентной конструкции с РНК364 С помощью метода задержки в геле изучено связывание 5'-[32Р]-меченого неактивного (мутантного) ДНКзима в присутствии и в отсутствие эффекторов, а также 5'-[32Р]-меченых эффекторов с «холодным» 1GF-I мРНК-транскриптом Показано, что эффекторы увеличивают значение константы скорости связывания ДНКзима с РНК в 10-20 раз (табл 10)

Реакция ассоциации k,„, mkM 1 мин 1

FRScw9'79mL + РНК364 0 0026±0 0004

FRScb9"Y9",L+ F° ns + PHK364 0 022±0 004

FRS«,9'79raL+ F5 rRS + PHK364 0 06±0 01

F3 ras + PHK364 0 40±0 08

F" FRS + PIIK364 0 30±0 05

Таблица 10 Значения констант скорости ассоциации (к,*,) ДНКзима, эффекторов и ДНКзима в присутствии эффекторов с РНК364

Условия реакции 50 мМ Трис-HCl, (pH 7 5), 10 мМ MgCl2, 200 мМ KCl, 37 "С, 100 нМ РНК, 1000 нМ ДНКзим, 500 нМ эффектор

Необходимо отметить, что константа скорости связывания самих эффекторов с РНК примерно на два порядка выше значения константы скорости ассоциации ДНКзима с транскриптом Можно предполагать, что при связывании двухкомпонентной конструкции с протяженной структурированной РНК в первую очередь с ней гибридизуются олиго(2'-0-метилрибонуклеотиды)-эффекторы, «разворачивая» при этом участок связывания для ДНКзима и ускоряя тем самым ассоциацию самого ДНКзима с мишенью

Следующим этапом работы стало исследование эффективности расщепления IGF-I мРНК-транскрипта созданными конструкциями Наиболее высокой каталитической активностью обладали двухкомпонентные системы FRSfft{L) и FRSfff/(Lnl), в которых степень расщепления РНК364 ДНКзимами при добавлении эффекторов повышалась с 10-20 % до 90-95 % за 10 мин инкубации (рис 14)

s?ioo

ti) FRSoí/W-L (о) FRSci/9nY9mL+F3'iífts

(a) frsotwl+f5 frs

(V) FRScl/9,79mL+F3 га5+ F5'

40 60 80 Время, мин

40 60 80 Время, мин

Рис 14 Расщепление РНК364 ДНКзимами серии FRScu Условия реакции 50 мМ Трис-HCl (pH 7 5), 10 мМ MgCl2, 200 мМ KCl, 37 "С, 100 нМ РНК, 1000 нМ ДНКзим, 500 нМ эффектор

Необходимо отметить, что при одновременном использовании 3'- и 5'-эффекторов эффективность расщепления РНК практически совпадала с эффективностью расщепления наиболее активными двухкомпонентными системами (ДНКзим+F5)

Таблица 11 Кинетические параметры расщепления РНЮ64 двухкомпонентными ДНКзимными конструк-

Условия реакции 50 мМ Трис-НС1 (рН 7 5), 10 мМ К^С12, 200 мМ КС1, 37 °С 0 100 нМ РНК, 1000-40000 нМ ДНКзим,

б) 20 нМ РНК, 200 нМ эффектор, 100-10000 нМ ДНКзим,

50 нМ РНК, 500-20000 нМ ДНКзим

циями

ДНКзимная конструкция к«,,, мин 1 Km, mkM kcat^Km, мин 1 mkM 1

FRSct9"V9",L') 0 20±0 Ol 18 0±2 2 0 01

FRSOT9,79mL+F3'FRS,') 0 18±0 01 1 6±0 3 0 11

FRSc^'Vg'^+F^'frs" 0 33±0 02 0 58±0 14 0 57

GAEL9m/9mILB) 0 14±0 01 2 2±0 2 0 06

GAEL9"V9"4L+Fjgaei.(" 0 10±0 01 0 68±0 15 0 15

GAEL9m/9mIL+F5 cael 012±0 01 0 53±0 08 0 23

Сравнение значений кинетических параметров расщепления ГСР-1 мРНК-транскрипта ДНКзимами в присутствии и в отсутствие эффекторов (табл 11) показывает, что, как и в случае двухкомпонентных систем, направленных на \iDRl мРНК, 3'-«инвертированные» олиго(2'-0-метилрибонуклеотиды)-эффекторы способствуют, главным образом, снижению значения константы Михаэлиса, то есть увеличивают сродство ДНКзимов к структурированному РНК-субстрату

Результаты, полученные в ходе данных исследований, подтверждают универсальность предложенной нами стратегии конструирования двухкомпонентных ДНКзимов и позволяют рассматривать созданные ДНКзимные конструкции как перспективные инструменты для подавления экспрессии генов

Выводы

Предложена и апробирована стратегия конструирования устойчивых в биологических средах двухкомпонентных ДНКзимов для эффективного расщепления протяженных структурированных РНК-мишеней, основанная на использовании ДНКзима «10-23» и олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов)-эффекторов, которые связываются с РНК «встык» с 3'- или 5'-концом ДНКзима, «разворачивая» ее вторичную структуру и облегчая тем самым присоединение ДНКзима к мишени

1 Созданы двухкомпонентные ДНКзимы, направленные на короткий и протяженный структурированный фрагменты мРНК гена множественной лекарственной устойчивости N10111 Изучено влияние типа эффектора и наличия в нем концевых модификаций на расщепление этих фрагментов созданными конструкциями Определены кинетические параметры расщепления Показано

• общая каталитическая эффективность ДНКзимов и их 3'-«инвертированных» аналогов в присутствии олигонуклеотидов-эффекторов возрастает на 1-2 порядка,

• роль олигонуклеотидов-эффекторов заключается в значительном усилении сродства ДНКзима к РНК-мишени,

• оптимальным вариантом эффекторов являются олиго(2'-0-метилрибонуклеотиды) с дополнительным З'-концевым тимидином, присоединенным З'-З'-фосфодиэфирной («инвертированной») связью,

• двухкомпонентные ДНКзимы эффективно расщепляют 190-звенный фрагмент М1Ж1 мРНК, при этом наиболее высокой каталитической активностью обладает система, содержащая З'-эффектор

2 Созданы четыре серии модифицированных ДНКзимов «10-23», направленных на различные участки мРНК гена инсулиноподобного фактора роста ГСР-1 с неизвестной вторичной структурой Исследована каталитическая активность созданных ДНКзимов в реакциях расщепления коротких фрагментов и протяженного транскрипта ГСР-1 мРНК Найдены две серии ДНКзимов «10-23» с наиболее высокой эффективностью расщепления

Показано, что наиболее эффективными в расщеплении протяженного 364-звенного транскрипта ГСР-1 мРНК являются 3'-«инвертированные» ДНКзимы, содержащие 2'-0-метилрибонуклеотиды в субстрат-связывающих участках и неконсервативных позициях каталитического кора

3 Созданы двухкомпонентные конструкции, направленные на IGF-I мРНК, состоящие из 3'-«инвертированного» ДНКзима «10-23», содержащего 2'-0-метилрибонуклеотиды, и 3'-«инвертированных» 20-звенных олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов)-эффекторов Изучено связывание двухкомпонентных ДНКзимов с 364-звенным IGF-I мРНК-транскриптом и определены кинетические параметры расщепления протяженной РНК созданными конструкциями Показано

• эффекторы обладают более высокой скоростью ассоциации со структурированной РНК по сравнению с ДНКзимами,

• в присутствии эффектора скорость связывания ДНКзима со структурированным РНК-транскриптом повышается в 10-20 раз,

• двухкомпонентные конструкции расщепляют протяженный IGF-I мРНК-транскрипт с высокой эффективностью Общая каталитическая эффективность ДНКзимов повышается в 3-20 раз в присутствии эффекторов за счет снижения значения константы Михаэлиса

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1 Кузнецова М А , Репкова М Н , Фокина А А . Веньяминова А Г , Власов В В «10-23» ДНКзимы для направленного расщепления мРНК гена mdrl Известия Академии наук Серия химическая 2002 №7 С 1100-1103

2 Kuznetsova М , Fokina А. Lukin М , Repkova М, Venyaminova А, Vlassov V Catalytic DNA and RNA for targeting MDR1 mRNA Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids 2003 V 22 N5-8 P 1521-1523

3 Fokina A A. Kuznetsova M A, Repkova M N, Venyaminova A G Two-component 10-23 DNA enzymes Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids 2004 V23 N 6-7 P 1031-1035

4 А Г Веньяминова, M А Кузнецова, А А Фокина Бинарные НК-энзимы Вестник научно-образовательных центров 2004 N5-6 С 14-18

5 А А Фокина, А Н Зенков, М А Зенкова, А Г Веньяминова, Ж -К Франсуа, В В Власов Двухкомпонентные ДНКзимы 10-23 Информационный вестник ВОГиС 2006 Т 10 №2 С 331-341

6 Фокина А А . Воробьева МА Влияние олигонуклеотидов-эффекторов на расщепление структурированной РНК ДНКзимами «10-23» Труды 3-го Международного форума «Актуальные проблемы современной науки» Естественные науки Часть 11 Биологические науки (10-12 сентября 2007, Самара) С 61-64

7 Воробьева М А , Фокина А А . Привалова А С , Зенков А Н , Веньяминова А Г Асимметричные мультикомпонентные НК-энзимы для воздействия на структурированные РНК Материалы V Конференции молодых ученых СО РАН, посвященной М А Лаврентьеву (Новосибирск, Академгородок, 20-22 ноября 2007) С 26-29

Подписано в печать «14» мая 2008 г Формат бумаги 60x84, 1/16 Тираж 100 экз Заказ № 723 Отпечатано «Документ-Сервис», 630090, Новосибирск, ул. Институтская 4/1, тел 335-66-00

ВВЕДЕНИЕ

1. ДНКЗИМ «10-23»: КОНСТРУИРОВАНИЕ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. ДНКзим «10-23» как каталитически активная нуклеиновая кислота

1.1.1. Роль ионов двухвалентных металлов в расщеплении РНК ДНКзимом« 10-23»

1.1.2. Кинетическая схема расщепления РНК ДНКзимом «10-23»

1.2. Связь структуры ДНКзима «10-23» и его каталитической активности

1.2.1. Влияние последовательности оснований каталитического домена на активность ДНКзима «10-23»

1.2.2. Зависимость каталитической активности ДНКзима «10-23» от длины, последовательности и типа нуклеотидов субстрат-связывающих участков

1.2.3. Регуляция каталитической активности ДНКзима «10-23» при помощи его конъюгирования с функциональными молекулами

1.2.4. Использование олигонуклеотидов-эффекторов для регуляции каталитической активности ДНКзима «10-23»

1.3. Применение ДНКзимов «10-23»

1.3.1. Использование ДНКзимов «10-23» для подавления экспрессии генов на уровне мРНК

1.3.1.1. Выбор участков РНК, доступных для расщепления ДНКзимами

1.3.1.2. Повышение устойчивости ДНКзима «10-23» в биологических средах

1.3.1.3. Способы доставки ДНКзимов в клетки

1.3.1.4. Расщепление протяженных РНК in vitro и ингибирование экспрессии генов in vivo ДНКзимами «10-23»

1.3.1.5. Сравнение биологической активности ДНКзима «10-23» с другими антисенс-агентами

1.3.2. Нетерапевтическое применение ДНКзимов «10-23»

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Реактивы и приборы

2.2. Основные методы работы

2.3. Методики эксперимента

2.3.1. Выделение и анализ олигонуклеотидов

2.3.2. Получение фрагмента IGF-I мРНК крысы (РНК364) транскрипцией in vitro

2.3.3. Введение радиоактивной метки в олигонуклеотиды

2.3.4. Введение радиоактивной метки в протяженные РНК-транскрипты

2.3.5. Расщепление синтетических фрагментов MDR1 мРНК (РНК18 и РНК25) ДНКзимными конструкциями

2.3.6. Расщепление синтетических фрагментов IGF-I мРНК ДНКзимными конструкциями серий FRSGt/, FRSGc, KPT и GAEL

2.3.7. Расщепление протяженных транскриптов MDR1 и IGF-I мРНК ДНКзимными конструкциями

2.3.8. Определение констант скорости ассоциации комплексов, образованных двухкомпонентным ДНКзимом или его отдельными компонентами с РНК

2.3.9. Исследование расщепления РНК364 РНКазой Н в присутствии антисенс-олигодезоксирибонуклеотидов и «мутантных» версий ДНКзимов

2.3.10. Исследование устойчивости ДНКзимов в культуральной среде с сывороткой

3. СОЗДАНИЕ ДВУХКОМПОНЕНТНЫХ ДНКзимов «10-23» И ИЗУЧЕНИЕ ИХ СВОЙСТВ (РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ)

3.1. Разработка стратегии конструирования двухкомлонентных ДНКзимных систем. Модельные двухкомпонентные ДНКзимные конструкции и изучение их каталитической активности

3.1.1. Создание модельных систем двухкомпонентных ДНКзимов

3.1.2. Влияние строения олигонуклеотидов-эффекторов на эффективность расщепления синтетического РНК-субстрата двухкомпонентными ДНКзимами

3.1.3. Влияние «инвертированного» тимидина на 3'-конце ДНКзима на эффективность расщепления РНК двухкомпонентными конструкциями

3.2. Двухкомпонентные ДНКзимы для расщепления мРНК гена множественной лекарственной устойчивости MDR

3.2.1. Выбор участка MDR1 мРНК-транскрипта для расщепления двухкомпонентными ДНКзимами. Создание двухкомпонентных систем для расщепления протяженного транскрипта MDR1 мРНК

3.2.2. Расщепление протяженного 190-звенного структурированного фрагмента MDR1 мРНК созданными двухкомпонентными ДНКзимами

3.3. Двухкомпонентные ДНКзимы для расщепления мРНК гена инсулиноподобного фактора роста IGF-I

3.3.1. Выбор участков.IGF-I мРНК для расщепления ДНКзимными конструкциями. Оптимизация длины субстрат-связывающих участков ДНКзимов. Инозинсодержащие аналоги ДНКзимов

3.3.2. ДНКзимы «10-23» для расщепления IGF-I мРНК, содержащие модификации в каталитическом коре и субстрат-связывающих участках

3.3.3. Расщепление протяженного транскрипта IGF-I мРНК наиболее эффективными ДНКзимами

3.3.4. Конструирование двухкомпонентных ДНКзимов «10-23» для расщепления IGF-I мРНК-транскрипта и изучение кинетических аспектов связывания двухкомпонентной конструкции с РНК

3.3.5. Расщепление IGF-I мРНК-транскрипта двухкомпонентными ДНКзимами 138 ВЫВОДЫ 141 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 143 ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

В настоящей работе использованы символы и сокращения структурных компонентов нуклеиновых кислот и их производных в соответствии с рекомендациями Комиссии по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии (IUPАС) и международного союза биохимиков (IUB), а также следующие обозначения: р - концевой фосфат В - гетероциклическое основание

Tmv- остаток тимидина, присоединенный З'-З'-фосфодиэфирной связью

АТР - аденозинтрифосфат

UTP - уридинтрифосфат

Phn - остаток Ы-(2-гидроксиэтил)феназиния

DMSO - диметилсульфоксид

EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота

SDS - додецилсульфат натрия

Трис - трис(гидроксиметил)аминометан

НК - нуклеиновая кислота

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота мРНК - информационная РНК

LNA - locked nucleic acid ед. акт. - единица активности фермента

ОЕ - оптическая единица

SELEX - Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

КД - круговой дихроизм

ПААГ - полиакриламидный гель

ФДЭ - фосфодиэстераза

Разработка эффективных подходов к направленному воздействию на нуклеиновые кислоты является актуальной проблемой современной молекулярной биологии, биотехнологии и фундаментальной медицины. Большой интерес исследователей вызывает поиск агентов, способных избирательно взаимодействовать с определенными последовательностями мРНК, с целью создания на их основе инструментов молекулярно-биологических исследований и терапевтических средств для лечения вирусных, онкологических и других заболеваний.

Одним из перспективных подходов к селективному воздействию на РНК, имеющим как фундаментальное, так и прикладное значение, является использование каталитических нуклеиновых кислот - олигорибо- и олигодезоксирибонуклеотидов с характерной вторичной структурой, способных катализировать избирательное расщепление фосфодиэфирных связей в РНК.

Ярким представителем каталитически активных нуклеиновых кислот является ДНКзим «10-23», полученный методом SELEX в 1997 г. [1] и представляющий собой каталитический кор из 15 дезоксирибонуклеотидов, фланкированный двумя РНК-узнающими олигодезоксирибонуклеотидными участками. Пространственная структура активного комплекса ДНКзим'РНК еще не установлена, но тем не менее простота синтеза, высокая каталитическая активность и широкая субстратная специфичность (пурин-пиримидиновые сайты в РНК) позволили использовать ДНКзимы «10-23» для расщепления множества РНК-мишеней как in vitro, так и in vivo. За истекшие 10 лет опубликовано большое число работ, в которых продемонстрировано эффективное подавление этими ДНКзимами экспрессии генов, вызывающих инфекционные и онкологические заболевания, а также заболевания нервной и сердечно-сосудистой систем (см., например, обзоры [2 - 5]). Как примеры нетерапевтического применения ДНКзимов «10-23» следует упомянуть использование этих НК-энзимов для выявления однонуклеотидных полиморфизмов, выделения и наработки РНК-транскриптов, для количественной детекции РНК, для выявления участков связывания РНК с комплементарными олигонуклеотидами (см. обзоры [6, 7]), а также для создания молекулярных «нанодвигателей» (см. обзор [8]).

В настоящее время интенсивно ведется поиск новых вариантов каталитически активных конструкций на основе ДНКзима «10-23» с комплексом улучшенных физико-химических и биологических свойств. Решающими факторами, которые нужно учитывать при конструировании ДНКзимов «10-23», являются высокая эффективность расщепления, устойчивость к нуклеазам и способность воздействовать на природные РНК, имеющие сложную пространственную структуру.

Целью данной работы было создание новых устойчивых в биологических средах и эффективно расщепляющих протяженные структурированные РНК двухкомпонентных ДНКзимов, которые состоят из ДНКзима «10-23» и олигонуклеотидов-эффекторов, связывающихся с РНК-субстратом вблизи 3'- или 5'-конца ДНКзима.

В качестве терапевтически важных мишеней нами были выбраны мРНК гена множественной лекарственной устойчивости МБШ и мРНК гена инсулиноподобного фактора роста ЮР-1.

Появление у опухолевых клеток фенотипа множественной лекарственной устойчивости, заключающегося в приобретении клетками опухоли резистентности к целому ряду химиотерапевтических препаратов, часто обусловлено гиперэкспрессией гена ШЖ1, кодирующего трансмембранный белок Р-гликопротеин, выводящий из клетки широкий спектр соединений, в том числе и препараты, используемые в химиотерапии рака (см. обзор [9]). Ингибирование экспрессии гена МБШ является наиболее прямым подходом для преодоления синдрома множественной лекарственной устойчивости.

Инсулиноподобный фактор роста I представляет собой полипептид, непосредственно вовлеченный в процессы клеточной дифференциации и пролиферации. Показано, что этот фактор является потенциальным ингибитором апоптоза. Гиперэкспрессия гена ЮР-1 приводит к злокачественному перерождению клетки (см. обзор [10]).

Следует отметить, что использование ДНКзимов «10-23» для воздействия на МОЮ и ЮР-1 мРНК впервые предложено в данной работе.

Для достижения поставленной цели необходимо было решение следующих задач:

• разработка стратегии конструирования двухкомпонентных ДНКзимов, устойчивых в биологических средах;

• конструирование двухкомпонентных ДНКзимов, направленных на мРНК генов множественной лекарственной устойчивости 1уНЖ1 и инсулиноподобного фактора роста ЮР-1;

• исследование закономерностей расщепления протяженных структурированных фрагментов МОШ мРНК и ЮР-1 мРНК созданными двухкомпонентными конструкциями.

Разработка стратегии конструирования устойчивых в биологических средах двухкомпонентных ДНКзимов «10-23», основанной на «разворачивании» пространственной структуры природной РНК одним из компонентов с последующим ее эффективным расщеплением другим компонентом, открывает возможность создания новых перспективных ингибиторов экспрессии генов на уровне мРНК.

выводы

Предложена и апробирована стратегия конструирования устойчивых в биологических средах двухкомпонентных ДНКзимов для эффективного расщепления протяженных структурированных РНК-мишеней, основанная на использовании ДНКзима «10-23» и олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов)-эффекторов, которые связываются с РНК «встык» с 3'- или 5'-концом ДНКзима, «разворачивая» ее вторичную структуру и облегчая тем самым присоединение ДНКзима к мишени.

1. Созданы двухкомпонентные ДНКзимы, направленные на короткий и протяженный структурированный фрагменты мРНК гена множественной лекарственной устойчивости МОШ. Изучено влияние типа эффектора и наличия в нем концевых модификаций на расщепление этих фрагментов созданными конструкциями. Определены кинетические параметры расщепления. Показано:

• общая каталитическая эффективность ДНКзимов и их 3'-«инвертированных» аналогов в присутствии олигонуклеотидов-эффекторов возрастает на 1-2 порядка;

• роль олигонуклеотидов-эффекторов заключается в значительном усилении сродства ДНКзима к РНК-мишени;

• оптимальным вариантом эффекторов являются олиго(2'-0-метилрибонуклеотиды) с дополнительным З'-концевым тимидином, присоединенным З'-З'-фосфодиэфирной («инвертированной») связью;

• двухкомпонентные ДНКзимы эффективно расщепляют 190-звенный фрагмент МОГи мРНК, при этом наиболее высокой каталитической активностью обладает система, содержащая З'-эффектор.

2. Созданы четыре серии модифицированных ДНКзимов «10-23», направленных на различные участки мРНК гена инсулиноподобного фактора роста ЮГЧ с неизвестной вторичной структурой. Исследована каталитическая активность созданных ДНКзимов в реакциях расщепления коротких фрагментов и протяженного транскрипта ЮР-1 мРНК. Найдены две серии ДНКзимов «10-23» с наиболее высокой эффективностью расщепления.

Показано, что наиболее эффективными в расщеплении протяженного 364-звенного транскрипта ЮР-1 мРНК являются 3'-«инвертированные» ДНКзимы, содержащие 2'-0-метилрибонуклеотиды в субстрат-связывающих участках и неконсервативных позициях каталитического кора.

3. Созданы двухкомпонентные конструкции, направленные на ЮР-1 мРНК, состоящие из 3'-«инвертированного» ДНКзима «10-23», содержащего 2-0-метилрибонуклеотиды, и 3'-«инвертированных» 20-звенных олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов)-эффекторов. Изучено связывание двухкомпонентных ДНКзимов с 364-звенным ГСР-1 мРНК-транскриптом и определены кинетические параметры расщепления протяженной РНК созданными конструкциями. Показано:

• эффекторы обладают более высокой скоростью ассоциации со структурированной РНК по сравнению с ДНКзимами;

• в присутствии эффектора скорость связывания ДНКзима со структурированным РНК-транскриптом повышается в 10-20 раз;

• двухкомпонентные конструкции расщепляют протяженный ЮР-1 мРНК-транскрипт с высокой эффективностью. Общая каталитическая эффективность ДНКзимов повышается в 3-20 раз в присутствии эффекторов за счет снижения значения константы Михаэлиса.

1. Santoro S. W., Joyce G. F. A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997. V. 94. № 9. P. 4262-4266.

2. Tritz R., Habita C., Robbins J. M., Gomez G. G., Kruse C. A. Catalytic nucleic acid enzymes for the study and development of therapies in the central nervous system: Review Article. // Gene Ther. Mol. Biol. 2005. V. 9A. P. 89-106.

3. Isaka Y. DNAzymes as potential therapeutic molecules. // Curr. Opin. Mol. Ther. 2007. V. 9. №2. P. 132-136.

4. Joyce G. F. RNA cleavage by the 10-23 DNA enzyme. // Methods Enzymol. 2001. V. 341. P. 503-517.

5. Silverman S. K. In vitro selection, characterization, and application of deoxyribozymes that cleave RNA. // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33. № 19. P. 61516163.

6. Lu Y., Liu J. Functional DNA nanotechnology: emerging applications of DNAzymes and aptamers. // Curr. Opin. Biotechnol. 2006. V. 17. № 6. P. 580-588.

7. Ставровская А. А. Клеточные механизмы множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. // Биохимия. 2000. Т. 65. № 1. С. 112-126.

8. Pollak М. N., Schernhammer Е. S., Hankinson S. Е. Insulin-like growth factors and neoplasia. // Nat Rev Cancer. 2004. V. 4. № 7. P. 505-518.

9. Cech T. R., Zaug A. J., Grabowski P. J. In vitro splicing of the ribosomal RNA precursor of Tetrahymena: involvement of a guanosine nucleotide in the excision of the intervening sequence. // Cell. 1981. V. 27. № 3. Pt 2. P. 487-496.

10. Guerrier-Takada C., Gardiner K., Marsh Т., Pace N., Altman S. The RNA moiety of ribonuclease P is the catalytic subunit of the enzyme. // Cell. 1983. V. 35. № 3. Pt 2. P. 849-857.1314,15,16