Окислительное расщепление ДНК аренами и их олигонуклеотидными конъюгатами в присутствии ионов Cu(II) тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

Коваль Ольга Александровна

Окислительное расщепление ДНК аренами и их олигонуклеотидными конъюгатами в присутствии ионов

Си(Т1)

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 2003

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (бывший Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН)

Научные руководители: д.х.н., академик Власов Валентин Викторович

к.х.н. Черноловская Елена Леонидовна

Официальные д.б.н., профессор Загребельный Станислав Николаевич

оппоненты: к.х.н. Левина Ася Сауловна

Ведущая организация: Институт цитологии и генетики СО РАН

Защита состоится 17 октября 2003 г. в 10:00 часов на заседании диссертационного совета Д 003.045.01

в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск 90, пр. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан 16 сентября 2003 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

Д.х.н. ¿-Ь Фёдорова О. С.

2оо?~А

14(8О

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Создание химических соединений, способных расщеплять ДНК по определенным нуклеотидным последовательностям, необходимо для развития ряда областей молекулярной биологии и для разработки терапевтических препаратов, регулирующих экспрессию генов. Такие соединения могут быть получены путем присоединения реакционноспособных групп к олигонуклеотидам, взаимодействующим с определенными нуклеотидными последовательностям ДНК. Одним из актуальнейших вопросов конструирования таких соединений, является поиск реакционноспособных групп, которые могли бы высокоэффективно расщеплять или химически модифицировать ДНК в физиологических условиях. На сегодняшний день создан широкий спектр производных олигонуклеотидов, несущих алкилирующие, фотоактивируемые группы, комплексы переходных металлов, катализирующие окислительную деструкцию нуклеиновых кислот (ЕБТА-железо, фенантролин-медь, порфирин-железо). Реагенты последнего типа способны расщеплять или модифицировать протяженные участки ДНК и РНК в аэробных условиях в присутствии восстановителей или доноров активного кислорода, однако направленная модификация ДНК ни одним из описанных реагентов не достигает в физиологических условиях биологически значимых уровней.

Поскольку ДНК клетки упакована в регулярно повторяющиеся нуклеопротеиновые структуры - нуклеосомы, расплетение её цепей является редким событием, и вопрос о формировании комплексов олигонуклеотидов с клеточной ДНК в настоящее время является не вполне выясненным. С нерасплетенной двуцепочечной ДЬЖ олигонуклеотиды могут образовывать комплексы путем формирования трехтяжевых структур в районах с гомопуриновыми-гомопиримидиновыми последовательностями.

Большая бороздка ДНК, упакованной в нуклеосому, периодически обращена к поверхности гистонового октамера, и в этом случае экранирована коровыми гистонами, что должно препятствовать образованию комплекса с олигонуклеотидом. Поэтому, исследование влияния упаковки ДНК в нуклеосому на взаимодействие с олигонуклеотидами является актуальной задачей. Локализация гистоновых октамеров на ДНК и экранированность белками последовательностей-мишеней ДНК могут быть определены методами футпринтинга с помощью ферментов и химических реагентов, в том числе и с использованием металлокомплекс" ~

Цель работы. Цель настоящей работы состояла в создании новых реагентов для расщепления ДНК на основе замещенных производных бензойной кислоты и исследовании закономерностей их действия в присутствии ионов меди (II). В ходе исследования решались следующие задачи:

• Расщепление ДНК аренами в присутствии ионов Cu(II) и установление закономерностей этой реакции.

• Изучение свойств реакционноспособного производного олигонуклеотида на основе о-бромбензойной кислоты как реагента для сайт-направленного расщепления ДНК в двуспиральном и трехспиральном комплексе. Сравнительное исследование расщепления ДНК под действием этого производного олигонуклеотида и производных олигонуклеотидов, несущих в качестве реакционноспособных групп фталоцианин кобальта (II) и блеомицин А5.

• Возможность применения системы Си(Н)/о-бромбензойная кислота для определения положения нуклеосомного кора на ДНК в составе реконструированной нуклеосомы и исследование доступности ДНК в составе реконструированной нуклеосомной цепи для модификации производными олигонуклеотидов.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые проведено исследование Си(И)-зависимого расщепления ДНК аренами различной структуры. Исследованы закономерности протекания реакции расщепления ДНК в системе Cu(II)/o-бромбензойная кислота и показана возможность применения этой системы в качестве реагента для футпринтинга ДНК-белковых взаимодействий в составе реконструированного хроматина. Проведено сайт-направленное расщепление ДНК конъюгатом олигонуклеотида с 5-(4'-амино-пропил-сульфамоил)-2-бромбензойной кислотой в присутствии свободной о-бромбензойной кислоты в двуцепочечном и трехцепочечном комплексах. Впервые проведена сайт-направленная модификация двуцепочечной ДНК в составе реконструированной нуклеосомной цепи алкилирующим производным олигонуклеотида.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Результаты работы были представлены на 14-м международном совещании "Nucleosides, Nucleotides and Their Biological Applications" (Сан-Франциско, США, 2000), 2-й международной конференции "Bioinformatics of Genome Régulation and Structure" (Новосибирск, 2000), международной конференции "RNA as therapeutic and

genomics target" (Новосибирск, 2001), 15-м международном совещании "Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids" (Лёвен, Бельгия, 2002).

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 136 страницах, содержит 28 рисунков, 11 схем и 5 таблиц. Библиография включает 256 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Расщепление ДНК аренами различной структуры в присутствии ионов Cu(II)

Для исследования ДНК-расщепляющей активности были выбраны орто- и пара-

изомеры арилгалогенидов, несущие атом брома или хлора. В качестве модельной ДНК, была использована ДНК плазмиды pMDRCAT5, содержащая фрагмент промотора гена mdrl. В экспериментах было показано, что орто- (obb) и пара- изомеры бромбензойной кислоты (I и II, соответственно), орто- и пара- изомеры хлорбензойной кислоты (III и IV, соответственно), а также салициловая кислота (V) эффективно расщепляют ДНК плазмиды в присутствии ионов Cu(II). Степень расщепления ДНК за 5 ч при 37 °С составляет 100% для соединений I-IV и 85% для соединения V при концентрации реагентов 100 мкМ и концентрации ионов Си2+ - 100 мкМ. Сравнение расщепления ДНК в присутствии ионов Cu(II) другими ароматическими соединениями: фенолом, бромбензолом, бензойной кислотой, в которых отсутствовал один или несколько структурных элементов арилгалогенидов, показало, что только бензойная кислота расщепляет ДНК в условиях расщепления арилгалогенидами. Этот результат указывает на необходимость присутствия

ароматического кольца и карбоксильной группы в исследуемых соединениях для эффективного металл-зависимого расщепления ДНК.

Предположили, что

расщепление ДНК под действием системы Си(И)/арен является

батокупроин, 200 мкМ Щ—I EDTA, 2 мМ |-ч анаэробные условия азид натрия, ЮмМ этанол, 800 мМ каталаза, 1300 ед

J

контроль Щ

20 40 60 80 10 Степень расщепления, (%)

Рис. 1. Влияние ловушек кислородных радикалов и батокупроина на степень расщепления плазмидной ДНК в системе Си/арен.

процессом окислительной деструкции с участием активных форм кислорода, образующихся по механизму, аналогичному Фентоновской реакции. Поскольку в реакциях Фентоновского типа происходит изменение степени окисления металла переменной валентности, исследовали происходит ли изменение степени окисления ионов меди при расщеплении ДНК под действием оЬЬ. Для этого реакцию проводили в присутствии ЕОТА, хелатора двухвалентных ионов, и батокупроина - специфического хелатора Си(1). Было обнаружено, что как в присутствии батокупроина, так и в присутствии ЕОТА расщепления ДНК не наблюдается (Рис. 1), что указывает на прохождение реакции через переход состояний Сип/Си'.

В анаэробных условиях расщепления ДНК в системе Си(И)/оЬЪ не происходило, что свидетельствует в пользу окислительного механизма расщепления (Рис. 1). Для доказательства участия в расщеплении ДНК активных форм кислорода реакцию проводили в присутствии ловушек различных кислородных радикалов — этанола, азида натрия и каталазы. Было обнаружено, что азид натрия, являющийся ловушкой синглетного кислорода, и каталаза - ловушка перекисных радикалов, препятствуют расщеплению ДНК. Эти результаты позволяют предположить, что расщепление ДНК в системе Си(Н)/оЬЬ происходит под действием кислородных радикалов (наиболее вероятно перекисного происхождения) и сопровождается изменением степени окисления Сип/Си'. Поскольку соединения 1-У в присутствии катионов меди (II) 4

20 Гс

Рис. 2. Спектры ЭПР ФБН с активными интермедиатами радикалов. Образцы содержали 200 мМ ФБН, 1мМ Си50„, 1 мМ оЪЪ, 40 мкг ДНК плазмиды рМЭКСАТ5. 1 - спектр ловушки в нулевой момент времени; 2 - время инкубации 24 ч (спектр формы А); 3 - время инкубации 48 ч; 4 - спектр формы Б, полученный вычитанием спектров 2 и 3.

расщепляли ДНК с эффективностью, близкой по значению, целесообразным представлялось сосредоточить внимание при выявлении кислородного радикала (или радикалов), образующихся в системе Си(Н)/арен и вызывающих разрывы в ДНК лишь на одном из них - о-бромбензойной кислоте (оЪЬ), подразумевая единообразный механизм действия и для соединений Н-У. Детекцию кислородных радикалов, участвующих в реакции, проводили с помощью спектроскопии ЭПР с применением спиновой ловушки. В качестве ловушки использовали а-фенил-Ы-гретбутилнитрон (ФБН), который реагирует с короткоживущими радикалами, образуя долгоживущие нитроксильные радикалы, по параметрам спектра ЭПР которых можно судить о радикале-предшественнике. Характерные спектры спиновой ловушки, присоединившей радикал, приведены на Рис. 2. Кинетические кривые накопления радикалов получали, выдерживая образцы при температуре 37 °С в течение 120 ч, периодически регистрируя спектры ЭПР. Экспериментальные данные показали, что в процессе реакции регистрируется накопление нитроксильных радикалов двух типов (Рис. 2, спектры 2 и 4), причём форма Б образуется значительно позже формы А. Спектр радикала типа А (Рис. 2, кривая 2) характеризуется константами сверхтонкого расщепления СТС ак = 16.0 Гс и ан = 3.4 Гс, спектр радикала второго типа Б (Рис. 2, спектр 4) состоит только из триплета линий ам = 17.5 Гс. Ширина линии в спектрах обеих форм одинакова, и составляет 1.7 Гс. Полученные параметры спектров ак и ан для радикала А более всего соответствуют параметрам спектров ЭПР для ловушек типа ФБН, когда радикалом-предшественником

время, ч

время, ч

Рис. 3. Кинетика накопления нитроксильных радикалов А и Б в системе Cu(II)/ obb. На рисунке представлены кривые накопления радикалов в реакционной смеси, содержащей: 1 - 40 мкг ДНК, 1 мМ CuS04 и 1 мМ obb; 2 -1 мМ obb и 1 мМ CuS04; 3- 40 мкг ДНК и 1 мМ CuS04; 4- 40 мкг ДНК, 1 мМ obb: 5 - 1 мМ obb, 1 мМ CuS04 и 2 мМ EDTA.

является короткоживущий алкоксильный радикал. Образование радикала типа Б, наиболее вероятно, происходит в результате внутримолекулярного окисления ловушки, присоединившей радикал А.

На Рис. 3 представлены кинетические кривые накопления нитроксильных радикалов типа А и типа Б. Видно, что в отсутствие в реакционной смеси ДНК происходит накопление радикалов А и Б, в то время как в отсутствие либо меди, либо о-бромбензойной кислоты не удалось зафиксировать появления указанных радикалов. Полученные данные позволяют предположить, что для процесса образования радикалов как типа А, так и Б, необходимым и достаточным условием является присутствие в реакционной смеси ионов меди и молекул о-бромбензойной кислоты, которые, по-видимому, формируют специфический комплекс, катализирующий неполное восстановление кислорода раствора с образованием радикалов. Поскольку образование радикалов типа Б удаётся зарегистрировать (в отличие от радикала типа А) только при длительной инкубации - дольше 24 ч, то в соответствии с данными по расщеплению ДНК, где расщепление наблюдается уже при инкубации в течение 1 ч, можно с уверенностью утверждать, что в расщеплении ДНК участвуют радикалы типа А.

Для выяснения состава реакционноспособных комплексов исследовали влияние порядка добавления компонентов смеси на эффективность реакции расщепления. Оказалось, что в случае предынкубации (20 мин) меди с оЬЬ степень расщепления ДНК значительно ниже, чем в случае, когда происходила предыкубация меди с ДНК или оЬЬ с ДНК. Возможно, в процессе инкубации меди с оЬЬ образуется о-бромбензоат меди,

препятствующий связыванию ионов меди с ДНК, и генерация реакционноспособных частиц в таком комплексе происходит в растворе, а не непосредственно

A+G Î

jgnm ЩШ

Рис 4. Анализ продуктов расщепления ОН Y-box под действием системы Cu(II)/obb в 20 % ПААГ. Реакцию проводили при концентрации ОН Y-box 100 нМ, 100 мкМ CuS04 в течение 24 ч при 37 °С. 1 -Y-box; 2 - Y-box + 100 мкМ CuS04; 3 - Y-box + ЮмкМ CuS04 + 50мкМ obb; 4 - Y-box + 100 мкМ CuS04 + 500M obb; 5 - Y-box + 500 мкМ obb; A+G -Y-box, расщепленный по методу Максама-Гилберта

вблизи ДНК. Таким образом, не смотря на то, что для генерации радикалов обоих типов важно лишь образование комплекса Cu(II)-obb, для эффективного расщепления ДНК необходимо образование комплексов ДНК-Си(Н), и, затем - ДНК'Си(Н)-оЬЬ.

Исследование специфичности расщепления ДНК в системе Си(Н)/о-бромбензойная кислота проводили используя [32Р]-меченный по 5'-концу олигонуклеотид Y-box последовательности dGGCTGATTGGCTGGGCAGGA и его комплементарный дуплекс Y-box°. Было обнаружено, что прямое расщепление происходило с одинаковой эффективностью по всем нуклеотидам и носило статистический характер (Рис. 4). Проведение реакции расщепления ДНК при концентрации obb 500 мкМ и 100 мкМ C11SO4 в течение 24 ч при 37 °С показало, что суммарная степень расщепления по всем нуклеотидам составляла 21 %. Сравнение эффективности прямого расщепления олигонуклеотида Y-box и ДНК-дуплекса Y-boxD показало, что он расщепляется эффективнее ДНК-дуплекса. Для выявления «скрытой модификации» по окончании реакции расщепления проводили обработку образцов пиперидином, в результате чего общий выход реакции расщепления составлял около 30 % для Y-box и 16 % для Y-box° (Рис. 5).

На Рис. 6 представлены кривые зависимости степени расщепления Y-box и Y-boxD от концентрации о-бромбензойной кислоты. Максимальная степень расщепления наблюдалась при концентрациях obb > 200 мкМ как для Y-box, так и для Y-boxD, и составляла 25 % и 17 %, соответственно.

Концентрация о<5ромбенэойной кислоты, мкМ

Рис. 5. Зависимость степени расщепления дуплекса Y-boxD (1, 2) и олигонуклеотида Y-Ьох (3, 4) от времени. Кривые 1,3- прямое расщепление ДНК, кривые 2, 4 - пиперидин-индуцированное расщепление ДНК. Реакцию проводили при 37 °С и концентрации ДНК 100 нМ, 500 мкМ CuS04, 100 мкМ obb в течение 0.5 - 74 ч.

Рис. 6. Зависимость степени расщепления олигонуклеотида Y-box и дуплекса Y-Ybox" (2) от концентрации obb. Реакцию проводили при 37 СС и концентрации ДНК 100 нМ, 500 мкМ CuS04 в течение 24 ч.

Поскольку расщепление олигонуклеотида системой Си(И)/оЬЬ происходит с несколько большей эффективностью, чем расщепление ДНК-дуплекса, и при этом образуются как разрывы цепи ДНК, так и модифицированные основания, представлялось интересным рассмотреть взаимосвязь между местами связывания ионов меди с ДНК и наблюдаемым типом расщепления. Доступными местами связывания ионов меди (II) в нуклеотидах являются атомы кислорода фосфатных групп и эндоциклические атомы азота гетероциклов. Изучение специфических комплексов меди с ДНК, образующихся в процессе реакции, проводили с помощью метода ЭПР. Были записаны спектры ЭПР серии растворов гуанина (виа), дезоксигуанозина (<Ю), гуанозин-5'-монофосфата (сЮМР) в присутствии СиБОд с мольным отношением Си(П)/гетероциклическое основание от 0,5 до 10. Добавление азотистого основания приводило к появлению в спектрах ЭПР новых линий, отсутствовавших в спектре СиБО^ Интенсивность линий исходной формы Си(И) уменьшалась и совершенно исчезала при повышении концентрации <Ю или <ЮМР, что соответствует появлению в смеси новой формы меди. Согласно параметрам спектров ЭПР для растворов с виа (Табл. 1), регистрируемые новые формы меди близки по параметрам спектров ЭПР к известному тетрапиридинатному комплексу, выявляемому при большом избытке пиридина в растворе. Можно предположить, что, как и в случае с тетрапиридинатом меди, в зарегистрированной форме атом меди окружен четырьмя атомами азота остатков гуанинов. В случае взаимодействия аквакомплекса меди с азотистым основанием в составе сЮ и (ЮМР параметры спектров ЭПР полученного продукта имеют промежуточные значения, что соответствует образованию промежуточного комплекса меди с замещением только двух атомов кислорода на атомы азота (Табл. 1). Согласно литературным данным, при наблюдаемом уровне замещенных азотсодержащих форм наиболее вероятным типом комплекса является хелат, включающий N(7) атом гуанина и кислород фосфатной группы.

Таблица 1. Параметры спектров ЭПР продуктов взаимодействия сульфата меди с

Образцы & gy ё* Аг АУ Ах

Си804 2.406 2.078 2.075 125

Си804 + виа 2.276 2.045 2.045 185 36 30

Си804 + сЮ 2,335 2,070 2,060 150

Си804 + сЮМР 2.332 2.083 2.080 155

На следующем этапе работы исследовали связывание ионов меди с ДНК в условиях, приближенных к условиям реакции расщепления ДНК в системе Си2+/оЬЬ. При титровании растворов сульфата меди в присутствии оЬЬ олигонуклеотидом 14-^ состава СТТССССССССТТСр наблюдаемые спектры ЭПР указывали на одновременное образование нескольких форм комплексов меди с разной степенью замещения атомов кислорода на атомы азота ДНК, и несколько различающимися параметрами. Следует отметить, что при соотношении Си2+/14-Лк равном 1/5 практически не наблюдается исходного комплекса меди.

В экспериментах с комплементарным олигонуклеотидным дуплексом замещение молекул воды в координационной сфере ионов меди на атомы азота происходило в гораздо меньшей степени, и его полного подавления не удалось добиться даже при соотношении Си2/14-^5° равном 1/100. Такое различие в комплексообразовании одноцепочечного олигонуклеотида и дуплекса можно объяснить тем, что в случае ДНК-дуплекса атом азота N(3) цитозина полностью недоступен для связывания с ионами меди. Поскольку атомы кислорода диамагнитны, замещение атомов кислорода молекулы воды на атомы кислорода других групп молекулы ДНК не может быть определено методом ЭПР, и данные о координации ионов меди эндоциклическими атомами азота оснований ДНК не противоречат возможности координации ионов меди атомами кислорода фосфатов. Исходя из экспериментальных значений, число сайтов связывания ионов меди с эндоциклическими атомами азота ДНК-дуплекса уменьшается по сравнению с олигонуклеотидом, и это должно вести к снижению эффективности расщепления ДНК-дуплекса в случае участия в генерации радикалов ионов Си(П), координированных только атомами азота ДНК. Такое предположение согласуется с данными по расщеплению олигонуклеотида и ДНК-дуплекса в системе Си(П)'0 бромбензойная кислота (Рис. 5).

Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что для генерации кислородных радикалов необходимо образование комплекса Си(П)-о бромбензойная кислота, тогда как для эффективного расщепления ДНК важно образование комплекса ДНК-Си(Н)-оЬЬ, где ионы меди координируются эндоциклическими атомами азота и, в меньшей степени, атомами кислорода фосфатных групп.

2. Сайт-направленное расщепление ДНК конъюгатами олигонуклеотидов с производными о-бромбензойной кислоты

Синтез производных олигонуклеотидов, содержащих арилгалогениды, ранее не был описан в литературе, но в настоящее время хорошо разработаны методы синтеза производных олигонуклеотидов путем активации 3'- или 5'- концевого фосфата олигонуклеотида и присоединения реагента, содержащего алифатическую аминогруппу. При синтезе олигонуклеотидного конъюгата на основе о-бромбензойной кислоты использована аналогичная методика. Было обнаружено, что соединение VI, представляющее собой о-бромбензойную кислоту с линкером и аминогруппой, расщепляет ДНК в присутствии ионов Си(И) с эффективностью, сравнимой с эффективностью оЬЬ (Рис. 7). Соединение VI, было ковалентно присоединено к 5'-концу олигонуклеотида 14-108 (конъюгат ОВВ).

юо

* «о -

О 1 60 -нЬ—

Б-N11— (СН2)У1ЧН3+СГ 5 40 ' ___

[

! У!

Рис. 7. Анализ эффективности расщепления ДНК плазмиды рМОШСАТ5 соединениями I и VI. Плазмидную ДНК (15 нМ) инкубировали в 50 мМ имидазольном буфере, содержащем 5 % ЭМБ в течение 2 ч при 37 "С с 10 мкМ соединения I или VI в присутствии 100 мкМ Си504.

Исследование специфичности и эффективности расщепления нуклеиновых кислот конъюгатом ОВВ в присутствии ионов меди проводили в дуплексе:

8 10 14 1618 20 М1 5' [32Р|-(дАА(5(ЗС10К5(3(-г(5АА(дС6С6СС 3' 14-Л« 3' СТТССССССССТТСр-И 5', где Я = ОВВ или Я= Пс

Оказалось, что расщепления ДНК-мишени под действием конъюгата ОВВ в присутствии ионов Си(П) не происходит даже при длительной инкубации. Известно, что ион меди способен координировать две молекулы оЬЬ. Возможно, именно образование подобных комплексов является необходимым для формирования каталитически активного комплекса меди, генерирующего кислородные радикалы. Предположили, что для протекания реакции расщепления ДНК под действием конъюгата ОВВ необходимо присутствие в составе расщепляющего комплекса еще одной молекулы оЬЬ. Было

0(14) ■• А(13) "» A(I2)

0(11) G(IO) - G(9)

• С(К)

• С(7)

• 0(6)

Рис. 8. Расщепление олигонуклеотида М1 конъюгатами Р(с и ОВВ. 1 - М1, контроль; 2, 3,4, 5, 6 - М1 + Р1с в концентрациях 200 мкМ, 100 мкМ, 50 мкМ, 500 мкМ и 0 мкМ в присутствии 2 мМ Н202 с последующей обработкой пиперидином; 7 - М1 + 200 мкМ Ис без добавления Н2О2; 8 - М1 + пиперидин; 9 - М1 + 100 мкМ о-бромбензойной кислоты; 10 - М 1 + 100 мкМ СиБ04; 11 - М1 + 10 мкМ о-бромбензойной кислоты и 10 мкМ Си504; 12, 13, 14 -М1 + ОВВ, 20 мкМ, 10 мкМ и 20 мкМ, соответственно + 10 мкМ о-бромбензойной кислоты, (12, 13) или 0 мкМ (14), соответственно. А-Кж -олигонеклеотид М1, расщепленный по методу Максама-Гилберта.

Рис. 9. Кинетика расщепления М1 под действием ОВВ по сайтам GiS (■) и G16 (•). MI инкубировали с конъюгатом ОВВ, 10 мкМ при 37 °С в присутствии 10 мкМ о-бромбензойной кислоты и 10 мкМ CuS04.

обнаружено, что в присутствии свободной о-бромбензойной кислоты и ионов меди, под действием конъюгата ОВВ происходит сайт-специфическое расщепление ДНК (Рис. 8, дорожки 12, 13 и 14) преимущественно по 0)6 и Кинетическая кривая расщепления представлена на Рис. 9. Степень модификации олигонуклеотида М1 после 22 часов инкубации составляла 2,9 % и 2,6 % по нуклеотидам 018 и 0|(„ соответственно. Дальнейшая инкубация не вела к увеличению степени расщепления по этим сайтам, а происходило только накопление продуктов неспецифической деградации ДНК.

В процессе работы представлялось важным сравнить эффективность действия аренового производного олигонуклеотида с описанным в литературе конъюгатом, несущим остаток аналога порфирина - тетракарбоксифталоцианин кобальта (II) (Пс).

Время, ч

На Рис. 10 представлены данные по расщеплению М1 производными олигонуклеотида 14-Гоэ: ОВВ и Пс. Расщепление конъюгатом Р1с происходит только в присутствии экзогенного окислителя - перекиси водорода. Основными сайтами расщепления М1 конъюгатом ОВВ являются и хотя некоторое расщепление наблюдалось и по другим сайтам (Рис. 8, 10). Степень специфического расщепления

мишени М1 конъюгатом ОВВ была ниже, чем степень расщепления фталоцианиновым производным: по составляла 2.9% и 15.7%, соответственно (Рис. 10). Следует отметить, что при воздействии конъюгата Р1с на ДНК происходит окисление гетероциклов, выявляемое лишь дополнительной обработкой пиперидином, в то время как реакция с конъюгатом на основе о-бромбензойной кислоты приводит к прямому расщеплению ДНК, а также не требует экзогенного окислителя. Кроме того, в используемых условиях, при применении аренового производного наблюдается меньшая неселективная деградация ДНК по сравнению с фталоцианиновым производным (Рис. 8).

Одним из путей направленного воздействия на ДНК олигонуклеотидными производными является формирование олигонуклеотидом трехтяжевых комплексов с гомопиримидин-гомопуриновыми последовательностями ДНК-мишени. Модификацию двуцепочечного 152 п.о. фрагмента ДНК (М2) гена с-/ох соответствующего району от -148 до +3 производным ОВВ проводили в комплексе следующей структуры:

М2:

5'-СвСССССТТССССССССТТССАСТТССССССАСТСАСвТАССААБТССАТССАТТСА- 3' 3' -ССССбСеААСССбССвСААСвТСААССССССТСАСТбСАТССТТСАббТАССТААСТ' -|32Р] -100 -90 -80 -70 -60

3'-СТТССССССССТТСр-К 14-£оэ 5' -<ЗАА«ЗС«3<ЗСаАА6р-В1т ов

08 № л Д|

А13 014 си ^

Сайты модификации

¡□ОВВ ИР^Со)!

Рис. 10. Расщепление М1 конъюгатами Р1с и ОВВ. М1 инкубировали с конъюгатами: 200 мкМ Р1с в присутствии 2 мМ Н2Ог при 24 °С в течении 24 ч; 10 мкМ ОВВ в присутствии 10 мкМ о-бромбензойной кислоты и 10 мкМ Си804, при 37 °С в течениие 24 ч

Эффективность расщепления М2 производным ОВВ сравнивали с эффективностью расщепления производными Ptc и Bim (конъюгатом олигонуклеотида G-fos с природным антибиотиком блеомицином А5), осуществляющими окислительную деструкцию ДНК в присутствии внешних восстановителей. На Рис. 11 представлен радиоавтограф разделения продуктов расщепления М2 конъюгатами ОВВ, Ptc, Bim. Реакцию М2 с конъюгатами ОВВ и Ptc проводили в буфере с pH 5.3, поскольку образование тройного комплекса пиримидинового олигонуклеотида с двуцепочечной ДНК возможно лишь в том случае, если остатки цитозина протонированы. При реакции с конъюгатом ОВВ (Рис. 11, дорожки 13-15) модификации подвергаются преимущественно нуклеотиды пуриновой цепи G.109, G.№3 и G.83, а в случае использования конъюгата Ptc - G.109, G.97, C.8t, G.75, T.72 (Рис. 11, дорожки 3, 5). Сравнительные диаграммы эффективности расщепления ДНК М2 конъюгатами ОВВ и Ptc представлены на Рис. 12. Наличие относительно удаленных сайтов расщепления от места расположения реакционноспособной группы конъюгатов, очевидно, объясняется

Рис. П. Расщепление М2 конъюгатами Ptc, Bim, ОВВ. 1 - М2, контроль; 2, 3, 4,

5 - М2+ Ptc в концентрациях 500 мкМ, 200 мкМ, 100 мкМ, и 0 мкМ в присутствии 2 мМ Н2О2 (3, 5 ,6) с последующей обработкой пиперидином;

6 - матрица М2, обработанная пиперидином; 7-10 - М2 + Bim в концентрациях 5 мкМ, 10 мкМ, 20 мкМ, 0 мкМ, соответственно в присутствии 10 мкМ Fe и 5 мМ 2-меркаптоэтанола; 11 -М2 + 1 мкМ свободного блеомицина; 12 - М2 + 10 мкМ о-бромбензойной кислоты и 10 мкМ CuS04; 13, 15 -М2 + ОВВ в концентрациях 10 мкМ и 20 мкМ, соответственно, + 10 мкМ о-бромбензойной кислоты + 10 мкМ CuSO„; 14 - М2 + 10 мкМ ОВВ + 10 мкМ CuS04; 16 - М2 + 100 мкМ о-бромбензойной кислоты; 17 - М2 + 100 мкМ C11SO4; A+G - матрица М2, расщеплённая по методу Максама-Гилберта.

диффузией части радикалов вдоль цепи ДНК. Как в случае конъюгата ОВВ, так и в случае конъюгата Р1с,

преимущественной модификации подвергаются сайты,

расположенные на расстоянии не более 20 нуклеотидов от реакционноспособной группировки что наблюдается в реакциях с группами, генерирующими диффузные кислородные радикалы.

Поскольку из литературных данных известно, что блеомицин расщепляет ДНК при значениях рН от 7 до 9, для модификации М2 был использован конъюгат олигонуклеотида С-Гоя, несущий остаток блеомицина на 3'-конце, способный образовывать триплекс пуринового типа при нейтральных значениях рН с той же 14-звенной последовательностью М2. Реакцию ДНК с производным В1ш проводили при концентрации реагента от 1 мкМ до 5 мкМ и концентрации ДНК 20 нМ. Показано, что в таких условиях (100-кратный избыток реагента по отношению к мишени) наряду с сайт-специфическим расщеплением в районе расположения блеомициновой группы наблюдается также и неспецифическое расщепление по последовательностям ОС и ОТ, которые являются предпочтительными для связывания и расщепления свободным блеомицином (Рис. 11, дорожки 7-9 и 11). Характер расщепления позволяет предположить, что в условиях избытка конъюгата В1ш по отношению к мишени, происходит связывание остатка блеомицина с двуцепочечной ДНК без формирования триплекса олигонуклеотидной частью реагента. Однако, в условиях данного эксперимента, снижение концентрации реагента ведёт к резкому снижению эффективности триплексообразования: наличие триплекса фиксировали методом задержки в геле и методом ОЕРС-футпринтинга при 100-кратном избытке олигонуклеотида (х-Сов по отношению к мишени М2.

Результаты, изложенные в этой главе, показывают, что конъюгат ОВВ может направленно расщеплять и одноцепочечную и двуцепочечную ДНК в присутствии 14

¡□РК(Со) иовв |

Рис. 12. Расщепление М2 конъюгатами олигонуклеотидов Пс и ОВВ. М2 инкубировали с конъюгатами: 10 мкМ ОВВ в присутствии 10 мкМ о-бромбензойной кислотоы и 10 мкМ СиБО^ при 37 °С; 100 мкМ Р1с в присутствии 2 мМ Н202 при 24 °С в течение 24 ч.

свободной о-бромбензойной кислоты и ионов меди. Необходимость образования активного комплекса арен*Си(П)*арен, в котором ион меди координирует две молекулы obb, позволяет надеяться на возможность конструирования в будущем бинарных реагентов на основе аренов, в которых обе ареновые молекулы будут присоединены к олигонуклеотидам.

3. Сайт-направленная модификация ДНК в составе реконструированной

нуклеосомной цепи

Основной структурной единицей хроматина является нуклеосома, состоящая из двух доменов: нуклеосомного кора - ДНК, накрученной на гистоновый октамер и линкерной ДНК. Возможность образования тройного комплекса олигонуклеотидом с линкерной областью нуклеосомы, не имеющей контактов с гистоновым октамером, была показана ранее, тогда как образование тройного комплекса в области нуклеосомного кора представляется более сложной задачей. Детекция попадания последовательности-мишени в коровую или линкерную область нуклеосомы может осуществляться с помощью методов футпринтинга, позволяющих определять зоны контактов ДНК с гистоновым октамером. В этой части работы в качестве объекта исследования была выбрана реконструированная нуклеосомная цепь на фрагменте промотора гена c-fos - fos 352, длиной 352 п.о. (район с -348 по +3), содержащая гомопуриновую последовательность Л/2, описанную выше. Поскольку расщепление ДНК о-бромбензойной кислотой в присутствии ионов Cu(II) происходит сиквенс-независимым образом было решено применить этот реагент для выявления местоположения гистоновых октамеров на ДНК. Для реконструирукции хроматина на фрагменте fos 352 использовали метод солевого обмена, в котором источником гистоновых октамеров служат мононуклеосомы. Мононуклеосомы выделяли из плаценты человека и охарактеризовывали по содержанию гистоновых белков SDS-электрофорезом в 16 % ПААГ и по содержанию ДНК нуклеосомной длины электрофорезом в 1.5 % агарозном геле. Реконструкцию нуклеосом на фрагменте проводили в 0.7 М NaCl. В этих условиях гистоновый октамер диссоциирует и перераспределяется между собственной ДНК и ДНК-фрагментом. Для достижения высокой эффективности реконструкции использовали пятидесятикратный по весу избыток нуклеосом (гистоновых октамеров) по отношению к ДНК-фрагменту. Эффективность реконструкции анализировали

электрофорезом в 0.7 % агарозном геле по изменению электрофоретической подвижности ДНК-белкового комплекса.

Для получения информации о местоположении гистонового октамера на реконструированном фрагменте ДНК свободный фрагмент fos 352 и реконструированный фрагмент fos 352 инкубировали в течение 24 ч при 37 "С с 100 мкМ о-бромбензойной кислоты в присутствии 100 мкМ ионов Cu(II), продукты расщепления анализировали в 5 % денатурирующем ПААГ (Рис. 13). Можно видеть, что в случае свободного фрагмента сайты расщепления наблюдаются на протяжении всего фрагмента. В случае реконструированного фрагмента появляется область ДНК, не подверженная расщеплению - область нуклеосомного кора, а расщепление происходит лишь в области линкерной ДНК (Рис. 13). При футпринтинг-анализе с помощью микрококковой эндонуклеазы была выявлена аналогичная область ДНК, не подверженная гидролизу. Показано, что система Cu(II)/obb может быть использована для футпринтинга ДНК-белковых комплексов. Сопоставление результатов футпринтинга с расщеплением фрагмента ДНК fos 352 по методу Максама-Гилберта позволяет утверждать, что гомопуриновая последовательность-мишень расположена в области нуклеосомного кора.

После того, как было показано, что наличие гистонового октамера не мешает образованию триплекса в коровой области нуклеосомы, синтезировали

алкилирующее производное

олигонуклеотида 14-fos 4-[N-Meran-N-(2-хлорэтил)амино]бензиламид (RC1) для модификации реконструированной на фрагменте 352 fos нуклеосомной цепи в специфическом тройном комплексе. Использование алкилирующего

производного было обусловлено его высокой эффективности модификации 16

; Л

üuft" '"Я ж

Jfc

Рис. 13. Результат футпринтинга свободного (0 и реконструированного (п) 352 п.о. фрагмента ДНК. Образцы инкубировали в присутствии 100 мкМ Си504 и 100 мкМ оЬЬ, как указано на рисунке в течение 24 ч при 37 °С. МИазс - гидролиз образцов с помощью ■ 0.02 ед микрококковой эндонуклеазы в течение 5 мин при 37 °С. А-КЗ - ДНК, расщепленная по методу Максама-Гилберта.

ДНК (по сравнению с ареновым производным). Алкилирование ДНК в составе тройного комплекса происходит преимущественно по N-7 положению гуанозина. Последующая пиперидиновая обработка приводит к расщеплению ДНК по модифицированному основанию. Для формирования тройного комплекса свободный фрагмент и фрагмент в составе реконструированной нуклеосомной цепи переводили диализом в буфер с рН 5.3, и такие условия не приводили к диссоциации нуклеосомной цепи. Реакцию модификации проводили 18 часов при комнатной температуре с концентрацией реагента в реакционной смеси 2 мкМ. Для контроля свободные фрагменты и фрагменты в составе реконструированной нуклеосомной цепи инкубировали в идентичных условиях, но без добавления реагента. По окончании модификации и расщепления пиперидином по участкам алкилирования ДНК анализировали электрофорезом в 4 % денатурирующем ПААГ (Рис. 14). Видно, что как свободный фрагмент, так и фрагмент в составе реконструированной нуклеосомной цепи подвергаются специфической модификации преимущественно по одному основанию. Расщепление фрагмента по А + О позволяет установить, что модифицируемое основание - С83, расположенное вблизи алкилирующей группы. Эффективность модификации свободного фрагмента достигала 52 %, а в составе реконструированной цепи - 48 %. Алкилирование ДНК-мишени по в"83 подтверждает протекание реакции модификации в тройном комплексе, поскольку в случае образования двойного комплекса, олигонуклеотидный конъюгат был бы расположен антипараллельно

пуриновой цепи и алкилирование С83

т +ЯС1

Г п п Г А+С

было бы невозможно.

Поскольку выбранная для образования тройного комплекса последовательность-мишень, при реконструкции попадает в область нуклеосомного кора, можно сделать вывод, что наличие гистонового октамера не препятствует образованию тройного комплекса и эффективной специфической

модификации ДНК в составе такого комплекса.

Рис. 14. Анализ в 4 % денатурирующем ПААГ продуктов модификации свободного (1) и в составе

реконструированной нуклеосомной цепи 83 (п) 352 п.о. фрагмента ДНК алкилирующим (КС1) производным олигонуклеотида 14-£га. К - контроль ДНК, Т - инкубация ДНК в буфере с рН 5.3.

Выводы

1. Исследовано Си(Н)-зависимое расщепление ДНК аренами различной структуры.

• показано, что арены, в структуре которых имеется бензольное кольцо с присоединённой к нему карбоксильной группой, статистически расщепляют ДНК в присутствии ионов Си(П) без добавления восстановителей или перекиси водорода за счёт присутствующего в растворе молекулярного кислорода, вызывая как прямые разрывы ДНК, так и образование пиперидин-лабильных модифицированных оснований.

• обнаружено, что арены вызывают окислительную деструкцию ДНК через Си(Н)/Си(1)-индуцированное образование кислородных радикалов, зарегистрированных методом ЭПР с использованием спиновых ловушек и ингибиторов кислородных радикалов.

• показано, что хотя для генерации короткоживущих кислородных радикалов достаточно образования комплекса Си(Н)*о-бромбензойная кислота в растворе, для эффективного расщепления ДНК необходимо образование комплекса ДНК-Си(П) о-бромбснзойная кислота.

• показана возможность применения системы Си(П)-о-бромбензойная кислота в качестве реагента для футпринтинга ДНК-белковых контактов в составе реконструированного хроматина для определения местоположения последовательности-мишени на нуклеосоме.

2. Изучено расщепление одноцепочечной и двуцепочечной ДНК конъюгатом

олигонуклеотида с 5-(4'-амино-пропил-сульфамоил)-2-бромбензойной кислотой.

• показано, что в присутствии свободной о-бромбензойной кислоты этот конъюгат способен вызывать сайт-направленное расщепление ДНК при образовании комплементарных комплексов с одноцепочечной и двуцепочечной ДНК.

• сравнение расщепления ДНК в дуплексе и триплексе олигонуклеотидными конъюгатами, содержащими в качестве реакционноспособной группы о-бромбензойную кислоту, фталоцианин кобальта (II) и блеомицин А5, показало, что расщепление под действием конъюгата олигонуклеотида с 5-(4'-амино-пропил-сульфамоил)-2-бромбензойной кислотой происходит с меньшей эффективностью, однако более специфично; приводит к образованию прямых

разрывов и не требует присутствия в реакционной смеси восстановителя или перекиси водорода.

3. Исследована сайт-направленная модификация двуцепочечной ДНК в составе реконструированной нуклеосомы.

• футпринтинг ДНК с помощью системы Си(П)/о-бромбензойная кислота и микрококковой нуклеазы показывает, что при реконструкции нуклеосом на фрагменте промотора протоонкогена с-/оз длиной 352 п.о. (-348/+3) последовательность (-97Л84), выбранная для образования тройного комплекса с производным олигонуклеотида, расположена в области нуклеосомного кора.

• впервые проведена сайт-направленная модификация двуцепочечной ДНК в составе реконструированной нуклеосомной цепи алкилирующим производным гомопиримидинового олигонуклеотида. Показано, что наличие гистонового октамера не препятствует образованию триплекса олигонуклеотид-двуцепочечная ДНК и эффективному направленному алкилированию ДНК в составе такого комплекса (степень модификации до 48 %).

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Makel'skaya М. V., Koval О. A., Kobets N. D., Vlassov V. V. Formation of nucleosomes does not suppress interaction of DNA-fragment with alkylating derivative of pyrimidine oligonucleotide. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1999. V. 9. P. 533536.

2. Koval O. A., Oleinikova S. В., Chernolovskaya E. L., Litvak V. V., Vlassov V. V. Chemical cleavage of plasmid DNA by arenas in the presence of Cu(II) ions. Proceeding of the Second International Conference of Bioinformatics of Genome Regulation and Structure. Novosibirsk. Russia. 2000. V. 3. P. 46-48.

3. Koval O. A., Chernolovskaya E. L., Litvak V. V., Vlassov V. V. Cu2+-dependent DNA-cleaving activity of arenas. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 2001. V. 20. P. 851-854.

4. Коваль О. А., Богуславский E. Б., Олейникова С. Б., Черноловская Е. JL, Литвак В. В., Надолинный В. А., Власов В. В. Медькатализируемое расщепление ДНК аренами. Биоорган, химия. 2003. Т. 29. С. 637-644.

5. Koval О. A., Oleinikova S. В., Chernolovskaya Е. L., Litvak V. V., Vlassov V. V. New reagents for protein-DNA contacts footprinting. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 2003. V. 22. P. 1587-1589.

í I)

¡I

>

\

\

) /

l<

1

I

I

I

I

)

I /

I

'I

" I

«14180

(4 ("iо*

Список сокращений

Введение

1. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КОМПЛЕКСОВ МЕДИ С Ю

НУКЛЕИНОВЫМИ КИСЛОТАМИ (Обзор литературы)

1.1. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ИОНОВ МЕДИ С НУКЛЕИНОВЫМИ 11 КИСЛОТАМИ

1.1.1. Связывание ионов меди с нуклеиновыми кислотами

1.1.2. Механизм реакции Фентона

1.1.3. Взаимодействие активных форм кислорода с нуклеиновыми ^ кислотами

1.1.4. Реакция Фентона in vivo

1.1.4.1. Мутации в ДНК, возникающие под действием кислородных радикалов

1.1.4.2. Воспаление и окислительный стресс

1.2. РАСЩЕПЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ 26 КОМПЛЕКСАМИ МЕДИ И МЕДЬ-ЗАВИСИМЫМИ СИСТЕМАМИ

1.2.1. Комплексы меди, осуществляющие окислительную деструкцию нуклеиновых кислот

1.2.1.1. Комплексы меди и медь-зависимые системы. осуществляющиеокислительн уюдеструкцию нуклеиновых кислот в присутствии тиолов или Н2О2.

1.2.1.2 .Окислительная деструкция нуклеиновых кислот комплексами меди. действующими без активации экзогенными окислителями или восстановителями

1.2.2. Комплексы меди, осуществляющие гидролитическую деструкцию нуклеиновых кислот

1.3. САЙТ-НАПРАВЛЕННОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ 57 КИСЛОТ КОНЪЮГАТАМИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ С КОМПЛЕКСАМИ МЕДИ

1.3.1. Расщепление ДНК и РНК конъюгатами олигонуклеотидов с 58 комплексами меди в двуцепочечном комплексе

1.3.2. Расщепление ДНК и РНК конъюгатами олигонуклеотидов с 62 комплексами меди в триплексе

Создание химических соединений, способных расщеплять ДНК по определенным нуклеотидным последовательностям, необходимо для развития ряда областей молекулярной биологии и для разработки терапевтических препаратов регулирующих экспрессию генов [1, 2]. Такие соединения могут быть получены путем присоединения реакционноспособных групп к олигонуклеотидам, взаимодействующим с определенными нуклеотидными последовательностям ДНК [3, 4]. Важным, не решенным вопросом конструирования таких соединений, является разработка реакционноспособных групп, которые могли бы высокоэффективно расщеплять или химически модифицировать ДНК в физиологических условиях. На сегодняшний день создан широкий спектр производных олигонуклеотидов, несущих алкилирующие, фотоактивируемые группы, комплексы переходных металлов, катализирующие окислительную деструкцию нуклеиновых кислот (EDTA-железо, порфирин-железо, 1,10-фенантролин-медь блеомицин-железо) [5-12]. Реагенты последнего типа способны расщеплять или модифицировать ДНК и РНК в аэробных условиях в присутствии восстановителей или доноров активного кислорода. Однако направленная модификация ДНК ни одним из описанных реагентов не достигает в физиологических условиях биологически значимых уровней.

В настоящее время не вполне выясненным является вопрос о формировании комплексов олигонуклеотидов с клеточной ДНК. ДНК клетки упакована в регулярно повторяющиеся нуклеопротеиновые структуры - нуклеосомы, и расплетение её цепей является редким событием [13,14]. Уотсон-Криковское связывание олигонуклеотидов может происходить только по расплетенным одноцепочечным участкам ДНК, появляющимся в составе активного хроматина [15]. С нерасплетенной двуцепочечной ДНК олигонуклеотиды могут образовывать комплексы путем формирования трехтяжевых структур, в районах с гомопуриновыми-гомопиримидиновыми последовательностями. Большая бороздка ДНК, упакованной в нуклеосому, периодически обращена к поверхности гистонового октамера [16], и в этом случае экранирована коровыми пистонами, что должно препятствовать образованию комплекса с олигонуклеотидом. Поэтому, исследование влияния упаковки ДНК в нуклеосому на ззаимодействие с олигонуклеотидами является актуальной задачей. Локализация гистоновых октамеров на ДНК и экранированность белками последовательностей-мишеней ДНК могут быть определены методами футпринтинга: с помощью ферментов, ДНКазы I, микрококковой нуклеазы и химических реагентов [17, 18] В качестве реагентов для такого футпринтинга могут быть использованы и металлокомплексы [19,20].

В настоящей работе исследовали возможность создания на основе галоген-замещенных производных бензойной кислоты реакционноспособных производных олигонуклеотидов как для направленного расщепления ДНК так и для изучения структуры ДНК-белковых комплексов. В отличие от органических растворителей, в водных растворах медные комплексы бензойных кислот обладают пониженной стабильностью, что позволит добиться снижения степени неселективной деградации ДНК [21,22].

Цель и задачи исследования

Целью работы являлось создание новых реагентов для расщепления ДНК на основе замещенных производных бензойной кислоты и исследование закономерностей их действия в присутствии ионов меди (II). В ходе исследования решались следующие задачи:

1. Расщепление ДНК аренами в присутствии ионов Cu(II) и установление закономерностей этой реакции.

2. Исследование свойств реакционноспособного производного олигонуклеотида на основе о-бромбензойной кислоты как реагента для сайт-направленного расщепления ДНК в двуспиральном и трехспиральном комплексе. Сравнительное исследование расщепления ДНК под действием этого производного олигонуклеотида и производных олигонуклеотидов, несущих в качестве реакционноспособных групп фталоцианин кобальта (II) и блеомицин А5.

Возможность применения системы Си(П)/о-бромбензойная кислота для определения положения нуклеосомного кора на ДНК в составе реконструированной нуклеосомы и исследование доступности ДНК в составе реконструированной нуклеосомной цепи для модификации производными олигонуклеотидов.

выводы

1. Исследовано Си(П)-зависимое расщепление ДНК аренами различной структуры.

• показано, что арены, в структуре которых имеется бензольное кольцо с присоединенной к нему карбоксильной группой, статистически расщепляют ДНК в присутствии ионов Си(П) без добавления восстановителей или перекиси водорода за счет присутствующего в растворе молекулярного кислорода, вызывая как прямые разрывы ДНК, так и образование пиперидин-лабильных модифицированных оснований.

• обнаружено, что арены вызывают окислительную деструкцию ДНК через Си(И)/Си(1)-индуцированное образование кислородных радикалов, зарегистрированных методом ЭПР с использованием спиновых ловушек и ингибиторов кислородных радикалов.

• показано, что хотя для генерации короткоживущих кислородных радикалов достаточно образования комплекса Си(П)*о-бромбензойная кислота в растворе, для эффективного расщепления ДНК необходимо образование комплекса ДНК-Си(И)-о-бромбензойная кислота.

• показана возможность применения системы Си(П)-обромбензойная кислота в качестве реагента для футпринтинга ДНК-белковых контактов в составе реконструированного хроматина для определения местоположения последовательности-мишени на нуклеосоме.

2. Изучено расщепление одноцепочечной и двуцепочечной ДНК конъюгатом олигонуклеотида с 5-(4/-амино-пропил-сульфамоил)-2-бромбензойной кислотой.

• показано, что в присутствии свободной о-бромбензойной кислоты этот конъюгат способен вызывать сайт-направленное расщепление ДНК при образовании комплементарных комплексов с одноцепочечной ДНК и двуцепочечной ДНК.

• сравнение расщепления ДНК в дуплексе и триплексе олигонуклеотидными конъюгатами, содержащими в качестве реакционноспособной группы о-бромбензойную кислоту, фталоцианин кобальта (П), и блеомицин А5 показало, что расщепление под действием конъюгата олигонуклеотида с 5-(4 -амино-пропилсульфамоил)-2-бромбензойной кислотой происходит с меньшей эффективностью, однако более специфично; приводит к образованию прямых разрывов и не требует присутствия в реакционной смеси восстановителя или перекиси водорода. 3. Исследована сайт-направленная модификация двуцепочечной ДНК в составе реконструированной нуклеосомы.

• футпринтинг ДНК с помощью системы Си(П)/о-бромбензойная кислота и микрококковой нуклеазы показывает, что при реконструкции нуклеосом на фрагменте промотора протоонкогена c-fos длиной 352 п.о. (-348/+3) последовательность (-97/-84), выбранная для образования трехцепочечного комплекса с производным олигонуклеотида, расположена в области нуклеосомного кора.

• впервые проведена сайт-направленная модификация двуцепочечной ДНК в составе реконструированной нуклеосомной цепи алкилирующим производным гомопиримидинового олигонуклеотида. Показано, что наличие гистонового октамера не препятствует образованию триплекса олигонуклеотид-двуцепочечная ДНК и эффективному направленному алкилированию ДНК в составе такого комплекса (степень модификации до 48%).

1. Helene С. The anti-gene strategy: control of gene expression by triplex-forming-oligonucleotides И Anticancer Drug Des. 1991. V. 6. P. 569-584.

2. Maher L.J III. DNA triple-helix formation: an approach to artificial gene repressors? II BioEssays. 1992. V.14. P. 807-815.

3. Knorre D.G., Vlassov V.V., Zarytova V.F., Lebedev A.V., Fedorova O.S. Design and targeted reactions of oligonucleotide derivatives // Boca Raton, FL: CRC Press. 1994.

4. Belikova A.M., Zarytova V.F., Grineva N.I. Synthesis of ribonucleosides and diribonucleoside phosphates containing 2-chloroethylamine and nitrogen mustard residues II Tetrahedron Lett. 1967. N. 37. P. 3557-3562.

5. Boutorin A.S., Vlassov V.V., Kazakov S.A., Kutiavin I.V., Podyminogin M.A. Complementary addressed reagents carrying EDTA-Fe(II) groups for directed cleavage of single-stranded nucleic acids IIFEBS Lett. 1984. V. 172. P. 43-46.

6. Dobrikov M.I., Gaidamakov S.A., Gainutdinov T.I., Koshkin A.A., Vlassov V.V. Sensitized photomodification of single-stranded DNA by a binary system of oligonucleotide conjugates // Antisense Res. Dev. 1997. V. 4. P. 309-317.

7. Zarytova V.F., Sergeyev D.S., Godovikova T.S. Synthesis of bleomycin A5 oligonucleotide derivatives and site-specific cleavage of the DNA target II Bioconjug. Chem. 1993. V. 3. P. 189-193.

8. Chen C.B., Milne L., Landgraf R., Perrin D.M., Sigman D.S. Artificial nucleases II Chembiochem. 2001. V. 2. P. 735-740.

9. Francois J.-C., Helene C. Recognition and cleavage of single-stranded DNA containing hairpin structures by oligonucleotides forming both Watson-Crick and Hoogsteen hydrogen bonds II Biochemistry. 1995. V. 34. P. 65-72.

10. Frolova E.I., Fedorova O.S., Knorre D.G. Kinetic study of the addressed modification by hemin derivatives of oligonucleotides II Biochimie. 1993. V. 75. P. 5-11.

11. Strobel S.A., Dervan P.B. Site-specific cleavage of a yeast chromosome by oligonucleotide-directed triple-helix formation II Science. 1990. V. 249. P. 73-75.

12. Bigey P., Pratviel G., Meunier B. Cleavage of double-stranded DNA by 'metalloporphyrin-linker-oligonucleotide' molecules: influence of the linker II Nuc leic Acids Res. 1995. V. 23. P. 3894-3900.

13. Kornberg R.D. Structure of chromatin II Annu. Rev. Biochem. 1977. V. 46. P. 931 -954.

14. Laskey R.A., Earnshaw W.C. Nucleosome assembly II Nature. 1980. V. 286. P. 763-767.

15. Drew H.R., Calladine C.R. Sequence-specific positioning of core histones on an 860 base-pair DNA. Experiment and theory. II J. Mol. Biol. 1986. V. 189. P. 179-188.

16. Zhang L., Gralla J.D. Micrococcal nuclease as a probe for bound and distorted DNA in lac transcription and repression complexes II Nucleic Acids Res. 1989. V. 17. P. 50175028.

17. Suzuki Т., Kuwahara J., Sugiura Y. Nucleotide sequence cleavage of guanine-modified DNA with alfatoxin Bl, dimethyl sulfate, and mitomycin С by bleomycin and deoxyribonuclease I //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1983. V. 117. P. 916-922.

18. Sigman D.S. Chemical nucleases II Biochemistry. 1990. V. 29. P. 9097-105.

19. Basak M., Nagaraja V. A versatile in vivo footprinting technique using 1,10-phenanthroline-copper complex to study important cellular processes II Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. 105-119.

20. Lindley J. Copper assisted nucleophilic substitution of aryl halogen II Tetrahedron. 1984. V. 40. P. 1433-1456.

21. Сергеев Д.С., Зарытова В.Ф. Взаимодействие блеомицина и его олигонуклеотидных производных с нуклеиновыми кислотами II Успехи химии. 1996. Т. 65. С. 377-401.

22. Cowan J.A. Metal activation of enzymes in nucleic acid biochemistry H Chem. Rev. 1998. V. 98. P. 1067-1088.

23. Trawick B.N., Osiek T.A., Bashkin J.K. Enhancing sequence-specific cleavage of RNA within a duplex region: incorporation of 1,3-propanediol linkers into oligonucleotide conjugates of serinol-terpyridine II Bioconjug. Chem. 2001. V. 12. P. 900-905.

24. Brigelius-Flohe R., Kelly F.J., Salonen J.T., Neuzil J., Zingg J.M., Azzi A. The European perspective on vitamin E: current knowledge and future research II Am. J. Clin. Nutr. 2002. V. 4. P. 703-711.

25. Bryan S.E., Vizard D.L., Beary D.A., LaBiche R.A., Hardy K.J. Partitioning of zinc and copper within subnuclear nucleoprotein particles II Nucleic Acids Res. 1981. V. 9. P. 5811-5823.