Окислительное расщепление нуклеиновых кислот конъюгатами блеомицина с олигонуклеотидами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

ВОРОБЬЕВ ПАВЕЛ ЕВГЕНЬЕВИЧ

ОКИСЛИТЕЛЬНОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ КОНЪЮГАТАМИ БЛЕОМИЦИНА СОЛИГОНУКЛЕОТИДАМИ

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

у'

Новосибирск, 2005 г.

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментатьной медицины СО РАН (бывший Новосибирский институт биоорганической химии СО РАИ)

Научный руководитель

дхн, профессор Зарыгова Валентина Филипповна

Официальные оппоненты

цхн Сильников Владимир Николаевич

кхн доцент Халимская Людмила Михайловна

Ведущая организация Институт цитологии и генетики СО РАН

Защита состоится Лб )) г в^ часов

на заседании диссертционного совета Д 003 045 01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу 630090 Новосибирск-90, пр Лаврентьева, 8

С диссертацией м ожно ознакомиться в бибтиотеке

Института химической био югии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан « >

2005 г

Ученый секретарь диссертационного совета

д х н

Федорова О.С

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Направленная модификация нуклеиновых кислот при помощи реак-ционноспосбных производных олигонуклеотидов (РПО) является одним из основных подходов к решению целого ряда задач современной физико-химической биологии В их числе - исследование нуклеиново-белковых взаимодействий, манипулирование генетическим материалом, регуляция экспрессии гена, генная конверсия В качестве реакционноспособных групп при создании РПО перспективно использовать соединения, способные к многократной реактивации и многократному взаимодействию с субстратом К числу таких группировок принадлежит остаток гликопептидного антибиотика блеомицина, обладающий рядом уникальных свойств Наиболее важными из них являются

♦ способность вызывать прямое (наблюдаемое без дополнительных обработок) расщепление ДНК и РНК,

♦ высокая селективность окисления дезоксирибозы и рибозы (гетероциклические основания практически не модифицируются),

♦ относительно низкая токсичность, позволяющая применять антибиотик как противоопухолевое средство в терапевтической практике

В ЛХНК НИБХ СО РАН впервые были созданы блеомициновые производные олигонуклеотидов Был разработан способ конъюгирования блеомицина А5 и олигонуклеотидов с сохранением способности олигонуклеотидов образовывать комплементарные комплексы, а остатка блеомицина -осуществлять селективное расщепление ДНК Первые исследования показали, что конъюгаты блео-мицина с олигонуклеотидами обладают рядом уникальных свойств Они могут эффективно расщеплять одноцепочечные ДНК в составе комплементарных дуплексов В зависимости от условий одна молекула конъюгата может повреждать до трех молекул ДНК или наносить несколько повреждений одной молекуле мишени Кроме того, было выявлено, что остаток блеомицина в составе олиготими-дилата способен осуществлять прямые разрывы двуцепочечных ДНК в триплексах До сих пор неизвестны другие конъюгаты олигонуклеотидов, обладающие столь уникальными свойствами Полученные результаты безусловно свидетельствовали о том, что конъюгаты блеомицина с олигонуклео-тидами являются одними из наиболее перспективных реакционноспособных производных олигонук-леотидов

Целью данной работы являлось исследование расщепления одноцепочечных ДНК конъюгата-ми блеомицина с олигонуклеотидами в составе тандемных комплексов с эффекторами, исследование возможности повышения эффективности расщепления двуцепочечных ДНК конъюгатами блеоми-цина с триплекс-формирующими олигонуклеотидами в составе триплексов, исследование взаимодействия блеомицин-олигонуклеотидных конъюгатов с РНК, а также исследование влияния остатка блеомицина в составе олигодезоксирибонуклеотидов на способность РНКазы Н Е COU расщеплять РНК в составе гибридных дуплексов, образованных с их участием

Научная новизна и практическая ценность. В настоящей работе впервые исследовано расщепление фрагментов ДНК конъюгатами блеомицина с олигонуклеотидами в тандемных комплексах с олигонуклеотидными эффекторами Показано, что в тандемных комплексах одна молекула конъю-гата блеомицина с тетрануклеотидом может расщепить свыше 6 молекул ДНК-мишени Обнаружено,

что максимальную эффективность проявляют конъюгаты с коротким олигонуклеотидным адресом (4-5 нуклеотидов), повреждающие мишень в сайте связывания конъюгата

Впервые показана возможность расщепления РНК (30-звенного фрагмента) конъюгатами блео-мицина с олигодезоксирибонуклеотидами

Разработан метод синтеза новых конъюгатов блеомицина с олигонуклеотидами, содержащих линкеры на основе гексаэтиленгликольфосфата Показано, что такие конъюгаты более эффективно расщепляют двуцепочечные ДНК в составе триплексов Также показано, что использование линкер-содержащих конъюгатов позволяет существенно повысить эффективность направленного расщепления РНК за счет формирования в цепи РНК однонуклеотидных петель, являющихся сайтами предпочтительного связывания остатка блеомицина, и его доставки к таким сайтам при помощи линкера оптимальной длины

Выявлено, что субстратные свойства блеомициновых производных коротких олигонуклеотидов в составе тандемных гибридных дуплексов по отношению к рибонуклеазе Н Е coh близки к таковым для протяженных олигонуклеотидов

Конъюгаты блеомицина с олигонуклеотидами могут найти применение в антисенс- и антигенном подходах к регуляции экспрессии гена, для генной конверсии, а также могут быть использованы в молекулярно-биологических исследованиях в качестве эффективных искусственных нуклеаз с уникальной специфичностью Низкая токсичность блеомицина позволяет также надеяться на возможность использования его конъюгатов с олигонуклеотидами в качестве терапевтических средств

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ Результаты работы были представлены на III съезде Биохимического общества, Санкт-Петербург, 2002 г и международных конференциях «RNA as Therapeutic and Genomic Target», Новосибирск, Россия, 2001г, XV International Round Table «Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids», 2002, Leuven, Belgium, «Targeting RNA Artificial Ribonucleases, Conformational Traps and RNA Interference», Новосибирск, Россия, 2003 г, «RNase H 2004», 2004, Strasbourg, France

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитированной литературы Работа изложена на 104 страницах, содержит 49 рисунков и 5 таблиц Библиография включает 133 литературных источника

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Синтез блеомициновых производных олигонуклеотидов

Для выполнения данной работы были синтезированы конъюгаты двух типов (Рис 1) В конъю-гатах первого типа (Рис 1 а) остаток блеомицина непосредственно связан с концевой фосфатной группой олигонуклеотида Далее такие конъюгаты будут обозначаться как «стандартные» Конъюга-ты второго типа (Рис 1 б) содержат между остатками олигонуклеотида и блеомицина линкеры, состоящие из нескольких остатков гексаэтиленгликольфосфата Такие конъюгаты (далее - линкерсо-держащие) синтезированы и охарактеризованы впервые Гибкие протяженные линкеры были введены в состав конъюгатов с целью обеспечить остатку блеомицина высокую конформационную под-

вижность Предполагалось, что это свойство окажется ценным при расщеплении ДНК в составе три-плексов и РНК в составе гибридных дуплексов

Рис. 1. Структураконъюгатов блеомицинаА5с олигонуклеотидами: а) стандартныеконъюга-ты, б) линкерсодержащиеконъюгаты.

Стандартные конъюгаты (Таблица 1) были синтезированы по методу, описанному ранее Выделение и очистка конъюгатов были выполнены методами ионообменной и обращеннофазовой хроматографии, гомогенность конъюгатов подтверждена методом электрофореза в денатурирующем поли-акриламидном геле

Таблица 1. Стандартныеконъюгаты блеомицина с олигонуклеотидами.

Структура конъюгата Условное обозначение

В1трСА<ЗС В1трЫ4

ШтрТТТС BlшpN4(l)

В1трТТТСА В1шрЫ5(1)

В1шрТТСТТ В1трЫ5(2)

ВЬпрТТССА В1трЫКЗ)

В1трТТТТС В1шрЫ5(4)

ТТССАрВЬп Ы5рВ1ш

В1трСШТТС В1трЫ6

В1трСА<ЗСТССА В1трЫ8

В1трСА0СТССАСКЗСА В1трЫ|2

В1трПТСАТТСТПТССА В1трЫ|5

В1трТТТТТТГТТТГПТТТ ВЬрТ,6

ГПТПТШТПТП'рЫт Т16рВ1ш

Синтез линкерсодержащих конъюгатов был выполнен по схеме, представленной на рис 2 Для синтеза конъюгатов были использованы деблокированные олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие на 5'- или 3'- конце линкер, состоящий из одного (на рис 2) или нескольких (до четырех) остатков гексаэтиленгликольфосфата)1 Концевую фосфатную группу линкера активировали смесью 2,2'-

1 Любезно предоставлены И А Пышной (ИХБФМ СО РАН)

дипиридилдисульфида (РузВг) и трифенилфосфина (РЬ^Р) в присутствии 4-Ы,К-диметиламинопиридин-1-оксида (DMAPO) Образующееся активное производное вводили в реакцию с медьсодержащим комплексом блеомицина

Рис. 2. Схема синтеза линкерсодержащих конъюгатов.

Последовательности синтезированных конъюгатов приведены в таблице 2 Таблица 2. Линкерсодержащие конъюгаты.

Структура конъюгата Условное обозначение

В1трЬрТТТТТТГПТПТПТ В1тр1,рТ1б

ТТТТТТТТТТТТТТТТрЬрВ1т Т^рЬрВЬп

АТТОТТТТССАСТССО(рЬ)2рВ1т Ы16(рЬ)2рВ1т

АТТСТТТТССАСТССО(рЦ,рВ1ш М16(рЬ),рВ1т

АТТСТТТТССАСТССО(рЦ4рВ!т М16(рЬ)4рВ1т

Очистка и идентификация целевых конъюгатов была выполнена методами ионообменной и об-ращенно-фазовой хроматографии По данным электрофореза в денатурирующем ПААГ все конъюгаты гомогенны Структура конъюгатов М1б{рМ2рВ1т, М)б(р1.,)зрВ1п1 И М1б(рЬ)4рВ1П1 была подтверждена при помощи MALDI масс-спектрометрии

2. Расщепление одноцепочечных ДНК конъюгатами блеомнцина с олигонуклеотидами

Ранее было показано, что одна молекула стандартного конъюгата блеомицина с олигонуклеоти-дом способна повредить около трех молекул ДНК-мишени Однако, согласно литературным данным, одна молекула антибиотика способна повредить до 10 молекул ДНК-мишени Поскольку эффективность действия является одной из важнейших характеристик реакционноспособных производных олигонуклеотидов, исследование возможности ее повышения представляет значительный интерес

2.1. Расщепление одноцепочечных ДНК конъюгатами блеомицина с протяженной олиго-нуклеотидной частью

Ранее было показано, что одним из факторов, определяющих эффективность действия РПО на нуклеиновые кислоты, является стабильность комплементарного комплекса РПО мишень Повысить

стабильность такого комплекса возможно за счет увеличения длины олигонуклеотвдного адреса Мы исследовали расщепление одноцепочечной ДНК-мишени D30 конъюгатом блеомицина с 15-звенным олигонуклеотидом BlmpNu (Рис 3) Здесь и далее исследовали расщепленйймеченой мишени

Продукты расщепления анализировали методом электрофореза в денатурирующем ПААГ Повреждаемые нуклеотидные остатки идентифицировали по статистическому расщеплению 32Р-меченых мишеней по методу Макса-ма -Гилберта Соответствующие дорожки на радиоавтографах обозначены «A+G» для пуриновых нуклеотидов и «Т+С» для пири-Рис. 3. Комплементарные комплексы, образуемые мидиновых ДНК-мишенью D30, с олигонуклеотидом N1S и его

блеомиицновым Щшрк^ным н.р,. обозначены

повреждаемые нуклеотидные остатки Расщепление мишени D30 в составе комплекса 1 протекает по нуклеотидным остаткам А16, Т17, А19 (Рис 4, дорожка 3 и рис 3, комплекс 1) Неконъюгированный блеомицин расщепляет D30 преимущественно по нуклеотидному остатку Т6 (рис 4, дорожка 2), в GT-последовательности, являющейся предпочтительной для расщепления свободным блеомицином

Рис. 4. Электрофоретический анализ продуктов расщепления 31Р-меченой мишени D30 конъюгатом BlmpNls и неконъюгированным блеомицином. Все реакционные смеси содержали ЫО* MD30, 0.2 М LiO, 0.01 М mpuc-HClpH 7.5. 1 - мишень D30 в условиях реакции без добавления конъюгата или блеомицина, 2 - 1-104 М неконъюгирован-ного блеомицина, 3-1-106Мконъюгата BlmpNls 4- l'lff4М неконъю-гированного блеомицина и l-l(f М олигонуклеотида N¡¡. Реакции инициировали одновременным добавлением 0.05 М 2-меркаптоэтанола и l'lb4МFefNHJrfSOJt Пробы инкубировали при 20 Св течение 4 ч.

Обнаруженные различия в позиционной направленности расщепления мишени D30 конъюгатом и неконъюгированным блеомици-ном позволяют заключить, что расщепление мишени конъюгатом является специфическим, то есть протекает только в составе комплементарного комплекса конъюгат мишень Известно, что при расщеплении ДНК как блеомицином, так и его олигонуклеотидными конъю-гатами прямые разрывы цепи и щелочелабильные сайты образуются в приблизительно равном соотношении В данной работе эффективность повреждения ДНК-мишени конъюгатами оценивалась по суммарной степени модификации, наблюдаемой после обработки ДНК-мишени 0 1 М раствором 1-бутиламина в течение 8 мин для выявления щелочелабильных сайтов За степень расщепления принимали отношение радиоактивности пятен, соответствующих продуктам расщепления, к суммарной радиоактивности дорожки геля Предельная степень расщепления мишени D30 конъюгатом зависит от соотношения концентраций конъюгата и мишени При соотношении 1 1 при

I.

комплекс 1 I 20 25

2pCGGAGTTGGAAAACAATGAAAAGGCCCCCA D30 ACCTTTTGTTACTTTp Blm BÍmpNls

1 II I

5 <0 M 25 TV»n

32pCGGAGTTGGAAAACAATGAAAAGGCCCCCA "30 r ACCTTTTGTTACTTTp P^is

J

+В1Ш-Н

5» 10 20 25

;2pCGGAGTTGGAAAACAATGAAAAGGCCCCCA D30 +Blm-H

20 °С предельная степень расщепления достигается за 4 часа и составляет 40%, а при 10-кратном избытке конъюгата достигает 55% Принимая во внимание способность блеомицина к реактивации и повторной модификации ДНК-мишени, мы исследовали расщепление мишени в условиях 10-кратного недостатка конъюгата Предельная степень расщепления мишени D30 в таких условиях составляет 11%, что соответствует расщеплению в среднем 1 1 молекул D30 одной молекулой конъюгата

Таким образом, возможность повреждения нескольких молекул ДНК-мишени одной молекулой конъюгата с длинным олигонуклеотидным адресом практически не реализуется

2.2. Расщепление ДНК конъюгатами блеомицина с короткими олигонуклеотидами в присутствии олигонуклеотидных эффекторов

Ранее было показано, что для эффективной мо-

„„„„„.„^с з

«РСССАСТТССААААСДАТСААЙ1СССССССЙ 030 Дификации ДНК-мишени можно использовать алки-АССТТр АСТТТрМт

"----- -- -- лирующие производные коротких олигонуклеотидов

рад ТТЗТТр В1п рГУ,(1) РМ,(2)

4 - 1

еГТСОДАААСАД

в составе тандемов с олигонуклеотидными эффекто-

32рСЗСАСТТССААААСААТСААААСССССССА ОЗО Рами Поэтому далее мы исследовали расщепление АССТТр_ АСТТТр р1Ч£(1)

этой же мишени 1)30 конъюгатами блеомицина с

р!*,(3) ТТСТТрШт

В|трМ,(2)

Ы II и

пятизвенными

олигонуклеотидами

"рССаАСТТаСА^СААТСААААСЗСССССА ОЗО В1тр^(2), В1трМ5(3) И М5рВ1т), которые в присут-

ШтрВД ТТСТТр

ри,(г)

4

32рСССАСТТССААААСААТСААААСССССССА ОЗО В1трАССТТ АСТТТр

N. р В1ш ТТСТТр РВД

Рис. 5. Структура тандемныхкомплексов 3-6.

ствии эффекторов р^(2), pN5(3)) формиро-

вали тандемы, суммарная последовательность которых была эквивалентна последовательности олиго-нуклеотида р]Чц (Рис 5)

Мишень D30 расщепляется конъюгатами В)трМ${1), Б1шр^5(2), В1шр>5(3) И 1ЧфВ1т в составе комплексов 3-5 как по нуклеотидным остаткам, расположенным в непосредственной близости от остатка блеомицина в составе комплекса (повреждаемые нуклеотидные остатки помечены на рис 5 стрелками), так и по нуклеотидному остатку Т6

Рис. 6. Электрофоретическийанализпродуктоврасщепления 32Р-меченой мишени ОЗО конъюгатами блеомицина с короткими олигонуклеотидами в комплексах 3-6. Все реакционные смеси содержали 1 1(Г5 МВ30, 0.2 А/ иС1, 0.01 Мтрис-НС1 рН 7.5. 1 -BlmpNs(l)f эффекторь^$(2) и р№(3) (комплекс 3), 2- В1тр№$(2), эффектор ыр№$(1) ирЫ/3) (комплекс 4), 3 к т о р ы

р№$(1) и р№5(2) (комплекс 5), 4- ЬТфВ1т,эффекторы р1У${1) и р!^$(2) (комплекс 6). Концентрация конъюгатов и эффекторов-1*106М. Пробы инкубировали при 20°Св течение 18ч.

В комплексе 6, в котором остаток блеомицина располагается вблизи сайта Т6, расщепляется

Предельная степень расщепления ДНК-мишени в комплексах 3, 4, 5 и 6 (при 10-кратном избытке мишени D30) составляет 24 - 44% Это соответствует расщеплению в среднем 2 4-44 молекул мишени одной молекулой конъюгата Далее эту величину - среднее число молекул ДНК-мишени, поврежденных одной молекулой конъюгата, - принимали за эффективность конъюгатов в

условиях избытка ДНК-мишени (Рис 7)

Таким образом, переход от непрерывного 15-

звенного олигонуклеотидного адреса к равному по

протяженности трехкомпонентному тандему приводит к более чем четырехкратному увеличению эффективности расщепления, но при этом существенно снижает его специфичность По-видимому, в данном случае низкая специфичность расщепления мишени вызвана недостаточной стабильностью Рис. 8. Структура тандемных комплексов комплементарного комплекса ДНК-ми-

7,8.

шень конъюгат

Мы попытались повысить стабильность комплекса конъюгат мишень, улучшив комплексообра-зующие свойства эффекторов Было исследовано расщепление мишени D30 конъюгатом BlmpN5(2), фланкированным парой 8- (комплекс 7) или 11-звенных (комплекс 8) эффекторов (Рис. 8) Специфичность расщепления мишени D30 в комплексах 7 и 8 (Рис 8, 9) значительно выше, чем в комплексах 3 - 5 Нуклеотидный остаток Т6 практически не повреждается

■ Рис 9. Электрофоретический анализ продуктов расщепления 32Р-меченой мишени D30 конъюгшпами BlmpNs(2) (комплекс 7, дорожка 1 и комплекс 8, дорожка 2), BímpN/1) (комплекс 9, дорож-каЗ), BlmpN¡(4) (комплекс 10, дорожка 4) и BlmpNt (комплекс 11, дорожка 5). Концентрация D301-1 ff', концентрация конъюгатов и эффекторов - Г10* « буферном растворе: 0.2 М UCI, 0.01 М трис-HCl (pH 7.5). Пробы инкубировали при 20С в течение 18 ч.

Увеличение длины эффекторов практически не влияет на эффективность расщепления мишени D30 в комплексах 7 и 8 эта величина составляет 4 1 и 3 9 соответственно Таким образом, увеличение

только этот нуклеотидный остаток (Рис 5,6)

иШ

конъюгат ВЯтрЫи Е1тр№,(1} В1тр^(2) В1тр{%(3) комплекс 1 3 4 5 6

Рис 7. Эффективность расщепления D30

конъюгатами блеомицина с олигонуклеоти-

дами в комплексах 1, 3-6 в условиях

10-кратного избытка мишени Б30.

^ | ^ комплекс 7

ТСААССТТр АСТТТТССр ТТСГТрШт В1т

I ^ комплекс 9

згрСССАСТТССААААСААТОААААСС^ССССА ИЗО СССТСААССТТр АСТТТТСССССр ТТОТТрВЬп В1ш п(Ш

32РСССА||ТСС11мсмтсммссссссса ПЗО 32РСССАСТТСС1АА1СААТ6амассссссса 030 32РССОА|ттссаамс^ТСАМАОССССССА ИЗО

Рис. 10. Структура тандемных комплексов 9-11.

1||.1

длины эффекторов от 5 до 8 нуклеотидов (комплекс 7) позволяет существенно повысить специфичность расщепления ДНК-мишени Дальнейшее увеличение длины эффекторов до 11 нуклеотидов (комплекс 8) не оказывает заметного влияния на процесс расщепления (Рис 9, И)

Также было исследовано расщепление мишени D30 в тандемных комплексах 9-11 (Рис 10) конъюгатами блеомицина с четырех-пяти- и шестизвен-

ными олигонуклеотидами в присут-

ствии 8-звенных эффекторов В таких тандем-ных комплексах расщепление протекает с высокой специфичностью сайт Т6 является минорным (Рис 9) Максимальная эффективность расщепления мишени D30 - 65 (Рис 9, И) наблюдается при использовании конъюгата (комплекс 9) Таким образом, эффективность расщепления ДНК блеомициновыми производными коротких олигонуклеотидов в тандемах с эффек-

0 Ра м" существенно превышает эффективность

конъюгет В1трЫ5(2) В1гт>р№(2) В1трМ4(1) В1тр^(4) В1тр1Чв комплекс 7 8 9 10 11

Рис. 11. Эффективность расщепления D30 конъюгатами блеомицина с олигонуклеотида- 1 ми в комплексах 7-11 в условиях 10-кратного ее расщепления конъюгатами блеомицина с избытка мишени D30.

протяженными олигонуклеотидами По-видимому, эффективность и специфичность действия таких тандемов зависит от длины олигонукле-отидной части конъюгата и от длины эффекторов Среди исследованных конъюгатов наиболее эффективны блеомициновые производные тетра- или пентануклеотидов, фланкированные октануклео-тидными эффекторами Но, очевидно, существуют другие факторы, определяющие эффективность действия таких конъюгатов в тандемных комплексах Так, конъюгаты в

присутствии восьмизвенных эффекторов расщепляют мишень D30 с различной эффективностью -4 1 и 2 1 соответственно

2.2.1. Факторы, определяющие эффективность расщепления одноцепочечных ДНК конъюгатами блеомицина с короткими олигонуклеотидами в составе тандемных комплексов

Мы попытались выявить факторы, определяющие эффективность окислительного расщепления ДНК конъюгатами блеомицина с олигонуклеотидами Исследование было выполнено в рамках модельной системы, представленной на рис 12 и включающей в себя мишень D20, конъюгаты В1трК|, 8

BlmpNg, BlmpNn, эффекторы PhnpNs(l)Phn И PhnpNg(2)Phn (эффекторы любезно предоставлены

И А. Пышной (ИХБФМ СО РАН))

Исследование каталитической эффективности конъюгатов проводили при соотношении концентраций конъ-югата и мишени 110.

Все конъюгаты расщепляют мишень D20 специфично по сайтам СЮ и А8 (Рис. 13). Во всех случаях преобладает расщепление по сайту С10, в комплексе 13 более 90% от суммарной

степени расщепления приходится этот

сайт. Таким образом, расщепление осуществляется высокоселективно. Неконъюгированный блеоми-

цин расщепляет мишень D20 преимущественно по сайтам СЮ и СЗ, причем оба сайта повреждаются

в равной степени. Максимальная эффективность повреждения ДНК-мишени неконъюгированным

1 ^ 1 a с £ т Q и нем°ДиФиЦиРованного тетрануклеотида - 6.4.

Рис. 13. Результаты электрофоретического разделения в 20% ПЛАТ продуктов деструкции 32Р-меченой мишени D20 блеомицином и его олигонуклеотидными конъюгатами. Все реакционные смеси содержали: 2*10-5МD20, 0.2 МLiCl, 0.01 Мmpuc-HClpH 7.5. 2-D20 в отсутствие конъюгатов и эффекторов, 3 -BlmpN4 + PknpNs(1)Pkn, 4 - BlmpN4 + PhnpN¿1)Phn + PhnpNs(2)Phn, 5 - BlmpNs + PhnpN/1)Phn, 6 - BlmpNu + PhnpN/1)Phn, 7 - неконъюгированный блеомицин в присутствии тетрануклеотида pCAGC и эффекторов PhnpN8(1)Phn и PhnpNs(2)Phn. Дорожки 1 и 8 -A+G и Т+С соответственно. Концентрации конъюгатов и свободного блеомицина 2-106 М, концентрация эффекторов 105м. Реакционные смеси инкубировали 16 ч при 20°С.

Конъюгат BlropN|2 в комплексе 15 при 20 °С демонстрирует наименьшую среди всех конъюгатов эффективность -1.0 (Рис. 14 а, кривая 1). Повышение температуры реакции до 45 °С приводит к возрастанию эффективности до 2.1. Аналогичную зависимость эффективности от температуры демонстрирует конъюгат BlmpN«: при увеличении температуры от 20 до 45 °С происходит повышение эффективности от 1.2 до 3.5 (Рисунок 14 а, кривая 2).

В случае конъюгата BlmpNn наблюдается противоположная зависимость. Этот конъюгат демонстрирует максимальную эффективность - 6.4 - при 20 °С (Рис. 14 б, кривая 1). Близкая зависимость эффективности расщепления от температуры наблюдается для неконъюгированного блеомицина в присутствии эффектора PhnpNg(l)Pbll и тетрануклеотида pCAGC (Рис. 14 б, кривая 2). В присутствии дополнительного октануклеотидного эффектора связывающегося с ми-

PhnpM.(l)pPhn (-Phn Phrt-i pGAACTACGp )¿pTGCCTGGA GCTGCTTGATGC CGACp-Blm В1щр4

комплекс 14 PhnpNt(l)pPhn

pPhn Phn-i pGAACTACGp ,2pTGCC TGGAGCTG CTTGATGC ACCTCGACp-Blm Blmp8

^oSb

комплекс 13 PhnpN, (2) pPhn PhnpN, (l)pPhn

|-Phn Phrrj pPhn Phn-i pACGGACCTp pGAACTACGp ,zpTGCCTGGA GCTGCTTGATGC CGACp-Blm В1шр4

комплекс 15 ИшГ»,И)рМт

¡-Phn Phiri pGAACTACGp :'2pTGCCTGGAGCTG CTTGATGC ACGGACCTCGAC p-Blm Blmpl2

Рис. 12. Структура тандемных комплексов 12-15.

1234 5678

Мш

т А8

СЗ

шенью Б20 в 5'-концевой области, высокая эффективность конъюгата В1тр^ (6 5) сохраняется в интервале 20-35 °С и лишь при более высоких значениях температуры снижается до 2 4 (Рис 14 б, кривая 3)

а б

Рис 14. Зависимость эффективности расщепления мишени Б20 от температуры а: 1-конъюгат В1пф№2вприсутствшэффектораРНпрМ/1)Ркп (комплекс 15), 2-конъюгат В!тр№ в присутствии эффектора РкпрЩ1)РИп (комплекс 14). б: 1 - конъюгат ВЬлрМ в присутствии эффектора РИпрЩ1)Р1т (комплекс 12)), 2 - неконъюгированный блеомиицн в присутствии эффектора Р/тр/Ч/ЦРкп и тетранукпеотида рСАвС, 3 - конъюгат В1трЫ1 в присутствии эффекторов РЬпрЩ1)Р1м и РНпрЩ1)Р1т (комплекс 13). Условия реакции см. в подписи крис 13.

Таким образом, наблюдаются две противоположных зависимости эффективности расщепления от температуры реакции Эффективность длинных конъюгатов (В1шр^, ШтрГЧи) увеличивается с повышением температуры, тогда как эффективность конъюгата с ростом температуры сни-

жается

Возможной причиной ограничения активности конъюгатов могло бы быть расщепление олиго-нуклеотидной части конъюгата его собственным остатком блеомицина Было исследовано расщепление мишени Б20 32Р-мечеными конъюгатами в присутствии эффекторов Выяснилось, что олиго-нуклеотидная часть конъюгата В1тр1Ч4 в процессе реакции расщепляется незначительно (<10%) Конъюгаты В1тр№ и В1тр>1г расщепляются на 18-21% Таким образом, саморасщепление конъю-гатов не может существенно снижать их эффективность Кроме того, предельная степень саморасщепления конъюгатов не зависит от температуры реакции, и практически одинакова при 25 и 45 °С

Была исследована стабильность комплементарных комплексов (выделенные участки в комплексах 12-15 на рис 12), образуемых конъюгатами с ДНК в присутствии эффекторов Из данных термической денатурации (таблица 3) следует, что степень ассоциации комплексов, образуемых

Таблица 3. Температура плавления1 комплексов, образованных конъюгатами с исходной мишеньюD20,и структурными аналогамипродуктов ее окислительногорасщепления

Конъюгат ШО N»-N1« N9

комплекс Т "Г 1 ПЛ> V- комплекс т °г комплекс т °г 1ПЛ5

В1тр^ 12 31 12а' - 126' -

В1тр^ 13 45 13а1 <5 136' -

В1тр!У» 14 57 14а' 33 146' 15

В1тр1У,2 15 66 15а' 57 156' 52

Данные по термической денатурации любезно предоставлены Д В Пышным (ИХБФМ СО РАН)

конъюгатом В1шр^ с мишенью Э20, приближается к 1 лишь в узком интервале температур 20-25 °С в составе комплекса 12 и 20-35 °С в комплексе 13

Как видно на рис 14, в этих температурных интервалах достигается максимальная эффективность расщепления мишени Э20 в комплексах 12 и 13 По-видимому, снижение эффективности конъюгата за пределами этих температурных интервалов вызвано снижением степени ассо-

циации комплекса конъюгат мишень Степень ассоциации исходных комплексов конъюгатов В1шр№ И В1тр^2 по данным термической денатурации близка к 1 во всем исследованном интерва-0 ле температур Очевидно,

рТСССТвСАаСТССТТСАТСС

шелочелабильный сайт //

-N Н0 W

r^ift л

ч прямое ^s. расщепление

pTGCCTGGAGp -о—ч

pN,

низкая эффективность этих конъюгатов в составе ком. ) 1 4 и 1 5 при 20-7=0 р

35 °С и повышение их эффективности с ростом тем-

pTGCCTGGAGp —О"

PN9--|0

pTGCTTGATGC

Рис. 15. Продукты окисления мишени D20 при повреждении нук- пературы определяются леотидного остатка СЮ блеомицином. другими факторами

Известно, что при прямом расщеплении ДНК блеомицином образуются укороченные фрагменты, один из которых (5'-концевой) содержит на З'-конце в точке разрыва фосфогликолят, а другой -5'-фосфат При образовании щелочелабильного сайта полноразмерный олигонуклеотид сохраняется,

ч> = апирнмидиновый |-1 эффектор у = D20 по нуклеотидному

Рис. 16. Схематическое изображение комплексов 12а-15а и 12б-15б.

Согласно этой схеме,

рассматриваемые исходные комплексы 12,13,14 и 15 вследствие окисления остатком блеомицина и последующих превращений окисленного остатка дезоксирибозы переходят в комплексы 12а, 13а, 14а и 15а и в комплексы 12б, 13б, 14б и 15б (Рис 16) Для оценки стабильности комплексов серии «а» был синтезирован стабильный аналог продукта pNgrNw - олигонуклеоУ^д^одержащий в

комплекс 13а*

rVhn Phn-i pphn phrn

^ЫГСЬРГ'Фп 1 ______I

~0'

pACGGACCTp . f pGAACTACGp thf= W

TGCCTGGA GppTGCTTGATGC

" <j>

CGACpBlm

Рис. 17. Структура комплекса На.

положении 10 вместо гидроксилированного остатка дезоксирибозы его структурный аналог

Комплекс 13а1 не регистрируется по данным термической денатурации в интервале

температур выше 50С Это позволило исклю-

1 Синтезирован Д В Пышным (ИХБФМ СО РАН)

комплекс 146*

К,

чить из рассмотрения, как еще менее стабильные, комплексы 12а, 12б и 13б, а в случае комплексов 146 и 156 - исследовать лишь термическую денатурацию комплексов конъюгатов В1тр1Ч| и В1трГЧ12 с нонануклеотидным фрагментом N9 (Рис 18, табл 3)

Из данных таблицы 3, следует, что основное различие между конъюгатом В1трР^ и более длинными, заключается в стабильности комплементарных комплексов, образуемых ими с продуктами окислительного расщепления ДНК-мишени Очевидно, что продукты окисле-

комплекс 14а1

|-Р1т Р1т-|

ЛГ РСААСТАССр Т6СС Т5ЕАСррТ5СТТ6АТ6С ЛССТС6АС р-В1ш

ТСССТвСЗАСЗр

АССТСбАСр-В1т

комплекс 15а'

|-Р1т

К»"Г<и М рБААСТАССр ТвССТВВЛв ррТССТТСАТСС АСССэАССТССАС р-В1т

Р"

комплекс 156'

ТБССТСШБ р АСЭЗАССТССАС р-В1т Рис. 18. Структура комплексов 14а', 146', 15а' и 156'.

ния - не могут выступать в роли конкурентных ингибиторов, связывающих

конъюгат в непродуктивных комплексах Напротив, высокая стабильность комплексов,

образуемых В1трКв и В1трМн с продуктами деградации Б20 приводит к конкурентному ингибиро-ванию процесса расщепления По данным термической денатурации ингибирование должно быть менее выражено в случае конъюгата В1трМ8 На рис 14 а видно, что это в действительности имеет место - конъюгат активнее, чем конъюгат практически во всем исследованном

интервале температур

Известно, что в отсутствие субстратов происходит быстрая самоинактивация остатка блеоми-цина В нашем случае такая инактивация может протекать в составе долгоживущих ингибиторных комплексов, образованных конъюгатами блеомицина с поврежденной мишенью Б20 Именно самоинактивация остатка блеомицина делает наличие таких комплексов фактором, ограничивающим эффективность конъюгатов

Полученные результаты позволяют заключить, что скорость диссоциации комплекса конъю-гат продукт, образующегося в результате расщепления ДНК, играет определяющую роль в каталитическом расщеплении нуклеиновых кислот реакционноспособными производными олигонуклеотидов, изначально образующими с целевой мишенью стабильный комплекс Максимальная эффективность таких конъюгатов может быть достигнута лишь при соблюдении двух основных требований полная ассоциация исходного комплекса конъюгат мишень и быстрая диссоциация образующегося комплекса конъюгат продукт Максимальная эффективность расщепления ДНК (более шести молекул ДНК-мишени в расчете на одну молекулу конъюгата) наблюдается для тетрануклеотидного конъю-гата блеомицина, фланкированного двумя октануклеотидными эффекторами Такие конъюгаты в тандемных комплексах идеально удовлетворяют двум основным требованиям, предъявляемым к каталитическим реагентам высокая стабильность исходного комплекса с целевой ДНК и быстрая диссоциация реагента из комплекса с продуктами реакции Высокая стабильность исходного комплекса обеспечивается олигонуклеотидными эффекторами, а высокая скорость диссоциации - повреждением ДНК непосредственно в сайте связывания

Выявление факторов, определяющих высокую эффективность расщепления ДНК блеомицино-выми производными олигонуклеотидов, открывает путь к рациональному дизайну каталитических

реагентов, а на их основе - искусственных нуклеаз, которые могут иметь большое значение для развития генной терапии

3. Субстратные свойства тандемных гибридных дуплексов, содержащих конъюгаты блео-мицина с короткими олигонуклеотидами, по отношению к рибонуклеазе Н Е. Coli

Взаимодействие антисмысловых олигонуклеотидов с целевыми матричными РНК может приводить как к гибридизационному аресту трансляции данных мРНК, так и к их гидролизу РНКазой Н в составе образующихся гибридных дуплексов Поскольку эффективность антисмысловых олиго-

нуклеотидов и их производных может быть прямо связана со способностью образуемых ими гибридных дуплексов вызывать гидролиз матричных РНК РНКазой Н, важно иметь данные о возможности исследуемых систем формировать субстраты для РНКазы Н Ранее гидролиз РНК РНКазой Н в составе гибридных дуплексов с тандемными наборами коротких олигонуклеотидов исследован не был

Исследование влияния блеомицина, ковалент-но присоединенного к 5'-фосфатной группе олиго-дезоксирибонуклеотидов было проведено в услови-, П0Лного связывания матрицы R20 исследуемыми соединениями (Рис 19, таблица 4), поскольку в этом случае различия в начальных скоростях гидролиза РНК (Vo) отражают различия в субстратных свойствах гибридных дуплексов Как видно из таблицы 4, значения температур плавления непрерывных и тандемных комплементарных комплексов достаточно высоки Это свидетельствует о том, что степень ассоциации таких комплексов при 20"С должна быть близка к 1, даже с учетом перехода к более низким концентрациям Поэтому влияние остатка блеомицина на субстратные свойства гибридных дуплексов оценивали по начальной скорости гидролиза рибонуклеазой Н 20-звенной матрицы R20 при 20°С, то есть в условиях ее полного связывания исследуемыми производными

Таблица 4. Температура плавления1 гибридных комплексов «R20 + тандем»

комплекс 16

pNa<2> pNa(l>

ACGGACCTp GAACTACGp 3 2 pUGCCUGGAGCUGCUUGAUGC CGACp-Blm BlmpN,

комплекс 17 pNe(2> pNe (1)

ACGGACCTp GAACTACGp 3 2 pUGCCUGGAGCUGCUUGAUGC CGACp PN«

комплекс 18 ' 32 pUGCCUGGAGCUGCUUGAUGC

ACGGACCTСGACGAACTACGp

Рис. 19. Структура гибридных комплексов

1 - Тм комплекса BltttpN4 с мишенью R20 в присутствии эффекторов pNg(l) U pNg(2)

2 " Тпл комплекса эффектора pNg(l) с мишенью R20

3 - Т„ комплекса эффектора pNt(2) с мишенью R20

4 ' Тпя комплекса pNj с мишенью R20 в присутствии эффекторов pN$(l) U pNn(2)

1 Данные любезно предоставлены Д В Пышным (ИХБФМ СО РАН)

Начальная скорость гидролиза (V0) R20 РНКазой Н Е СОН в гибридных дуплексах с конъюгата-ми В1тр^ и В1тр>12 в 3-4 раза ниже, чем скорость гидролиза в гибридных дуплексах с исходными

олигодезоксирибонуклеотидами pN и pN,2 (данные не приведены) Напротив, в составе тандемного гибридного дуплекса снижение V, при переходе от немодифицированного тандема p^(1) + pN4 + pN8(2) к блеомицинсодержащему pN8(l) + BImpN4+ p^(2) (Рис 20) значительно менее выражено

g Снижение Vo может быть обусловлено встраиванием остатка

блеомицина в гибридный дуплекс или возникающими стерическими затруднениями

16

11

Рис. 20. Начальная скорость (VJ гидролиза R20 в комплексах 1618 в растворе, содержащем 20 мМ Hepes-КОН (рН 8.0), 50мМ KClf 10 MM ftfgClz и 1мМ дитиотреита при концентрации РНК-МивШШ 1'ИТ М, олигодезоксирибонуклеотидов - 2'1иМ. Реакционные смеси преинкубировали при 20 °С в течение 15 мин, затем добавляли 0.15 ед.акт РНКазы Н. Реакцию останавливали осаждением 2% раствором ЫСЮ4 в ацетоне. Электрофорез проводили в 20% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (0.09Мтрис-НзВОз, рН 8.3, 8 Ммочевина, 40°С).

Эксперименты по термической денатурации гибридных и ДНК-дуплексов, как немодифицированных, так и содержащих ковалентно связанный остаток блеомицина, показывают, что взаимодействие блеомицина с гибридными дуплексами может протекать иначе, чем с двуцепочечной ДНК Оказалось, что значения Тдл комплексов, образованных конъюгатом Stülpt и тетрануклеотидом pN^ с ДНК-аналогом матрицы R20 в комплексах 16а и 17а (Рис 21) совпадают

комплекс 17а

комплексна

pHe(2) pNe(l) pNa (2) pN,(l)

ACGGACCTp GAACTACGp ACGGACCTp GAACTACGp

d5' pTGCCTGGAGCTGCTTGATGC pTGCCTGGAGCTGCTTGATGC

CGACp-Blm BlnpN4

Рис. 21. Структура дуплексов 16а и 17а. AT/Ais

CGACp Р»,

(38°С) Напротив, комплекс, образованный блеомициновым производным тетрануклеотида с РНК в присутствии эффекторов (комплекс 16), на 3°С менее стабилен чем комплекс, образованный не-модифицированным тетрануклеотидом (комплекс 17) (см таблицу 4)

Кроме того, в случае ДНК-дуплекса 16а при длинах волн 300-320 нм выявлен переход в интервале температур 20-45 °С (кривые 1 и 2, рис 22), то есть в том же интервале, что и переход при 270 нм (кривая 3, рис 22), соответствующий денатурации комплементарного комплекса тетрануклеотида с ДНК При денатурации гибридного дуплекса 16 переход при 300-

Рис21 Изменение нормированного оптического , . тт

j ,1 320 нм отсутствует (кривая 4, рис 22) Наличие

поглощения Atf Ais при термической денатурации

такого перехода при термической денатурации

ДНК/ДНК-комплекса 16а на длинах волн 3GG (1), 320 (2), 270 нм (3) и гибридного РНК/ДНК-комплекса 16 на длине волны 300нм (4). AtU Ais- комплекса 16а, по-видимому, является следст-

оптическое поглощение при данной температуре u npu 15'C

вием батохромного сдвига соответствующей

полосы (Хщах^ЗЮ Нм) в спектре поглощения блеомицина при его взаимодействии с ДНК-дуплексом При термической денатурации комплекса 16а такой сдвиг приводит к повышению оптической плотности при X—300 (кривая 1) и к снижению при Х=320 (кривая 2) Учитывая, что полоса с Хмах~310 нм соответствует поглощению битиазольного фрагмента блеомицина, логично предположить, что отсутствие подобного перехода в интегральной кривой термической денатурации комплекса 16 (R20/pNg(l) + BlmpNj + pNg(2)) при 300 нм (Рис 22, кривая 4) свидетельствует об отсутствии взаимодействия битиазольного остатка блеомицина с гибридным дуплексом Таким образом, основной причиной негативного влияния объемного остатка блеомицина на субстратные свойства гибридных дуплексов по отношению к РНКазе Н может быть стерическое воздействие - молекулярная масса остатка блеомицина в виде медьсодержащего комплекса превышает 1500 Ранее отмечалось, что 3'-конец РНК в гибридном дуплексе, является первичным сайтом атаки фермента Также отмечалось, что наличие 5'-концевой фосфатной группы олигодезоксирибонуклеотида увеличивает эффективность гидролиза РНК РНКазой Н в гибридном дуплексе Блокирование 5'«концевой фосфатной группы остатком блеомицина также может являться причиной ухудшения субстратных свойств гибридного дуплекса

Тем не менее, при гидролизе R20 в комплексах 16 и 17 регистрируются все основные продукты наблюдающиеся при гидролизе этой же РНК в гибридном дуплексе с соответствующим нативным 20-мером (комплекс 18) И несмотря на некоторое снижение начальной

Рис. 23. Электрофореграммы Рис. 24. Кинетические кривые деструкции

гидролиза Я20РНКазой Н через 15 мин после Я20РНКазой Нв комплексах 16 (Щ, 17 (ф) и начала реакции в комплексах 16-18. Условия 18 (°)- Условия реакции см. в подписи к реакции см. в подписи крис. 20. рис. 20.

скорости гидролиза РНК-мишени РНКазой Н в гибридном дуплексе с блеомицинсодержащим тандемом, эффективность гидролиза РНК мишени в таком гибридном дуплексе сравнима с эффективностью гидролиза в дуплексе с немодифицированным тандемом и в непрерывном гибридном дуплексе такой же протяженности (Рис 24)

Таким образом, наличие остатка блеомицина не препятствует гидролизу РНК мишени рибонук-леазой Н в тандемных гибридных дуплексах

4. Расщепление РНК конъюгатами блеомицина с олигодезоксирибонуклеотидами

ACCTTTTGTTACTTTp BlmpN .

Неоднократно было показано, что неконъюгированный блеомицин способен расщеплять не только ДНК, но и РНК Однако, количество сайтов, «узнаваемых» блеомицином, в РНК значительно меньше, чем в ДНК Ранее не была продемонстрирована возможность расщепления РНК конъюгата-ми блеомицина с олигонуклеотидами

В качестве РНК-мишени для исследова-

комплекс 19

5 |„ 15 ^ ^ НI 25 шя так™ возможности был выбран фрагмент

"Я?_/чттттлл* -и « * /ч* «к » » ^ЛЛррЛОД II111

В1в Ю0' гомологичный фрагменту БЗО (Рис 25)

Было установлено, что данный фрагмент не Рис. 25. Структура комплекса 19. расщепляется свободным блеомицином в

интервале концентраций (1-10) 104 М (данные не приведены)

При обработке фрагмента К30 конъюгатом В1шр^5 наблюдается пять сайтов расщепления (018 - А22) Степень прямого расщепления мишени К30 составляет 6% (Рис 26) Дополнительная обработка раствором 0 25 М гидразина, рН 7 8 не привела к увеличению степени расщепления фрагмента (данные не приведены)

Рис. 26. Результатыэлектрофоретическогоразделения в 20% ПААТпро-дуктов деструкцЛР-меченой мишени КЗОконъюгатом ВЬпрИц 1 - К.30 в отсутствие конъюгата, 2-е присутствии ВЬпрМз. Концентрация ВЬпрЫм - 110~! М. Реакционные смеси содерэкЫО5 МЯЗО, 0.2М 1ЛС1, 0.01Мтрис-НС1 рН 7.5. Реакцию инициировали одновременным добавлением 1 Ю' М Ре^Н^^ЗО^г и0.05 М2-меркаптоэтанола, инкубировали 3 ч при 20°С

Таким образом, направленное расщепление РНК конъюгатами блеомицина с олигонуклеотида-ми возможно, но в данном случае протекает неэффективно

Известно, что расщепление рибосомальной 58 РНК дрожжей блеомицином протекает по нук-леотидным остаткам последовательностях, расположенных перед однонуклеотидными

петлями Для формирования подобной петли в мишени Ю0 был использован 16-звенный олигоде-еотля 07 зоксирибонуклеощд N1« (Рис 27, комплекс

к

5' "prCGGAGUGGAMACAAUGAAAAGGCCCCCA

pdGCCTCACCTTTTGTTA

N..

комплексы 21 -23

5' 32prCGGAGUGGAAAACAAUGAAAAGGCCCCCA

20) В данном комплексе мишень Ю0 расщепляется неконъюгированным блеомицином по нуклеотидному остатку иб, прилегающему к петле, содержащей остаток И7 Степень прямого расщепления составляет 30% Здесь и

В Imp (Lp) „dGCCTCACCTTTTGTTA

Рис 27. Структура комплексов 20-23.

далее регистрировались только прямые разрывы цепи РНК, наблюдаемые без дополнительных обработок Следует отметить, что в составе совершенного гибридного дуплекса, образуемого РНК-

мишенью и 17-звенным олигодезоксирибонуклеотвдом 3'- ёОССТСАЛССТТТТОТТА -5' мишень Ы30 не расщепляется неконъюгированным блеомицином (данные не представлены)

Далее были синтезированы линкерсодержащие конъюгаты ^6(рЬ)2рВ1ш, N16(pL)зpBlm и N16((pL)4pB1m, последовательность которых идентична последовательности олигонуклеотида N,6 Гибкие линкеры, состоящие из двух, трех или четырех остатков гексаэтиленгликольфосфата были введены в олигонуклеотиды чтобы присоединенный остаток блеомицина мог достичь предполагаемой области расщепления (Рис 1 б, 27) Как видно из рис 28, в присутствии конъюгатов ^6(рЬ)2рВ1ш, ^6(рЬ)зрВ1ш и ^6(рЬ)4рВ1ш, наблюдается расщепление мишени Ю0 по нуклеотидному остатку иб Эффективность расщепления зависит от длины линкера, связывающего остаток блеомицина с олигонуклеотидом

Рис. 28. Радиоавтограф гель-электрофореза продуктов расщепления примененной мишени К30 в присутствии: 1 - олигонуклеотида N 16 и неконъюгированного блеомицина, 2 - конъюгата N1б(рЬ)£)ВЬп; 3 - конъюгата )зрВ1т; 4 - конъюгата

Реакционные смеси содержали 2'№~5 М Я30, 0.2 М ЫС1, 0.01 М трис-НС1 рН 7.5. Реакцию инициировали одновременным добавлением Ив4 М Ге^Щ&О^

и 0.05 М 2-

меркаптоэтанола, инкубировали 3 ч при 20°С. ОН - статистический гидролиз РНК-мишени в 0.2 М №вНСОз, рН 8 9;

Степень расщепления РНК-мишени в комплексе с конъюгатом ]Ч|<;(рЬ)2рВ1т, достигает 8%, с конъюгатом ^б(р!-<)зрВ1т - 12%, а максимальная эффективность расщепления (18%) достигается в комплексе с олигонуклеотидом М|б(рЬ)4рВ1т, содержащим в линкере четыре остатка гексаэтиленгликольфосфата Очевидно, конъюгаты М1б(рЬ)2рВ1п], ^б(рЬ)зрВ1т И М|б(рЬ)4рВ)т, как и олигонук-леотид N16, образуют с мишенью К.30 дуплекс, содержащий в цепи РНК однонуклеотидную петлю

Степень расщепления РНК-мишени конъюгатом ^б(р1Д|рВ1т снижается при добавлении оли-гонуклеотида который конкурирует с конъюгатом за сайт связывания на РНК-

мишени Полное подавление расщепления достигается при концентрации олигонуклеотида N¡6 1 105 М Это указывает, что расщепление РНК-мишени конъюгатами 1Ч1б(рЬ)грВ1т, ]%1б(рЬ)зрВ1П1 и носит комплементарно адресованный характер Приведенные данные позволяют заключить, что использование олигонуклеотидной части бле-омицинсодержащих конъюгатов для формирования несовершенных комплексов, содержащих участки предпочтительного расщепления РНК блеомицином, позволяет осуществлять достаточно эффективное комплементарно адресованное расщепление РНК такими конъюгатами

5. Расщепление двуцепочечной ДНК конъюгатами блеомицина с триплекс-формирующими олигонуклеотидами (ТФО)

Ранее было показано, что степень расщепления двуцепочечной ДНК неконъюгированным бле-омицином значительно превышала степень ее расщепления триплекс-формирующими конъюгатами Мы предположили, что протяженность природного спермидинового линкера, соединяющего остатки

блеомицина и олигонуклеотида, ограничивает способность остатка блеомицина в составе стандартного конъюгата связываться с ДНК в необходимой конформации В этом случае увеличение длины линкера могло бы облегчить связывание блеомицина в малой бороздке ДНК и привести к увеличению эффективности ее расщепления бле-омицином Эксперименты по расщеплению дву-цепочечной ДНК триплекс-формирующими конъюгатами блеомицина проводились с использованием синтетической двуцепочечной 30-звенной ДНК МЗО (Рис 29) Для определения степени расщепления конкретной цепи ДНК использовали 32Р-меченые пурин-богатую (АЗО) или пиримидин-богатую (ТЗО) цепь

Было исследовано расщепление мишени МЗО стандартными конъюгатами Т16рВ1т, BlmpT16 и линкерсодержащими конъюгатами и

В1трЬрТи

Рис. 30. Радиоавтограф электрофоретического анализа продуктов расщепления цепи АЗО в 20% полиакршамидном геле. Все реакционные смеси содержали 1М НО, 0.1 М Тт-НС1 (рН 7.5), 10тМ М%С1ъ и 3-10* М мишени МЗО. Дорожка 1

- мишень МЗО без добавления конъюгата, дорожка 2 - расщепление в присутствии конъюгата ВЬпрТц, дорожка 3 - ШтрЬрТ,^ дорожка 4

- Т16рВ1т, дорожка 5- Т6рЬрЫт, дорожка 6-е присутствии неконъюгированного блеомицина, дорожка 7 - контрольный конъюгат Шт-ТТТСАТТОПТТССА. Концентрация конъюга-тое и свободного блеомицина составляла 1,51(Г! М. Реакционные смеси перед реакцией были преинкубированы в течение 18 ч при 20°С Реакционные смеси выдерживали в течение 5 ч при 20°С.

В условиях образования триплекса и в присутствии меркаптоэтанола конъюгаты вызы-

вают расщепление ДНК-мишени Расщепление цепи АЗО показано на рис 30, аналогичная картина (данные не приведены) наблюдается для цепи ТЗО Расщепление МЗО конъюгатами ТмрЬрШт и протекает по тем же сайтам, что и расщепление конъюгатами

(Рис 30) Конъюгаты Тц;рЬрШт И В1тр]ЬрТ1б расщепляют обе цепи МЗО более эффективно, чем конъюгаты Т|бВ1т и В1тТ16 (Рис 31) Например, линкерсодержащий конъюгат ТдерЬрВ!!!! расщепляет 61% цепи АЗО, тогда как степень расщепления этой же цепи стандартным конъюгатом Т1бВ1(П составляет лишь 41 %

В условиях избытка конъюгата обе цепи мишени подвержены слабому неспецифическому расщеплению Эти «неспецифические» сайты повреждаются также в реакции с неконъюгиро-ванным блеомицином (степень расщепления достигает 34 %, рис 30, дорожка 6) и контрольным конъюгатом, не образующим триплекса (до 5 %, рис 30, дорожка 7)

Рис. 31. Степень расщепления цепей АЗО и ТЗО Таким образом, расщепление целевой ДНК

новыми конъюгатами, содержащими гексаэти-

нии с конъюгатами В1трТ!6 и ТгфЫт.

ленгликольфосфатные линкеры, протекает до 1 5 раз более эффективно, чем расщепление стандартными конъюгатами

5. Выводы

1 Созданы и исследованы тандемные системы, содержащие конъюгаты коротких олигонуклео-тидов с блеомицином А5 и олигонуклеотидные эффекторы

Показано, что независимо от длины и последовательности олигонуклеотидного адреса, все исследованные конъюгаты в составе тандемных комплексов сайт-специфически взаимодействуют с комплементарными ДНК-мишенями, многократно вызывая расщепление мишени в области связывания конъюгата Наибольшую эффективность (деструкция более 6 молекул ДНК-мишени одной молекулой конъюгата в составе тандема) проявляют конъюгаты блеомицина с тетрануклеотидами, расщепляющие ДНК-мишень в собственном сайте связывания Установлено, что ключевыми факторами, определяющими эффективность таких конъюгатов в составе тандемов являются, с одной стороны, высокая степень ассоциации комплекса конъюгат ДНК-мишень, обеспечиваемая эффекторами, и, с другой стороны, быстрая диссоциация реагента из комплекса с поврежденной ДНК мишенью

2 Синтезированы конъюгаты нового типа, в которых остаток блеомицина А5 присоединен к олигонуклеотиду через линкер, состоящий из остатков гексаэтиленгликольфосфата (от одного до четырех остатков) Показано, что линкерсодержащие конъюгаты блеомицина с гексадекатимидила-том более эффективно расщепляют обе цепи ДНК в составе триплекса по сравнению со стандартными конъюгатами

3 Впервые продемонстрировано, что конъюгаты блеомицина с олигодезоксирибонуклеотидами способны вызывать сайт-специфическое расщепление фрагмента РНК

Показано, что эффективность расщепления РНК линкерсодержащими конъюгатами может быть существенно (до 3 раз) повышена за счет формирования олигонуклеотидной частью конъюгата в

цепи РНК однонуклеотидных петель, являющихся сайтами предпочтительного связывания остатка блеомицина

4 Исследовано расщепление РНК рибонуклеазой Н Е coif в непрерывных и тандемных гибридных дуплексах с олигонуклеотидами, несущими на 5'-концевой фосфатной группе остаток блеомицина Показано, что наличие остатка блеомицина не препятствует гидролизу РНК мишени рибонуклеазой Н в тандемных комплексах, и снижает его скорость в 34 раза в случае непрерывных комплексов

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1 Воробьев П Е, Маркушин Ю Я, Сергеев Д С, Зарытова В Ф Повышение эффективности сайт-специфического расщепления ДНК-мишени блеомициновым производным тетрануклеотида с помощью олигонуклеотидов-эффекторов // Биоорган химия 1996 Т22 №2 С 111-116

2 Sergeyev D S , Vorobjev Р Е, Zarytova V F Superactive ohgonucleotide derivatives //Nucleosides Nucleotides 1997 V 16 №7-9 P 1575-1577

3 Воробьев П E , Зарытова В Ф Расщепление РНК в составе гибридных дуплексов рибонуклеазой Н Е coli I Субстратные свойства комплексов, образованных РНК и тандемом коротких оли-гонуклеотидов//Биоорган химия 2000 Т26 №10 С 656-661

4 Воробьев П Е, Пышный Д В , Викстром Э, Зарытова В Ф Расщепление РНК в составе гибридных дуплексов рибонуклеазой Н Е coll III Субстратные свойства гибридных дуплексов РНК и олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих остаток блеомицина А5 // Биоорган химия 2002 Т 28 №4 С 332-340

5 Воробьев П Е, Пышная И А, Викстром Э, Зарытова В Ф Направленное расщепление РНК в несовершенном комплементарном комплексе конъюгатами блеомицина А5 с олигонуклеотидом // Известия Академии Наук Серия химическая 2002 № 7 С 1097-1099

6 Vorobjev Р Е, Zarytova V F Bleomycin-ohgonucleotide conjugates as site-specific nucleases // Artificial nucleases / Ed M A Zenkova Berlin, Heidelberg Springer 2004 P 269-287

7 Vorobjev P E, Smith J В, Pyshnaya I A, Levina A S , Zarytova V F, Wickstrom E Site-Specific Cleavage of RNA and DNA by complementary DNA-bleomycin A conjugates // Bioconjugate Chem 2003 V 14 №6 P 1307-1313

8 Vorobjev P, Tchaika О, Zarytova V Efficient cleavage of dsDNA by bleomycin conjugated via hexaethylene glycol linker to triplex-forming oligonucleotides // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2004 V 23 №6-7 P 1051-1055

Подписано к печати «24 » марта 2005 г Формат бумаги 60x84 16 Объем 2 печ. л. Тираж 100 экз. Заказ № 1413 Отпечатано «Документ Сервис», 630090 г. Новосибирск ул. Институтская 41 тел. 356-600

О¿00

ч I

>

И ДПР 2ÖÖ5 ?

Список сокращений.

1. Введение.

2. Взаимодействие блеомицина и его олигонуклеотидных производных с нуклеиновыми кислотами (обзор литературы).

2.1. Общая характеристика блеомицинов.

2.2. Структура блеомицинов.

2.3. Активация комплексов блеомицина с ионами железа.

2.4. Связывание блеомицина с нуклеиновыми кислотами.

2.5. Специфичность расщепления нуклеиновых кислот блеомицином.

2.6. Эффективность расщепления РНК блеомицином.

2.6.1. Сравнение эффективности расщепления различных РНК.

2.6.2. Зависимость эффективности расщепления от концентрации ионов магния.

2.7. Продукты расщепления нуклеиновых кислот блеомицином.

2.8. Свойства конъюгатов блеомицина с олигонуклеотидами.

2.8.1. Синтез конъюгатов блеомицина с олигонуклеотидами.

2.8.2. Стабилизация комплементарных комплексов конъюгат-мишень остатком блеомицина.

2.8.3. Сайт-специфическое расщепление одноцепочечных ДНК.

2.8.4. Каталитическое расщепление одноцепочечной ДНК олигонуклеотидным конъюгатом блеомицина.

2.8.5. Расщепление двуцепочечной ДНК в составе триплекса.

3. Расщепление нуклеиновых кислот блеомициновыми производными олигонуклеотидов (Результаты и обсуждение).

3.1. Синтез блеомициновых производных олигонуклеотидов.

3.1.1. Синтез стандартных конъюгатов.

3.1.2. Синтез линкерсодержащих конъюгатов блеомицина с олигонуклеотидами.

3.2. Расщепление одноцепочечных ДНК конъюгатами блеомицина с олигонуклеотидами

3.2.1. Расщепление одноцепочечных ДНК конъюгатами блеомицина с протяженной олигонуклеотидной частью.;.

3.2.2. Расщепление ДНК конъюгатами блеомицина с короткими олигонуклеотидами в присутствии олигонуклеотидных эффекторов.

3.2.2.1. Факторы, определяющие эффективность расщепления одноцепочечных ДНК конъюгатами блеомицина с короткими олигонуклеотидами в составе тандемных комплексов.

3.2.3. Влияние гидрофобных и гетероциклических группировок в составе конъюгата и эффекторов на эффективность расщепления одноцепочечной ДНК конъюгатами блеомицина с короткими олигонуклеотидами в составе тандемных комплексов.

3.3. Субстратные свойства гибридных дуплексов, образованных с участием тандемов производных коротких олигонуклеотидов по отношению к рибонуклеазе Н Е. coli.

3.3.1. Гидролиз РНК рибонуклеазой Н Е. coli в составе гибридного дуплекса, образованного с участием немодифицированного тандема коротких олигодезоксирибонуклеотидов

3.3.2. Субстратные свойства тандемных гибридных дуплексов, содержащих конъюгаты блеомицина с короткими олигонуклеотидами, по отношению к рибонуклеазе Н Е. coli.

3.4. Расщепление РНК конъюгатами блеомицина с олигодезоксирибонуклеотидами.

3.5. Расщепление двуцепочечной ДНК конъюгатами блеомицина с триплекс-формирующими олигонуклеотидами (ТФО).

Реакционноспособные производные олигонуклеотидов (РПО) широко применяются в исследовательской практике для изучения структуры и функций важнейших биополимеров - белков и нуклеиновых кислот. Направленная модификация нуклеиновых кислот при помощи РПО является одним из основных подходов к решению целого ряда задач. В их числе - исследование нуклеиново-белковых взаимодействий, манипулирование генетическим материалом, регуляция экспрессии гена, генная конверсия. К настоящему времени создан широкий спектр РПО, включающий олигонуклеотиды, несущие различные алкилирующие группы, фотоактивные остатки, металлокомплексы. Среди последних наибольший интерес представляют металлокомплексы, принимающие участие в циклических процессах окисления -восстановления. К числу таких группировок принадлежит остаток гликопептидного антибиотика блеомицина, обладающий рядом уникальных свойств. Наиболее важными из них являются:

- способность вызывать прямое (наблюдаемое без дополнительных обработок) расщепление ДНК и РНК;

- высокая селективность окисления дезоксирибозы и рибозы (гетероциклические основания практически не модифицируются);

- относительно низкая токсичность, позволяющая применять антибиотик как противоопухолевое средство в терапевтической практике.

В ЛХНК НИБХ СО РАН впервые были созданы блеомициновые производные олигонуклеотидов. Был разработан способ конъюгирования блеомицина А5 и олигонуклеотидов с сохранением способности олигонуклеотидов образовывать комплементарные комплексы, а остатка блеомицина - осуществлять селективное расщепление ДНК. Первые исследования показали, что конъюгаты блеомицина с олигонуклеотидами обладают рядом уникальных свойств. Они могут эффективно расщеплять одноцепочечные ДНК в составе комплементарных дуплексов. В зависимости от условий одна молекула конъюгата может повреждать до трех молекул ДНК или наносить несколько повреждений одной молекуле мишени. Кроме того, было выявлено, что остаток блеомицина в составе олиготимидилата способен осуществлять прямые разрывы двуцепочечных ДНК в триплексах. До сих пор неизвестны другие конъюгаты олигонуклеотидов, обладающие столь уникальными свойствами. Полученные результаты безусловно свидетельствовали о том, что конъюгаты блеомицина с олигонуклеотидами являются одними из наиболее перспективных реакционноспособных производных олигонуклеотидов. Такие конъюгаты могут найти применение в антисенс- и антигенном подходах к регуляции экспрессии гена, для генной конверсии, а также могут быть использованы в молекулярно-биологических исследованиях в качестве эффективных искусственных нуклеаз с уникальной специфичностью. Низкая токсичность блеомицина позволяет также надеяться на возможность использования его конъюгатов с олигонуклеотидами в качестве терапевтических средств.

В данной работе исследовано взаимодействие блеомициновых производных олигонуклеотидов в составе тандемных комплексов с одноцепочечной ДНК, в составе триплексов с двуцепочечной ДНК и впервые показана возможность расщепления РНК конъюгатами блеомицина с олигодезоксирибонуклеотидами. Также в работе показано, что остаток блеомицина не препятствует гидролизу РНК РНКазой Н Е.соИ в составе гибридных дуплексов.

Научная новизна и практическая ценность

В настоящей работе впервые исследовано расщепление фрагментов ДНК конъюгатами блеомицина с олигонуклеотидами в тандемных комплексах с олигонуклеотидными эффекторами. Показано, что в тандемных комплексах одна молекула конъюгата блеомицина с тетрануклеотидом может расщепить свыше 6 молекул ДНК-мишени. Обнаружено, что максимальную эффективность проявляют конъюгаты с коротким олигонуклеотидным адресом (4-5 нуклеотидов), повреждающие ДНК-мишень в сайте связывания конъюгата.

Впервые показана возможность расщепления РНК (30-звенного фрагмента) конъюгатами блеомицина с олигодезоксирибонуклеотидами.

Разработан метод синтеза новых конъюгатов блеомицина с олигонуклеотидами, содержащих линкеры на основе гексаэтиленгликольфосфата. Показано, что такие конъюгаты более эффективно расщепляют двуцепочечные ДНК в составе триплексов. Также показано, что использование линкерсодержащих конъюгатов позволяет существенно повысить эффективность направленного расщепления РНК за счет формирования в цепи РНК однонуклеотидных петель, являющихся сайтами предпочтительного связывания остатка блеомицина, и его доставки к таким сайтам при помощи линкера оптимальной длины.

Выявлено, что субстратные свойства блеомициновых производных коротких олигонуклеотидов в составе тандемных гибридных дуплексов по отношению к рибонуклеазе Н Е.соИ близки к таковым для протяженных олигонуклеотидов. Результаты этого исследования позволяют рассчитывать на успешное применение разработанных конъюгатов в качестве искусственных нуклеаз, а также эффективных ген-направленных соединений.

Публикации и апробация работы

По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.

5. Выводы:

1. Созданы и исследованы тандемные системы, содержащие конъюгаты коротких олигонуклеотидов с блеомицином As и олигонуклеотидные эффекторы.

Показано, что независимо от длины и последовательности олигонуклеотидного адреса, все исследованные конъюгаты в составе тандемных комплексов сайт-специфически взаимодействуют с комплементарными ДНК-мишенями, многократно вызывая расщепление мишени в области связывания конъюгата. Наибольшую эффективность (деструкция более 6 молекул ДНК-мишени одной молекулой конъюгата в составе тандема) проявляют конъюгаты блеомицина с тетрануклеотидами, расщепляющие ДНК-мишень в собственном сайте связывания. Установлено, что ключевыми факторами, определяющими эффективность таких конъюгатов в составе тандемов являются, с одной стороны, высокая степень ассоциации комплекса конъюгагДНК-мишень, обеспечиваемая эффекторами, и, с другой стороны, быстрая диссоциация реагента из комплекса с поврежденной ДНК мишенью.

2. Синтезированы конъюгаты нового типа, в которых остаток блеомицина As присоединен к олигонуклеотиду через линкер, состоящий из остатков гексаэтиленгликольфосфата (от одного до четырех остатков). Показано, что линкерсодержащие конъюгаты блеомицина с гексадекатимидилатом более эффективно расщепляют обе цепи ДНК в составе триплекса по сравнению со стандартными конъюгатами.

3. Впервые продемонстрировано, что конъюгаты блеомицина с олигодезоксирибонуклеотидами способны вызывать сайт-специфическое расщепление фрагмента РНК.

Показано, что эффективность расщепления РНК линкерсодержащими конъюгатами может быть существенно (до 3 раз) повышена за счет формирования олигонуклеотидной частью конъюгата в цепи РНК однонуклеотидных петель, являющихся сайтами предпочтительного связывания остатка блеомицина.

4. Исследовано расщепление РНК рибонуклеазой Н Е. coli в непрерывных и тандемных гибридных дуплексах с олигонуклеотидами, несущими на 5'-концевой фосфатной группе остаток блеомицина. Показано, что наличие остатка блеомицина не препятствует гидролизу РНК мишени рибонуклеазой Н в тандемных комплексах, и снижает его скорость в 3-4 раза в случае непрерывных комплексов.

3.6. Заключение

Результаты данного исследования позволяют заключить, что конъюгаты блеомицина с олигопуклеотидами способны эффективно расщеплять ДНК (как а дуплексах так и в триплексах) и РНК в гибридных дуплексах. Таким образом, конъюгаты блеомицина с олигонуклеотидами могут быть использованы в качестве искусственных нуклеаз РНК и ДНК, а также могут рассматриваться в качестве потенциальных антисенс-агентов для подавления экспрессии патогенных ДНК и в качестве индукторов гомологичной рекомбинации для конверсии мутантных генов.

4. Экспериментальная часть.

4.1. Исходные материалы.

В работе были использованы следующие реактивы и растворители: трифенилфосфин, 2,2'-дипиридилдисульфид, Ы,Ы,Ы\Ы'-этилендиаминтетрауксусная кислота, цетилтриметиламмония бромид, ^^К'^'-тетраметилэтилендиамин, гидразин-гидрат (Fluka AG, Швейцария), 2-меркаптоэтанол, трис(оксиметил)аминометан (Merck), аденозин-5'-трифосфат, акриламид, ^М-метиленбисакриламид, Stains-all (Acros Organics, США), карбамид, аммония персульфат, 4-Ы,М-диметиламинопиридин-1-оксид (Frinton Laboratories, США), железа(П)-аммония сульфата гексагидрат (х.ч.), ацетон (о.с.ч.), ацетонитрил (о.с.ч.), полинуклеотидкиназа фага Т4 (КФ 2.7.1.78) (Сибэнзим, Россия), рибонуклеаза Н Е. coli (КФ 3.1.26.4) (Promega, США).

Олигодезоксирибонуклеотиды (в т.ч. и линкерсодержащие) были синтезированы твердофазным фосфитамидным методом на автоматических синтезаторах Виктория 8М (Россия) и ASM700 (Биоссет, Россия) и любезно предоставлены А.С. Левиной, Д.В. Пышным и И.А. Пышной (ИХБФМ СО РАН). Эстрон- и холестеринсодержащие тетрануклеотиды а также дифеназиниевые производные октануклеотидов были синтезированы модифицированным триэфирным методом [130] и любезно предоставлены И.А. Пышной (ИХБФМ СО РАН). Эйкозарибонуклеотид UGCCUGGAGCUGCUUGAUGC синтезирован по методу [131] и любезно предоставлен А.Г.Веньяминовой и М.Н.Репковой (ИХБФМ СО РАН).

Гидрохлорид блеомицина А5 (95% основного вещества) производства опытного завода Института органического синтеза (Латвия).

4.2. Основные методы работы

Выделение нуклеотидного материала из водных растворов проводили при помощи осаждения 10-кратным объемным избытком 2% раствора L1CIO4 в ацетоне. Осадок отделяли центрифугированием на микроцентрифугах D 5414 или Minispin Plus (Eppendorf, ФРГ) при 14 ООО об/мин. После удаления супернатанта осадок промывали ацетоном, ацетон удаляли высушиванием в вакуум-эксикаторе при остаточном давлении 15-20 мм. рт. ст.

Для концентрирования водных растворов использовали ротационные испарители RE-120 и R-200 (Biichi, Швейцария) а также концентратор 5301 (Eppendorf, ФРГ). Концентрирование проводили при температуре не выше 45 °С.

4.2.1. Хроматографические методы

Обращенно-фазовая ВЭЖХ проводилась на хроматографе Waters 600Е на колонках 4x250мм.

Синтезированные олигонуклеотиды, содержащие диметокситритильную защитную группу, после удаления прочих защитных групп и полимерного носителя выделяли обращенно-фазовой хроматографией на носителе LiChroprep RP-18 (5-20 мкм) (Merck, ФРГ) в градиенте ацетонитрила 0-30% в 0.05 М LiC104. Диметокситритильную защитную группу удаляли обработкой 80% уксусной кислотой в течение 5 мин.

Олигонуклеотиды, содержащие концевую фосфатную группу, после деблокирования выделяли ионообменной хроматографией на сорбенте Полисил СА [132] в градиенте КН2РО4 0-0.3 М в 30% ацетонитриле.

Олигонуклеотиды после удаления диметокситритильной группы либо после ионообменной хроматографии дополнительно очищали обращенно-фазовой хроматографией на носителе LiChroprep RP-18 (5-20 мкм) (Merck, ФРГ) в градиенте ацетонитрила 0-20% в 0.05 М L1CIO4.

Медьсодержащий комплекс блеомицина выделяли обращенно-фазовой хроматографией на носителе LiChroprep RP-18 (5-20 мкм) (Merck, ФРГ) в градиенте ацетонитрила 0-40% в 0.05 М LiC104.

Конъюгаты блеомицина с олигонуклеотидами выделяли ионообменной хроматографией на колонке Resource Q, 1 ml (Amersham Pharmacia Biotech AB, Швеция) в градиенте LiC104 0-0.5 M в 0.01 М LiOH, затем обращенно-фазовой хроматографией на сорбенте PRP-1 (10 мкм) (Hamilton, США) в градиенте ацетонитрила 0-30% в 0.05 М LiC104.

4.2.2. Электрофорез

Все электрофоретические разделения проводили в 20%-ном денатурирующем полиакриламидном геле в присутствии 8М мочевины, 0.89 М Трис-НзВОз рН 8.3, 0.001 М о

ЭДТА при напряженности электрического поля 40-60 В/см и температуре 30-40 С.

Для анализа гомогенности олигонуклеотидов и конъюгатов использовали гель толщиной 0.4 мм. По окончании разделения гели окрашивали 0.1 % раствором Stains-all в 50% водном формамиде.

Препаративную очистку олигонуклеотидов и конъюгатов проводили при толщине геля 1-1.5 мм. По окончании разделения для визуализации гель помещали под ультрахемископ. В качестве фона использовали пластину с флуорофором для тонкослойной хроматографии Kieselgel 60 F254 (Merck, ФРГ). Полосы геля, содержащие олигонуклеотиды, вырезали и трижды элюировали 1М раствором LÍCIO4. Фракции, полученные после элюции объединяли и очищали от солей флэш-хроматографией на сорбенте RP-18 (Waters, США). Олигонуклеотиды с сорбента элюировали 50% ацетонитрилом.

Разделение продуктов деструкции радиоактивно меченых олигонуклеотидов-мишеней проводили в 20 %-ном денатурирующем полиакриламидном геле толщиной 0.4 мм. По окончании реакции нуклеотидный материал осаждали, прибавляли 50 мкл 0.1 М раствора 1-бутиламина и инкубировали при 90 °С в течение 8 мин. По окончании обработки нуклеотидный материал вновь осаждали, используя в качестве носителя полиуридиловую кислоту (1мкл раствора, содержащего 0.1 мг в 1мл). Полученный осадок растворяли в 2-5 мкл 8 М раствора мочевины, содержащего 0.02% бромфенолового синего и ксиленцанола FF, и наносили на полиакриламидный гель. По окончании разделения гели высушивали на установке FB GD 45 (Fisher Biotech, США).

Гели радиоавтографировали на пленку CP-BU NIF 100 (AGFA, Бельгия). Интенсивность сигналов на радиоавтографах оценивали с помощью программного пакета GelPro (Media Cybernetics, США) после предварительной калибровки по жидкостному сцинтилляционному счетчику Rackbeta (Wallac LKB, Finland) в воде по Черенкову. Относительная погрешность определения во всех опытах не превышала 20%. За степень расщепления принимали отношение интенсивности определяемой полосы к суммарной интенсивности всех полос в дорожке.

4.2.3. Спектрофотометрия

Электронные спектры поглощения регистрировали при помощи спектрофотометра UV-2100 (Shimadzu, Япония) в буферном растворе 0.2 LiCl, 0.01 М трис-HCI pH 7.5 при комнатной температуре.

Концентрации олигонуклеотидов и их производных определяли спектрофотометрически в буферном растворе 0.2 LiCl, 0.01 М трис-HCI pH 7.5 при комнатной температуре с использованием УФ-детектора жидкостного хроматографа «Милихром» (Россия). Молярные коэффициенты поглощения при длине волны 260 нм (в2бо) для олигонуклеотидов были рассчитаны по методу [133].

Молярные коэффициенты поглощения для блеомициновых производных олигонуклеотидов полагали равными сумме в2бо соответствующего олигонуклеотида и остатка антибиотика. Коэффициент экстинкции медьсодержащего остатка антибиотика считали равным 16000 М^см'1 [39].

Эксперименты по термической денатурации были выполнены Д.В.Пышным (ИХБФМ СО РАН). Термическую денатурацию ДНК-дуплексов исследовали в растворе, содержащем 0.1 М ЫаС1, 0.01 М какодилат натрия рН 7.4, при концентрации каждого олигонуклеотидного компонента 1.3'10"5М. Термическую денатурацию гибридных дуплексов исследовали в растворе, содержащем 0.05 М КС1, 0.01 М какодилат натрия рН 7.4, 0.01 М М§СЬ, при концентрации каждого олигонуклеотидного компонента 1.3-10"5 М. Перед плавлением буферные растворы, содержащие комплементарные олигонуклеотиды в эквимолярных количествах, нагревали до 80-90 °С и медленно охлаждали до 4-5 °С. Кривые оптического плавления регистрировались на установке с терморегулируемой оптической кюветой на базе УФ-детектора жидкостного хроматографа "Милихром" (Россия) с одновременной детекцией на длинах волн 260, 270, 280, 300, и 320 нм. Скорость нагрева образцов не превышала 0.7-1 °С/мин. Кривые нагревания всех исследованных образцов совпадали с кривыми охлаждения.

4.3. Методики эксперимента.

Получение медьсодержащего комплекса блеомицина А5 (Си(П)В1ш).

15.5 мг (10 мкмоль) гидрохлорида блеомицина А5 растворяли в 1 мл бидистиллированной воды и добавляли 150 мкл 0.1 М раствора Си504 (15 мкмоль). Образование медьсодержащего комплекса блеомицина А5 сопровождается появлением интенсивной синей окраски раствора. Полученный комплекс выделяли обращено-фазовой ВЭЖХ, концентрировали и осаждали 10-кратным объемным избытком ацетона. Выход 14.5 мг(90%).

Получение цетилтриметиламмонийных солей олигонуклеотидов.

0.1 мкмоль олигонуклеотида растворяли в 40 мкл бидистиллированной воды и добавляли по 2 мкл 8% раствора цетилтриметиламмоний бромида до прекращения выпадения осадка (-10 мкл раствора). Осадок отделяли центрифугированием, супернатант отбирали, осадок промывали диэтиловым эфиром и сушили в вакуум-эксикаторе при остаточном давлении 5 мм. рт. ст. в течение 1 ч.

Синтез коньюгатов блеомицина с олигонуклеотидами (в т. ч. эстронсодержащих и линкерсодержащих)

0.1 мкмоль цетилтриметиламмонийной соли олигонуклеотида растворяли в 40 мкл абсолютного ДМСО, добавляли 3,5 мг (13.5 мкмоль) трифенилфосфина, 3 мг (13.5 мкмоль) дипиридилдисульфида и 5 мкл 0.1 М раствора DMAPO в абсолютном ДМСО. После 20 мин инкубации промежуточное цвиттер-ионное производное олигонуклеотида отделяли от остальной реакционной смеси осаждением. К высушенному осадку добавляли 1.5 мг (1 мкмоль) медьсодержащего комплекса блеомицина As в 40 мкл 0.2 М раствора NaHC03 рН 8.5. Реакционную смесь инкубировали в течение 6 часов. Продукт выделяли ионообменной и обращенно-фазовой ВЭЖХ. Выход 55-70 %.

Полученные стандартные конъюгаты (в т.ч. эстронсодержащие) идентифицировали по хроматографической и электрофоретической подвижности а также по соотношению интенсивностей полос с >.Мах=260 и 310 нм в УФ-спектрах конъюгатов.

Линкерсодержащие конъюгаты идентифицировали методом MALDI масс-спектрометрии. Экспериментально полученные значения массы практически совпадают с расчетными: для Ni6(pL)2pBlm - 6982.6/6985.8, для Ni6(pL)3pBlm - 7330.7/7330.1 и для N,6(pL)4pBlin - 7688.0/7674.4.

Введение радиоактивной метки в РНК- и ДНК-мишени проводили с использованием полинуклеотидкиназы фага Т4 (5 ед.акт.), 0.1 mCi [у-32Р] АТР в буферном растворе, содержащем 50 мМ трис-HCl (рН 7.6), ЮмМ MgCb, 0.1 мМ спермидин, 0.1 мМ EDTA, 5мМ дитиотреит (общий объем 15 мкл). Меченую РНК-мишень выделяли при помощи электрофореза в 20%-ном ПААГ, элюировали из геля буферным раствором, содержащим 0.25 М CH3COONH4, 0.5 мМ EDTA, 0.1% додецилсульфата натрия. Окончательно продукт выделяли при помощи флэш-хроматографии на сорбенте Preparative С18 125А (55-105 мкм) (Waters, США).

Расщепление одноцепочечных ДНК- и РНК-мишеней коньюгатами блеомицина с протяженными олигонуклеотидами.

Реакционные смеси объемом 10 мкл содержали 5'-32Р-меченую мишень и конъюгат блеомицина с олигонуклеотидом (концентрации мишени и конъюгата указаны в каждом конкретном случае), 0.2 М LiCI, 0.01 М трис-HCl рН 7.5. Реакцию инициировали одновременным добавлением 1 мкл 0.5 М 2-меркаптоэтанола и 1 мкл раствора М0"3М Fe(NH4)2(S04)2, приготовленного в насыщенной аргоном бидистиллированной воде.

Реакционные смеси инкубировали при температуре 20 °С в течение 4 ч (при эквивалентном соотношении концентраций конъюгата и мишени и при избытке конъюгата) либо в течение 16 ч (при избытке мишени по отношению к конъюгату).

Расщепление одноцепочечных ДНК-мишеней конъюгатами блеомицина с короткими олигонуклеотидами в присутствии эффекторов

Реакционные смеси объемом 10 мкл содержали 5'-32Р-меченую мишень, конъюгат блеомицина с олигонуклеотидом а также олигонуклеотиды - эффекторы (концентрации мишени, конъюгата и эффекторов указаны в каждом конкретном случае). Реакцию проводили в буферном растворе 0.2 М LiCl, 0.01 М трис-HCI pH 7.5. Реакцию инициировали одновременным добавлением раствора 2-меркаптоэтанола до концентрации 0.05 М и раствора Fe(NH4)2(SC>4)2 до концентрации МО"4 М, приготовленного в насыщенной аргоном бидистиллированной воде. Реакционные смеси инкубировали при температуре 20 - 45 °С в течение 2-18 ч. в зависимости от температуры проведения реакции и соотношения концентраций конъюгата и мишени.

Расщепление двуцепочечной ДНК-мишени конъюгатами блеомицина с триплекс-формирукнцими олигонуклеотидами

Триплексы преформировали при 4 °С в течение 18 часов в 30 мкл раствора 1 М LiCl, 0.1 М трис-HCI pH 7.5, 10 мМ MgCb. Концентрация каждой из цепей ДНК-мишени составляла ЗМО^М, конъюгатов 1.5'10"5М. Реакцию инициировали одновременным добавлением 1 мкл 0.5 М 2-меркаптоэтанола и 1 мкл раствора Н03М Fe(NH4)2(S04)2, приготовленного в насыщенной аргоном бидистиллированной воде. Реакционные смеси инкубировали при 20 °С в течение 4 ч.

Гидролиз рибонуклеазой Н Е. coli проводили в растворе, содержащем 20 мМ HEPES (pH 8.0), 50 мМ KCl, ЮмМ MgCl2 и 1 мМ дитиотреит. Концентрация РНК-мишени во всех экспериментах составляла 1-10'7М, олигодезоксирибонуклеотидов -2'10"бМ. Реакционные смеси (10 мкл) инкубировали при 20 °С в течение 15 мин, затем добавляли 0.15 ед.акт. рибонуклеазы Н. Через необходимое время добавляли 1 мкл раствора полиуридиловой кислоты (0.1 мг/мл) и осаждали олигонуклеотиды 2% раствором перхлората лития в ацетоне.

Начальную скорость гидролиза Vo определяли по начальным участкам кинетических кривых (0-5 мин).

1. Umezawa Н., Maeda К., Takeuchi Т., Okami Y. New antibiotics, bleomycin A and В.// J. Antibiot. (Tokyo). 1966. V. 19, № 5, P. 200-209.

2. Lazo J.S., Chabner B.A. Bleomycin.// Cancer Chemotherapy and Biotherapy: Principles and Practice./ Eds. B.A. Chabner and D.L. Longo Philadelphia, PA: Lippincott-Raven, 1996. P. 379.

3. Bennett J.M., Reich S.D. Bleomycin.// Ann. Intern. Med. 1979. V. 90, № 6, P. 945-948.

4. Carlson R.W., Sikic B.I., Turbow M.M., Ballon S.C. Combination cisplatin, vinblastine, and bleomycin chemotherapy (PVB) for malignant germ-cell tumors of the ovary.//J. Clin. Oncol. 1983. V. 1, № 10, P. 645-651.

5. Nagai K., Yamaki H., Suzuki H., Tanaka N., Umezawa H. The combined effects of bleomycin and sulfhydryl compounds on the thermal denaturation of DNA.// Biochim. Biophys. Acta. 1969. V. 179, № 1, P. 165-171.

6. Stubbe J., Kozarich J.W., Wu W., Vanderwall D.E. Bleomycins: A structural model for specificity, binding, and double strand cleavage.//Acc. С hem. Res. 1996. V. 29, №7, P. 322-330.

7. Petering D.H., Mao Q., Li W., DeRose E„ Antholine W.E. Metallobleomycin-DNA interactions: structures and reactions related to bleomycin-induced DNA damage.//Met. Ions. Biol. Syst. 1996. V. 33, №, P. 619-648.

8. Stubbe J., Kozarich J.W. Mechanisms of bleomycin-induced DNA degradation.// Chem. Rev. 1987. V. 87, № 5, P. 1107-1136.

9. D'Andrea A.D., Haseltine W.A. Sequence specific cleavage of DNA by the antitumor antibiotics neocarzinostatin and bleomycin.// Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1978. V. 75, № 8, P. 3608-3612.

10. Takeshita M., Grollman A.P., Ohtsubo E., Ohtsubo H. Interaction of bleomycin with DNA.// Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 1978. V. 75, № 12, P. 5983-5987.

11. Mirabelli C.K., Huang C.H., Crooke S.T. Role of deoxyribonucleic acid topology in altering the site/sequence specificity of cleavage of deoxyribonucleic acid by bleomycin and talisomycin.// Biochemistry. 1983. V. 22, № 2, P. 300-306.

12. Barranco S.C., Humphrey R.M. The effects of bleomycin on survival and cell progression in Chinese hamster cells in vitro.// Cancer Res. 1971. V. 31, № 9, P. 1218-1223.

13. Hittelman W.N., Rao P.N. Bleomycin-induced damage in prematurely condensed chromosomes and its relationship to cell cycle progression in CHO cells.// Cancer Res. 1974. V. 34, № 12, P. 3433-3439.

14. Barlogie B., Drewinko B., Schumann J., Freireich E.J. Pulse cytophotometric analysis of cell cycle perturbation with bleomycin in vitro.// Cancer Res. 1976. V. 36, №3, P. 1182-1187.

15. Berry D.E., Chang L.H., Hecht S.M. DNA damage and growth inhibition in cultured human cells by bleomycin congeners.// Biochemistry. 1985. V. 24, № 13, P. 3207-3214.

16. Suzuki H., Nagai K., Yamaki H., Tanaka N., Umezawa H. Mechanism of action of bleomycin. Studies with the growing culture of bacterial and tumor cells.// J. Antibiot. (Tokyo). 1968. V. 21, № 6, P. 379-386.

17. Muller W.E., Yamazaki Z., Breter H.J., Zahn R.K. Action of bleomycin on DNA and RNA.// Eur. J. Biochem. 1972. V. 31, № 3, P. 518-525.

18. Haidle C.W., Bearden J., Jr. Effect of bleomycin on an RNA-DNA hybrid.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1975. V. 65, № 3, P. 815-821.

19. Krishnamoorthy C.R., Vanderwall D.E., J.W. K. Degradation of DNA-RNA hybrids by bleomycin: Evidence for DNA strand specificity and for possible structural modulation of chemical mechanism.//J. Am. Chem. Soc. 1988. V. 110, № 6, P. 2008-2009.

20. Murray V., Martin R.F. The sequence specificity of bleomycin-induced DNA damage in intact cells.//J. Biol. Chem. 1985. V. 260, №19, P. 10389-10391.

21. Moore C.W. Bleomycin-induced mutation and recombination in Saccharomyces cerevisiae.//Mutat. Res. 1978. V. 58, № 1, P. 41-49.

22. Umezawa K., Haresaku M., Muramatsu M., Matsushima T. Mutagenicity of anthracycline glycosides and bleomycins in Salmonella assay system.// Biomed. Pharmacoter. 1987. V. 41, № 5, P. 214-218.

23. Povirk L.F., Goldberg I.H. A role of oxidative DNA sugar damage in mutagenesis by neocarzinostatin and bleomycin.// Biochimie. 1987. V. 69, № 8, P. 815-823.

24. Povirk L.F. DNA damage and mutagenesis by radiomimetic DNA-cleaving

25. V agents: bleomycin, neocarzinostatin and other enediynes.// Mutat. Res. 1996. V.355, № 1-2, P. 71-89.

26. Onishi T., Shimada K., Takagi Y. Effects of bleomycin on Escherichia coli strains with various sensitivities to radiations.// Biochim. Biophys. Acta. 1973. V. 312, № 2, P. 248-258.

27. Levin J.D., Demple B. In vitro detection of endonuclease IV-specific DNAdamage formed by bleomycin in vivo.// Nucleic Acids Res. 1996. V. 24, № 5, P.885.889.

28. Kikuchi H., Tetsuka T. On the mechanism of lipoxygenase-like action of bleomycin-iron complexes.//J. Antibiot. (Tokyo). 1992. V. 45, № 4, P. 548-555.

29. Lim S.T., Jue CX, Moore C.W., Lipke P.N. Oxidative cell wall damage mediated by bleomycin-Fe(ll) in Saccharomyces cerevisiae.//J. Bacteriol. 1995. V. 177, № 12, P. 3534-3539.

30. Magliozzo R.S., Peisach J., Ciriolo M.R. Transfer RNA is cleaved by activated bleomycin.//Mol. Pharmacol. 1989. V. 35, № 4, P. 428-432.

31. Carter B.J., Reddy K.S., Hecht S.M. Polynucleotide recognition and strand scission by Fe-bleomycin.// Tetrahedron. 1991. V. 47, № 14-15, P. 2463-2474.

32. Holmes C.E., Hecht S.M. Fe.bleomycin cleaves a transfer RNA precursor and its "transfer DNA" analog at the same major site.// J. Biol. Chem. 1993. V. 268, № 34, P. 25909-25913.

33. Holmes C.E., Carter B.J., Hecht S.M. Characterization of iron (ll)bleomycin-mediated RNA strand scission.// Biochemistry. 1993. V. 32, № 16, P. 4293-4307.

34. Abraham A.T., Lin J.J., Newton D.L., Rybak S„ Hecht S.M. RNA cleavage and inhibition of protein synthesis by bleomycin.// Chem. Biol. 2003. V. 10, № 1, P. 45-52.

35. Padbury G., Sligar S.S. Chemical reactivities of bleomycin.// J. Biol. Chem. 1985. V. 260, № 13, P. 7820-7823.

36. Murugesan N., Hecht S.M. Bleomycin as an oxene transferase. Catalytic oxygen transfer to olefins.// J. Am. Chem. Soc. 1985. V. 107, № 2, P. 493-500.

37. Takita T., Muraoka Y., Nakatani T., Fujii A., Umezawa Y., Naganawa H. Chemistry of bleomycin. XIX Revised structures of bleomycin and phleomycin.// J. Antibiot. (Tokyo). 1978. V. 31, № 8, P. 801-804.

38. Umezawa H. Structure and action of bleomycin.// Prog. Biochem. Pharmacol. 1976. V. 11, №, P. 18-27.

39. Sugiura Y., Ishizu K., Miyoshi K. Studies of metallobleomycins by electronic spectroscopy, electron spin resonance spectroscopy, and potentiometric titration.// J. Antibiot. (Tokyo). 1979. V. 32, № 5, P. 453-461.

40. Petering D.H., Byrnes R.W., Antholine W.E. The role of redox-active metals in the mechanism of action of bleomycin.// Chem. Biol. Interact. 1990. V. 73, № 2-3, P. 133-182.

41. Claussen C.A., Long E.C. Nucleic Acid recognition by metal complexes of bleomycin.//Chem. Rev. 1999. V. 99, № 9, P. 2797-2816.

42. Dabrowiak J.C., Greenaway F.T., Longo W.E., Van Husen M., Crooke S.T. A spectroscopic investigation of the metal binding site of bleomycin A2. The Cu(ll) and Zn(ll) derivatives.// Biochim. Biophys. Acta. 1978. V. 517, № 2, P. 517-526.

43. Rishel M.J., Thomas C.J., Tao Z.F., Vialas C., Leitheiser C.J., Hecht S.M. Conformationally constrained analogues of bleomycin A5.// J. Am. Chem. Soc. 2003. V. 125, № 34, P. 10194-10205.

44. Sausville E.A., Peisach J., Horwitz S.B. A role for ferrous ion and oxygen in the degradation of DNA by bleomycin.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976. V. 73, № 3, P. 814-822.

45. Sausville E.A., Stein R.W., Peisach J., Horwitz S.B. Properties and products of the degradation of DNA by bleomycin and iron(ll).// Biochemistry. 1978. V. 17, № 14, P. 2746-2754.

46. Ishida R., Takahashi T. Increased DNA chain breakage by combined action of bleomycin and superoxide radical.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1975. V. 66, № 4, P. 1432-1438.

47. Lown J.W., Sim S.K. The mechanism of the bleomycin-induced cleavage of DNA.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1977. V. 77, № 4, P. 1150-1157.

48. Burger R.M., Horwitz S.B., Peisach J., Wittenberg J.B. Oxygenated iron bleomycin. A short-lived intermediate in the reaction of ferrous bleomycin with O2.// J. Biol. Chem. 1979. V. 254, № 24, P. 12999-12302.

49. Kuramochi H., Takahashi K., Takita T., Umezawa H. An active intermediate formed in the reaction of bleomycin-Fe(ll) complex with oxygen.// J. Antibiot. (Tokyo). 1981. V. 34, № 5, P. 576-582.

50. Burger R.M., Peisach J., Horwitz S.B. Activated bleomycin. A transient complex of drug, iron, and oxygen that degrades DNA.//J. Biol. Chem. 1981. V. 256,22, P. 11636-11644.

51. Albertini J.P., Garnier-Suillerot A., Tosi L. Iron . bleomycin . DNA system evidence of a long-lived bleomycin . iron . oxygen intermediate.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1982. V. 104, № 2, P. 557-563.

52. Burger R.M., Peisach J., Blumberg W.E., Horwitz S.B. Iron-bleomycin interactions with oxygen and oxygen analogues. Effects on spectra and drug activity.//J. Biol. Chem. 1979. V. 254, № 21, P. 10906-10912.

53. Burger R.M. Cleavage of Nucleic Acids by Bleomycin.// Chem. Rev. 1998. V. 98, №3, P. 1153-1170.

54. Sugiura Y., Suzuki T., Kuwahara J., Tanaka H. On the mechanism of hydrogen peroxide-, superoxide-, and ultraviolet light-induced DNA cleavages of inactive bleomycin-iron (III) complex.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1982. V. 105, №4, P. 1511-1518.

55. Burger R.M., Peisach J., Horwitz S.B. Activated bleomycin. A transient complex of drug, iron, and oxygen that degrades DNA.//J. Biol. Chem. 1981. V. 256,22, P. 11636-11644.

56. Bukowski M.R., Zhu S., Koehntop K.D., Brennessel W.W., Que L., Jr. Characterization of an Fe lll-OOH species and its decomposition product in a bleomycin model system.//J. Biol. Inorg. Chem. 2004. V. 9, № 1, P. 39-48.

57. Povirk L.F., Hogan M., Dattagupta N. Binding of bleomycin to DNA: intercalation of the bithiazole rings.// Biochemistry. 1979. V. 18, № 1, P. 96-101.

58. Povirk L.F., Hogan M., Dattagupta N., Buechner M. Copper(ll).bleomycin, iron(lll).bleomycin, and copper(ll).phleomycin: comparative study of deoxyribonucleic acid binding.// Biochemistry. 1981. V. 20, № 3, P. 665-671.

59. Roy S.N., Orr G.A., Brewer C.F., Horwitz S.B. Chemical synthesis of radiolabeled Щ bleomycin A2 and its binding to DNA.//Cancer Res. 1981. V. 41, № 11, P. 44714477.

60. Albertini J.P., Garnier-Suillerot A. Cobalt-bleomycin-deoxyribonucleic acid system. Evidence of deoxyribonucleic acid bound superoxo and mu-peroxo cobalt-bleomycin complexes.// Biochemistry. 1982. V. 21, № 26, P. 6777-6782.

61. Albertini J.P., Garnier-Suillerot A. Iron-bleomycin-deoxyribonucleic acid system. Evidence of deoxyribonucleic acid interaction with the alpha-amino group of the beta-aminoalanine moiety.// Biochemistry. 1984. V. 23, № 1, P. 47-53.

62. Suzuki H., Nagai K., Akutsu E., Yamaki H., Tanaka N. On the mechanism of action of bleomycin. Strand scission of DNA caused by bleomycin and its bindingto DNA in vitro.// J. Antibiot. (Tokyo). 1970. V. 23, № 10, P. 473-480.

63. Chien M., Grollman A.P., Horwitz S.B. Bleomycin-DNA interactions: fluorescence and proton magnetic resonance studies.// Biochemistry. 1977. V. 16, № 16, P. 2641-2647.

64. Сергеев Д.С., Зарытова В.Ф. Взаимодействие блеомицина и его олигонуклеотидных производных с нуклеиновыми кислотами.// Успехи химии. 1996. V. 65, № 4, Р. 377-402.

65. Kemsley J.N., Zaleski K.L., Chow M.S., Decker A., Shishova E.Y., Wasinger E.C., Hedman В., Hodgson K.O., Solomon E.I. Spectroscopic studies of the interaction of ferrous bleomycin with DNA.//J. Am. Chem. Soc. 2003. V. 125, № 36, P. 10810-10821.

66. Li W., Antholine W.E., Petering D.H. Kinetics of reaction of DNA-bound Fe(lll)bleomycin with ascorbate: interplay of specific and non-specific binding.// J. Inorg. Biochem. 2002. V. 90, № 1-2, P. 8-17.

67. Nakamura M., Peisach J. Self-inactivation of Fe(ll)-bleomycin.// J. Antibiot. (Tokyo). 1988. V. 41, № 5, P. 638-647.

68. Morgan M.A, Hecht S.M. Iron(ll) bleomycin-mediated degradation of a DNA-RNA heteroduplex.// Biochemistry. 1994. V. 33, № 34, P. 10286-10293.V