Комплементарно-адресованная окислительная модификация ДНК конъюгатами олигонуклеотидов с фталоцианинами Co(II) и Fe(II) тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

Кузнецова Александра Александровна

Комплсментащю-адрссованная окислительная модификация ДНК конъюгатами олигонуклеотидов с фта л о цианинами Со(П) и Ре(П)

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

□□3476БеЬ

Новосибирскт - 2009

003476595

Работа выполнена в Новосибирском государственном университете и Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный руководитель: д.х.н., профессор Фёдорова Ольга Семёновна

Официальные оппоненты: д.х.н., профессор Малыгин Эрнст Георгиевич

к.х.н. Левина Ася Сауловна

Ведущая организация: Институт катализа им. Г.К. Борескова СО РАН

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при

Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

по адресу: 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

С авторефератом можно ознакомиться на сайте www.niboch.nsc.ru

Защита состоится «

У » 2009 г. в

часов

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного к.х.н., доцент

Коваль В.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Комплементарно-адресованная модификация нуклеиновых кислот представляет собой один из самых универсальных методов направленного воздействия на ДНК или РНК. Идея подхода была предложена Гриневой Н.И. с соавторами в 1967 г. и состоит в направлении (адресовании) реакционноспособной группы на определенный участок НК-мишени с помощью комплементарного этому участку олигонуклеотида. Перспективными группами при создании комплементарно-адресованных реагентов являются соединения, способные многократно воздействовать на биомолекулы. К ним относятся комплексы ионов переходных металлов, выступающие катализаторами образования активных форм кислорода. Постоянно ведется поиск новых соединений, обладающих преимуществами по сравнению с уже использующимися. Комплексы фталоцианинов с парамагнитными ионами переходных металлов эффективно катализируют окисление различных органических соединений с помощью 02, Н202 и других окислителей и представляют собой перспективные группы для окислительной модификации НК.

Цель настоящей работы состояла в выяснении механизмов сайт-направленного окисления ДНК-мишеней молекулярным кислородом и пероксидом водорода в присутствии -конъюгатов олигонуклеотидов с фталоцианинами Со(П) и Ре(И).

В задачи настоящего исследования входило:

• исследование окисления одноцепочечной ДНК-мишени молекулярным кислородом и пероксидом водорода в присутствии конъюгатов олигонуклеотидов с тетракарбоксифталоцианинами кобальта(И) и железа(И) (МеРс);

• исследование окисления одноцепочечной ДНК-мишени молекулярным кислородом в присутствии гетерогенных димеров фталоцианинов (МеРс»МеРср05), образованных фталоцианином МеРс в составе конъюгата и несущим отрицательно заряженные заместители, и фталоцианином МеРсро5 в растворе, несущим положительно заряженные заместители;

• определение продуктов окисления 5'-монофосфат-2'-дезоксигуанозина молекулярным кислородом в присутствии фталоцианинов МеРс и их гетерогенных димерных комплексов с МеРср05.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе представлены результаты комплексного исследования процессов каталитической окислительной модификации одноцепочечных фрагментов ДНК пероксидом водорода в присутствии конъюгатов олигонуклеотидов с тетракарбоксифталоцианинами Со(П) и Ре(П). Показано, что исследуемые реагенты приводят к эффективной и селективной модификации ДНК пероксидом водорода. В рамках данного исследования впервые изучено окисление одноцепочечной ДНК-мишени молекулярным кислородом и пероксидом водорода в присутствии гетерогенных димерных комплексов

1 :

(MePepos'MePe), образованных между фталоцианином МеРс в составе конъюгата и несущим отрицательно заряженные заместители, и фталоцианином MePcpos в растворе, несущим положительно заряженные заместители. Показано, что образующиеся гетерогенные димеры фталоцианинов имеют высокую каталитическую активность при окислении одноцепочечной ДНК молекулярным кислородом. Расщепление ДНК этими комплексами происходит с большей эффективностью, чем конъюгатами олигонуклеотидов с тетракарбоксифталоцианинами кобальта(П) и железа(Н), и приводит к образованию прямых разрывов цепи ДНК. При исследовании продуктов каталитического окисления ДНК молекулярным кислородом на примере 5'-монофосфат-2'-дезоксигуанозина было показано, что главными продуктами являются 8-оксо-7,8-дигидрогуанин и глиоксалевое производное гуанина. Полученные результаты демонстрируют перспективность использования конъюгатов олигонуклеотидов с фталоцианинами Co(II) и Fe(II) при создании новых подходов к регуляции экспрессии генов.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Результаты работы были представлены на конференциях: «International Conference on Chemical Biology», Новосибирск, 2005; «Nucleic Acids as Targets and To ols», Новосибирск, 2006; «Физико-химическая биология», Новосибирск, 2006; «Современные проблемы органической химии», Новосибирск, 2007; «5й1 International Conference on Porphyrins and Phthalocyanines», Москва, 2008; «IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов», Новосибирск, 2008, «V съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова», Москва, 2008, «21st IUBMB and 12* FAOBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biology», Шанхай, 2009 и «10й1 International Conference on Environmental Mutagens», Флоренция, 2009.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 145 страницах, содержит 45 рисунков, 33 схемы и 10 таблиц. Библиография включает 230 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Окисление одноцепочечной ДНК-мишени молекулярным кислородом и пероксидом водорода в присутствии конъюгатов олигонуклеотидов с тетракарбоксифталоцианинами кобальта(П) и железа(И)

В качестве реагентов для окислительного расщепления нуклеиновых кислот используют различные комплексы переходных металлов. Деструкция НК под действием металлокомплексов непосредственно связана с их способностью генерировать активные формы кислорода

(АФК) либо при возбуждении светом, либо в "темновых" реакциях сопряженного окисления некоторых соединений, таких как аскорбиновая кислота, тиолы и другие. Комплексы порфиринов и их аналогов с ионами диамагнитных и парамагнитных металлов являются одними из наиболее эффективных катализаторов окисления органических субстратов молекулярным кислородом. Фталоцианины (Рс) являются синтетическими аналогами порфиринов и обладают рядом преимуществ по сравнению с последними. В настоящее время комплексы фталоцианинов с ионами Со(Н) и Ре(И) исследуются в методе каталитической терапии рака. К началу настоящего исследования в Лаборатории исследования модификации биополимеров ИХБФМ СО РАН были разработаны методы синтеза конъюгатов фталоцианинов А1(Ш), 2п(П) и Со(П) с олигодезоксирибонуклеотидами и исследованы физико-химические свойства полученных конъюгатов.

Целью настоящей работы явилось выяснение механизмов сайт-направленного окисления ДНК-мишени молекулярным кислородом и пероксидом водорода в присутствии конъюгатов олигонуклеотидов с тетра-4-

карбоксифталоцианинами Со(П) и Ре(Н) (СоРс и РеРс, соответственно, Рис. 1). Последовательности олигодезоксирибонуклеотидов, использованных в синтезе конъюгатов, а также строение комплементарных комплексов с одноцепочечной ДНК-мишенью приведены на Рис. 2 (префикс «с1» опущен). Окислительную модификацию ДНК-мишеней проводили либо молекулярным кислородом в присутствии сопряженных восстановителей (2-меркаптоэтанол или аскорбиновая кислота), либо пероксидом водорода. Для выяснения механизма модификации ДНК-мишени проводили изучение отдельных стадий процесса.

1.1. Влияние остатка фталоцианина на кинетику образования и стабильность комплекса между мишенью и конъюгатом

Первым этапом взаимодействия конъюгата с мишенью является образование комплекса между МеРс-ООИ и взВИА. Кинетика образования комплекса СоРс-ОВМ^збБКА! была исследована методом

соон

Рис. 1. Структура МеРс.

580^1 5'-ДТОСЬааоаосотсаостт-З'

СоРс-СФШ 3 '-Т ТАССС -ГТ С ТрО(СЩЛН-СоРс

, 1 5 10 15 20 ssDNA2 5-ОАГСООААОАСООТСАООТТ-3' РеРс-ОШ2 З'-СГАСССТ ТСТрО^НЛШ-РеРс

Рис. 2. Последовательности олигодезоксирибонуклеотидов и структуры комплементарных комплексов с одноцепочечной ДНК-мишенью.

«остановленной струи». В первую очередь был проанализирован процесс образования комплекса между ззБЫА! и ^модифицированным олигонуклеотидом 5'-ТСТТСССАТТ-3' (ОБШ). Показано, что процесс образования комплекса ОБМ1'85БМА1 описывается одностадийной Схемой 1, тогда как процесс образования комплекса СоРс-ОБШ^БКА! - двухстадийной Схемой 2, предусматривающей образование промежуточного комплекса (СоРс-ОБШ^БКА!)!. Полученные величины констант скорости образования и распада комплексов ОБШ*ззБЫА1 и СоРс-(ЛЖ1*8зБМА1 приведены в Табл. 1. Как видно го Табл. 1, величины кх для ОБШ^БИА! и (СоРс-ОБШ^БКА!), близки между собой, что говорит о том, что остаток фталоцианина не оказывает значительного влияния на скорость образования первичного комплекса (СоРс-

ОБШ^БКА!)!. Однако константы скорости кл

отличаются в два раза, поэтому комплекс (СоРс-ОБШ'38БКА1)1 менее стабилен по сравнению с комплексом ОБШ^БКА!. Можно предположить, что молекула конъюгата находится в растворе в конформации, в которой остаток фталоцианина взаимодействует с тремя-четырьмя азотистыми основаниями олигонуклеотида, в результате чего при взаимодействии конъюгата с мишенью в первый момент времени образуется неполный дуплекс (СоРс-ОБШ'ббБКА!)!. После того, как такой дуплекс сформирован, происходит более медленный процесс "вытеснения фталоцианина", в результате которого формируется полностью комплементарный комплекс конъюгат'мишень СоРс-ОБЫ 1 ^БМА 1. Из Табл. 1 видно, что значения констант равновесия К* для комплексов близки. Можно сделать вывод, что остаток фталоцианина не имеет существенного влияния на стабильность комплекса СоРс-ОБИ 1 ^БИА1, но оказывает влияние на кинетику его образования.

Таблица 1. Константы скорости и равновесия, характеризующие процесс

образования комплексов ззРЫАЬОРЩ' и бэРИ А1 • СоРс-ОРК 1

Комплекс кь (Мхе)"' к. и с1 ¿2хЮ, с1 А.2х10,с 1 К*, М"1

ОРШ^РЫА! (1.0±0.1)х106 0.4 ±0.1 - - (2.6 ± 0.4)х106

CoPc-ODNl•ssDNA (0.8±0.1)*106 0.8 ±0.1 4.0 ±0.3 2.3 ± 0.2 (3.0 ± 0.4)*106

^^и^мхжг _ *■/*.„ К взокА!"СоРс-оом 1 ~К\ + где К\ - к\1кА, К2— к21к.г

Термодинамические параметры устойчивости комплексов МеРс-ОБМ^БКА и ОБШ^БИА! были получены с помощью метода термической денатурации. Было показано, что изменение свободной энергии Гиббса -Дв 2чг совпадало для данных комплексов и в среднем составляло 9.1 ккал/моль. Это дополнительное свидетельство того, что

Схема 1

«8В\А1 + ОПМ ОйМ . 55ША1

Схема 2

[НА]«, мкм

(б)

75 М"

Время, ч

1НА]„, мкМ

остаток фталоцианина в целом не влияет на общую стабильность комплекса между олигонуклеотидной частью конъюгата и комплементарной последовательностью мишени, хотя и влиял на отдельные стадии процесса комплексообразования.

1.2. Кинетика протекания побочных реакций

При катализе образования активных форм кислорода фталоцианиновая группа в составе реагента может сама подвергаться окислительной деградации. Такой процесс наблюдали ранее для конъюгата олигонуклеотида

5'ТТСССАТТЗ' с 2,4-ди-[2-(2-гидроксиэтил)]дейтеропорфирином IX Ре(Ш) (ГгоЬуа ЕЛ. с/ а1, 1993). Кроме того, в этой работе наблюдали другую побочную реакцию - каталитическое разложение пероксида водорода до 02 и Н20. Для оптимизации условий модификации ДНК была изучена кинетика деградации фталоцианина и каталитического разложения

пероксида водорода.

Показано, что при взаимодействии СоРс и РеРс с пероксидом водорода происходило уменьшение оптической плотности в видимой и УФ-областях спектра, соответствующих (^-полосам и полосе Соре молекулы МеРс. Для изучения кинетики деградации остатка фталоцианина с образованием неактивного продукта регистрировали

изменение оптического поглощения раствора на длине волны, соответствующей (¡»-полосе: 682 нм для СоРс и 630 нм для РеРс (Рис. 3). Показано, что природа иона металла оказывает влияние на процесс деградации фталоцианина. Так, СоРс подвергается значительной деградации только при больших избытках пероксида водорода, тогда как деструкцию РеРс наблюдали уже при одинаковых концентрациях фталоцианина и Н202. Кроме того, при взаимодействии БеРс с пероксидом водорода наблюдали увеличение оптической плотности в начальный период времени (Рис. 3, вставка). Увеличение поглощения на 630 нм может свидетельствовать об образовании промежуточного комплекса РеРс(Н202)2, а последующее падение - о деградации фталоцианина. При

Ш.ОХ. м кМ

.—0.50 Я ¿5

§0.48 ^ "С —- 60

г %

5 10 15 20 и"—"— Рр£МЯ,С

1%

500

0

10

20

30

40

Время, мин Рис. 3. Изменение во времени оптического поглощения СоРс-СЮШ (а) и РеРс (б) от концентрации Н202 ([СоРс-СЮШ]0 = 8 мкМ, [РеРс]0 = 50 мкМ). Вставка -

кинетические взаимодействия РеРс начальных временах.

кривые Н202 на

взаимодействии СоРс с пероксидом водорода подобного увеличения оптической плотности не наблюдали. Показано, что скорость деградации МеРс описывается уравнением (1), значение 1ц для СоРс составило (2.2 ± 0.2)х10"2 (Мхе)"1, для FePc - 49.5 ± 15.8 (Мхе)-1.

Каталитическое разложение Н202 ., „ , .. „ ,,„„

- „ 1 i МеРс + Н202 —» МеРс : ¿мл (1)

представляет собой К*

диспропорционирование двух 2Н2Ог—McFc > Н20 + 02: ¿hMcPc (2)

молекул пероксида, в результате

которого одна окисляется до кислорода, а другая восстанавливается до воды. Катализатор ускоряет перенос электронов от одной молекулы Н202 к другой. При этом процесс может протекать по радикальному цепному механизму, когда роль переносчиков цепи играют радикалы Н02" и ОН', а также ионы металлов в нестабильных валентных состояниях, или по молекулярному механизму. При взаимодействии СоРс с Н202 порядок реакции каталитического разложения пероксида водорода удалось определить при анализе спектрофотометрических данных по деградации остатка СоРс. Реакция каталитического разложения Н202 под действием FePc была исследована методом остановленной струи с регистрацией интенсивности хемилюминесценции (ХЛ), возникающей при окислении люминола (гидразида 3-аминофталевой кислоты). Наличие XJI свидетельствует о радикальном механизме разложения Н202 в присутствии FePc (Федорова О.С. и др., 1983). Следует отметить, что окисление люминола в присутствии пероксида водорода и СоРс не приводило к генерации XJI, что, вероятно, свидетельствует о нерадикальном или скрыто-радикальном механизме разложения Н202. Было показано, что скорость каталитического разложения Н202 в присутствии МеРс описывается уравнением (2) и значение kh составляет (2.5 ± 0.5)* 103 (М2хс)-1 для СоРс и 66.7 ± 23.1 (М^с)"1 для FePc.

1.3. Модификация одноцепочечной ДНК молекулярным кислородом и пероксидом водорода в присутствии конъюгатов олигоиуклеотидов с фталоцианинами Со(Н) и Fe(II)

Известно, что окисление ДНК активными формами кислорода может приводить к появлению прямых разрывов цепи ДНК, щелочелабильных сайтов, а также продуктов, устойчивых в условиях щелочной обработки (например, 8-оксо-7,8-дигидрогуанин). Щелочелабильные продукты детектировали после обработки реакционной смеси 1 М пиперидином (pH 12). Для выявления 8-оксо-7,8-дигидро-гуанина реакционные смеси параллельно обрабатывали ферментом 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазой из Е. coli (Fpg-белок, КФ 3.2.2). Продукты окисления ДНК-мишени анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях.

При модификации ДНК молекулярным кислородом в составе комплекса MePc-ODN'ssDNA в присутствии 2-меркаптоэтанола прямых 6

[СоРс-ООЖ]0=3 мкМ [550ЫЛ1],= 0.01 мкМ [РеРс-00Ы2],= 1 мкМ [ssDNA2]u= 1 мкМ [МЕ],= 2х10"'М(») [МЕ]„-4х10'М(»)

Время, ч

СоРс-ОБШ *>зОКА1

[СоРс-ООМ1]„=3 мкМ [350ыа1]0=0.01 мкМ [МЕ]„=4х10'М(.)

[Н,0,1о= 1*10"'М(»)

разрывов мишени не наблюдается. Модификацию выявляли лишь после обработки реакционной 1 М пиперидином. Данные реагенты приводили к направленной модификации бзБМА: окислению подвергались остатки гуанинов в положениях 9, 11-13, 17, 18. Следует отметить, что степень модификации ДНК-мишени была достаточно низкой: ~ 15 % для РеРс-ООЫ2 и ~ 8 % для СоРс-СШ>11 за 6 часов реакции. При этом в присутствии РеРс-СЮШ реакция окисления ДНК-мишени молекулярным кислородом протекала значительно быстрее, чем в присутствии СоРс-СЮМ1 (Рис. 4а).

Замена пары "02 + восстановитель" на Н202 приводила к более интенсивному специфическому расщеплению ДНК-мишени (Рис. 46, в). Поэтому кинетические закономерности модификации ДНК были изучены для случая, когда окислителем являлась молекула Н202. На Рис. 5а - б представлены типичные радиоавтографы, полученные при разделении в 20 % денатурирующем ПААГ продуктов окисления ДНК-мишени пероксидом водорода после обработки пиперидином. Видно, что модификации подвергались остатки гуанозинов в положениях 9, 11-13, 17, 18, то есть, расположенных вблизи сайта связывания МеРс (см. Рис. 2). Положения модифицированных оснований совпадали для случаев окисления ДНК-мишени пероксидом водорода в присутствии СоРс-СЮШ и в присутствии РеРс-СЮ№ (Рис. 4в). Следует отметить, что обработка реакционной смеси пиперидином давала более высокие значения модификации мишени, чем обработка Fpg-бeлкoм.

РеРс-стго^вкАг

[РеРс-ООЫ2]„= 1 мкМ [ssDNA211-1 мкМ [МЕ]„=2*|0'М(») [НА].-5*10'М(»)

4 5 Время, ч

Рис. 4. Кинетические кривые модификации бзОКА молекулярным кислородом (а) или пероксидом водорода (б, в) в присутствии конъюгатов МеРс-ОБЫ. Модификацию детектировали после обработки реакционной смеси пиперидином.

(а)

CoPc-ODNl'ssDNAl/HA

Время, ч 24 24 24 О I 2 3 5 8 24

CoPc-ODNl--++++++ + +

Н202 -+-+++++ + +'

A+G

т £

/

(б)

СоРс-степень ssDNAl ростом

Время, ч Обработка пиперидином

FePc-ODN2 • ssDNA2/H,02

О 0.3 0.6 1 2 3 4 6 6 + ++ + + ++ +-

A+G

«И

Была изучена зависимость степени модификации ДНК мишени пероксидом водорода от концентрации конъюгатов СоРс-СЮШ и FePc-ODN2 (Рис. 6а, б). Было показано, что при окислении ббОМА! пероксидом водорода в присутствии СЮШ

модификации возрастала с начальной концентрации конъюгата и представляла собой гиперболическую зависимость. В то же время при окислении 350КЛ2 пероксидом водорода в присутствии РеРс-СЮЫ2 максимальная степень модификации Б5ПМА2 достигалась при эквимолярном соотношении ДНК-мишени и РеРс-СЮШ. Наличие максимума при соотношении [зБОЫА^УРеРс-СЮГО]0 = 1 свидетельствует о

высокой каталитической активности группы РеРс. В самом деле, при низких концентрациях 55Ш>1А2 большая часть конъюгата находится вне комплекса РеРс-(ЛЖ2'35ВНА2, и каталитическая группа подвергается быстрой деструкции под действием окислителя. При высоких концентрациях збОЫА2 уменьшение степени модификации мишени происходит, вероятно, вследствие нехватки окислителя. Гиперболическая зависимость степени модификации эбОКА! от концентрации СоРс-ОБ^П

тш И» <М

ез ssDNAl* CoPc-ODN 1/Н,02 (обработка пиперидином) ез ssDNA 1 • CoPc-ODN 1/Н,0, (обработка гликозилазой) eassDNA2« FePc-0DN2/Hj03 (обработка пиперидином)

G18 G17 G13 G12 СП G9 Остаток нуклеотида

Рис. 5. Радиоавтографы, полученные при разделении в 20 % денатурирующем ПААГ продуктов окисления ДНК-мишени пероксидом водорода в комплексе MePc-ODN»ssDNA после обработки пиперидином. Концентрации реагентов, мкМ: а -[ssDNA 1]0 = 0.01, [Н2О2]0 = lxlO4, [CoPc-ODNl]0 = 10; б - [ssDNA2]0 = [FePc-ODN2]0 = [Н2О2]0 = 1; в -распределение степени модификации по остаткам нуклеотидов окисленной ДНК-мишени в конечный момент времени.

на

три

п-6

порядка ниже:

свидетельствует, вероятно, о более группы СоРс по сравнению с БеРс.

На Рис. 6в, г представлены зависимости степени модификации ДНК-мишени от концентрации пероксида водорода. Они представляют собой кривые с максимумами, но при этом диапазоны оптимальных

концентраций Н202 для СоРс-ОБШ и БеРс-ОБЫг были различными. При окислении 1 в

присутствии СоРс-ОБШ требовалась достаточно большая концентрация Н202 (1*10"3 - 1х1(Г2 М), тогда как при окислении ззОКА2 в присутствии РеРс-ОБШ диапазон оптимальных концентраций Н202 был

низкои каталитическои активности

(а)

Обработка пиперидином

[530НА1]в=0.01 мкМ

[НА]»= 1x10'м

Обработка 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазой из Е. соН

10 20 30 40 50 [СоРс-СЮМУ^О^!],

Обработка пиперидином

[Ре-ООЫ2]„= 1 мкМ (.) [Ре-ООГО]„=3 мкМ (•) [НА].= Ю мкМ

1 10 100 [ГеРс-00К2]„ф50^2|„

1x10"° - М.

Повторное добавление Н202 к комплексу РеРс-ООЫ2*5зВКА2 приводило к дальнейшему

накоплению продуктов модификации ssDNA2, при этом степень модификации достигала 50 %.

Колоколообразная зависимость эффективности модификации ДНК-мишени от концентрации пероксида водорода или конъюгата указывает на наличие конкуренции между

СоРс-ОБМ^ОМА!

[СоРс-ОПШ]„=5.6мкМ [53быа1]„=0.01 мкМ

0.0

FePc-ODN2•ssDNA2

[РеРс-00№]„= 1 мкМ [550ЫА2]л= 1 мкМ

1x10^ 1x10'

1x10" 1x10°

[Н,0,]и м

Рис. 6. Зависимость степени модификации ДНК мишени от концентрации МеРс-СЮЫ (а, б) или пероксида водорода (в, г). Время реакции: комплекс СоРс-ООЫ 1 А1 - 24 ч, комплекс РеРс-СЮК2«8зОЫА2 -6 ч.

процессами окисления

ДНК-мишени, 9

деградации каталитической группы и разложения Н202. Оптимальным соотношением концентраций конъюгата и Н202 является такое, при котором процессы деструкции активной группы и расхода окислителя проходят за одно и тоже время. Было показано, что количественная модификация ббБЫА! происходит приблизительно за 10 ч при следующих условиях: при ~ 500-кратном молярном избытке СоРс-ООШ по отношению к ббБКА! и ~ 2000-кратном молярном избытке пероксида водорода по отношению к СоРс-ОБШ. Общая степень модификации составляла ~ 80 % после обработки реакционной смеси пиперидином. После обработки реакционной смеси Рр§-белком степень расщепления составляла ~ 40 %. Поскольку продукты модификации, выявляемые при обработке пиперидином и Рр§-белком, частично перекрываются, то суммарная степень модификации составляет 80 - 100 %. При окислении 8зВЫА2 пероксидом водорода в присутствии РеРс-ОВК2 максимальная степень модификации достигалась приблизительно за 2 ч при эквимолярном соотношении мишени и конъюгата и примерно 5-10-кратном избытке Н202 по отношению к каталитической группе. При этом общая степень модификации составила 40^-50 % после обработки пиперидином и была не более 10 % после обработки Рр§-белком.

Для описания процесса окисления одноцепочечной ДНК-мишени пероксидом водорода в присутствии конъюгатов МеРс-ОВК была предложена Схема 3.

Схема 3

МеРс-ОШ МеРс-СШМ^ОГЧА Н'0" МеРс-ОШ^Б^" + МеРс-(^

НАД,! IНА,К |но А

I «АД 1 НА> -

МеРс"-ОВ1Чг===* МеРс"-001Ч«850КА * *

МсРси-0».\««ША" ¿Ь к»|>МА~ + МсРс"-ОВ>'

I МсРеОШ \

МеР!-ОВИ>ыи*А . к.

2н,0;

В данной схеме ввБЫЛ - одноцепочечная ДНК-мишень; МеРсох-ОБЫ - продукт деструкции остатка фталоцианина в конъюгате МеРс-ОБИ, не обладающий каталитическими свойствами, но сохраняющий такое же сродство к мишени, как и исходный реагент; ssDNA0X - продукт модификации мишени; МеРс-ОВ№ззБКА, МеРс0*-ОБМ«85В^, МеРс-ОБМ^зБЫЛ0* и МеРсох-ОБ№з5БК Аох- соответствующие комплексы; Кх -константа ассоциации МеРс-ОБИ и МеРсох-ОБК с мишенью; к0 -константа скорости модификации мишени Н202 в комплексе МеРс-OБN•ssDNA; кл - константа скорости деструкции остатка фталоцианина под действием пероксида водорода; къ - константа скорости каталитического разложения Н202 до Н20 и 02. Серым цветом выделены стадии, присущие только окислению в5БКА2 пероксидом водорода в присутствии РеРс-ОБЫ2.

Значения кинетических Таблица 2. Сводная таблица кинетических и и термодинамических термодинамических констант процесса констант приведены в Табл. окисления ДНК пероксидом водорода в 2. Более стабильной каталитической группой в условиях окисления

является СоРс, величина константы скорости

деструкции ЕеРс была в ЗхЮ3 раз больше. В то же время, при модификации мишени реагентом РеРс-ОБИ2 величина ко была примерно в 2x103 раз больше, чем при модификации мишени СоРс-ОБШ. То есть, модификация мишени конъюгатом с фталоцианином Ре(Н) протекала значительно быстрее. Другим важным параметром сравнения является отношение АДсЬ поскольку для получения высокоэффективной модификации нуклеиновых кислот необходимо использовать такие реакционноспособные группы, которые реагируют с мишенью с более высокими скоростями, чем инактивируются в побочных реакциях. Видно, что этот параметр больше единицы. Данный результат может свидетельствовать в пользу того, что конъюгаты олигонуклеотидов с СоРс и БеРс способны проводить модификацию в каталитическом режиме.

Таким образом, в настоящей работе показано, что комплексы фталоцианина с кобальтом(Н) и железом(П) в качестве реакционноспособных группы могут приводить к эффективной модификации ДНК-мишени в присутствии пероксида водорода. Процесс окислительной модификации ДНК сопровождается деградацией макроцикла фталоцианина и каталитическим разложением Н202. Колоколообразная зависимость эффективности модификации мишени от концентрации Н202 или соотношения мишень-конъюгат подтверждает конкурирование этих процессов.

2. Окисление одноцепочечной ДНК-мишени молекулярным кислородом и пероксидом водорода в присутствии гетерогенных димерных комплексов (МеРср03«МеРс), образованных между фталоцианином МеРс в составе конъюгата, несущим отрицательно заряженные заместители, и фталоцианином МеРср05 в растворе, несущим положительно заряженные заместители

присутствии реагентов MePc-ODN

Константы CoPc-ODNl FePc-ODN2

коь (Мхе)"' (4.2 ± 0.6)х10'2 84.2 ± 9.7

ксъ (Мхе)"1 (1.2 ± 0.2)* 10"2 не определено

kd, (Мхе)"1 (2.2± 0.2)хЮ"2 68.8 ± 16.5

к (2.5 ± 0.5)* 10J (М2хС)-' (52.4 ±34.1) (М2хС)-'

1.9 ±0.4 1.2 ±0.4

V*d 0.5 ±0.1 -

Кх, М-' (3.0 ± 0.4)хЮ6 (2.3 ± 1.4)хЮь

&oi — определено из экспериментальных данных, полученных при обработке реакционных смесей пиперидином; — при обработке реакционных смесей 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазой из Е. coli.

Из литературных данных известно, что при образовании гетерогенных димерных комплексов, образованных между фталоцианинами кобальта и железа, несущих положительные или отрицательно заряженные заместители, наблюдается увеличение каталитической активности по сравнению с мономерными формами данных фталоцианинов (Schipper Е. et al, 1995; Борисенкова С.А. и др., 2002). В связи с этим представляло интерес проверить, приведет ли в нашем случае образование гетерогенных димерных комплексов фталоцианинов к увеличению скорости окисления ДНК-мишени молекулярным кислородом и пероксидом водорода.

Было исследовано окисление одноцепочечной ДНК-мишени молекулярным кислородом и пероксидом водорода в присутствии конъюгатов CoPc-ODNl и FePc-ODN2, отрицательно заряженные остатки фталоцианинов которых формируют гетерогенные димеры с положительно заряженными фталоцианинами Fe(II) и Со(И) в растворе. Структура образующихся комплексов приведена на Рис. 7.

2.1. Взаимодействие MePcpos с одноцепочечной и двуцепочечной

ДНК

Общим свойством

порфиринов и их производных является способность

выступать в качестве лигандов нуклеиновых кислот.

Катионные порфирины и их аналоги образуют с ДНК прочные комплексы либо за счет интеркаляции, либо за счет внешнецепочечного связывания. Из Рис. 6 видно, что исследуемые комплексы (CoPcpos»CoPc)-ODNl -ssDNAl и (FePepos'FePe)-

ODN2«ssDNA2 можно условно разделить на два фрагмента: двуцепочечный участок,

образованный олигонуклеотидной составляющей конъюгата и

комплементарной областью на олигонуклеотиде-мишени, и одноцепочечный участок ДНК-мишени. Таким образом, MePcpos, присутствующий в растворе, должен взаимодействовать со всеми компонентами: с двуцепочным и одноцепочным фрагментами дуплекса, формируемого олигонуклеотидом-мишенью и конъюгатом, и с отрицательно заряженным фталоцианином в составе конъюгата. 12

Me(II) = Со(П), Fe(D) МеРсрш: R=COO<^H4N+(C2H5)2C2H4NH2

(СоРс^ • CoPc)-ODNl» ssDNAl

. 1 5 10 15 20,

5 -AATGGGAAGAGGGTCAGGTT-3 З'-t TÄCCC TT cfpocoy.NH-CoPc

CoPc^

(FePc^- FePc)-ODN2 • ssDN A2

1 5 10 15 20 5'-GATGGGAAGAGGGTCAGGTT-3 З'-CT ÄCCCT TCTpO(CH,),NH-FePc

FePcp..

Рис. 7. Структуры комплексов (MePCpoS*MePc)-ODN*ssDNA и строение MePcDOS.

Способность МеРСроз связываться с НК была исследована спектрофотометрическим методом. Для определения параметров взаимодействия МеРср05 с одноцепочечной ДНК было зарегистрировано изменение электронного спектра фталоцианина при его титровании водным раствором олиго-20-с!Т (с1Т2о) и олиго-20-(1А (dA2o), для определения параметров взаимодействия с двуцепочечной ДНК - при титровании водным раствором ДНК из тимуса теленка (ДНКС[). Для определения константы связывания МеРсро5 с ДНК, а также числа пар оснований п, занимаемых одной связанной молекулой МеРср05 (Табл. 3), использовали модель МакГи и фон Хиппеля (МсСИее ХО. е( а1, 1974). Показано, что значения констант связывания МеРср05 с одноцепочечной ДНК на порядок меньше значения констант связывания с двуцепочечной ДНК. Величина константы ассоциации РеРср05 с одноцепочечной ДНК практически не зависит от ее природы (олигопиримидиновая или олигопуриновая цепь) и в среднем составляет 1.3х105 М"1.

Таблица 3. Значения констант ассоциации (К), чисел нуклеотидов, занимаемых одним лигандом на ДНК (п) и гипохромного эффекта (/г) процесса взаимодействия МеРс„мсНК

Параметр ГеРс„„, СоРс„„,

<1Т2о <1А20 ДНК,, ат2„ ¿Аго ДНК,,.

К, М"1 (1.2±0.1)х105 (1.4±0.2)х105 (3.7 ± 0.3)х106 (4.7±0.2)хЮ5 (6.8±0.5)х105 (4.2 ± 0.5)х106

п 1.6±0.1 1.7 ± 0.1 1.9 ± 0.1 2.6 ±0.1 2.5 ±0.1 2.7± 0.1

К, % 12.5 15.7 25.5 16.5 25.4 34.1

'Н= И 00%

Величина гипохромного эффекта к (Табл. 3) была в 1.5-2 раза меньше при титровании одноцепочечной ДНК по сравнению с двуцепочечной. В случае РеРср08 величина гипохромного эффекта была одинакова для с1Т20 и ¿А2о, а в случае СоРсроз - существенно больше для с1А20. Значение константы ассоциации положительно заряженного фталоцианина с ДНКс1. практически не зависело от природы иона металла и в среднем составляла 3.9х106М"'. Число пар нуклеотидов п, исключаемых из взаимодействия с другими молекулами фталоцианина после образования комплекса, не зависело от одноцепочечной/двуцепочечной формы НК и составляло в среднем 1.7 для РеРср08 и 2.6 для СоРсро5. Низкие значения параметров п и /г, по-видимому, отражают внешний тип связывания МеРср05 с НК {РаЫетаск Я.Г. а а1, 1983).

Взаимодействие МеРсроз с МеРс было исследовано электрофоретическим методом. Было показано, что при взаимодействии МеРСр0:! с МеРс формировались гетерогенные комплексы (МеРСр05*МеРс), обладающие отличной от исходных фталоцианинов электрофоретической подвижностью.

(СоРс,„,'СоРс)-ОВГЧЬ55В^1 (ГеРс,..'РеРс)-ООК2 >5ЛЖА2

2.2. Окисление одноцепочечной ДНК молекулярным кислородом и пероксидом водорода в присутствии (МеРсрох*МеРс)-ООМ

Окисление ббОМА в присутствии свободного МеРср08 приводило к неспецифической модификации ~ 10 % (без предпочтительного окисления по какому-либо из нуклеотидов), выявляемой после обработки реакционной смеси 1 М пиперидином. Окисление бзОКА в комплексах (МеРсро5'МеРс)-ОВЫ»5зОМА как молекулярным кислородом, так и пероксидом водорода приводило к сайт-специфической модификации ДНК.

Для определения оптимального соотношения МеРср05 и конъюгата (г| = [МеРср05]/[МеРс-ОБЫ]) проводили окисление ДНК-мишени пероксидом водорода при

различных значениях т|. Как видно из Рис. 8а, накопление

модифицированного продукта проходит через максимум, при этом г] составляет ~ 20-60 для комплекса (СоРСро5'СоРс)-ОБМ^ОМА! и~ 1030 для комплекса (РеРсроз'РеРс)-ОВШ^БКАг. Все последующие

---(СоРс„- СоРс)-ОПМ«

-(ГеРс_-ГеРс)-00\2 •ssDNA2

■ 2-меркаптоэтанол • НгО,

А Аскорбиновая кислота

1x10° 1x10" 1x10" Концентрация, М

Рис. 8. Зависимость степени модификации олигонуклеотида-мишени пероксидом водорода от соотношения т] ([МеРср{К]/[МеРс-СЮМ]) (а) или концентрации Н202, 2-меркаптоэтанола и аскорбиновой кислоты при т| = 20 (б). Время реакции 16 часов. Модификацию детектировали после обработки реакционной смеси 1 М пиперидином. Концентрации реагентов, М: [8бОЫА]0 = [МеРс-ОБИЬ = 1 х 10"6 (а, б), [Н202]о = 1 х 10"3 (а).

эксперименты проводили при г| = 20.

На Рис. 8 б представлена зависимость степени модификации олигонуклеотида-мишени от концентрации пероксида водорода, 2-меркаптоэтанола (МЕ) и аскорбиновой кислоты. Видно, что окисление ДНК-мишени молекулярным кислородом в присутствии 2-меркаптоэтанола приводило к более высоким степеням модификации, при этом диапазон оптимальных концентраций составлял (1+5)* 10"5 М для комплекса (СоРсро5'СоРс)-ОВМ 1 ^ОЫА1 и (1+5)хЮ'6 М для комплекса (РеРср05'РеРс)-ОБК2'38ВКА2.

Образование гетерогенного димера (СоРср05'СоРс) сопровождалось значительным увеличением каталитической активности. Так, например,

при эквимолярном соотношении эзОЫА! и СоРс-ОБМ1 степень модификации ДНК-мишени пероксидом водорода достигала ~ 40 % в комплексе (СоРсро5'СоРс)-ОВШ'ззВМА1 (Рис. 8а) и ~ 12 % в комплексе СоРс-ОВШ ^эВМА 1 (см. Рис. 6а). Аналогичную ситуацию наблюдали и при окислении 88ВЫА1 молекулярным кислородом. В комплексе (СоРСроз'СоРсЭ-ОБШ'ззБЫА! (т] = 20) в присутствии МЕ в качестве сопряженного восстановителя степень модификации збВМА! достигала 45 % (Рис. 9а), тогда как окисление ббВИА! молекулярным кислородом в комплексе СоРс-ОБШ^БИА! в присутствии МЕ даже при 100-кратном избытке конъюгата СоРс-ОВШ над ДНК-мишенью приводило лишь к ~ 10 % модификации (Рис. 9а).

Образование гетерогенного димера (РеРсроз'РеРс) также приводило к увеличению каталитической активности: при

окислении 5зБНА2

молекулярным кислородом при т| = 20 в присутствии МЕ степень модификации в

комплексе (РеРсро5*РеРс)-ОВК2*5зВЫА2 достигала 38% (Рис. 96). В то же время, при окислении 55ВКА2 молекулярным кислородом в комплексе РеРс-ОВК2»88ВКА2 в присутствии МЕ степень модификации мишени не превышала 15 % (Рис 96). При окислении ззВКА2 пероксидом водорода в присутствии комплекса (РеРср05*РеРс) не наблюдали увеличение степени модификации ДНК-мишени по сравнению с комплексом РеРс. Однако образование гетерогенного димера (РеРсРо8»РеРс) приводило к повышению стабильности группы РеРс в процессе каталитического окисления ДНК-мишени пероксидом водорода. Так, в отсутствие РеРср05 при высоких концентрациях Н202 происходила инактивация группы РеРс конъюгата РеРс-ОВЫ2, что приводило к резкому уменьшению степени модификации (см. Рис. 6г).

Для сравнения эффективности окисления ДНК-мишени молекулярным кислородом в присутствии гетерогенных димеров (СоРсро5*СоРс) и

15

[830^1],= 0.01 мкМ (•)

1 мкМ (.) ¡СоРс-СШШ]„= 1 мкМ [МЕ]„=4х10лМ 1СоРс,_.]„= 20 мкМ (.)

20 30 40 Время, ч

■х 5

5 §0.2 Е л

О

(б) 2

г 1

[550^21,= 1 мкМ [РеРс-СШШ]п= 1 мкМ [МЕ]„=2х10лМ [РеРсД = 20 мкМ (.)

2 4 6

Время, ч

Рис. 9. Кинетические кривые модификации бзБЫА молекулярным кислородом (а, б) в присутствии МеРс-СЮК (1) и (МеРсРот'МеРс)-ОБН (2). Модификацию детектировали после обработки реакционной смеси 1 М пиперидином.

(РеРОроз'БеРс) была изучена кинетика модификации мишени в присутствии 2-меркаптоэтанола. Продукты реакции анализировали гель-электрофорезом в 20 % ПААГ.

из

(а)

(СоРси

Время, ч 0 Обработка + пиперидином

C0Pc)-ODNl«ssDNAl/2-MepKanT03Tan0.i

1 2 4 6 8 16 24 36 36 + + + + + Ч-4- +

A+G

(б)

(FePe^«FcPc)-ODN2»ssDNA2/2-MepkanT(»Taiio.n

Время, мин 0 Обработка + пиперидином

120 240 360 360 + + 4- -

A+G

(в)

сэ (СоРс^• CoPc)-ODN 1 • ssDN А1

"О, + HSCH^OH" и (FePc„-FePc)-ODN2-ssDNA2 "O, + HSCHzCH,OH"

I

Как видно представленных радиоавтографов (Рис. 10), окисление мишени в комплексе

(СоРсро5*СоРс)-ОВШ'ввВЫА! приводило к

появлению -10% прямых разрывов цепи ДНК по положениям Сц - 0]3, тогда как в комплексе (РеРсРо5-РеРс)-0ВК2*5зВ1ЧА2 количество прямых разрывов цепи ДНК было меньше 3 %.

На Рис. 10в представлено распределение степени расщепления по

нуклеотидам ДНК-мишени. В отсутствие положительно заряженных фталоцианинов (см. Рис. 4г) модификации подвергались только остатки 09, О [ 1 — О [з и

^17, 018.

окислении мишени молекулярным кислородом в присутствии гетерогенных димеров фталоцианинов наблюдали другую картину. Видно, что в обоих комплексах наибольшей модификации (>5%) подвергались также остатки вд, О п - и йп, 018. Кроме того, значительной модификации подвергались остатки С]5, Ти- Следует отметить, что в комплексе 16

При ДНК-

с18 а16 т14 g12 а10 а8 g17 с15 g13 gil g9 а7 Остаток нуклеотида Радиоавтографы, полученные при в 20 % денатурирующем ПААГ окисления ssDNA молекулярным в комплексах (MePcp0S'MePc)-ODN'SSDNA после обработки пиперидином. Концентрации реагентов, мкМ: [ssDNA]0 = [МеРс-ODN]0 = 1, [МЕ]о = 4, т] = 20; в - распределение степени расщепления по модифицированным остаткам ssDNA в комплексах (MePcpos'MePc)-ODN'ssDNA.

Рис. 10. разделении продуктов кислородом

(СоРсро5*СоРс)-СЮЫ 1 ^ОТЧА1 также наблюдали в незначительной степени расщепление по сайтам А7, А8, Аю и А16. Таким образом, гетерогенные димеры фталоцианинов (МеРср05»МеРс) при окислении ДНК-мишени молекулярным кислородом обладают большей каталитической активностью по сравнению с мономерными формами фталоцианинов Ре(П) и Со(Н) в составе конъюгатов, но меньшей специфичностью по отношению к модифицируемым нуклеотидам.

На Рис. 11 представлены кинетические кривые накопления продуктов модификации мишени молекулярным кислородом в комплексах (СоРсро^СоРсЭ-ОБК 1 ^БКА1 и (РеРср05-РеРс)-ОВН2'55ОНА2. Видно, что при окислении ДНК-мишени в комплексе (РеРср05*РеРс)-СЮ№,5зВКА2 реакция выходит на плато за 4 часа, тогда как в комплексе (СоРср05'СоРс)-ОБШ^БКА! в течение 36 часов не удавалось достигнуть полной модификации. С другой стороны, в одинаковых условиях окисления молекулярным кислородом комплекс (СоРСр^-СоРс) приводил к более высоким степеням модификации ДНК-мишени.

Экспериментальные данные обрабатывали по уравнению (3). В этом уравнении £, - степень модификации ДНК-мишени, -предельная степень модификации ДНК-мишени при I -» <х>, кэфф -эффективная константа скорости. Данная константа представляет собой сложную комбинацию констант скорости связывания и

30.45

— (СоРс, (РеРс,

• СоРсУСШШ • БвИМА; •РеРсНЮШ^Ш,)

МеРс,

роэ

ДНК-

диссоциации мишенью и отрицательно заряженным фталоцианином в составе конъюгата, констант скорости образования активных форм кислорода и констант скорости модификации

олигонуклеотида-мишени. Было обнаружено, что при окислении ДНК-мишени в комплексе

10

Время, ч

Рис. 11. Кинетические кривые модификации мишени бзВЫА молекулярным кислородом в комплексах (МеРср05»МеРс)-

(ЮЫ-ззОМЛ. Концентрации реагентов, мкМ: ^БОД];, = [МеРс-ОБЭДо = 1, П = 20, [МЕ]о = 1 (■), 2 (•), 3 (А), 4 (♦).

(3)

(СоРср05*СоРс)-СЮШ'8зВНА1 к1 эфф = (8.6 ± 1.7)х10"2 ч"1, а в комплексе (РеРср08»РеРс)-СЮ№'55ВКА2 ¿2эфф = 3.3 ± 0.5 ч"1. Таким образом, Л2^ примерно в 40 раз больше А^фф.

Таким образом, в настоящей работе показано, что гетерогенные димеры фталоцианинов имеют высокую каталитическую активность при окислении одноцепочечной ДНК молекулярным кислородом. Расщепление ДНК этими комплексами происходит с большей эффективностью, чем

конъюгатами олигонуклеотидов с тетракарбоксифталоцианинами кобальта(П) и железа(П), и приводит к образованию прямых разрывов цепи ДНК. Эффективная константа скорости окисления ДНК мишени А^фф для комплекса (РеРср08,РеРс) примерно в 40 раз больше, чем для комплекса (СоРСроБ'СоРе). Но в то же время окисление ДНК в присутствии гетерогенного димера (СоРСр0з»СоРс) приводит к более высоким степеням окисления ДНК-мишени.

3. Определение продуктов окисления 5'-монофосфат-2'-дезоксигуанозина молекулярным кислородом в присутствии фталоцианинов СоРс и РеРс и их гетерогенных димерных комплексов с СоРсРо, и РеРср0,

Для разработки наиболее эффективных реагентов для воздействия на нуклеиновые кислоты необходимо знание структуры и свойств образующихся продуктов. К сожалению, в настоящее время, за небольшим исключением, такие сведения отсутствуют, исследователи ограничиваются определением положения нуклеотида, в котором произошло изменение. В настоящее время в литературе нет данных по продуктам окисления ДНК, вызываемым фталоцианинами кобальта(Н) и железа(И).

В наших экспериментах по окислению ДНК-мишени пероксидом водорода в присутствии конъюгатов МеРс-СЮИ наблюдали модификацию только остатков гуанина. При окислении ДНК-мишени молекулярным кислородом в присутствии гетерогенных комплексов (МеРср05'МеРс) наибольшей модификации также подвергались остатки гуанозина. В связи с этим было исследовано окисление 5'-монофосфат-2'-дезоксигуанозина (сЮМР) молекулярным кислородом в присутствии фталоцианинов МеРс и их гетерогенных димерных комплексов с МеРс^.

Изучение продуктов окисления сЮМР проводили в условиях, когда МеРс был присоединен к кремневому носителю (8Ю2). Это позволяло легко отделять реакционный раствор от катализатора. Таким образом, окисление гуанина молекулярным кислородом в присутствии МеРс протекало в гетерофазных условиях. В качестве сопряженных восстановителей использовали аскорбиновую кислоту и 2-меркаптоэтанол. Проводили многократное добавление сопряженного восстановителя для достижения высокой степени модификации сЮМР. Процесс с участием РеРс приводил к более ¡высоким степеням окисления сЮМР молекулярным кислородом по сравнению с СоРс. В связи с этим продукты окисления сЮМР молекулярным кислородом были определены для катализаторов РеРс-БЮг и (РеРсроз«РеРс)-БЮ2.

РеРс-БЮг и (РеРсро5'РеРс)-8!02 катализировали окисление сЮМР молекулярным кислородом, что приводило к накоплению одних и тех же продуктов окисления. Главное отличие заключалось в величине выхода модифицированных продуктов. В целом, (РеРср05»РеРс)-8Ю2 приводил к более высокому выходу образования модифицированных продуктов. 18

Идентификацию продуктов окисления гуанина проводили на основе масс-спектров и спектров электронного поглощения продуктов. Были идентифицированы следующие соединения: свободное основание гуанин (виа); свободное основание 8-оксо-7,8-дигидрогуанин (8-охоОиа); 1,№-глиоксалевый аддукт 5'-монофосфат-2'-дезоксигуанозина (1,Н2-§1уоха1-сЮМР); 5'-монофосфат-2'-дезокси-8-оксо-7,8-дигидрогуанозин (8-охо-ёОМР); 5'-альдегидо-2'-дезоксигуанозин (5'-aldehyde-dG); 2'-дезокси-8-оксо-7,8-дигидрогуанозин (8-охо-ёв). Природа сопряженного восстановителя влияла на распределение продуктов окисления ёвМР. Так, в присутствии аскорбиновой кислоты главным продуктом окисления являлся 8-охо^ОМР, тогда как в присутствии 2-меркаптоэтанола -глиоксалевое производное гуанина 1,Ш^]уохаМОМР.

Полученные данные позволяют сделать заключение о том, что в качестве окисляющих частиц выступают как гидроксильные радикалы, так и оксокомплексы РеРс. Возможность образования оксокомплексов была подтверждена в реакции эпоксидирования модельного субстрата - 5Н-дибензо[6,/]-азепш{-5-карбоксамида.

ВЫВОДЫ

1. Синтезированы новые конъюгаты дезоксирибоолигонуклеотидов, несущие в качестве химически активной группы комплекс тетра-4-карбоксифталоцианина железа(Н). Проведено детальное сравнение каталитических свойств данных конъюгатов с конъюгатами дезоксирибоолигонуклеотидов с тетра-4-карбоксифталоцианином кобальта(П), синтезированными ранее. Показано, что конъюгаты фталоцианинов железа(П) обладают более высокой каталитической активностью при окислении ДНК пероксидом водорода и молекулярным кислородом по сравнению с конъюгатами фталоцианинов кобальта(П).

2. Исследованы количественные закономерности модификации одноцепочечной ДНК пероксидом водорода в составе дуплексов с конъюгатами олигонуклеотидов с тетра-4-карбоксифталоцианинами кобальта(П) и железа(П) и предложены кинетические схемы процессов.

3. Впервые показано, что гетерогенные димеры фталоцианинов Ре(Н) и Со(Н), образуемые между фталоцианинами в составе конъюгатов, несущими отрицательно заряженные заместители, и свободными фталоцианинами с положительно заряженными заместителями, обладают более высокой каталитической активностью при окислении одноцепочечной ДНК молекулярным кислородом, чем мономерные фталоцианины в составе конъюгатов олигонуклеотидов, и приводят к образованию прямых разрывов цепи ДНК.

4. Определены продукты окисления 5'-монофосфат-2'-дезоксигуанозина молекулярным кислородом в присутствии фталоцианинов Fe(II) и Со(И) и их гетерогенных димерных комплексов. Природа образующихся продуктов окисления зависела от природы сопряженного восстановителя: в присутствии аскорбиновой кислоты главным продуктом окисления является 5'-монофосфат-2'-дезокси-8-оксо-7,8-дигидрогуанин, тогда как в присутствии 2-меркаптоэтанола -1 ,К2-глиоксалевый адцукт 5 '-монофосфат-2'-дезоксигуанозина.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих

работах:

1. Kuznetsova A.A., Chernonosov А.А., Kuznetsov N.A., Koval V.V., Knorre D.G. and Fedorova O.S. Kinetic study of DNA modification by phthalocyanine derivative of the oligonucleotide // Bioinorg. Chem. Appl. -2006.-V. 2006.-P. 1-10.

2. Кузнецова A.A., Соловьева Л.И., Федорова O.C. Модификация одноцепочечной ДНК конъюгатом олигонуклеотида с фталоцианином Fe(II): кинетические закономерности и механизм процесса // Биоорган, химия.-2008.-Т. 34.-С. 683-695.

3. Kuznetsova А.А., Lukyanets E.A., Solovyeva L.I., Knorre D.G., Fedorova O.S. DNA-binding and oxidative properties of cationic phthalocyanines and their dimeric complexes with anionic phthalocyanines covalently linked to oligonucleotides // J. Biomol. Struc. Dyn. -2008. -V. 26. -P. 307-320.

4. Kuznetsova A.A., Solovyeva L.I., Kaliya O.L., Lukyanets E.A., Knorre D.G., Fedorova O.S. Fe(II) phthalocyanine catalyzed oxidation of dGMP by molecular oxygen // Bioinorg. Med. Chem. Lett. -2009. -V. 19. -P. 43354338.

5. Кузнецова A.A., Кнорре Д.Г., Федорова O.C. Окисление ДНК и ее компонентов активными формами кислорода // Успехи химии. -2009. -Т. 78. -С. 714-734.

Подписано в печать 16.07.09 Печать офсетная Заказ №263

Формат 60x84 1/16 Усл. печ. л. 1.25 Тираж 100 экз.

Редакционно-издательский центр НГУ. 630090, Новосибирск-90, ул. Пирогова 2

Список сокращений

Введение

1. Окисление ДНК активными формами кислорода {Обзор литературы)

1.1. Активные формы кислорода

1.2. Окисление ДНК активными формами кислорода

1.2.1. Окисление ДНК синглетным кислородом

1.2.2. Окисление ДНК супероксидным радикалом

1.2.3. Окисление ДНК гидроксильными радикалами

1.2.3.1. Окисление гетероциклов в составе нуклеиновых кислот

1.2.3.1.1. Окисление остатка тимина

1.2.3.1.2. Окисление остатка цитозина

1.2.3.1.3. Окисление остатка гуанина

1.2.3.1.4. Окисление остатка аденина

1.2.3.2. Окисление углеводных фрагментов в составе нуклеиновых кислот

1.2.4. Окисление ДНК высоковалентными оксокомплексами металлов

1.2.4.1. Окисление ДНК мезо-тетра-(4-Ы-метилпиридинил)-порфирином марганца(Ш)

1.2.4.2. Окисление ДНК комплексом бис-(1,10-фенантролин) меди(1)

1.2.4.3. Окисление ДНК комплексом блеомицина с железом(П)

1.3. Каталитические свойства металлокомплексов фталоцианинов и их димерных комплексов

1.3.1. Каталитические свойства тетрасульфофталоциана железа и его димерных р-оксо-комплексов

1.3.2. Каталитические свойства димерных р-нитридо-комплексов фталоцианина железа

1.3.3. Каталитические свойства гетерогенных димерных комплексов, образованных меэ/сду фталоциашшами кобальта и железа, несущих положительные или отрицательно заряженные заместители 1.4. Заключение

2. Материалы и методы

3. Исследование механизмов окисления ДНК молекулярным кислородом и пероксидом водорода в присутствии конъюгатов олигонуклеотидов с 75 фталоциашшами Со(Н) и Ее(П) (Результаты и обсуждение)

3.1. Окисленне одноцепочечной ДНК молекулярным кислородом и пероксидом водорода в присутствии конъюгатов олигонуклеотидов 75 с тетракарбоксифталоцианинами Со(Н) и Ге(П)

3.1.1. Влияние остатка фталоцианина на кинетику образования и стабильность комплекса МеРс-ООМ^ИМА

3.1.1.1. Исследование кинетики образования комплексов СоРс

ОИN1 \ssDNA 1 и ОЭЫ1 \ssDNA 1 методом остановленной струи

3.1.1.2. Исследование стабильности комплексов СоРс

ООN1 КеРс-ООЮ'зхОМА2 и ООИ1 \ssDNA методом термической денатурации

3.1.2. Кинетика протекания побочных реакций

3.1.2.1. Деградация СоРс и 17еРс под действием Н2О

3.1.2.2. Каталитическое разлоэюение НоО

3.1.3. Кинетические закономерности протекания процесса модификации одноцепочечной ДНК молекулярным кислородом и пероксидом водорода в присутствии 89 конъюгатов олигонуклеотидов с фтало цианинами Со(Н) и

Ре(П)

3.1.4. Механизм модификации одноцепочечной ДНК пероксидом водорода в присутствии конъюгатов олигонуклеотидов с 95 фтало цианинами Со(Н) и Ке(П)

3.2. Окисленне одноцепочечной ДНК молекулярным кислородом и пероксидом водорода в присутствии гетерогенных димерных комплексов (МеРср05*МеРс), сформированных между МеРс в составе олнгонуклеотндных конъюгатов и МеРсрох в растворе

3.2.1. Взаимодействие МеРсрох с одноцепочечной и двуцепочечной ДНК

3.2.2. Взаимодействие МеРср0Х с МеРс

3.2.3. Окисление одноцепочечной ДНК молекулярным кислородом и пероксидом водорода в присутствии (МеРсро5»МеРс)-СШ/У 3.3. Определение продуктов окисления 5'-монофосфат-2'дезоксигуанозина молекулярным кислородом в присутствии фталоцианинов МеРс и их гетерогенных димерных комплексов с МеРср

3.3.1. Окисление (ЮМР молекулярным кислородом в присутствии МеРс и (МеРср0^МеРс) и сопряженного восстановителя

3.3.2. Эпоксидирование карбамазепина оксокомплексами МеРс 119 Заключение 122 Выводы 127 Список литературы

Список сокращений

В настоящей работе использованы символы и сокращения структурных компонентов нуклеиновых кислот и их производных в соответствии с рекомендациями Комиссии по номенклатуре Международного Союза чистой и прикладной химии (ШРАС) и Международного Союза биохимиков (ШВ), а также следующие обозначения:

2аРи - 2-аминопурин,

BlmFe — комплекс железа(П) с блеомицином,

BPh - 2,2',3,3',5,5,-гексаметил-4,4,-дигидрокси-бифенил,

Bu'-ООН - гидроперекись трет-6утила,

Си(ОР)г - 1,10-фенантролиновый комплекс меди(1) или (II),

CBZ - 5//-дибензо[/?,/]-азепип-5-карбоксамид (карбамазепин)

CBZE - 10,11-эпоксид карбамазепина dGMP — 5'-монофосфат-2'-зезоксигуанозин,

ESI-MS — времяпролетная масс-спектрометрия с ионизацией при электрораспылении,

FePc'Bu^N — (i-нитридо-мостиковый комплекс тетра-трет-бутинфталоцианина железа,

FePc)2N - (i-нитридо-мостиковый димер фталоцианина железа,

FePcS — тетрасульфофталоциан железа,

GC-MS — газовая хроматография с последующим с массспектрометрическим анализом,

MALDITOF — времяпролетная масс-спектрометрия с матричноактивированной лазерной десорбцией/ионизацией,

МСМ-41 — мезопористое стекло,

МЕ — 2-меркаптоэтанол,

МеРс - комплекс тетракарбоксифталоцианипа кобальта(П) или железа(П),

MePCpos — комплекс окта-4,5-(Н-Р-аминоэтил-Р'-К,1Ч-диэтиламмониоэтоксикарбонил)фталоцианина кобальта(П) или железа(П) (фталоцианин с положительно заряженными заместителями),

MePcp0S*MePc) - гетерогенный димерный комплекс между фталоцианинами

МеРс и MePcpos

6-MeQ - 6-метилнафтахинон,

2MN - 2-метилнафталин,

МРРН - гидроперекись 1-фенилизопропила,

NIH-сдвиг - 1,2-сдвиг заместителя в соседнее положение ароматического кольца,

Ох - окислитель,

Рс - фталоцианин,

Рог - порфирин,

Рут - N-метилпиридин,

Red - восстановитель,

Rf - рибофлавин,

SSO - тиоантрен-5-оксид,

TMP - 2,3,6-триметилфенол,

TMQ - 2,3,6-триметилбензохинон,

АФК - активные формы кислорода,

НК - нуклеиновая кислота,

ОФ ВЭЖХ - обращено фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография,

ФДТ - фото динамическая терапия.

Существование высокоселективных взаимодействий между комплементарными цепями нуклеиновых кислот позволяет конструировать реагенты для воздействия на любые участки РНК или ДНК с целью направленного подавления их функций. Для этого к олигонуклеотидам заданной длины и последовательности, комплементарным к выбранным участкам ДНК или РНК, присоединяют реакционноспособные группы, которые проводят направленную модификацию участков мишени, располагающихся вблизи области образования комплементарного комплекса. Такой подход был впервые предложен Гриневой Н.И. с соавторами и получил название "комплементарно-адресованной модификации" нуклеиновых кислот [1]. Позже было показано, что подобным образом можно осуществлять селективную модификацию не только одпоцепочечных НК, но и двуцепочечных олигопурин/олигопиримидиновых участков [2-4]. Комплементарно-адресованная модификация является наиболее универсальным методом высокоизбирательного воздействия на нуклеиновые кислоты.

Каталитически активные металлокомплексы фталоцианинов являются перспективными реагентами для окислительного расщепления НК. Комплексы фталоцианинов с ионами парамагнитных металлов способны окислять различные органические соединения [5], при этом молекула фталоцианипа стабильна в условиях окисления [6]. К началу настоящего исследования в Лаборатории исследования модификации биополимеров ИХБФМ СО РАН под руководством Федоровой О.С. были разработаны методы синтеза конъюгатов фталоцианинов А1(Ш), Zn(II) и Со(Н) с олигодезоксирибонуклеотидами и исследованы физико-химические свойства полученных конъюгатов. Целью настоящей работы явилось продолжение начатой ранее работы и выяснение механизмов сайт-направленного окисления ДНК-мишени молекулярным кислородом и пероксидом водорода в присутствии конъюгатов олигонуклеотидов с фталоцианинами Со(П) и Ре(П). Особое внимание уделялось кинетическим характеристикам процесса модификации ДНК-мишени, поскольку оценка селективности и эффективности адресованной модификации чрезвычайно важны для практического использования реакционноспособных производных олигонуклеотидов. В задачи настоящего исследования входило:

• исследование окисления одпоцепочечной ДНК-мишени молекулярным кислородом и пероксидом водорода в присутствии конъюгатов олигонуклеотидов с тетракарбоксифталоцианинами кобальта(Н) и железа(Н) (МеРс);

• исследование окисления одноцепочечной ДНК-мишени молекулярным кислородом в присутствии гетерогенных димеров фталоцианинов (МеРсМеРсрод), образованных между фталоцианином МеРс в составе конъюгата, несущим отрицательно заряженные заместители, и фталоцианином МеРсроз в растворе, несущим положительно заряженные заместители;

• определение продуктов окисления ДНК молекулярным кислородом на примере окисления 5'-монофосфат-2'-дезоксигуанозина в присутствии фталоцианинов МеРс и их гетерогенных димерных комплексов с МеРср05.

Кинетические аспекты окислительной модификации были исследованы на модельных ДНК-мишенях. Из литературных данных известно, что при использовании химически активных производных олигонуклеотидов наряду с процессом модификации мишени протекают побочные реакции, приводящие к параллельному расходованию реагента. В результате возможно образование продуктов деградации реагента, сохраняющих сродство к мишени, но не способных ее модифицировать и, таким образом, выступающих в роли конкурентного ингибитора [7-9]. В связи с этим была изучена кинетика побочных реакций разрушения МеРс под действием окислителя и каталитического разложения пероксида водорода.

В результате проведенного исследования получены данные, свидетельствующие о способности конъюгатов олигонуклеотидов с фталоцианинами кобальта(П) и железа(И) вызывать эффективную и селективную модификацию ДНК в темновых условиях.

Выводы

1. Синтезированы новые конъюгаты дезокеирибоолигонуклеотидов, несущие в качестве химически активной группы комплекс тетра-4-карбоксифталоцианина железа(Н). Проведено детальное сравнение каталитических свойств данных конъюгатов с конъюгатами дезокеирибоолигонуклеотидов с тетра-4-карбоксифталоцианином кобальта(П), синтезированными ранее. Показано, что конъюгаты фталоцианинов железа(П) обладают более высокой каталитической активностью при окислении ДНК пероксидом водорода и молекулярным кислородом по сравнению с конъюгатами фталоцианинов кобальта(Н).

2. Исследованы количественные закономерности модификации одноцепочечной ДНК пероксидом водорода в составе дуплексов с конъюгатами олигонуклеотидов с тегра-4-карбоксифталоцианинами кобальта(П) и железа(П) и предложены кинетические схемы процессов.

3. Впервые показано, что гетерогенные димеры фталоцианинов Ре(П) и Со(П), образуемые между фталоцианинами в составе конъюгатов, несущими отрицательно заряженные заместители, и свободными фталоцианинами с положительно заряженными заместителями, обладают более высокой каталитической активностью при окислении одноцепочечной ДНК молекулярным кислородом, чем мономерные фталоцианины в составе конъюгатов олигонуклеотидов, и приводят к образованию прямых разрывов цепи ДНК.

4. Определены продукты окисления 5'-монофосфат-2'-дезоксигуапозина молекулярным кислородом в присутствии фталоцианинов Ре(Н) и Со(П) и их гетерогенных димерных комплексов. Природа образующихся продуктов окисления зависит от природы сопряженного восстановителя: в присутствии аскорбиновой кислоты главным продуктом окисления является 5'-монофосфат-2'-дезокси-8-оксо-7,8-дигидрогуанин, тогда как в присутствии 2-меркаптоэтанола - ¡,N2-глиоксалевый аддукт 5'-монофосфат-2'-дезоксигуанозина.

Заключение

В представленной работе выполнено комплексное исследование процесса модификации ДНК молекулярным кислородом и пероксидом водорода в присутствии конъюгатов олигонуклеотидов с фталоцианинами кобальта(Н) и железа(Н). Данные комплексы катализируют образование активных форм кислорода при последовательном одноэлектронном восстановлении 02 или Н202 до Н20. В качестве окисляющих частиц при этом могут выступать как гидроксильпые радикалы, так и оксокомплексы металлов, находящиеся в высоковалентных состояниях окисления.

Каталитическую активность конъюгатов MePc-ODN в окислении ДНК пероксидом водорода можно рассматривать как пероксидазную активность [227, 228]. Из литературных данных известно, что в клетках Е. coli пероксид водорода образуется с постоянной скоростью (10 мкМ/с), однако вследствие активности пероксидаз внуктриклеточный уровень Н202 остается на уровне 0.1 мкМ [229,230]. В прокариотических клетках пероксид водорода также образуется с постоянной скоростью и внутриклеточная концентрация пероксида водорода может варьироваться от 0.001 мкМ до 0.5-0.7 мкМ [231]. При развитии различных онкологических заболеваний уровень Н202 может значительно повышаться [232, 233]. Таким образом, исследование каталитической окислительной модификации ДНК пероксидом водорода представляет интерес не только в качестве модельного исследования, но и в плане оценки возможности использования исследуемых реагентов in vivo.

Эксперименты по модификации ДНК молекулярным кислородом в составе дуплексов MePc-ODN*ssDNA показали, что прямых разрывов мишени не образуется. Модификацию выявляли после обработки реакционной пиперидином. Было показано, что реагенты MePc-ODN приводили к направленной модификации ssDNA молекулярным кислородом. Однако степень модификации ДНК-мишени была достаточно низкой: ~ 15 % для FePc-ODN2 и ~ 8 % для CoPc-ODNl за 6 часов реакции. В присутствии FePc-ODN2 реакция окисления ДНК-мишени молекулярным кислородом протекала значительно быстрее, чем в присутствии CoPc-ODNl. Замена пары "молекулярный кислород + восстановитель" на пероксид водорода приводила к более интенсивному специфическому расщеплению ДНК-мишени. В этом случае также не наблюдали образования прямых разрывов цепи ДНК-мишени. При этом степень модификации, выявляемая обработкой реакционной смеси пиперидином составляла ~ 80 % для CoPc-ODNl и 40-50 % для FePc-ODN2. При обработке 8-оксогуанин-ДНКгликозилазой из Е. coli выявляемая степень модификации была ниже: ~ 40 % для СоРс-ODN1 и не более 10 % для FePc-ODN2.

Были исследованы количественные закономерности модификации одноцепочечной ДНК пероксидом водорода в составе дуплексов с копъюгатами олигонуклеотидов с тетра-4-карбоксифталоцианинами кобальта(И) и железа(Н). Для выяснения механизма модификации ДНК-мишени пероксидом водорода были изучены отдельные стадии процесса: образование комплекса между конъюгатом и мишеныо, побочные реакции деградации СоРс и FcPc под действием пероксида водорода и каталитическое разложение пероксида водорода и каталитическая окислительная модификация ДНК пероксидом водорода.

Методом остановленной струи с регистрацией оптического поглощения и методом термической денатурации показано, что остаток фталоцианипа не оказывает существенного влияния на стабильность комплекса, по влияет на кинетику его образования. Процесс образования комплекса ДНК-мишени с конъюгатом CoPc-ODNl описывается двухстадийной, а процесс образования комплекса ДНК-мишени с немодифицированпым олигонуклеотидом - одностадийной кинетической схемой. Были определены кинетические и термодинамические параметры процесса комплексообразования.

При исследовании кинетики побочных реакций было показано, что реакция деструкции остатка фталоцианипа имеет первый порядок, а реакция каталитического разложения пероксида водорода под действием фталоцианина — второй порядок по концентрации пероксида водорода. При исследовании деструкции остатка фталоцианина было показано, что группа СоРс более стабильна в условиях окисления, чем группа FePc. Следует отметить, что при взаимодействии СоРс с II2O2 порядок реакции каталитического разложения пероксида водорода был определен при анализе спектров оптического поглощения, полученных в ходе деградации остатка СоРс. Для определения порядка реакции каталитического разложения пероксида водорода под действием FePe был использован хемилюминесцентный метод, основанный на окислении люминола пероксидом водорода. Наличие XJI свидетельствовало о радикальном механизме разложения Н202 [208]. Окисление люминола в присутствии пероксида водорода и СоРс не приводило к генерации хемилюминесценции, что, вероятно, свидетельствовало о нерадикальном механизме разложения Н202.

Таким образом, в настоящей работе показано, что исследуемые реагенты приводили к эффективной и селективной модификации ДНК пероксидом водорода. Было показано, что при окислении ДНК-мишени пероксидом водорода в присутствии

CoPc-ODNl степень модификации возрастала с ростом начальной концентрации конъюгата и представляла собой гиперболическую зависимость. В тоже время при окислении ДНК-мишени пероксидом водорода в присутствии FePc-ODN2 максимальная степень модификации ДНК-мишени достигалась при эквимолярном соотношении реагентов. Зависимость предельного выхода модифицированного продукта от начальной концентрации пероксида водорода также представляла собой кривую с максимумом, но при этом диапазон оптимальных концентраций пероксида водорода был различным. При окислении ДНК-мишени в присутствии CoPc-ODNl требовалась достаточно большая концентрация пероксида водорода (~ 1-10 мМ) тогда как при окислении ДНК-мишени в присутствии FePc-ODN2 диапазон оптимальных концентраций пероксида водорода был на три порядка ниже 1-10 мкМ).

Колоколообразная зависимость степени модификации ДНК-мишени от концентрации пероксида водорода или конъюгата подтверждает конкуренцию процессов окисления ДНК-мишени, деградации каталитической группы и разложения пероксида водорода. На основании совокупности полученных данных была предложена кинетическая схема процесса модификации ДНК-мишени пероксидом водорода в присутствии исследуемых конъюгатов и определены константы скоростей элементарных стадий, входящих в кинетическую схему.

Следует отметить, что конъюгат олигонуклеогида с FcPc обладает более высокой каталитической активностью при окислении ДНК как пероксидом водорода, гак и молекулярным кислородом. Высокая активность этого конъюгата при низких концентрациях пероксида водорода свидетельствует о его преимуществе для использования гп vivo.

Впервые исследована модификация одноцепочечной ДНК молекулярным кислородом и пероксидом водорода в присутствии конъюгатов CoPc-ODNl и РеРс-ODN2, отрицательно заряженные остатки фталоцианинов которых способны формировать в растворе гетерогенные димеры с положительно заряженными фталоцианинами Fe(II) и Co(II).

Показано, что MePcpos, присутствующий в растворе, взаимодействовал с двуцепочным и одноцепочным фрагментами дуплекса, формируемого олигонуклеотидом-мишеныо и конъюгатом, и с отрицательно заряженным фталоцианином в составе конъюгата.

При окислении ДНК пероксидом водорода было показано, что образование гетерогенных комплексов сопровождалось повышением стабильности каталитической группы в условиях окисления.

При окислении одноцепочечной ДНК молекулярным кислородом образующиеся гетерогенные димеры фталоцианинов обладали высокой каталитической активностью. Расщепление ДНК этими комплексами происходило с большей эффективностью, чем конъюгатами олигонуклеотидов с тетракарбоксифталоцианинами кобальта(П) и железа(П). После обработки реакционных смесей пиперидином степень модификации составляла ~ 45-50 % в присутсвии (СоРсро5*СоРс) и — 40 % в присутсвии (РеРср05'РеРс). При этом модификации подвергались не только остатки гуанинов, но также остатки цитозина и тимина. Следует отметить, что окисление ДНК-мишени молекулярным кислородом в присутствии гетерогенных фталоцианиновых комплексов приводило к появлению прямых разрывов цепи ДНК: —10% в присутсвии (СоРсРо5*СоРс) и ~ 3 % в присутсвии (РеРсРо5*РеРс). Повторное добавление сопряженного восстановителя к реакционной смеси приводило к дальнейшему накоплению щелочелабильных продуктов модификации и прямых разрывов цепи ДНК.

Гетерогенные димеры фталоцианинов железа катализировали окисление ДНК молекулярным кислородом с более высокой скоростью, чем гетерогенные димеры фталоцианинов кобальта. Было показано, что эффективная константа скорости окисления ДНК-мишени молекулярным кислородом в присутствии (РеРср05*РеРс) примерно в 40 раз больше, чем в присутсвии (СоРср05*СоРс).

Впервые определены продукты окисления 5'-монофосфат-2'-дезоксигуанозина молекулярным кислородом в присутствии фталоцианинов МеРс и их гетерогенных димерных комплексов с МеРср05. Было показано, что МеРс и (МеРсро5*МеРс) приводили к накоплению одних и тех же продуктов окисления, главное отличие заключалось в выходе модифицированных продуктов. В целом, (МеРсрод'МеРс) приводил к более высокому выходу образования модифицированных продуктов.

Природа сопряженного восстановителя также влияла на распределение продуктов окисления 5'-монофосфат-2'-дезоксигуанозина. Так, в присутствии аскорбиновой кислоты главным продуктом окисления являлся 8-оксо-7,8-дигидрогуанин, тогда как в присутствии 2-меркаптоэтанола - глиоксалевое производное гуанина.

Образование 8-оксо-7,8-дигидрогуанина, а также продуктов окисления остатка сахара в нуклеотиде (свободных азотистых оснований и глиоксалевого производного гуанина) может свидетельствовать об образовании гидроксильных радикалов. Наличие оксокомплексов в реакционной смеси было подтверждено при окислении модельного субстрата - карбамазепина. Таким образом, в качестве окисляющих частиц при окислении различных субстратов молекулярным кислородом и пероксидом водорода в присутствии РеРс и СоРс выступают, вероятно, как гидроксильные радикалы, так и оксокомплексы различной природы.

Таким образом, в настоящей работе показано, фталоцианины кобальта(Н) и железа(Н), а также их димерные комплексы в составе олигонуклеотидных конъюгатов являются перспективными группами для каталитической окислительной модификации ДНК как молекулярным кислородом, так и пероксидом водорода. Результаты, полученные в данной работе, имеют большое значение для дальнейшей разработки ген-направленных реагентов.

1. Belikova A.M., Zarytova V.F., Grineva N.I. Synthesis of ribonucleosides and diribonucleoside phosphates containing 2-chloroethylamine and nitrogen mustard residues I I Tetrahedron Lett. -1967. -V. 37. -P. 3557-3562.

2. Moser H.E., Dei~van P.B. Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation // Science. -1987. -V. 238. -P. 645-650.

3. Fedorova O.S., Knorre D.G., Podust L.M., Zarytovaa V.F. Complementary addressed modification of double-stranded DNA within a ternary complex I I FEBS Lett. -1988. -V. 228. -P. 273-276.

4. Vol'pin M.E., Novodarova G.N., Krainova N.Yu., Lapikova V.P., Aver'yanov A.A. Redox and fungicidal properties of phthalocyanine metal complexes as related to active oxygen // J. Inorg. Biochem. -2000. -V. 81. -P. 285-292.

5. Вульфсон С.В., Любимова О.И., Котов А.Г., Калия О.Л., Лебедев О.Л., Лукъянец Е.А. Окислительно-восстановительные реакции фталоцианинов и родственных соединений // Ж. Общ. Химии. -1975. -Т. 45. -С. 1841-1846.

6. Гринева Н.И., Ломакина Т.С., Тигеева Н.Г., Чимитова Т.А. Кинетика ионизации С-С1 связи в 4-(Н-2-хлорэтил-М-метиламино)бензил-5'-фосфамидах нуклеозидов и олигонуклеотидов // Биоорган, химия. -1977. -Т. 3. -С. 210-214.

7. Valko М., Izakovic М., Mazur М., Rhodes C.J., Telser J. Role of oxygen radicals in DNA damage and cancer incidence // Mol. Cell. Biochem. -2004. -V. 266. -P. 37-56.

8. Evans M.D., Dizdaroglu M., Cooke M.S. Oxidative DNA damage and disease: introduction, repair and significance // Mutat. Res. -2004. -V. 567. -P. 1-61.

9. Valko M, Leibfritz D., Moncol J., Cronin M.T., Mazur M., Telser J. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease // Int. J. Biochem. Cell. Biol. -2007. -V. 39. -P. 44-84.

10. Valko M, Rhodes C.J., Moncol ./., Izakovic M., Mazur M. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer // Chern. Biol. Interact. —2006. -V. 160. -P. 1-40.

11. Tullius T.D., Dombroski B.A. Hydroxyl radical "footprinting": High-resolution information about DNA-protein contacts and application to X repressor and Cro protein // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. -1986. -V. 83. -P. 5469-5473.

12. Bonnett R. Photodynamic therapy in historical perspective // Rev. Contemp. Pharmacother. -1999.-V. 10.-P. 1-17.

13. MacDonald I.J., Dougherty T.J. Basic principles of photodynamic therapy // J. Porphyrins Phthalocyanines. -2001. -V. 5.-P. 105-129.

14. Kimoto E., Tanaka H., Gyotoku J., Morishige F., Pauling L. Enhancement of antitumor activity of ascorbate against Ehrlich ascites tumor cells by the copperrglycylglycylhistidine complex // Cancer Res. -1983. -V. 43. -P. 824-828.

15. Feofanov A.V., Grichine A.I., Shitova L.A., Karmakova T.A., Yakubovskaya R.I., Egret-Charlier M., Vigny P. Confocal Raman microspectroscopy and imaging study of theraphthal in living cancer cells // Biophys. J. -2000. -V. 78. -P. 499-512.

16. Гиренко Е.Г., Борисенкова С.А., Калия О.Л. Окисление аскорбиновой кислоты в присутствии фталоцианиновых комплексов металлов. Химические аспекты каталитической терапии рака // Изв. Ак. Наук. Серия Хим. -2002. -Т. 7. -С. 11371142.

17. Chen С.В., Gorin М.В., Sigman D.S. Sequence-specific scission of DNA by the chemical nuclease activity of l,10-phenanthroline-copper(I) targeted by RNA // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. -1993. -V. 90. -P. 4206-4210.

18. Chen C.B., Sigman D.S. Nuclease activity of 1,10-phenanthroline-copper: Sequencc-specific targeting// Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. -1986. -V. 83. -P. 7147-7151.

19. Коваль О.А., Черноловская Е.Л., Литвак В.В., Власов В.В. Сайт-направленное расщепление ДНК конъюгатом олигонуклеотида с о-бромбензойной кислотой в присутствии ионов меди // Изв. АН, Сер. хим. -2003. —Т. 11. -Р. 2380-2385.

20. Boutorin A.S., Vlassov V.V., Kazakov S.A., Kutiavin I.V., Podyminogin M.A. Complementary addressed reagents carrying EDTA-Fe(II) groups for directed cleavage of single-stranded nucleic acids // FEBS Lett. -1984. -V. 172. -P. 43-46.

21. Dreyer G.B., Dervan P.B. Sequence-specific cleavage of single-stranded DNA: oligodeoxynucleotide-EDTA'Fe(II) // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. -1985. -V. 82. -P. 968972.

22. Chu B.C., Orgel L.E. Nonenzymatic sequcnce-specific cleavage of single-stranded DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. -1985. -V. 82. -P. 963-967.

23. Vorobjev P.E., Smith V.F., Pyshnaya I.A., Levina A.S., Zarytova V.F. Site-specific cleavage of RNA and DNA by complementary DNA-bleomycin A5 conjugates // Bioconjugate Chem. -2003. -V. 14.-P. 1307-1313.

24. Le Doan Т., Perrouault L., Helens C. Chassignol M, Thuong N.T. Targeted cleavage of polynucleotides by complementary oligonucleotide covalently linked to iron-porphyrins // Biochemistry. -1986. -V. 25. -P.6736-6739.

25. Иванова E.M., Мамаев С.В., Федорова О.С., Фролова Е.И. Комплементарно-адресованная модификация одноцепочечного фрагмента ДНК железопорфириновым производным олигонуклеотида // Биоорган, химия. -1988. —V. 14. -Р. 551-554.

26. Mestre В., Jakobs A., Pratviel G., Meunier В. Structure/nuclease activity relationships of DNA cleavers based on cationic metalloporphyrin-oligonucleotide conjugates // Biochemistry. -1996. -V. 35. -P. 9140-9149.

27. Fedorova O.S., Savitskii A.P., Shoikhet K.G., Ponomarev G.V. Palladium(II)-coproporphyrin I as a photoactivable group in sequence-specific modification of nucleic acids by oligonucleotide derivatives 11 FEBS Lett. -1990. -V. 259. -P. 335-337.

28. Magda D., Miller R.A., Sessler J.L., Iverson B.L. Site-specific hydrolysis of RNA by europium (III) texaphyrin conjugated to a synthetic oligodeoxyribonucleotide // J. Am. Chem. Soc.-1994.-V. 116.-P. 7439-7440.

29. Magda D., Wright M., Miller R.A., Sessler J.L., Sansom P.I. Sequence-specific photocleavage of DNA by an expanded porphyrin with irradiation above 700 nm// J. Am. Chem. Soc. -1995. -V. 117. -P. 3629-3630.36