Конъюгаты олигонуклеотидов с металлофталоцианинами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

Черноносов Александр Анатольевич

Конъюгаты олигонуклеотидов с металлофталоцианинами: синтез, термодинамические свойства и реакционная способность

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Новосибирск - 2005

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН и Новосибирском государственном университете

Научный руководитель: д.х.н. Фёдорова Ольга Семёновна

Официальные оппоненты:

д.б.н., проф. Загребельный Станислав Николаевич к.х.н. Веньяминова Алия Гусейновна

Ведущая организация: Институт цитологии и генетики СО РАН

часов

Защита состоится« % » 2005 г. в Л

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан « «5/ „ОШ^и^^ 2005 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

Д.Х.Н. ФёДОрОВаОС-

2.Ш676

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Создание реагентов, способных направленно модифицировать нуклеиновые кислоты, является одной из важнейших задач физико-химической биологии. Среди таких реагентов широко исследуются производные олигонуклеотидов, содержащие реакционноспособные группы.

Особый интерес представляют фотоактивируемые и каталитически активные группы, способные многократно воздействовать на биомолекулы. К таким группам относятся синтетические аналоги порфиринов - фталоциани-ны (тетрабензотетраазапорфирины).

Фталоцианины и их комплексы с ионами диамагнитных металлов (2п(П), А1(П1), Рс1(11) и др.) могут возбуждаться длинноволновым светом и сенсибилизировать генерацию синглетного молекулярного кислорода '02. В тоже время, комплексы фталоцианинов с ионами переходных металлов (Со(П), Ре(11), Мп(П) и др.) способны катализировать возникновение свободных и координированных радикалов кислорода О; и *ОН при

взаимодействии с Ог, Н202 и другими окислителями. Все эти активные формы кислорода могут вызывать окислительную деструкцию нуклеиновых кислот.

Целью настоящей работы являлась разработка методов синтеза конъю-гатов фталоцианинов с олигодезоксирибонуклеотидами, изучение термодинамических характеристик их взаимодействия с ДНК, а также исследование их способности выступать реагентами для направленной каталитической или сенсибилизированной окислительной модификации ДНК.

Научная новизна в практическая ценность. Впервые синтезированы конъюгаты олигодезоксирибонуклеотидов с фталоцианинами А1(Ш) и Zn(lí) как в растворе, так и на твердом носителе, а также с фталоцианином Со(П) на твердом носителе. Методами спектроскопии кругового дихроизма и термической денатурации исследовано влияние остатка фталоцианина на образование дуплексов, триплексов и тетраплексов; впервые получены термодинамические параметры образования дуплексов и триплексов, содержащих остаток фталоцианина. Показано, что конъюгаты олигонуклеотидов с фталоцианином Со(П) селективно модифицируют модельные ДНК-мишени в темновых условиях, а конъюгаты с фталоцианинами А1(Ш) и Zn(ll) - при облучении светом ртутной лампы или гелий-неонового лазера.

Полученные данные свидетельствуют о том, что конъюгаты олигонукле-

отидов с фталоцианинами Со(11), А1

III) и 2п(11) могут быть использованы в

РОС. НАЦИОНАЛА

БИБЛИОТЕКА 1

СПе •8

качестве реагентов для направленной модификации ДНК в темновых условиях и при облучении светом, а также могут найти практическое применение в антисенс- и антиген- подходах к регуляции экспрессии генов.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликованы 4 печатные работы. Результаты работы были представлены на III Съезде биохимического общества, Санкт-Петербург, 2002 г.; Всероссийской конференции «Фундаментальные науки - медицине», Новосибирск, 2005 г.; международных конференциях: «Targeting RNA: Artificial Ribonucleases, Conformational Traps and RNA interference», Новосибирск, 2003 г.; 30th FEBS Congress - 9th IUBMB Conference «The Protein World. Proteins and Peptides: Structure, Function and Organization», Будапешт, Венгрия, 2005 г.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 126 страницах, содержит 47 рисунков, 26 схем и 17 таблиц. Библиография включает 156 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Синтез конъюгатов фталоцианинов с олигонуклеотидами

Фталоцианины (Ptc) являются производными тетрабензотетраазапорфиринов, у которых пиррольные кольца сочленены с бензольными. Это сравнительно дешевые синтетические красители, более устойчивые в окислительных средах, чем природные порфирины. По сравнению с электронными спектрами поглощения порфиринов у фталоцианинов происходит смещение полос видимой части спектра в красную область, где выше прозрачность биологических тканей. Последнее важно для практического применения фталоцианинов, например, в фотодинамической терапии для лечения онкологических заболеваний.

Однако, фталоцианины имеют высокую гидрофобность и стремятся образовывать

Ptc Me Y

1 Co(II) —

2 Zn(II) -S-CH2-

3 А1(Ш)-С1 -S02-NH-(CH2)S-

Рис. 1. Структуры фталоцианинов.

рТСТТСССА 01

рТСТТСССАТТ 02

рТСТСТСТСТСТСТ ОЗ pGGGTAACT 04

pAGGGTAACT 05

pAAGGGTAACT 06

pAAAGGGTAACT 07 pAAAAGGGTAACT 08 pAAAAAGGGTAACT 09 Рис. 2. Последовательность олигодезоксирибонукпеопадов.

межмолекулярные ассоциаты. Данное свойство затрудняют синтез конъюгатов фталоцианинов с олигонуклеотидами. Для решения этой проблемы были использованы фталоцианины, содержащие в структуре четыре карбоксильные группы: тетра-4-карбоксифталоцианин Со(П), тетра-4-карбоксиметилтиофталоцианин Zr\(lT), тет-ра-[4-карбоксипентилсульфамил]фталоциа-нин А1(111) (Рис. 1). Последовательности олигонуклеотидов, использованных в синтезе конъюгатов, приведены на Рис. 2 (префикс «<1» опущен).

Синтез конъюгатов олигонуклеотидов с тетракарбоксифталоцианинами Со(П), гп(11) и А1(1П) проводили в растворе или на твердом носителе.

Синтез в растворе проводили согласно Схеме I. В ходе синтеза происходило взаимодействие свободной аминогруппы про-пилендиаминового линкера, предварительно присоединенного к 5'-концевой фосфат-

-о-^о-оон

о-|

ОМАР

»«-».о-оотг

¿.Гу О"

НгИ (СН,),Г«Н,

* 9

(СН1)э N11 Р О

V

Ис (со-гч^ь

1,1 М №НСОз о

НХО:ОМР(1 :1 \>ы\

И

ГИ(С-ОН)гС Н^ИСН;^ р-оом ООИ-рТСГГСССА °

Схема I

н,лчси), аоол"—

о Я

РИ-(СО. (О и I ОРЕАЛ)МР

О V-1 I _

О V о о » /^л

«(Ьо-К 1Ь-СНГ< (СН),о-ооглиСРС1 ¿НН/ИКш) I И С, 12 чясм О О 1

Ис-(Й.О.™1)г<^НР1.(С11)4.0-ООЛ

•ЛМК.НСО, I 45 Гм«, 1.1 М N1^0, | О О

Р1с-(&он)] Ьтмсн), о-ооп

ПИН 1111111)»И111И1 раииш!

аклпомшьнсп (01 -ОЯ)

СРС-стаст с контролируемым размером вор

Схема П

нои группе олигонуклео-тида, с избытком Ы-гидроксисукцинимидного эфира соответствующего фталоцианина. Выход конъюгатов фталоцианинов Со(П), гп(11) и А1(Ш) составил 25 %, 15 % и 30 %, соответственно.

Основной причиной низких выходов конечных продуктов при синтезе в растворе являлась сложность отделения целевого

Таблица 1. Строение и выходы конъюгатов,

Конъюгат ИсМе, Ме сюк Линкер Выход конъюгата, %

К1 Со(И) ох -№НСН2)3-о- 40

К2 Хп(1Г) 01 -МН-(СН2),-0- 30

КЗ А1(Ш) 01 -ШЧСН2)3-0- 35

К4 Со(П) 01 -ШЧСВДб-О- 40

К5 гп(П) 01 -ЫН-(СН2)6-0- 30

Кб А1(Ш) 01 -шчсн2)6-о- 35

К7 Со(11) 02 -ЫНЧСН2)6-0- 70

К8 Со(П) оз -Ш-(СН2)6-0- 70

К9 Со(П) 04 -ШЧСН2)6-0- 70

К10 Со(11) 05 -Ш-(СН2)б-0- 70

К11 Со(11) Об -МН-<СН2)6-0- 70

К12 соал 07 -ИНЧСНД-О- 65

К13 с«а1) 08 -ШЧСН2)б-0- 65

К14 Со(11) 09 -ЫН-(СН2)6-0- 60

продукта синтеза от избытка фталоцианина. Эту проблему решали путем проведения синтеза конъюгатов на твердом носителе согласно Схеме II, что позволило увеличить выход конъюгатов К1-К14 в некоторых случаях до 70 % (Табл. 1).

Полученные конъюгаты охарактеризовали с помощью электронной спектроскопии и МАЫЛ-ТОР масс-спектрометрии. Электронные спектры поглощения фталоцианинов изменялись в области 600-700 нм после их присоединения к олигонуклеотидам (Рис. 3). При этом появлялся максимум поглощения на длине волны около 260 нм, характерный для олигонуклеотидов.

« б €

Рис. 3. Электронные спектры поглощения водных растворов фталоцианинов Со(Т1) а, 2п(П) 6, А1(Ш) в (-) и их олигонуклеотидных производных (-■).

Масс-спектры конъюгатов фталоцианинов Со(И) и 2п(Н) содержали пики, соответствующие как массам конъюгатов, так и массам продуктов их деградации. Такая деградация возможна при ионизации образцов в процессе МАЫЛ-ТОЕ масс-спеюрометрического анализа. Спектр конъюгата фталоцианина А1(Ш) содержал пики, соответствующие только массам продуктов деградации конъюгата.

2. Изучение комплексообразования между конъюгатами олигонуклеотидов, содержащими фталоцианин Со(П), и комплексами ДНК

Для изучения влияния остатка фталоцианина Со(П), находящегося в составе конъюгатов, на образование одно-, двух-, трех- и четырехнитевых комплексов ДНК регистрировали оптические кривые плавления и спектры кругового дихроизма (КД). Оптические кривые плавления комплексов регистрировали на длинах волн: 260, 270, 280, 300 и 360 нм. В свою очередь, изменения спектров кругового дихроизма комплексов регистрировали в диапазоне температур от 10 °С до 95 °С. Из оптических кривых плавления были получены термодинамические параметры устойчивости различных комплексов.

2.1. Взаимодействие с одноцепочечными ДНК Влияние остатка фталоцианина на термодинамические параметры образования дуплексов изучали, сравнивая комплексы Д1 и Д2 (Рис. 4), образованные олигонуклеотидом 01 и конъюгатом К4 с модельным ДНК-фрагментом М1 в буфере состава: 0,16 М №С1, 20 мМ Ыа2НР04 (рН7,4), 1 мМЕОТА.

5' АТС«ЗАА<ЗАОСК 3' М1

у рТСТТСССА

П1 5' АТОЮААеАССС у М1 У АСССТТСТр 5' О!

5' РЬс-Со(Н)-РТСТТСССА 3' К4 3' М1

П2 5' атосЬАЛЗАЕ«;

" 3' АСССТТСТр-РГс-Со(П) 5' к«

Рис 4 Последовательность олигонуклеотидов 01 и М1, конъюгата К4 и структуры образуемых ими дуплексов Д1 и Д2

»10-3

20 40 Температура, С

Обнаружено, что в самом конъюгате К4 происходило образование внутримолекулярного комплекса между олигонуклеотидной частью конъюгата и остатком фталоцианина с Тт «18 °С.

Установлено, что температура плавления комплекса Д2 была на 6°С выше температуры плавления комплекса Д1 (Рис. 5), что указывало на наличие стабилизирующего влияния остатка фталоцианина при образовании двухцепо-чечных комплексов ДНК. Доказательством взаимодействия остатка фталоцианина с

250 300 350' Длина волны, ни

250 300 350 Длина волны ни

б

Рис 5 Дифференциальные кривые термической денатурации (а, в) и спектры КД при различных температурах (б, г) дуплексов Д1 (а, 6) и Д2 (в, г)

ДНК также являлось совпадение формы дифференциальной кривой плавления, регистрируемой на длине волны 300 нм и относящейся к поглощению остатка фталоцианина, с формами дифференциальных кривых плавления, регистрируемых на длинах волн 260, 270 и 280 нм. Этот результат свидетельствовал о том, что все дифференциальные кривые плавления описывали один тот и же процесс. Другими словами, «плавление» остатка фталоцианина происходило одновременно с плавлением олигонуклеотида.

Методом КД было показано (Рис. 5), что комплекс Д2 плавился при более высокой температуре, чем комплекс Д1, что подтверждало вывод о стабилизирующем влиянии остатка фталоцианина Со(Н) на образование дуплексов.

2.2. Взаимодействие с двухцепочечными ДНК

Влияние остатка фталоцианина на стабильность трехцепочечных комплексов ДНК изучали на модельных триплексах Т1-Т4 (Рис. 6), образующихся при взаимодействии двухцепочечных участков олигонуклеотидов ДЗ и Д4, имеющих форму шпилек, с одноцепочечным олигонуклеотидом О! или конъюгатом К4 в буфере состава: 0,1 М ЫаС1, 5 мМ MgCl2, 10 мМ какодипат Ыа (рН 5,3).

ПЗ 5' СССТСТТСССТт М2 у еоедоААеоетТ

Т1

5* СССТСТТСССТт у С65АСААеебт* 5' рТСТТСССА

у АСССТТСТр

М2 ТЗ

01

СССТСТТСССТт ОЭСАСААСССтТ

• Я У

у СЕЕААСА13«ЗТТ ^ ,, е(ЖААОАССС

«« у ссст^стссстТ Т2 сссттстссс

5' Р1:с-Со (И)-рТСТТСССА з< К4 у АСССТТСТр-РСС-Со(П) 3' К4

у СССТТСТССС ^ т ш Т4 5' СССТТСТСССт»

Рис 6 Структура олигонуклеотидов ДЗ и Д4 и трехцепочечных комплексов ДНК Т1-Т4

■ т

260 им 270 нм 280 нм 300 нм 360 нм

20 15-

I»

5' О-

20 40 60 60 100 Температура, С

260 нм 270 нм 260 нм 300 нм 360 нм

20 40 60 60 100 Температура, С

* А. —

о-ю _¡5

13С

20 с 21С 30С 3*С 40 С

Добавление к оли-гонуклеотидам-мише- щ ням ДЗ и Д4 олигонук- | леотида 01 в качестве третьей цепи не приводило к появлению на дифференциальных кривых плавления нового перехода. Наблюдали лишь переходы, соответствующие плавлению шпилечных участков в ДЗ и Д4, с Тт — 76,9 °С и 74,0 °С, соответственно. Следовательно триплексы Т1 и Т2 не образовывались.

В случае комплексов ТЗ и Т4 дифференциальные кривые плавления содержали по два перехода (Рис. 7а, 7в), один из которых, при высокой температуре, соответствовал плавлению шпильки, а второй, при низкой температу-6

250 300 350 Длина волны, нм

яс «с

7* С

мс

~2Й 300 350—"С Длина волны, нм

Рис 7 Дифференциальные кривые термической денатурации (в, в) и спектры КД при различных температурах (6, г) триплексов ТЗ (а, 6) и Т4 («, г)

ре, — плавлению третьей Таблица 2 Термодинамические параметры процесса цепи с Тт = 20,1 °С для ТЗ и 19,9 °С для Т4. Спектры КД, соответствующие три-плексам ТЗ (Рис. 76) и Т4 (Рис. 7г) изменялись в диапазонах 15-25 "С и 6585 "С, что также указывало на наличие двух переходов.

Из оптических кривых плавления свободного конъюгата К4, дуплексов Д1-Д4 и триплексов Т1-Т4 были рассчитаны термодинамические параметры процессов диссоциации: ДБ0, ДН°, ДО°25, ДО°37 (Табл. 2).

Из данных, представленных в Табл. 2, видно, что в случае дуплексов Д1 и Д2 изменение свободной энергии Гиббса Дв0, рассчитанное для 25 °С и 37 "С, возрастало, если в образовании комплекса принимал участие остаток фталоцианина.

Поскольку было зарегистрировано лишь образование триплексов, содержащих остатки фталоцианина Со(П), то невозможно было количественно оценить влияние фталоцианина на стабильность этих комплексов. Однако, само наличие переходов на оптических кривых плавления и в спектрах КД, соответствующих образованию триплексов ТЗ и Т4, являлось доказательством стабилизирующего действия молекулы фталоцианина на трехнитевые комплексы ДНК.

2.3. Взаимодействие с трехцепочечными ДНК

Влияние остатка фталоцианина на образование тетраплексов изучали в комплексах Т5 и Т6, содержащих теломерные повторы хромосомы человека ТТАвОО (Рис. 8) в буфере состава: 1 М КС1, 10 мМ К2НР04, 0,1 мМ БЭТА (рН 7,0). Конъюгаты К9-К14 содержали олигонуклеотиды 04-09 длиной 8, 9, 10, 11,12 и 13 звеньев.

Анализ оптических кривых плавления не позволил надежно доказать образование тетраплексов, поскольку диссоциация разных цепей происходила примерно в одном и том же температурном диапазоне.

диссоциации комплексов Д1-Д4, Т1-Т4 и конъюгата К4.

Комплекс т 1 т> °с ДБ06, кал/(К*моль) ДН06, ккал/моль до06«, ккал/моль до%, ккал/моль

К4" 17,6 135,9 39,5 -1,0 -2,6

Д1 28,1 180,1 61.5 7,8 5,7

да 34,2 156,7 55,6 8,9 7,0

да- 76,9 186,2 65,5 10,0 7,8

Т1" 76,4 181,5 63.5 9,4 7,2

ТЗ 20,1 70,0 27,6 6,7 5,9

ТЗ* 76,7 230,5 80,6 11,9 9,1

Д4° 74,0 168,8 58,6 8,3 6,3

Т2" 73,6 179.6 62.3 8.8 6.6

Т4 19,9 153,3 52,0 6,3 4,5

Т4' 75,0 174,9 60,9 8,8 6,7

■внутримолекулярный переход,

'погрешность в расчетах не превышала 19,18 и 11 % для Дв", АН" и ДО0, соответственно

Метод спектроскопии КД, у Асттакхлташзттаим уж у рСОСТААСТ у 04 более чувствительный к измене- у рсс-соиц-рссотмст у ю

у ГСс-Со(ПЬрй«аЗТААСТ у Я.0

НИЮ структуры, ПОЗВОЛИЛ детек- у Кс-Со (пЬрААоестмст у кХ1

у РЬс-Со(11>—рААДСССТАДСТ 3' К12

тировать образование тет- у мс-соиц-раааассстдасг у из

у ГСс-Со(11>-рАААААОССТААСТ 3' И4

раплекса Т5, образованного без _ у

участия остатка фталоцианина. ^¡¡¡^т ш т65.

Образование тетраплекса Т6 » * »»«»«.¿ыад,»«

Рис. 8. Строение олигонуклеотидов М4 и 04, конъю-удалось зарегистрировать ТОЛЬ- гатов К9-К14 и структуры, образуемых ими, тетрап-

ко в случае конъюгата К14, дли- лексов Т5 и Тб.

на олигонуклеотидной части которого составляла тринадцать нуклеотидов.

Спектр КД тетраплекса Т5 содержал отрицательную полосу на 240 нм и две положительные полосы с максимумами на 265 и 286 нм. В спектр КД тетраплекса Т6, в отличие от спектра Т5, самая крайняя длинноволновая полосы была смещена в коротковолновую область на 2 нм. Такое изменение положения максимума могло бьггь вызвано лишь взаимодействием остатка фталоцианина с ДНК в составе комплекса Т6, поскольку спектр наведенного КД конъюгата К14, возникающий при взаимодействии остатка фталоцианина с олигонуклеотидной частью конъюгата, содержал только одну положительную полосу с максимумом на 260 нм.

На основании этих данных был сделан вывод, что остаток фталоцианина создавал стерические затруднения для образования тетраплексов. Для образования таких комплексов в нуклеотидную часть конъюгата необходимо включать дополнительные нуклеотиды для пространственного удаления остатка фталоцианина от области формирования тетраплекса.

3. Исследование способности коиъюгатов олигонуклеотидов с фталоцианинами вызывать селективную модификацию ДНК

Конъюгаты олигонуклеотидов с фталоцианинами испытывали как реагенты для направленной модификации ДНК в составе различных комплексов. Исследование проводили как с конъюгатами фталоцианина Co(II), катализирующим в темновых условиях образование радикалов О; и 'ОН при восстановлении Ог и Н202, так и с конъюгатами фталоцианинов Al(III) и Zn(II), сенсибилизирующих генерацию синглетного молекулярного кислорода. Модификацию в ДНК выявляли после обработки 1 М пиперидином или Fpg-белком, ферментом репарации из Е. coli, который расщепляет ДНК преиму-

щественно по остаткам 7,8-дигидро-8-оксогуанозина, устойчивым к щелочной обработке.

3.1. Каталитическая модификация ДНК

Окислительную модификацию ДНК- _ лмв

мишеней конъюгатами олигонуклеоти- Т6 у »оттдЩт1

У ТСААТОССШу-Рк-СоШ) У

дов с Р1сСо(П) проводили либо молеку-

5. йог;А;; АСА* АС АС АСА у

лярным кислородом В присутствии СО- Т7 тстстстстстстр-рт£-с0(11)

г г г У Р1с-Со(Н)-рТСТСТСТСТСТСТ у

пряженных восстановителен, таких как

пц ]' С С С С С А С А С А С АС А С А С А

дитиотреит, 2-меркаптоэтанол и аскорбиновая кислота (Н2А), либо пероксидом д6 водорода. Остаток Р1сСо(П) выступал в

Д® 3' ТСТСТСТСТСТСТр-Р(с-Со<11> у

ТСААТйССААСАСССТСАССТТ АСССТТСТР-Р1С

ТвААТСввАЛаАвОСТСАВвТТ

качестве катализатора окисления ДНК Ю г ""«""р-'«*"»

Рис. 9. Структуры олигонуклеотидных молекулами 02 ИЛИ Н2О2. В качестве комплексов, используемых в исследова-

мишеней использовали фрагменты ДНК, нии модификации ДНК. входящие в состав комплексов различной структуры: тетраплексов, триплексов, дуплексов (Рис. 9).

В тетраплексе Т6 модификация мишени М4 конъюгатом Р1сСо(П)-ЫН-(СН2)б-0-рАААААСССТААСТ (К14) протекала с низким выходом и составляла около 10 %. Это могло быть вызвано структурными особенностями тет-раплекса, приводящими к низкой досягаемости остатков С для радикалов кислорода, продуцируемых Р1сСо(П).

Для исследования модификации ДНК в составе трехцепочечных комплексов использовали конъюгат Р1сСо(Д)-Ш-(СН2)6-0-рТСТСТСТСТСТСТ (К8), который мог образовывать с олигонуклеотидом-мишенью ООСКЗОА-САСАОАОАСАСА (М5) как дуплекс Д5, так и триплекс Т7 (Рис. 9). В образовании трехцепочечного комплекса принимали участие две молекулы конъ-югата К8. Образование двух- и трехцепочечных комплексов регулировали буферными условиями (состав буферов был приведен выше).

Модификацию ДНК проводили в присутствии пероксида водорода. Распределение по сайтам модификации определялось местом локализации реак-ционноспособной группы, то есть, зависело от того, в каком комплексе ДНК, двух- или трехцепочечном, протекала модификация (Рис. 10). Если в дуплексе модификации подвергались основания С13-017, расположенные на З'-конце олигонуклеотида-мишени, то в триплексе модифицировались преимущественно основания А6-А10 и, в незначительной степени, 015-017. Выход щелоче-

А-*——М1

лабильной модификации ДНК в * 14]_ ■■ дуплекс да

__ £121 ■■ триплекс Т7

составе триплекса Т7 составил около 30 %. Примерно такой же уровень модификации наблюдали для дуплекса Д5.

При исследовании модификации ДНК в составе дуплексов в17А1«в15А14в1»А12б11АМ ев а. от де конъюгатами олигонуклеотидов Модифицированные основания

«V! /тт\ с. Рис 10 Распределение модифицированных

С ПсСо(11) была проведена ОП- оснований олигонуклеотида-мишени М5 в

тимизация условий модифика- зависимости от локализации остатка фталоциа-

нина коньюгагга К8 на 3'- или З'-конце мишени

ЦИИ И изучены кинетические Модификацию детектировали обработкой в 1 М

закономерности процесса. Рас- пиперидине [М5] = 1,0x10* м, [К8] - 1,0хкг5

_ . М, [Нг021 = 1,0x10'2 М Время - 24 часа, Т =

пределение сайтов модифика- 25°с

ции мишени ТОААТССЮАА-ОАСЮСТСАСОТТ (Мб) конъюгатами Р1сСо(П)-ЫН-(СН2)6-0-

рТСТТСССА (К4) и Р1сСо(И)- К4 " " " д д+(.

ЫН-(СН2)6-0-рТСТТСССАТТ нп * *

(К7) в составе дуплексов Д6 и Д7, соответственно, представлено на Рис. II. Видно, что в присутствии пероксида водорода в ^ ^ 2а основном модифицировались 67 основания 013-015, расположен- м ные в районе локализации реак-ционноспособной группы. Состав модифицированных осно-

Рис 11. Анализ продуктов окислительной модифи-ваний, получаемых при дейст- кацт мишени Мб конъюгатами К7 и К4 в составе

ВИИ конъюгатов К4 И К7, был дуплексов Д7 (дорожки 1,2, 5) и Д6 (дорожки 3,4,6)

в присутствии пероксида Радиоавтограф в 20 % примерно одинаковым. В ОС- денатурирующем ПААГ после обработки пипериди-

новном модификация протекала иом 1М61 = '.О*10'* И [К7] = 1 ОжЮ"5 м, [К4] = ~]5 1,0x10'5 М, [Н202] = 1,0х 10'2 М Время - 48 часов, Т =

по остаткам и -и , среди кото- гь „с

рых главным образом модифицировался остаток О13. Дополнительными сайтами модификации являлись О19 и О20.

А4 АЗ

Зависимости степени модификации мишени Мб от концентрации конъюга-тов К4 и К7, образующими с олигонук-леотидом-мишенью комплексы Дб и Д7, соответственно, представлены на Рис. 12. Из рисунка видно, что в случае К4 выход реакции модификации увеличивался с возрастанием концентрации конъюгата во всем диапазоне концентраций, тогда как в случае конъюгата К7 с более длинным олигонуклеотидным фрагментом максимальный выход реакции модификации достигался уже при концентрации 1,0х 10"5 М.

Исследование зависимости выхода модификации от природы сопряженного восстановителя показало, что присутствие аскорбиновой кислоты в реакционной смеси приводило к неселективной модификации олигонуклеоти-да-мишени. Распределение сайтов модификации в присутствии дитиотреита и 2-меркаптоэтанола было примерно одинаковым, но выход продуктов в случае 2-меркаптоэтанола был более чем в два раза выше, чем в случае дитиотреита. Поэтому в дальнейших исследованиях в качестве сопряженного восстановителя использовали 2-меркаптоэтанол.

Была изучена зависимость выхода модификации от концентрации перок-сида водорода и 2-меркаптоэтанола. Установлено, что при концентрации конъюгата 1,0x10"4 М оптимальная концентрация пероксида водорода либо 2-меркаптоэтанола в реакционной смеси составляла 1,0x10"2 М при однократном добавлении или 1,0х 10"4 М при дробном последовательном добавлении.

Зависимость выхода модификации олигонуклеотида-мишени ТвА АТСКЮААвАОСЮТСАООТТ (Мб) конъюгатом Р1сСо(И)-Ш-(СН2)6-0-рТСТТСССАТТ (К7) в составе комплекса Д7 представлена на Рис. 13. Предельная степень модификации, выявляемая пиперидином, в присутствии 2-меркаптоэтанола составила 18 %, а в присутствии Н202 - около 80 %. В случае Н202 модификация достигала своего предела за 20 часов. В случае 2-меркаптоэтанола скорость образования продуктов была заметно ниже, при

Рис 12 Зависимость выхода реакции модификации от концентрации конъюга-тов Р^Со(11)-ЫНЧСН2)6-0-рТСТТСССА (К4) ▼ и ЩсСоО^НЧСНЛ-О-рТСТТС-ССАТТ (К7) • [Н202] = 1,0х10"2 М, Т = 25 °С Модификацию детектировали после обработки I М пиперидином

этом инкубация реакционной смеси в течение 70 часов не позволила достичь предела модификации.

В комплексе Д7 общий выход щелочелабильной модификации в присутствии Н202 составил 80%, тогда как выход модификации, детектируемой Рр§-белком, - 40 %. Поскольку Рря- * белок может, в принципе, не выявлять сайты модификации, которые выявляются пиперидином, то суммарное значение степени модификации ДНК может приближаться к 100 %.

В связи с тем, что остаток фтапо-цианина в конъюгате может сам подвергаться деградации в побочных реакциях, была исследована кинетика деградации

остатка фталоцианина в конъюгате в ствии нг02 (—) и 2-меркаптоэтанола (—)

|МЗ| = 1,0хЮ'7 М, 1К71 = 1,0x10'5 М,

присутствии Н202. Деградацию остатка фталоцианина кобальта(П) детектировали по изменению во времени оптического поглощения раствора конъюгата К4 на длине волны 631 нм в максимуме поглощения остатка Р1сСо(П). Показано, что скорость деградации описывается уравнением (1):

10 20 30 40 50 60 70 Время, ч

Рис 13 Зависимость от времени степени модификации олигонуклеотида Мб конъ-югатом К7 в составе дуплекса Д7 присут-

[Н2Ог| и 12-меркаптоэтаиол1 = 1,0x10"2 М Т = 25 °С Модификацию детектировали после обработки 1 М пиперидином

d[PteCo( II)/ dt

-kd[PtcCo( II )ЦН202/

(1)

Значение kj в этом уравнении равно (3,0+0,5)* 10"' М"'хмин"'.

Предварительная инкубация конъюгата К7 в присутствии Н202 до полной деградации реакционноспособной группы не приводила к потере способности образовывать комплекс с мишенью, по- р + х «-> РХ скольку добавление такого инактивированного реагента в реакционною смесь вызывало снижение выхода модификации.

Следовательно, при избытке конъюгатов PtcCo(II) модификация ДНК-мишеней протекает в условиях конкурентного ингибирования нереакционноспособной формой реагента, возникающей в побочной реакции. Для описания процесса модификации ДНК была предложена кинетическая схема III, где Р - мишень,

px+H2O2 ->PZ

x+h2o2-»r

Р + R PR

Схема III

(Кх)

(kä) (К*)

X - реагент, И. - дезактивированный реагент, РХ и РЯ - соответствующие комплексы, РЪ - продукт модификации.

Экспериментальные данные были обра- ,

ботаны по уравнению (2), соответствующему Р) ^ 1+к„х,) ^ ' кинетической схеме III. В этом уравнении Хо —

концентрация конъюгата, у = Кх - константа образования комплекса, [PZ]Jpo - предельная по времени степень модификации. Из Табл. 3 видно, что значение у, как в случае К4, так и в случае К7, больше единицы. Это означало, что скорость деградации реагента в побочных реакциях мишени. Поэтому конъюгаты способны ческом режиме.

3.2. Фотосенсибнлизированная модификация ДНК

Сенсибилизированную модификацию ДНК проводили в условиях образования полного дуплекса Д6 (Рис. 9). В качестве реагентов использовали конъюгаты Р1с2п(П)-КН-(СН2)3-0-рТСТТСССА (К2), 1ЧсА1(Ш)-Ш-(СН2)з-0-рТСТТСССА (КЗ), Р1с2п(11)-Ш-(СН2)6-0-рТСТТСССА (К5) и РгсА1(Ш)-Ш-(СН2)6-0-рТСТТСССА (Кб). Поскольку оптические спектры поглощения фталоцианинов Zn(П) и А1(Г11) содержали полосу Соре на длине волны 340 нм и две О-полосы на 630 и 680 нм, остатки фталоцианинов возбуждали либо СВеТОМ ртутной ЛаМПЫ (А.тах = 365 нм), либо светом гелий-неонового лазера (^пых = 633 нм). Для вырезания из спектра ртутной лампы ультрафиолетовой области ниже 340 нм, использовали фильтр БС-4. Фталоцианины Zт^(ll) и А1(П1) сенсибилизировали генерацию '02 при передаче энергии возбуждения на молекулы 02.

При облучении реакционных смесей в течение 3 часов при 5 °С светом ртутной лампы (1000 Вт) выход реакции мо-

Таблица 3. Параметры у и К%

Конъюгат 1

К4 1,3 ±0,1 8,8х104±2,0хЮ4

К7 1,8 ±0,3 5,0x10* ±1,7*105

была меньше скорости модификации проводить модификацию в каталити-

в15 в14 в13 С|1 вв в7 <Х

Модифицированные основания Рис. 14. Распределение модифицированных

оснований олигонуклеотида-мишени ТОАА-Т<ХЮААОА(ХЮТСА(ЮТТ (Мб) в случае сенсибилизированной модификации конъю-гатами К5 и Кб при облучении светом гелий-неонового лазера на длине волны 633 нм. Модификацию выявляли 1 М пиперидином.

дификации мишени Мб после обработки пиперидином составил 18 % и 14 % для конъюгатов К2 и К5, соответственно. После обработки Fpg-бeлкoм выход модификации мишени достигал только 8 % и 6 % для конъюгатов К2 и К5, соответственно. Сравнение выходов модификации для конъюгатов К2 и К5 показало, что в случае конъюгата К2 выход выше, чем для конъюгата К5 как при выявлении модификации пиперидином, так и при выявлении Рр§-белком. Модификация мишени Мб конъюгатами как К2, так и К5 преимущественно протекала в области в1'-О20. Главным образом модификации подвергались основания О13 и в15, что, по-видимому, связано с локализацией остатка фталоцианина в этой области.

В случае конъюгата фталоцианина А1(Ш) КЗ выход реакции модификации, выявляемый после обработки пиперидином и Рр£-белком, составил 12 % и 5 %, соответственно. Для конъюгата фталоцианина А1(П1) Кб степень модификации, детектируемая как с помощью пиперидина, так и после обработки Fpg-бeлкoм, была примерно одинакова и составила 5-7 %.

Реакционные смеси, содержащие конъюгаты К5 и Кб, облучали светом гелий-неонового лазера (1=633 нм, 10 мВт) в течение 30 минут при 25 °С. Выход модификации олигонуклеотида-мишени Мб, выявляемый после обработки пиперидином, был выше в случае конъюгата К5 по сравнению с конъ-югатом Кб и составил 24 % и 10 %, соответственно. Распределение сайтов модификации в случае конъюгатов фталоцианина А1(П1) Кб и фталоцианина гп(И) К5 отличалось незначительно (Рис. 14).

Следовательно, при возбуждении как УФ-светом, так и видимым светом более активным в отношении модификации ДНК оказался комплекс фталоцианина гп(П). Поскольку набор продуктов модификации, выявляемых пиперидином и Рр§-белком, может, в принципе, не перекрываться, то общий выход модификации может составлять сумму величин, получаемых двумя методами.

Выводы

1. Впервые синтезированы конъюгаты олигодезоксирибонуклеотидов с тет-ра-4-карбоксиметилтио-фталоцианином Хп(11) и тетра-[4-карбокси-пентилсульфамоил]фталоцианином А1(Ш) как в растворе, так и на твердом носителе, а также с тетра-4-карбоксифталоцианином Со(П) на твердом носителе.

Методами термической денатурации и кругового дихроизма изучено влияние остатка тетра-4-карбоксифталоцианина Со(П) в составе конъю-гатов олигодезоксирибонуклеотидов на образование различных комплексов ДНК:

• установлено, что остаток тетра-4-карбоксифталоцианинаСо(П) в составе конъюгата взаимодействует с олигонуклеотидной частью, образуя внутримолекулярный комплекс;

• показано, что конъюгат тетра-4-карбоксифталоцианинаСо(11) с олигодезоксирибонуклеотидом стабилизирует двухцепочечные и трехцепочечные комплексы ДНК;

• обнаружено, что остаток тетра-4-карбоксифталоцианинаСо(11) в составе конъюгата стерически препятствует образованию четы-рехцепочечного комплекса ДНК, что может быть преодолено пространственным удалением остатка фталоцианина путем включения дополнительных нуклеотидов в конъюгат;

• методом термической денатурации получены термодинамические параметры взаимодействия конъюгатов тетра-4-карбокси-фталоцианина Со(П) с нуклеиновыми кислотами в составе дуплексов и триплексов.

Показано, что конъюгаты олигонуклеотидов с металлокомплексами фта-лоцианинов способны катализировать направленную окислительную модификацию ДНК как при облучении, так и в темновых условиях:

• обнаружено, что конъюгаты тетра-4-карбоксиметилтиофтало-цианина Хп(1Т) и тетра-[4-карбоксипентилсульфамоил]фтало-цианина А1(Ш) сенсибилизируют направленную модификацию ДНК в составе дуплексов при облучении светом ртутной лампы ф-шах = 365 нм) или светом гелий-неонового лазера (Хщ^ = 633 нм);

• установлено, что конъюгат тетра-4-карбоксифталоцианина Со(П) в составе дуплексов, триплексов и тетраплексов способен катализировать окисление ДНК молекулярным кислородом в присутствии сопряженных восстановителей или пероксидом водорода;

• обнаружено, что в дуплексах конъюгат тетра-4-карбокси-фталоцианина Со(П) в присутствии пероксида водорода вызывает высокоэффективную направленную модификацию ДНК.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Коваль В.В., Черноносов А.А., Абрамова Т.В., Иванова Т.М., Фёдорова О.С., Кнорре Д.Г. Синтез конъюгата тетракарбоксифталоциани-на кобальта(И) с дезоксирибоолигонуклеотидом - реагента для направленной модификации ДНК. // Биоорган, химия. 2000. Т. 26. С. 118-125.

2. Koval V.V., Chernonosov А.А., Abramova T.V., Ivanova T.M., Fedorova O.S., Derkacheva V.M., Lukyanets E.A. Photosensitized and catalytic oxidation of DNA by metallophthalocyanine oligonucleotide conjugates. //Nucleosides Nucleotides. 2001. V. 20. P. 1259-1262.

3. Chernonosov A.A., Kuznetsov N.A., Koval V.V., Pyshnyi D.V., Derkacheva V.M., Lukyanets E.A., Fedorova O.S. Thermodynamics of interaction of phthalocyanine-oligonucleotide conjugates with single- and double-stranded DNA. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2004. V. 23. P. 983-987.

4. Черноносов A.A., Кнорре Д.Г., Фёдорова O.C. Конъюгаты олигонук-леотидов с порфиринами и их аналогами - реагенты для направленной окислительной модификации нуклеиновых кислот. // Рос. хим. журнал. 2004. Т. 48. С. 83-99.

Р20873

РНБ Русский фонд

2006-4 19232

(

с

Список сокращений

Введение

1. Конъюгаты олигонуклеотидов с порфиринами и их аналогами - реагенты для направленной окислительной модификации нуклеиновых кислот

Обзор литературы)

1.1. Механизмы образования активных форм кислорода

1.1.1. Каталитическая активация молекулы кислорода

1.1.2. Образование активных комплексов с ионами переходных металлов

1.1.3. Механизм образования синглетного кислорода 15 1.1.3.1. Фотосенсибилизаторы на основе порфирина и его аналогов

1.2. Реагенты для окислительной модификации нуклеиновых кислот на основе коньюгатов олигонуклеотидов с порфиринами и их аналогами

1.2.1. Производные олигонуклеотидов с группами, способными сенсибилизировать образование синглетного молекулярного кислорода

1.2.1.1. Порфирины

1.2.1.2. Хлорины

1.2.1.3. Тексафирин и сапфирин

1.2.2. Производные олигонуклеотидов с группами каталитически активными в условиях окисления нуклеиновых кислот молекулярным кислородом и пероксидом водорода

1.2.2.1. Порфирины

1.2.2.2. Корриновый комплекс кобальта(П)

1.2.2.3. Тексафирин диспрозия(Ш)

Поиск реагентов, способных к направленному воздействию на нуклеиновые кислоты, находящиеся в клетках в составе различных комплексов, является одной из важнейших задач физико-химической биологии. Среди существующих методов создания таких реагентов можно выделить подход, впервые сформулированный в 1967 году Н. И. Гриневой и получивший название "комплементарно-адресованной модификации нуклеиновых кислот" [1]. Этот подход основан на фундаментальном свойстве нуклеиновых кислот - способности образовывать двухспиральные структуры за счет Уотсон-Криковских водородных связей (комплементарные взаимодействия). Такое свойство нуклеиновых кислот позволяет создавать реагенты на основе олигонуклеотидов, комплементарных одноцепочечным участкам ДНК-или РНК-мишеней и несущих реакционноспособные группы, которые с помощью олигонуклеотидной части реагентов направляются или "адресуются" на выбранные участки мишеней. Такой подход является наиболее универсальным методом высокоизбирательного воздействия на нуклеиновые кислоты и может быть использован для подавления развития вирусных инфекций и роста опухолей.

В реакционноспособных производных олигонуклеотидов в настоящее время применяются различные химически активные группы: термически активируемые, фотоактивируемые и каталитически активные группы. Среди таких группировок представляют интерес металлированные и неметаллированные порфирины и их аналоги. В силу уникальности своей электронной структуры эти соединения обладают широким спектром полезных свойств. Неметаллированные порфирины и их комплексы с диамагнитными металлами А1, Рф обладают фотохимической активностью как за счет сенсибилизации генерации синглетного молекулярного кислорода, так и из-за возможности прямой реакции возбужденного порфирина с нуклеиновой кислотой. Комплексы порфиринов с парамагнитными ионами переходных металлов способны катализировать окислительную деструкцию ДНК и РНК с помощью О2, Н2О2 и других окислителей.

Аналогичными свойствами обладают синтетические аналоги порфиринов -фталоцианины (тетрабензотетраазапорфирины), которые химически более стабильны, чем порфирины. К тому же электронный спектр у них сдвинут в длинноволновую область, поэтому они могут возбуждаться светом с длиной волны более 600 нм, что существенно для их применения в фотодинамической терапии.

Цель настоящей работы состояла в комплексном изучении физико-химических свойств новых потенциальных ген-направленных реагентов - конъюгатов олигонуклеотидов с фталоцианинами Со(П), А1(Ш) и гп(П). Для решения поставленной задачи были разработаны методы синтеза в растворе и на твердом носителе конъюгатов олигонуклеотидов с фталоцианинами, содержащими в боковых заместителях карбоксильные группы. Методами кругового дихроизма и термической денатурации было исследовано влияние остатка фталоцианина на процессы образования дуплексов, триплексов и тетраплексов, происходящие с участием конъюгатов олигонуклеотидов с фталоцианинами. Методом термической денатурации были получены термодинамические параметры устойчивости дуплексов и триплексов. Полученные конъюгаты были испытаны как потенциальные ген-направленные реагенты для окислительной модификации модельных ДНК-мишеней как в темновых условиях, так и при облучении светом ртутной лампы или гелий-неонового лазера.

В результате проведенного исследования получены данные, свидетельствующие о способности производных олигонуклеотидов с металлокомплексами фталоцианинов вызывать эффективную и селективную окислительную модификацию нуклеиновых кислот. Такие соединения перспективны для дальнейшего практического использования в качестве препаратов для темновой и фотодинамической терапии различных заболеваний.

Выводы

1. Впервые синтезированы конъюгаты олигодезоксирибонуклеотидов с тетра-4-карбоксиметилтиофталоцианином Ъг\(\\) и тетра-[4-карбоксипентил-сульфамоил]фталоцианином А1(Ш) как в растворе, так и на твердом носителе, а также с тетра-4-карбоксифталоцианином Со(П) на твердом носителе.

2. Методами термической денатурации и кругового дихроизма изучено влияние остатка тетра-4-карбоксифталоцианина Со(И) в составе конъюгатов олигодезоксирибонуклеотидов на образование различных комплексов ДНК:

• установлено, что остаток тетра-4-карбоксифталоцианина Со(П) в составе конъюгата взаимодействует с олигонуклеотидной частью, образуя внутримолекулярный комплекс;

• показано, что конъюгат тетра-4-карбоксифталоцианина Со(П) с олигодезоксирибонуклеотидом стабилизирует двухцепочечные и трехцепочечные комплексы ДНК;

• обнаружено, что остаток тетра-4-карбоксифталоцианина Со(И) в составе конъюгата стерически препятствует образованию четырехцепочечного комплекса ДНК, что может быть преодолено пространственным удалением остатка фталоцианина путем включения дополнительных нуклеотидов в конъюгат;

• методом термической денатурации получены термодинамические параметры взаимодействия конъюгатов тетра-4-карбокси-фталоцианина Со(И) с нуклеиновыми кислотами в составе дуплексов и триплексов.

3. Показано, что конъюгаты олигонуклеотидов с металлокомплексами фталоцианинов способны катализировать направленную окислительную модификацию ДНК как при облучении, так и в темновых условиях:

• обнаружено, что конъюгаты тетра-4-карбоксиметилтиофталоцианина Ъп{\\) и тетра-[4-карбоксипентилсульфамоил] фталоцианина А1(Ш) сенсибилизируют направленную модификацию ДНК в составе дуплексов при облучении светом ртутной лампы (Хтах = 365 нм) или светом гелий-неонового лазера (Хтах = 633 нм);

• установлено, что конъюгат тетра-4-карбоксифталоцианина Со(П) в составе дуплексов, триплексов и тетраплексов способен катализировать окисление ДНК молекулярным кислородом в присутствии сопряженных восстановителей или пероксидом водорода;

• обнаружено, что в дуплексах конъюгат тетра-4-карбоксифталоцианина Со(П) в присутствии пероксида водорода вызывает высокоэффективную направленную модификацию ДНК.

Заключение

В представленной работе впервые синтезированы конъюгаты олигонуклеотидов с фталоцианинами двумя методами: в растворе и на твердом носителе. Данные методы синтеза позволяют достаточно легко синтезировать конъкЗгаты с использованием доступных химических реактивов и оборудования. Хотя в случае проведения синтеза в растворе из-за особенностей строения молекулы фталоцианина не удается достигнуть высоких выходов целевого продукта, этот метод может быть использован для синтеза конъюгатов, радиоактивномеченных по 5'-концу олигонуклеотида. Такие радиоактивномеченные конъюгаты необходимы для определения места локализации конъюгатов в клетках и органах живых организмов, а также для исследования повреждения олигонуклеотидной части конъюгатов в ходе реакции модификации модельных ДНК-мишеней, что важно для определения механизма реакции и изучения кинетики процесса модификации.

Синтез на твердом носителе позволяет избежать проблему выделения конъюгатов из реакционной смеси. В этом случае избыток непрореагировавших свободных фталоцианинов выводят из реакционной смеси до удаления продуктов с твердой подложки, что чрезвычайно упрощает методику очистки. В результате, по сравнению с жидкофазным методом синтеза, выход продукта синтеза значительно возрастает.

Методами кругового дихроизма и термической денатурации на примере тетракарбоксифталоцианина Со(П) установлено, что молекула фталоцианина увеличивает стабильность различных комплексов ДНК. Обнаружено, что остаток фталоцианина взаимодействует с четырьмя-пятью нуклеотидами собственной олигонуклеотидной части конъюгата. В случае дуплексов экспериментальные данные позволяют однозначно сказать, что остаток фталоцианина увеличивает температуру плавления комплекса примерно на 6-7 °С. Стабилизация остатком фталоцианина образования триплексов установлена даже более явно, чем для дуплексов, так как образование трехцепочечного комплекса ДНК происходит только в присутствии фталоцианина. В тех же условиях, но в отсутствие фталоцианина, образование триплекса зарегистрировать не удается. В случае тетраплексов нельзя однозначно сказать о стабилизации комплекса остатком фталоцианина по следующим причинам. Во-первых, так как существует взаимодействие фталоцианина с нуклеиновой кислотой в составе конъюгата, при образовании тетраплекса приходится пространственно удалять остаток фталоцианина от участка цепи олигонуклеотидной части конъюгата, принимающей участие в образовании тетрамеров. Во-вторых, из-за кооперативной диссоциации четырехцепочечного комплекса методом термической денатурации регистрируется только один общий переход, что не позволяет оценить вклад фталоцианина в образование комплекса. Экспериментальные данные позволяют только утверждать, что фталоцианин взаимодействует с ДНК в составе тетраплекса.

Сравнение способности конъюгатов К56-К61 модифицировать модельные олигонуклеотиды в составе дуплексов показывает, что наиболее эффективными оказываются конъюгаты К58 и К61, содержащие фталоцианин Со(П). В случае конъюгата К61 максимальная степень щелочелабильной модификации, проводимой 2 в присутствии 1,0x10 М Н2О2, достигает 80 %, а степень модификации, выявляемая Fpg-бeлкoм - 40 %. Это означает, что если модификация, выявляемая Ррд-белком, полностью выявляется пиперидином, то реальная степень модификации составляет 80 %. В случае, если же какая-то часть модификации, выявляемая пиперидином, не выявляется Fpg-бeлкoм, или наоборот, какая-то часть модификации, выявляемая Рр§-белком, не выявляется пиперидином, реальный выход реакции может быть выше и достигать 100 %.

Замена Н2О2 на пару сопряженный восстановитель + 02 приводит к снижению выхода реакции модификации приблизительно до 20 - 25 %, но даже в этом случае степень модификации несколько выше, чем в случае фотоактивируемых конъюгатов.

Сопоставление степени фотомодификации конъюгатами К56, К57, К59 и К60 позволяет сделать заключение о влиянии длины аминолинкера и центрального иона металла на эффективность действия данных реагентов. Результаты экспериментов показывают, что, во-первых, выход реакции модификации в случае конъюгатов К56 и К57, содержащих аминопропанольный линкер, несколько выше, чем в случае конъюгатов К59 и К60, содержащих аминогексанольный линкер. Во-вторых, степень модификации при использовании конъюгатов К56 и К59, содержащих фталоцианин 2п(П), выше, чем в случае использования конъюгатов К56 и К57, содержащих А1(Ш). Соответственно, наиболее эффективным является конъюгат фталоцианина Zn(II) К56, содержащий аминопропанольный линкер.

Причиной низкой эффективности модификации фотоактивируемыми конъюгатами может являться способность синглетного кислорода диффундировать на значительное расстояние за время своей жизни. Время жизни синглетного кислорода и гидроксил-радикала составляет 10"6 и 10"9 секунды, соответственно. Несложно оценить средний диффузный радиус действия данных частиц по формуле Эйнштейна - Смолуховского [155]: для синглетного кислорода он составляет 45 нм, а для гидроксил-радикала - 3 нм. Видно, что гидроксил-радикал не выходит за пределы 22-х звенного олигонуклеотида TGAATGGGAAGAGGGTCAGGTT (МЗ), в котором расстояние между соседними основаниями ДНК составляет 0,34 нм [156], тогда как синглетный кислород способен диффундировать на расстояние, значительно превышающее размер олигонуклеотида-мишени. В этом случае доля активных частиц, вступивших в реакцию с ДНК вблизи их места образования, будет меньше.

В отличие от ранее предложенных порфириновых производных олигонуклеотидов, данные конъюгаты менее подвержены окислительной деструкции. Они способны модифицировать более одной молекулы мишени в расчете на молекулу конъюгата. Поэтому результаты, полученные в данной работе и показывающие способность конъюгатов, несущих фталоцианины Co(II), Zn(II) и А1(Ш), стабилизировать образование дуплексов и триплексов, а также модифицировать нуклеиновые кислоты в составе различных комплексов, имеют большое значение для дальнейшей разработки ген-направленных реагентов.

1. Belikova A.M., Zarytova V.F., Grineva N.I. Synthesis of ribonucleotides and diribonucleotides phosphates containing 2-chloroethylamine and nitrogen mustard residues. // Tetrahedron Lett. 1967. P. 3557-3567.

2. Knorre D.G., Vlassov V.V., Zarytova V.F., Lebedev A.V., Fedorova O.S. Design and targeted reactions of oligonucleotide derivatives. Boca Raton. Florida: CRC Press. 1994.

3. Cerutti P.A. Prooxidant states and tumor promotion. // Science. 1985. V. 227. P. 375-381.

4. Бердников B.M., Журавлёва O.C. Термодинамические характеристики радикала НОг в водном растворе. // Журнал физ. химии. 1972. Т. 46. С. 26582661.

5. Денисов Е. Т. Кинетика гомогенных химических реакций. М: Мир, 1978.

6. Aust S.D., Morehouse L.A., Thomas С.Е. Role of metals in oxygen radical reactions. // J. Free Rad. Biol. Med. 1985. V. 1. P. 3-25.

7. Halliwell В., Gutteridge J.M.C. Free radicals in biology and medicine. Oxford: Clarendon press, 1986.

8. Morehouse L.A., Thomas C.E., Aust S.D. Superoxide generation by NADPH-cytochrome P-450 reductase: the effect of iron chelators and the role of superoxide in microsomal lipid peroxidation. // Arch. Biochem. Biophys. 1984. V. 232. P. 366377.

9. McCord J.M., Fridovich I. The reduction of cytochrome с by milk xanthine oxidase. // J. Biol. Chem. 1968. V. 243. P. 5753-5760.

10. Das D.K., George A., Liu X.K., Rao P.S. Detection of hydroxyl radical in the mitochondria of ischemic-reperfused myocardium by trapping with salicylate. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989. V. 165. P. 1004-1009.

11. Chuaqui C.A., Petkau A. Chemical reactivity and biological effects of superoxide radicals. //Radiat. Phys. Chem. 1987. V. 30. P. 365-373.

12. Follin P., Dahlgren C. Altered O2-/H2O2 production ratio by in vitro and in vivo primed human neutrophils. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990. V. 167. P. 970-976.

13. In: Enzyme nomenclature: Recommendations (1978) of the nomenclature committee of the International Union of Biochemistry. New York: Acad. Press, 1979. P. 82.

14. Gibbs E.J., Pasternack R.F. Interaction of porphyrins and metalloporphyrins with nucleic acids. //Seminars in Hematology. 1989. V. 26. P. 77-85.

15. Winston G.W., Feierman D.E., Cederbuum A.I. The role of iron chelates in hydroxyl radical production by rat liver microsomes, NADPH-cytochrome P-450 reductase and xanthine oxidase. // Arch. Biochem. Biophys. 1984. V. 232. P. 378390.

16. Czapski G., Goldstein S. Role of metal complexes in the formation-detoxication action of active oxygen species. // Bioelectrochem. Bioenergetics. 1987. V. 18. P. 21-28.

17. Афанасьев КБ. Кислородные радикалы в биологических процессах. // Усп. химии. 1979. Т. 48. С. 977.

18. Dix Т.A., Aikens J. Mechanisms and biological relevance of lipid peroxidation initiation. // Chem. Res. Toxicol. 1993. V. 6. P. 2-18.

19. Cadet J., Teoule R. Comparative study of oxidation of nucleic acid components by hydroxyl radicals, singlet oxygen and superoxide anion radicals. // Photochem. Photobiol. 1978. V. 28. P. 629.

20. Blakely W.F., Fuciarelli A.F., Wegher B.J., Dizdaroglu M. Hydrogen peroxide-induced base damage in deoxyribonucleic acid. // Radiat. Res. 1990. V. 121. P. 338-343.

21. Link E.M. The mechanism of pH-dependent hydrogen peroxide cytotoxicity in vitro. //Arch. Biochem. Biophys. 1988. V. 265. P. 362-372.

22. Farhataziz, Ross A.B. II Nat. Stand. Ref. Data System, Nat. Bur. Stand. 1977. V. 59.

23. Richard P., Haugland Ph. Handbook of fluorescent probes and research chemicals. 6th Ed. Eugene: Molecular Probes Inc, 1996.

24. Bertinchamps A.S., Huttermann J., Kohnlein W, Teoule R. Effects of ionizing radiation on DNA. Berlin: Springer-Verlag, 1978.

25. Von Sonntag C. The chemical basis of radiation biology. London: Taylor and Francis, 1987.

26. White P. W Mechanistic studies and selective catalysis with cytochrome P-450 model systems. // Bioorgan. Chem. 1990. V. 18. P. 440-456.

27. Traylor T.G., Fann W.-P., Bandyopadhyay D. A common heterolytic mechanism for reactions of iodosobenzenes, peracids, hydroperoxides, and hydrogen peroxide with iron(III) porphyrins. // J. Am. Chem. Soc. 1989. V. 111. P. 8009-8010.

28. Traylor T.G., Xu F. Mechanisms of reactions of iron(III) porphyrins with hydrogen peroxide and hydroperoxides: solvent and solvent isotope effects. // J. Am. Chem. Soc. 1990. V. 112. P. 178-186.

29. Tsuchiya S. Stable oxo-iron(IV) porphyrin 7i-radical cation related to the oxidation cycles of cytochrome P-450 and peroxidase. // J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1991. V. 10. P. 716-717.

30. Oertling W.A., Kean R.T., Weaver R., Babcock G.T. Factors affecting the iron-oxygen vibrations of ferrous oxy and ferryl oxo heme proteins and model compounds. //Inorg. Chem. 1990. V. 29. P. 2633-2645.

31. Chen S.-M., Su Y.O. Electrochemical and spectral characterization of stable iron(IV) tetrakis-5,10,15,20-(N-methyl-4-pyridyl)porphyrin in aqueous solution at room temperature. // J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1990. V. 1. P. 491-493.

32. Koppenol W.H., Liebman J.F. The oxidizing nature of the hydroxyl radical. A comparison with the ferryl ion (FeC^. //J. Phys. Chem. 1984. V. 88. P. 99-101.

33. Ениколопян H.C., Богданова Л.Ф., Кармшова JI.B., Аскаров К.А. Катализ металлопорфиринами реакций окисления молекулярным кислородом и кислородсодержащими соединениями. //Усп. химии. 1985. Т. 54. С. 369-395.

34. Bowry T.G., Ingold K.V. A radical clock investigation of microsomal cytochrome P-450 hydroxylation of hydrocarbons. Rate of oxygen rebound. // J. Am. Chem. Soc. 1991. V. 113. P. 5699-5707.

35. Khanna R.K., Sutherlin J.S., Lindsey D. Mechanisms in a biomimetic hydroxylation of a chemical probe: 5-nitroacenaphthene. // J. Org. Chem. 1990. V. 55. P. 62336234.

36. Grieco P.A., Stuk T.L. Remote oxidation of unactivated carbon-hydrogen bonds in steroids via oxometalloporphinates. // J. Am. Chem. Soc. 1990. V. 112. P. 77997801.

37. Watanabe Y„ Takehira K, Shimizu M., Hayakawa Т., Orita H. Oxidation of aldehydes by an iron(III) porphyrin complex-m-chloroperbenzoic acid system. // J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1990. P. 927-929.

38. Rodgers K.R., Arafa I.M., Goff H.M. Iron porphyrin catalysed oxidation of propanal and cyclohexene by molecular oxygen. // J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1990. P. 1323-1324.

39. Stubbe J., Kozarich J. W. Mechanisms of bleomycin-induced DNA degradation. // Chem. Rev. 1987. V. 87. P. 1107-1136.

40. McGall G.H., Stubbe J. II In: Nucleic Acids and Molecular Biology/Eds. Eckstein F., Lilley D. M. J. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, 1988. V. 2. P. 85-104.

41. Pratviel G., Bernadou J., Meunier B. Evidence for high-valent iron-oxo species active in the DNA breaks mediated by iron-bleomycin. // Biochem. Pharmacol. 1989. V. 38. P. 133-140.

42. Sigman D.S. Chemical nucleases. // Biochemistry. 1990. V. 29. P. 9097-9105.

43. Thederahu T.B., Kuwabara M.D., Larsen T.A., Sigman B. Nuclease activity of 1,10-phenanthroline-copper: kinetic mechanism. // J. Am. Chem. Soc. 1989. V. 111. P. 4941-4946.

44. Dizdaroglu M„ Aruoma O.I., Halliwell B. Modification of bases in DNA by copper ion-1,10-phenanthroline complexes. // Biochemistry. 1990. V. 29. P. 8447-8451.

45. Johnson G.R.A., Nazhat N.B. Kinetics and mechanism of the reaction of the bis(l,10-phenanthroline)copper(I) ion with hydrogen peroxide in aqueous solution. // J. Am. Chem. Soc. 1987. V. 109. P. 1990-1994.

46. Kuwabara M., Yoon C., Goyne Т., Thederahn Т., Sigman D.S. Nuclease activity of 1,10-phenanthroline-copper ion: reaction with CGCGAATTCGCG and its complexes with netropsin and EcoRI. // Biochemistry. 1986. V. 25. P. 7401-7408.

47. Briviba K., Klotz L.O., Sies H. Toxic and signaling effects of photochemically or chemically generated singlet oxygen in biological systems. // Biol. Chem. 1997. V. 378. P. 1259-1265.

48. Singh A. Introduction: interconversion of singlet oxygen and related species. // Photochem. Photobiol. 1978. V. 28. P. 429-433.

49. Красновский A.A. Синглетный молекулярный кислород и первичные механизмы фотодинамического действия оптического излучения. // Итоги науки и техники. Сер. Соврем, проблемы лазерной физики. ВИНИТИ. 1990. С. 63-135.

50. Foote C.S. II In: Porphyrin localization and treatment of tumors/Eds. Doirion D.R., Gomer C.J. New York: Alan R. Liss., 1984. P. 3-18.

51. Кузнецова H.A., Калия O.JI. Фотокаталитическая генерация активных форм кислорода в биологических средах в методе фотодинамической терапии. // Рос. Хим. Журнал. 1998. С. 37-49.

52. Crestini С., D'Auria М. Photodegradation of lignin: the role of singlet oxygen. // J. Photochem. Photobiol. A. 1996. V. 101. P. 69-73.

53. Seen H., Spikes J., Kopecek P. Photodynamic crosslinking of proteins. I. Model studies using histidine- and lysine-containing N-(2-hydroxypropyl) methacrylamide copolymers. //J. Photochem. Photobiol. B. 1996. V. 34. P. 203-210.

54. Girotti A. W. Photodynamic lipid peroxidation in biological systems. // Photochem. Photobiol. 1990. V. 51. P. 497-509.

55. Piette J. New trends in photobiology: Biological consequences associated with DNA oxidation mediated by singlet oxygen. // J. Photochem. Photobiol. B. 1991. V. 11. P. 241-260.

56. Baker A., Kanofsky J. Quenching of singlet oxygen by biomolecules from L1210 leukemia cells. // Photochem. Photobiol. 1992. V. 55. P. 523-528.

57. Moan J. On the diffusion length of singlet oxygen in cells and tissues. // J. Photochem. Photobiol. B. 1990. V. 6. P. 3434.вЪ.Беккер Г. О. Введение в фотохимию органических соединений. JL: Химия, 1976. С. 326.

58. Dolphin D. Photomedicine and photodynamic therapy. // Canad. J. Chem. 1994. V. 72. P.1005-1013.

59. Чиссов В.И., Соколов В.В., Филоненко Е.В. Фотодинамическая терапия злокачественных опухолей. Краткий очерк развития и опыт клинического применения в России. // Рос. Хим. Журнал. 1998. С. 5-9.

60. Laurens Н. The physiological effects of radiation energy. New York: Tudor Press, 1933.

61. Eales L. И In: The porphyrins/Ed. Dolphin D. New York: Academic Press Inc., 1979. V. 7. P. 663.

62. Койфман О.И., Агеева T.A. Структурные типы порфиринов. // Усп. химии порфиринов/Ред. Голубчиков О.А. 1997. Т. 1. С. 6-26.

63. Кузьминский В.А., Соловьев КН., Цвирко М.П. Спектроскопия и квантовая химия порфиринов. // Порфирины: Спектроскопия, электрохимия, применение/Ред. Ениколопян Н.С. М.: Наука, 1987. С. 7-126.

64. Березин Б.Д., Ениколопян Н.С. Классификация. Молекулярная структура и свойства порфиринов. // Порфирины: Структура, свойства, синтез/Ред. Ениколопян Н.С. М.: Наука, 1985. С. 28.

65. Goodchild J. Conjugates of oligonucleotides and modified oligonucleotides: a review of their synthesis and properties. // Bioconjug. Chem. 1990. V. 1 P. 165187.

66. Da Ros Т., Spalluto G., Boutorine A.S., Bensasson R.V., Prato M. DNA-photocleavage agents. // Curr. Pharm. Des. 2001. V. 7. P. 1781-1821.

67. Manoharan M. Oligonucleotide conjugates as potential antisense drugs with improved uptake, biodistribution, targeted delivery, and mechanism of action. // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2002. V. 12. P. 103-128.

68. In: Antisense Research and Applications/Eds. Crooke S.T., Lebleu B. Boca Raton. Florida: CRC Press. 1993. 579 P.

69. Gait M.J. Peptide-mediated cellular delivery of antisense oligonucleotides and their analogues. // Cell. Mol. Life Sci. 2003. V. 60. P. 844-853.

70. Da Ros T., Spalluto G., Prato M, Saison-Behmoaras T., Boutorine A., Cacciari B. Oligonucleotides and oligonucleotide conjugates: a new approach for cancer treatment. // Curr. Med. Chem. 2005. V. 12. P. 71-88.

71. Battiroli G., Ramponi R., Croce A.C. Quantitative analysis of intracellular behaviour of porphyrins. // Photochem. Photobiol. 1987. V. 28. P. 7268-7275.

72. ChenX., HuiL., Foster D.A., Drain C.M. Efficient synthesis and photodynamic activity of porphyrin-saccharide conjugates: targeting and incapacitating cancer cells. //Biochemistry. 2004. V. 43. P. 10918-10929.

73. Dukh M, Saman D, Lang K, Pouzar V, Cerny I, Drasar P, Kral V. Steroid-porphyrin conjugate for saccharide sensing in protic media. // Org. Biomol. Chem. 2003. V. 19. P.3458-3463.

74. Paillous N., Vicendo P. Mechanisms of photosensitized DNA cleavage. // J. Photochem. Photobiol. B. 1993. V. 20. P. 203-209.

75. Cadet J., Decarroz C., Wanf S.Y., Midden W.R. Mechanisms and products of photosensitized degradation of nucleic acids and related model compounds. // Isr. J. Chem. 1983. V. 23. P. 420-429.

76. Kearns D.R. Physical and chemical properties of singlet molecular oxygen. // Chem. Rev. 1971. V. 71. P. 395-427.

77. Mastruzzo L., WoisardA., Ma D.D.F., Rizzarelli E., Favre A., Le Doan T. Targeted photochemical modification of HIV-derived oligoribonucleotides by antisense oligodeoxynucleotides linked to porphyrins. // Photochem. Photobiol. 1994. V. 60. P. 316-322.

78. Li H., Fedorova O.S., Trumble W.R., Fletcher T.R., Czuchajowski L. Site-specific photomodification of DNA by porphyrin oligonucleotide conjugates synthesized via a solid phase. // Bioconjug. Chem. 1997. V. 8. P. 49-56.

79. Magda D., Wright M„ Miller R.A., Sessel J.L., Sansom P.I. Site-specific photocleavage of DNA by expanded porphyrin with irradiation above 700 nm. // J. Am. Chem. Soc. 1995. V. 117. P. 3629-3630.

80. Sessel J.L., Sansom P.I., Kral V., O'Connor D., Iverson B.L. Sapphyrin-oligonucleotide conjugates. Novel sequence-specific DNA photomodifying agentswith increased binding affinity. // J. Am. Chem. Soc. 1996. V. 118. P. 1232212330.

81. Sigman D.S., Mazumder A., Perrin D.M. Chemical nucleases. // Chem. Rev. 1993. P. 2295-2316.

82. Tullius T.D. Chemical 'snapshots' of DNA: using the hydroxyl radical to study the structure of DNA and DNA-protein complexes. // Trends Biochem. Sci. 1987. V. 12. P. 297-300.

83. Волъпин М.Е., Кнорре Д.Г., Новодарова Г.Н., Тувин М.Ю., Федорова О.С., Фролова Е.И. Хелатные комплексы кобальта как катализаторы окислительного расщепления цепей ДНК. // Доклады АН. 1988. Т. 298. С. 363366.

84. Ward В., Skorobogaty A., Dabrowiak J.C. DNA cleavage of a group of cationic metalloporphyrins. // Biochemistry. 1986. V. 25. P. 6875-6883.

85. Кнорре Д.Г., Фёдорова O.C., Фролова Е.И. Окислительная деградация нуклеиновых кислот. // Усп. химии. 1993. Т. 62. С. 70-91.

86. Stubbe J., Kozarich J.W. Mechanisms of bleomycin-induced DNA degradation. // Chem. Rev. 1987. V. 87. P. 1107-1136.

87. Le Doan T., Perrouault L., Hélène С., Chassignol M., Thuong N.T. Targeted cleavage of polynucleotides by complementary oligonucleotide covalently linked to iron-porphyrins. // Biochemistry. 1986. V. 25. P. 6736-6739.

88. Le Doan T., Perrouault L„ Chassignol M., Thuong N.T., Hélène С. Sequence-targeted chemical modifications of nucleic acids by complementary oligonucleotides linked to porphyrins. // Nucleic Acids Res. 1987. V. 15. P. 86438659.

89. Иванова Е.М., Мамаев C.B., Фёдорова О.С., Фролова Е.И. Комплементарно -адресованная модификация одноцепочечного фрагмента ДНК железопорфириновым производным олигонуклеотида. // Биоорган, химия. 1988. Т. 14. С. 551-554.

90. Frolova ЕЛ., Ivanovo Е.М., Zarytova V.F., Abramova T.V., Vlassov V.V. Porphyrin-linked oligonucleotides. Synthesis and sequence-specific modification of ssDNA. //FEBS Lett. 1990. V. 269. P. 101-104.

91. Frolova ЕЛ., Fedorova O.S., Knorre D.G. Kinetic study of the addressed modification by hemin derivatives of oligonucleotides. // Biochimie. 1993. V. 75. P. 5-12.

92. Casas С., Lasey С.J., Meunier В. Preparation of hybrid "DNA cleaver-oligonucleotide" molecules based on metallotris(methyl-pyridiniumyl)porphyrin motif. //Bioconjug. Chem. 1993. V. 4. P. 366-371.

93. Mestre В., Pratviel G., Meunier В. Preparation and nuclease activity of hybrid "metallotris(methylpyridinium)porphyrin oligonucleotide" molecules having a 3'-loop for protection against 3'- exonucleases. // Bioconjug. Chem. 1995. V. 6. P. 466-472.

94. Hamilton G.A., Workman R.J., Woo L. Oxidation by molecular oxygen. I. Reactions of a possible model system for mixed-function oxidases. // J. Am. Chem. Soc. 1964. V. 86. P. 3390-3391.

95. Hamilton G.A. Oxidation by molecular oxygen. II. The oxygen atom transfer mechanism for mixed-function oxidases and the model for mixed-function oxidases.// J. Am. Chem. Soc. 1964. V. 86. P. 3391-3392.

96. Hamilton G.A., Giacin J.R., Hellman T.M., Snook M.E., Weller J.W. Oxenoid models for enzymic hydroxylations. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1973. V. 212. P. 4-12.

97. Estabrook R.W., Hildebrandt A.G., Baron J., Netter K.J., Leibman K. A new spectral intermediate associated with cytochrome P-450 function in liver microsomes. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1971. V. 42. P. 132-139.

98. Murugesan N., Hecht S.M. Bleomycin as oxene transferase. Catalytic oxygen transfer to olefins. // J. Am. Chem. Soc. 1985. V. 107. P. 493-500.

99. Bigey P., Sonnichsen S.H., Meunier В., Nielsen P.E. DNA binding and cleavage by a cationic manganese porphyrin-peptide nucleic acid conjugate. // Bioconjug. Chem. 1997. V. 8. P. 267-270.

100. Mestre В., Jakobs A., Pratviel G., Meunier B. Structure/Nuclease activity relationships of DNA cleavers based on cationi metalloporphyrin-oligonucleotide conjugates. //Biochemistry. 1996. V. 35. P. 9140-9149.

101. Magda D., Crofts S., Lin A., Miles D., Wright M., Sessel J.L. Synthesis and kinetic properties of ribozyme analogues prepared using phosphoramidite derivatives of dysprosium (III) texaphyrin. // J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. P. 2293-2294.

102. Magda D., Wright M., Crofts S., Lin A., Sessel J.L. Metal complex conjugates of antisense DNA which display ribozyme-like activity. // J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. P. 6947-6948.

103. Годовикова Т.С., Зарытова В.Ф., Халимская JI.M. Реакционноспособные фосфамиды моно- и динуклеотидов. // Биоорган, химия. 1986. Т. 12. С. 475481.

104. Sinha N.D., Striepeke S. II In: Oligonucleotides and analogues. A practical approach/Ed. Eckstein F. Oxford; New York; Tokyo: Oxford University Press, 1991. P. 185-210.

105. Promega protocols and aplications guide/Ed. Titus E. 2nd Ed. Madison: Promega Corporation. 1991.

106. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Москва: Мир, 1984. С. 402.

107. Барам Г.И., Грачев С. А. Использование перхлората лития при выделении и анализе олиго- и полинуклеотидов. // Биоорган, химия. 1985. Т. 11. С. 14201422.

108. Borer P.N. II In: Handbook of biochemistry and molecular biology: Nucleic Acids. V. I/Ed. Fasman G.D. 3rd Ed. Cleveland: CRC Press. Inc., 1975. P. 589.

109. Калверт Дж., Питтс Дж. Фотохимия. Москва: Мир, 1968.

110. Махат, A.M., Gilbert, W. Sequencing end-labelled DNA with base-specific chemical cleavages. // Methods Enzymol. 1980. V. 65. P. 499-560.

111. Ishchenko A.A., Bulychev N.V., Maksakova G.A., Johnson F., Nevinsky G.A. Single-stranded oligodeoxyribonucleotides are substrates of Fpg protein from Escherichia coli. IIIUBMB Life. 1999. V. 48. P. 613-618.

112. Stuzhin P.A., Khelevina O.G. Azaporphyrins: structure of the reaction centre and reactions of complex formation. // Coord. Chem. Rev. 1996. V. 147. P. 41-86.

113. Chen B.M.L., Tulinsky A. Redetermination of the structure of porphine. // J. Am. Chem. Soc. 1972. V. 94. P. 4144- 4151.

114. Шойхет К.Г., Фёдорова O.C. Синтез металлопорфирина с изотиоцианатной группой для мечения олигонуклеотидов. // Сиб. Хим. Журнал. 1991. Вып. 4. С. 32-36.

115. Johnson W.C., Jr. Determination of the conformation of nucleic acids by electronic CD. // In: Circular dichroism and the conformational analysis of biomolecules/Ed. Fasman G.D. New York: Plenuim Press, 1996. P. 433-468.

116. Cantor C.R., Warshaw M.M., Shapiro H. Oligonucleotide interactions. 3. Circular dichroism studies of the conformation of deoxyoligonucleotides. // Biopolymers. 1970. V. 9. P. 1059-1077.

117. Baase W.A., Johnson W.C., Jr. Circular dichroism and DNA secondary structure. // Nucleic Acids Res. 1979. V. 6. P. 797-814.

118. Allshire R.C., Dempster M., Hastie N.D. Human telomeres contain at least three types of G-rich repeat distributed non-randomly. // Nucleic Acids Res. 1989. V. 17. P. 4611-4627.

119. TchouJ., KasaiH., ShibutaniS., Chung M.-H., Laval J., Grollman A.P., Nishimura S. 8-Oxoguanine (8-hydroxyguanine) DNA glycosylase and its substrate specificity. // Proc. Natl Acad. Sei. USA. 1991. V. 88. P. 4690-4694.

120. Tchou J., Bodepudi V., Shibutani S., Antoshechkin I., Miller J., Grollman A.P., Johnson F. Substrate specificity of Fpg protein. Recognition and cleavage of oxidatively damaged DNA. //J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 15318-15324.

121. Karakaya A., Jaruga P., Bohr V.A., Grollman A.P., Dizdaroglu M. Kinetics of excision of purine lesions from DNA by Escherichia coli Fpg protein. // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 474-479.

122. Jurado J., Saparbaev M., Matray M.J., Greenberg M.M., Laval J. The ring fragmentation product of thymidine C5-hydrate when present in DNA is repaired by the Escherichia coli Fpg and Nth proteins. // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 7757-7763.

123. Кнорре Д. Г., Попов С. Г., Чимитова Т. А. Кинетические особенности аффинной модификации биополимеров для реакций, протекающих с участием активных промежуточных частиц. // Доклады АН СССР. 1976. Т. 230. С. 1369-1372.

124. Кнорре Д. Г., Чимитова Т. А. Изотермы химической модификации биополимеров для аффинных реагентов, образующих активные промежуточные частицы. // Молекулярн. биология. 1978. Т. 12. С. 814-821.

125. Knorre D. G., Chimitova Т. A. Equations of the kinetic curves of affinity labelling of biopolymers with the reagents consumed in parallel reactions in solution. // FEBS Lett. 1981. V. 131. P. 249-252.

126. Немордук А. А., Безрогова E. В. Фотохимические реакции в аналитической химии. М.: Химия, 1972. С. 167.

127. Энтелис С. Г., Тигер Р.П. Кинетика реакции в жидкой фазе. Количественный учет влияния среды. М.: Химия, 1973.

128. Lehninger A. L., Nelson D. L., Сох М. М. Principles of Biochemistry. 2nd ed. Worth Publishers Inc., 1993. P. 334.1. Благодарности

129. Автор благодарен Ольге Семёновне Фёдоровой за постоянное внимание и научное руководство, Владимиру Васильевичу Ковалю за помощь и всестороннюю поддержку, академику Дмитрию Георгиевичу Кнорре за интерес к работе.

130. Автор благодарен Алие Гусейновне Веньяминовой за прочтение и правку диссертации в период её подготовки к защите.

131. Особенно автор благодарен Татьяне Вениаминовне Абрамовой и Дмитрию Владимировичу Пышному за неоценимую помощь и плодотворное сотрудничество.

132. Автор признателен всем сотрудникам Института химической биологии и фундаментальной медицины за интерес к работе, оказанную помощь и поддержку.