Молекулярные аспекты механизма биологической активности мурамоилпептидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

УДК 577.1 /2.6—577.27 На правах рукописи

НЕСМЕЯНОВ ВЛАДИМИР АНДРЕЕВИЧ

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ АСПЕКТЫ МЕХАНИЗМА БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ МУРАМОИЛПЕПТИДОВ

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

ДИССЕРТАЦИЯ в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора химических наук

МОСКВА 1997

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской Академии Наук

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор В.И.Цетлин доктор медицинских наук, академик РАЕН, А.А.Ярилин доктор биологических наук, профессор В.П.Завьялов

Ведущая организация - Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардга Российской Академии Наук.

Защита состоится 28 мая 1997 года в 10 часов на заседании специализированного совета Д 002.35.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН по адресу: 117871 ГСП Москва В-437, ул.Миклухо-Маклая 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Диссертация в виде научного доклада разослана 25 апреля 1997 года

И.о. ученого секретаря специализированного совета доктор химических наук

Л.Д.Румш

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы в ряду терапевтических препаратов все более заметное место занимают иммуномодуляторы различной природы. Среди них эндогенные иммуномодуляторы (цитокины иммунной системы, пептиды тимуса и костного мозга), синтетические соединения (полиокскдоний, полинуклеотиды) и, наконец, некоторые бактериальные продукты. К последней группе относятся прежде всего мурамоилпептиды -фрагменты муреина, пептидогликана клеточной стенки бактерий, и их синтетические аналоги и производные.

Мурамоилпептиды (МП)' - класс соединений, открытый в 70-х годах французскими учеными во главе с Э.Ледерером в результате поиска минимального иммуноактивного фрагмента клеточных стенок микобактерий, входящих в состав полного адыованта Фрейнда. Этим минимальным фрагментом, способным заменить в адъюванте целые микобактерии, оказался Ы-ацетилмурамоил-аланил-О-изоглутамин (мурамоилдипептид, МДП). Исследование свойств полученного синтетическим путем МДП продемонстрировало, что помимо адъювантной активности для него характерны способность стимулировать неспецифическую резистентность организма к бактериальным и вирусным инфекциям, а также пирогенный и сомногенный эффекты. Таким образом, МДП влиял как на неспеиифические иммунные реакции, так и на адаптивный иммунитет.

В последующие два десятилетия в различных лабораториях мира были синтезированы сотни аналогов и производных МДП, некоторые из которых обладали еще и противоопухолевой активностью. Из этих соединений были

1 Список сокращений: МП - мурамоилпептиды; МДП - Ы-ацетилмурамоил-р1--4-аланил-0-изоглутамин; ГМП - глюкозаминилмурамоилпептиды; ГМДП М-ацетилглюкозаминил-р1--4-!Ч-ацетилмурамоил-аланил-0-изоглутамин; 1,-ГМДП - Ы-ацетилглюкозаминил-р1--4-Ы-ацетилмурамоил-аланил-изоглутамин; ГМДП-Ьуя - Ы-ацетилглюкозаминил-р1--4-Ы-ацетилмурамоил-аланил-О-изоглутаминил-лизин; ГМДП-СООН - Ы-ацетилглюкозаминил-р1—4-1Ч-ацетилмурамоил-аланил-0-глутаминовая кислота; МТР-РЕ мурамоилтрипептидфосфатидилэтаноламин; ОАА - опухолеассоциированные антигены; АГКГ - антигены главного комплекса гистосовместимости; МА -моноклональные антитела; ЗОБ-РАСЕ - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия; И. - интерлейкин.

отобраны перспективные лекарственные средства и адъюванты, высокоактивные, не вызывающие серьезных побочных эффектов. В результате проведенных клинических испытаний в медицинскую практику были рекомендованы японский препарат ромуртид, способствующий быстрому восстановлению уровня лейкоцитов в крови раковых больных после радио- и хемотерапии, швейцарский противоопухолевый препарат

мурамоилтрипептидфосфатидилэтаноламин (МТР-РЕ), а также включенный Всемирной Организацией Здравоохранения в состав вакцины против беременности нор-мурамоидаипептид. На стадии клинических испытаний находится апирогенное производное МДП мурабутид.

Классические МП содержат лишь один углеводный остаток -N-ацетилмурамовую кислоту (MurNAc). В то же время минимальным повторяющихся фрагментом полисахаридной цепи муреина является дисахарид GlcNAc-pt—4-MurNAc. Гликопептиды, содержащие подобный олигосахаридный фрагмент, могут выщепляться из клеточной стенки бактерий в результате ферментативного гидролиза и поступать в кровоток (Gray, 1984), причем это может иметь место не только при инфицировании организма, но и в норме при деградации бактерий, населяющих желудочно-кишечный тракт. Данный факт позволил ЭДедереру выдвинуть гипотезу о том, что МП являются "витаминами" иммунной системы, поддерживающими иммунный статус организма. Свидетельством роли дисахарид-содержащих МП было обнаружение Пинегиным с соавт. (1995) в крови здоровых доноров антител к подобным структурам, но не к классическим МП.

Исследование свойств олигосахарид-, в частности, дисахарид-содержащих МП стало возможным благодаря разработке в лаборатории химии пептидов ИБХ им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН эффективного метода синтеза этих соединений. С использованием разработанного метода была синтезирована большая группа оригинальных МП. Оказалось, что дисахаридсодержащие МП в ряде случаев обладают более выраженными полезными свойствами, чем моносахарид-содержащие аналоги. В результате проведенного в России цикла работ на основе одного из них, N-ацетилглюкозаминил-р!—4-Ы-ацетилмурамоил-аланил-0-изоглутамина

&с МАс (Р1-» 4)МигМс

сн2он сн2он

он Рис.1. Структура ГМДП

¡|>' И- I ;н о; СОЫНг

; Д1а 0-аи-1ЧН;

СН3 Н

'2

(ГМДП, рис.1) был создан новый отечественный лекарственный препарат ликопид, рекомендованный в качестве иммунокоррегирующего средства при вторичных иммунодефицитах.

Несмотря на успехи в исследовании биологических свойств МП и в их практическом применении, молекулярный механизм активности МП оставался малоизученным. Спорным было наличие рецепторов МП на иммунокомпетентных клетках, противоречивыми были данные и о типах клеток, способных отвечать на МП, что делало актуальным решение вопроса об их молекулярных и клеточных мишенях.

Цел и и задачи работы. Основной целью исследования явилось выяснение молекулярных основ иммуномодулирующей и противоопухолевой активностей глюкозаминилмурамоилпептидов (ГМП). В ходе выполнения исследования решались следующие главные задачи:

1. Поиск и локализация ГМП-связываюших центров на клетках разной этиологии.

2. Получение и характеристика свойств моноклональных анти-идиотипических антител к ГМДП как инструмента изучения ГМП-связываюших молекул.

3. Выделение и структурная характеристика рецепторных молекул.

4. Характеристика изменений в составе поверхностных рецепторов клеток иммунной системы под действием ГМП.

5. Характеристика фенотипических изменений, вызываемых действием ГМП на опухолевые клетки, и выяснение их функциональной значимости.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые продемонстрировано, что механизм биологической активности глкжозаминилмурамоилпептидов включает модификацию спектра поверхностных антигенов клеток-мишеней. В случае клеток миело-моноцитарного ряда это антигены класса II главного комплекса гистосовместимости и рецептор интерлейкина 2, отвечающие соответственно за презентацию антигенов Т-лимфоцитам и развитие иммунной реакции, в случае опухолевых клеток - антигены, существенные для распознавания опухолевых клеток иммунной системой (опухолеассошшрованные антигены, молекулы адгезии). Доказана функциональная значимость подобных изменений.

Впервые показано, что не только макрофаги, но и Т-лимфоциты-хелперы, и опухолевые клетки имеют центры связывания ГМП, находящиеся внутри клеток. Определено их число и константы диссоциации. Продемонстрировано, что связывание ГМДП с внутриклеточными центрами макрофагов приводит к активации клеток, что доказывает сигнал-проводящую активность этих центров.

Впервые получены монокпональные анти-идиотипические антитела к ГМДП. Изучены их свойства, и выявлены антитела, связывающиеся с рецепторами ГМДП и имитирующие его адъювантную активность.

Впервые проведено выделение и структурная характеристика ГМП-связывающих белков. Выяснено, что одним из их типов являются гистоны HI. Доказано, что ГМДП способен конкурировать с ДНК за связывание с гистонами HI и что обработка хроматина ГМДП приводит к изменению доступности межнуклеосомных участков ДНК для расщепления микрококковой нуклеазой, то есть к изменениям в структуре хроматина. На основании полученных данных сформулирована гипотеза о том, что ГМП влияют на экспрессию поверхностных антигенов клеток-мишеней путем взаимодействия с гистонами HI, приводящего к обнажению регуляторных межнуклеосомных участков ДНК и инициации транскрипции.

Полученная информация может быть использована при разработке новых высокоэффективных препаратов на основе мурамоилпептидов. Разработанные подходы к оценке иммуномодулирующей активности ГМДП in vitro могут применяться для тестирования партий субстанции при

4

производстве лекарственного препарата ликопид и для характеристики пептидных иммуномодуляторов. Моноклональные анти-идиотигшческис антитела к ГМДП могут послужить основой для создания нового адъюванта. Моноклональные антитела к ГМДП уже используются для определения ГМДП в биологических жидкостях.

Апробация полученных результатов. Результаты проделанной работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях: VII Международном конгрессе иммунологов (Берлин, 1989), I Всесоюзном иммунологическом съезде (Сочи, 1989), I Советско-японском симпозиуме "Рецепторы: структура и функции" (Москва, 1989), Международном симпозиуме "Молекулярные факторы гемопоэза и стволовая клетка" (Москва-Ленинград, 1990), Международном симпозиуме "Проблемы иммунофармакологии" (Тбилиси, 1990), X Конференции Европейской федерации иммунологических обществ (Эдинбург, 1990), Международном симпозиуме "Современные тенденции в изучении лейкозов человека. IX." (Вилсед, 1990), XI Конференции Европейской федерации иммунологических обществ (Эспо, 1991), II Японско-советском симпозиуме "Рецепторы: структура и функции" (Киото, 1991), VIII Международном конгрессе иммунологов (Будапешт, 1992), Международном симпозиуме "Структура и функции регуляторных пептидов" (Москва, 1992), II Российско-израильском симпозиуме по белкам и пептидам (Москва, 1992), Международном симпозиуме "Иммунотерапия инфекций" (Берлин, 1994), Ш симпозиуме IUPAC по биоорганической химии (Дагомыс, 1995), симпозиуме "Пептиды в иммунологии" (Интерлакен, 1995), 1-ой национальной конференции Российской Ассоциации Аллергологов и Клинических Иммунологов (Москва, 1997).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 42 работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

К началу данного цикла исследований ряд вопросов, касающихся механизма биологической активности МП, оставался невыясненным или вызывал существенные разногласия. К числу основных из них можно было отнести

а) состав клеток-мишеней МП и характер изменений, индуцируемых у них МП;

б) наличие рецепторов МП на клетках-мишенях и характеристики связывания;

в) природу рецепторных молекул и их молекулярную структуру.

Поиск ответа на эти вопросы составил существо данной работы.

Клеточные мишени глюкозаминилмурамоилпептидов

Многочисленные данные, полученные разными группами исследователей, указывали на то, что основной мишенью МДП и его аналогов являются макрофаги. В то же время сведения о прямом действии МДП на Ти В-лимфоциты были весьма неубедительны, поскольку были получены на смешанных клеточных популяциях, и влияние МП на Т- и В-зависимые процессы могло опосредоваться макрофагами и секретируемыми ими продуктами. Поэтому для поиска потенциальных клеток-мишеней ГМП был применен подход, основанный на выявлении у них центров связывания мурамоилпептидов.

Несмотря на то, что наличие даже на макрофагах подобных центров являлось предметом дискуссии, рецепторный механизм действия МП выглядел наиболее реальным ввиду стереоспецифичности эффектов, а также насыщаемого характера зависимости доза-ответ. Для решения вопроса о наличии на клетках разной этиологии центров связывания ГМП были применены методы проточной цитофлуориметрии и. радиолигандного анализа с использованием флуоресцеин- (рис.2а) и иод-125-меченных (рис.26) производных ГМДП, полученных конъюгацией лизин-содержащего аналога ГМДП (ГМДП-Ьув) соответственно с флуоресцеинизотиоцианатом и реагентом Болтона-Хантера. Соединение 26 метилось иодом-125 с помощью Хлорамина Т. Очистку продуктов реакции проводили обращенно-фазной

СН2ОН

СН2ОН

но но

он

Н I п Н

сн3 н

н о соинг

С - N4 - СН - (СН2)4 - N4 - П

о

II

I

соон

он

а Я = - с - NN - б Н

б -с-снг -снг-о

э

'о

НО

В п = - с

о

Рис.2. Структура использованных в работе производных ГМДП-ЬуБ. а - ГМДГМ^-ПиТС; б - ГМДП-Ьу5-[(1251)ВН); в - ГМДП^К^ОАгБ].

ВЭЖХ на колонке Ыис1со511 5С18, элюируя линейным градиентом аиетонитрила. Структуру продуктов подтверждали методами ЯМР и масс-спектрометрии.

Сохранение присущей ГМДП биологической активности у производных с модифицированным по Е-аминогруппе лизином подтпержлалось тем, что их адъювантная активность при ответе мышей ВА1_В/с на овальбумин была на уровне немодифицированного ГМДП.

На первом этапе работы анализ связывания проводился с помощью проточной цитофлуориметрии, причем для количественного определения ГМДП-связывающих центров в отдельной клетке прибор калибровался флуоросферами с известным содержанием флуоресцеина (Соикгошсэ, Франция). Клетки инкубировались на льду с 1 мкМ раствором ГМДП-Ьув-ПиТС и после отмывки избытка метки анализировались на цитофлуориметре. Высокий уровень неспецифического связывания клетками меченных производных ГМДП обусловил необходимость проведения ингибиторного

Таблица 1. Локализация центров связывания ГМДП на клетках различной этиологии.

Клетки и клеточные линии Число специфических участков связывания*

внутренних внешних

Перитонеальные макрофаги мыши 98000+5900 900**

WEHI-3 (миелолейкоз мыши) 30350+1760 <1000

Jurkat (Т-лейкоз человека) 40700+2440 <1000

EL4 (тимома мыши) 22300+1100 <1000

RLS (Т-лимфосаркома крысы) 32800+1640 <1000

PAI (миелома мыши) <1000 <1000

SP2/0 (миелома мыши) <1000 <1000

IMR-32 (нейробластома человека) 75000+7800 <1000

BRO (мелаиома человека) 14000+800 <1000

анализа и многократного воспроизведения опытов для получения статистически достоверных результатов. Связывание считали специфическим, если оно ингибировалось немеченным ГМДП, но не его фрагментами. Число специфических мест связывания определялось как разность между общим и неспецифическим связыванием.

Проведенные эксперименты показали, что в пределах чувствительности метода (1000 молекул на клетку) специфические центры связывания ГМДП на поверхности мышиных перитонеальных макрофагов отсутствуют. В то же время после мягкой фиксации клеток и перфорации клеточной мембраны н-октил-р-О-глюкопиранозидом значительное число центров связывания было обнаружено внутри этих клеток (табл.1). Результаты, свидетельствующие о внутриклеточной локализации МП-связывающих центров у макрофагов, согласуются с данными Tenu et al. (1989) и функциональными данными Fogler & Fidler (1986), говорящими о том, что активация макрофагов мурамоилпептидами протекает более эффективно при их проникновении внутрь клетки.

Неудачная попытка обнаружения мембранных центров связывания ГМДГТ могла объясняться недостаточной чувствительностью метода проточной цитофлуориметрии. Для повышения чувствительности был применен метод радиолигандного анализа с использованием модифицированного реагентом Болтона-Хантера ГМДП-Lys (рис.26). Действительно, этим методом на мышиных макрофагах удалось обнаружить незначительное количество (несколько сотен) рецепторов с Kd 350 пМ. Эти данные совпадают с результатами, полученными для МДП Silverman et al. (1986).

На следующем этапе были проанализированы нормальные клетки и клеточные линии различной этиологии (табл.1). У них не было обнаружено поверхностных рецепторов ГМДП, в то время как внутренние центры связывания бьии найдены у трансформированных Т-хелперов (Jurkat, EL4, RLS) и миеломоноцитарных клеток WEHI-3, но не у клеток мышиной плазмацитомы (PAI, SP2/0). Значительное число внутриклеточных центров связывания ГМДП присутствовало в клетках нейробластомы человека IMR-32. Этот результат не удивителен, если принять во внимание известное действие мурамилпептидов на центральную нервную систему, а также тот факт, что рецепторы ГМДП были обнаружены Цетлиным с соавт. (19S9) на мембранах мозга крысы.

Как следует из табл.1 наибольшее число специфических ГМДП-связывающих центров обнаруживается у макрофагов, что в дальнейшем предопределило выбор этих клеток для изучения рецепторных молекул.

Наличие внутриклеточных центров связывания ГМДП у нормальных Т-хелперов, но не у В-лимфоцитов было продемонстрировано для клеток селезенки мышей BALB/c двухпараметрическим цитофлуориметрическим анализом с использованием ГМДП-Lys-FluTC и меченных фикоэритрином моноклональных антител (МА) к СЭ4-маркеру Т-хелперов или антител к IgM рецептору В-клеток. Хотя связывание зонда имело место и для Т-хелперов, и для В-клеток, сдвиг пика флуоресценции в сторону меньшей интенсивности свечения при проведении мечения в присутствии ингибитора - ГМДП -наблюдался только для первых, что говорило о наличии у Т-хелперов специфического связывания.

0.01 0.1 1 10 100

Концентрация ингибитора (мкг/мл)

Рис.3. Ингпбпрование связывания ГМДП-Ьуя-ЯиТС с клетками \VEHI-3 ГМДП, ЬГМДП и трипептидом А1а-0-Ю1и-Ьух.

И А1а-0-|'ап-1_уз □ ЬГМДП ■ ГМДП

Связывание ГМДП-Ьуя-РШТС с внутриклеточными мишенями было стереоспецифическим, так как биологически неактивный аналог ГМДП, содержащий вместо 0-Ю1п его ^стереоизомер (Ь-ГМДП), подавлял связывание в значительно меньшей степени, чем ГМДП. и примерно в такой же степени как трипепткд А!а-0-Ю1п-Ьу8 (рис.3).

Определение констант диссоциации обнаруженных внутриклеточных центров связывания ГМДП у клеток \VEHI-3 и макрофагов мыши проводилось методом поляризации флуоресценции с использованием ГМДП-1^-ПиТС. Расчет по методу Скэтчарда показал нхчичие двух типов центров с константами диссоциации 21 и 540 нМ (рис.4).

Таким образом, не только макрофаги, но и др\гие типы клеток, в частности, Т-хелперы, являются потенциальными мишенями ГМДП. Очевидно, способность клеток, имеющих внутриклеточные рецепторы, отвечать на ГМДП определяется не только наличием рецепторов, но и способностью мурамоилпептида проникать внутрь клетки-мишени. В случае клеток макрофагального ряда, для которых характерен активный эндоиитоз, проникновение ГМП внутрь клетки не вызывает затруднений. В случае же других потенциальных мишеней, например, Т-хе.шеров, возможность поглощения ГМП может определяться функциональным состоянием клетки, что в свою очередь может объяснять противоречивые данные о действии МП на Т-клетки.

s

i 0,440

x

CD

■O

J 0,435-

<D

a

> 0,430-

к 0,425-

s с

a 0,420 -

о

M

s

0,3 0,35 0,4 0,45 0,5 0,55 В

I

0

10

20

30

<

Концентрация ГМДП (нМ)

Рис.4. Определение констант диссоциации комплексов ГМДП с внутриклеточными центрами связывания клеток WEHI-3.

Наличие внутриклеточных центров связывания ГМП еще не доказывало их функциональной значимости, поскольку нельзя было

исключить, что действие ГМП опосредуется незначительным числом мембранных рецепторов, обнаруженных, например, на макрофагах. Поэтому были запланированы эксперименты по оценке функциональной активности внутриклеточных центров связывания, однако для их осуществления необходимо было разработать удобный метод оценки действия ГМП in vitro. Таким тестом явилась обнаруженная нами способность ГМП индуцировать экспрессию ряда антигенов нормальными и трансформированными клетками.

Известно, что действие МП на макрофаги приводит к активации у них внутриклеточных процессов, включая окислительный взрыв и биосинтез цитокинов, к индукции цитотоксичности макрофагов по отношению к опухолевым клеткам. Тем не менее данные эффекты едва ли в полной мере объясняют ааъювантную активность МП. В связи с тем, что клетки макрофагального ряда на ранних стадиях распознавания антигенов участвуют в их презентации Т-хелперам, можно было предположить, что МП вносят «вклад в этот процесс. Поскольку основную роль при этом играют антигены

Влияние мурамоилпептидов на экспрессию поверхностных антигенов макрофагами

главного комплекса гистосовместимости (АГКГ) II класса (у мышей 1а-антигены) на антиген-презентирующих клетках, было проверено, не влияют ли ГМП на экспрессию 1а-антигенов макрофагами мыши.

Макрофаги выделяли из перитонеального эксудата (КПЭ) мышей путем адсорбции на пластик. Инкубация прилипающих клеток с ГМДП приводила к дозозависимому увеличению как числа 1а-несущих клеток, так и средней плотности 1а-антигенов на клеточной поверхности. Об этом свидетельствовали данные проточной цитофлуориметрии при окрашивании интакгных или обработанных ГМДП КПЭ моноклональными антителами против 1а-антигенов (рис.5): увеличение площади пика свидетельствовало о росте числа 1а-позитивных клеток, а некоторый сдвиг пика вправо - об увеличении поверхностной плотности этих антигенов. Ввиду того, что по данным фенотипирования прилипающие КПЭ содержали помимо макрофагов лимфоциты, бьшо проведено цитометрическое разделение этих клеточных популяций на основе различий в размерах и гранулярности цитоплазмы. Последующий цитофлуориметрический анализ показал, что экспрессия 1а-антигенов повышалась только у крупных высокогранулярных клеток -макрофагов.

О 50 100 150 200 250 Интенсивность флуоресценции

Рис. 5. Индуцирующий эффект ГМДП на экспрессию 1а-антигенов перитонеальными макрофагами мышей in vitro.

§ ,tL 111 И _

10 мкг/мл

Эффект не зависел от гаплотипа мышей, т.е. не был генетически детерминирован: усиление la-экспрессии наблюдалось и для BALB/c (H-2d), и для C57BL/6 (Н-2к). Модулирующему влиянию ГМДП были подвержены и антигены макрофагов селезенки.

И в случае макрофагов перитонеального эксудата, и в случае макрофагов селезенки далеко не все клетки отвечали на ГМДП увеличением la-экспрессии. По всей видимости наличие эффекта зависит от стадии дифференцировки клетки.

Описанный эффект воспроизводился и в опытах in vivo при введении ГМДП (150 мкг) в солевом растворе в перитонеальную полость мышей и последующем анализе выделенных КПЭ.

Результаты, полученные с перитонеальными и селезеночными макрофагами, были подтверждены опытами с мышиной миеломоноцитарной линией клеток WEHI-3. Как и у макрофагов, в популяции клеток WEHI-3 при инкубации с ГМДП наблюдался рост числа la-позитивных клеток. Повышение экспрессии антигенов гистосовместимости II класса наблюдалось и при обработке ГМДП моноцитов человека.

Исследование аналогов ГМДП на способность вызывать экспрессию 1а-антигенов показало, что данный эффект коррелирует с наличием у ГМП адъювантной активности (табл.2): только адъювантно-активные ГМП были способны индуцировать экспрессию 1а-антигенов.

Присутствие лимфоцитов в популяции прилипающих КПЭ оставляло возможность индукции 1а-антигенов ГМДП опосредовано, в результате его действия на Т-лимфоциты и секреции последними цитокинов. Против этого говорили упомянутые выше данные по индукции la-экспрессии на клетках WEHI-3, а также результаты стимуляции перитонеальных макрофагов, отделенных от лимфоцитов по размерам клеток и гранулярности цитоплазмы. Дополнительные аргументы против такого механизма были получены при исследовании способности ГМДП модулировать экспрессию 1а-ангигенов в присутствии циклоспорина A (CsA), который блокирует секрецию цитокинов Т-лимфоцитами. Как в отсутствие, так и в присутствии ГМДП CsA в небольшой степени снижал экспрессию 1а-антигенов перитонеальными макрофагами. Однако, действие CsA не приводило к исчезновению эффекта

Таблица 2. Влияние глкжозаминилмурамоилпептидов на экспрессию 1а-антигенов перитонеальными макрофагами мыши.

Глюкозаминилмурамоил-пептид Наличие адъювантной активности Увеличение числа 1а-позитивных клеток

1 мкг/мл 10 мкг/мл

ГМДП + 18.0 25.2

L-ГМДП - 2.7 2.6

(ГМДП)2 + 14.3 19.6

ГМДП(ОВи) + 13.4 7.3

ГМДП-СООН + 23.9 28.5

ГМДП-Lys + 14.8 16.6

ГМДП-Lys-St + 25.5 25.7

GlcNAcp l-4-MurNAc - 3.0 1.1

L-ГМДП - GlcNAcp 1 —4-MurNAc-Ala-iGln; ГМДП-Lys - GlcNAcp 1--4-MurNAc-Ala-D-iGln-Lys; (ГМДП)2 - GlcNAcp l--4-MurNAc-(Ala-D-iGln)-GlcNAcpi—4-MurNAc-(Ala-D-iGIn); ГМДП(ОВи) - GIcNAcpl-4-MurNAc-Ala-D-iGlnfr-бутиловый эфир); ГМДП-СООН - GlcNAcp 1-4-MurNAc-Ala-D-Glu; ГМДП-Lys-St - GlcNAcpi--4-MurNAc-Ala-D-iGln-(e-N-creapomi)^H3HH.

ГМДП: уровень экспрессии 1а-антигенов был значительно выше, чем у клеток не подвергавшихся обработке ГМДП.

Таким образом, полученные данные говорят о том, что вызываемое биологически активными ГМП усиление экспрессии 1а-антигенов на макрофагах вносит свой вклад в их адьювантную активность, причем экспрессия 1а-антигенов обусловливается непосредственным действии на макрофаги ГМДП, а не опосредована Т-клеточными цитокинами.

В последние годы обнаруженная нами способность МП индуцировать экспрессию поверхностных антигенов лейкоцитов была подтверждена работами Kleinerman et al. (1995) и Parant et al. (1995, 1996) на примере АГКГ II класса и некоторых молекул адгезии.

Влияние глюкозаминилмурамоилпептидов па секрецию цитокинов и экспрессию рецептора иптерлейкина 2

Цитокины являются одним из основных компонентов межклеточной кооперации в иммунном ответе. Они секретируются как лимфоцитами, так и клетками макрофагального ряда при стимуляции последних различными агентами, в том числе бактериальными продуктами, в частности, липополисахарицом. Для МДП и его аналогов также было продемонстрировано индуцирующее влияние на секрецию интерлейкина 1 (ПЛ) и фактора некроза опухолей-а (ТОТ-а) макрофагами, но нельзя было исключить, что особенности структуры ГМП могут сказываться на их действии, в связи с чем была проверена способность ГМДП и ГМДП-СООН индуцировать секрецию 1Ы и 1Ь6 мононуклеарными клетками периферической крови человека (МКК). ГМДП-СООН был выбран из числа аналогов ГМДП, поскольку был существенно менее пирогенным, чем ГМДП, что могло объясняться различиями в секреции названных выше цитокинов.

МКК, выделенные центрифугированием на градиенте Фиколл-верографин, инкубировались с различными дозами ГМП. Через 72 ч содержание 1Ы и 1Ь6 в среде культивирования оценивалось с помощью твердофазного ИФА и биотеста. Результаты иследования показали, что и ГМДП, и ГМДП-СООН индуцируют биосинтез обоих цитокинов (рис.6), однако в количественном отношении в их действии наблюдается различие, а именно, ГМДП в сравнимых концентрациях стимулировал биосинтез значительно большего количества и ПЛ, и 1Ь6, чем ГМДП-СООН. Таким образом, наблюдалась корреляция между способностью ГМП индуцировать секрецию ПЛ и 11-6 и его пирогенностью.

Таким образом, одним из путей влияния ГМП на иммунный ответ является модуляция биосинтеза цитокинов звена природного иммунитета. Эти цитокины не только вызывают активацию клеток миелоидного ряда, но и влияют на адаптивный иммунитет, в том числе

0.001 0.01 0.1 1 10 Концентрация ГМП (мкг/мл)

ж о

0.01 0.1 1 10 100 Концентрация ГМП (мкг/мл)

Рис.6. Индукция ГМДП и ГМДП-СООН секреции 11.6 (А) и Г1_ 1 (Б) мононуклеарными клетками периферической крови человека. Светлые столбики - ГМДП, темные - ГМДП-СООН.

Путем активации биосинтеза лимфоцитарных цитокинов. В свою очередь многие секретируемые лимфоцитами цитокины влияют на активность клеток звена природного иммунитета, в частности, макрофагов. Как показали наши исследования, ГМП вносят вклад в повышение активности макрофагов под действием одного из центральных цитокинов иммунной системы, интерлейкина 2 (1Ь2). Было обнаружено, что ГМДП вызывает экспрессию а-субъединицы рецептора 1Ь2 (1Ь2Я) как на перитонеальных макрофагах мыши, так и на клетках \VEHI-3 (рис. 7). Как и в случае с модуляцией экспрессии 1а-антигенов, данный эффект был дозозависимым.

£

0.01 0.1 1 10 100 Концентрация (мкг/мл)

Рис.7 Влияние ГМДП на экспрессию 1Ь2Я

перитонеальными макрофагами мыши (2) и линией клеток \VEHI-3 (О-

Действие г. чокоюмини. l ну pa, мои. ¡пептидов на опухолевые к.гетки Наличие внутриклеточных центров связывания ГМДП у трансформированных, в частности, меланомных клеток (табл.1) предполагает возможность прямого воздействия на них МП. В то же время при изучении противоопухолевой активности ГМДП Ростовцевой с соавт. (1981) было показано, что, несмотря на его способность вызывать ингибирование роста и некроз некоторых экспериментальных опухолей, ГМДП не обладает цитотоксической или цитостатической активностью по отношению к опухолевым клеткам in vitro. Ввиду отсутствия видимого прямого эффекта ГМДП на опухолевые клетки, его противоопухолевый эффект был приписан активации иммунокомпетентных клеток.

Полученные нами данные о способности ГМП индуцировать экспрессию поверхностных антигенов у макрофагов позволили предположить, что модулирующему влиянию ГМП могут быть подвержены антигены, существенные для распознавания опухолевых клеток иммунной системой. К числу таких молекул относяться опухолеассоциированные антигены (ОАА), антигены главного комплекса гистосовместимости и молекулы адгезии.

Для проверки данной гипотезы были выбраны четыре линии опухолевых клеток человека разной этиологии: меланома BRO, аденокарцинома легкого А-549, карциномы толстой кишки WIDR и молочной железы МаТи. Исследование проводилось методом проточной цитофлуориметрии с использованием специфичных к соответствующим антигенам МА (табл.3).

Таблица 3. Опухолеассоциированные антигены и моноклональные антитела.

Клеточная линия Антиген Природа, мол. масса МА Автор, год

BRO MUC-18 Гликопротеин, 113 кДа MUC-18 Lehmann, (1987)

А-549 МСА-С1 Не описан МСА-С1 Houshton, (1982)

WIDR КЭА Гликопротеин, 180 кДа Т84.66 Wagener, (1983)

МаТи ВСА-2 Гликопротеин, 36 кДа ВСА-2 Ткачева, (1991)

Опухолеассоциированные антигены. Присутствие на клеточной мембране опухолеассоциированных антигенов (ОАА) является характерным признаком опухолевых клеток, отличающим их от нормальных аналогов.

Результаты исследования ГМДП-индуцированной экспрессии ОАА, полученные для всех четырех линий, имели сходный характер. Инкубация in vitro опухолевых клеток с ГМДП в течение 48 часов вызывала дозозависимое изменение как числа ОАА-несущих клеток, так и средней плотности антигенов на клеточной поверхности (табл.4). Дозовая зависимость носила колоколообразный характер, характерный и для других эффектов МП, причем максимум экспрессии для разных линий вызывался различными концентрациями ГМДП. Различалась и амплитуда ответа.

Кинетика индуцированной ГМДП экспрессии ОАА носила двухфазный характер. В ранние сроки после введения в культуру ГМДП (6-9 часов) для всех линий наблюдалось снижение числа ОАА-позитивных клеток, после чего их число и средняя плотность антигенов на поверхности возрастали, превышая уровень контрольных клеток (табл.5). Максимум экспрессии достигался в разные сроки в интервале 24-72 часа, а через 96 часов после добавления ГМДП уровень экспрессии ОАА возвращался к исходному.

Таблица 4. Влияние ГМДП на экспрессию опухолеассоциированных антигенов

Линия клеток Концентрация ГМДП, мкг/мл

0 0.001 0.01 0.1 1.0 10.0 50.0

МаТи 20 (65.4) 22 (68.3) 24 (71.8) 28 (75.5) ¡-ффЩ 27 (74.3) 23 (69.4)

BRO 15 (60.3). 16 (62.5) 18 (63.9) 23 (68.2) 19 (65.1) 16 (63.0) 15 (59.8)

А-549 10 (56.7) 13 (59.5) 15 (62.4) 16 (65.2) 18 (87.3) ЩтЩ] 14 (63.4)

WIDR 10 (57.0) И (58.5) 14 (61.5) 15 (64.5) 17 (65.9) . 24 /. ; (72.1) 12 (60.3)

В таблице указан процент ОАА-позитивных клеток. В скобках - средняя интенсивность флуоресценции. Стандартное отклонение не более 10%. р<0.05. В случае меланомы ВШЭ оценивалась экспрессия антигена МСА-С1.

Таблица 5. Кинетика индукции ГМДП экспрессии опухолеассоциированных антигенов.

Линия клеток Концентрация ГМДП (мкг/мл) Время инкубации с ГМДП (ч)

0 6 18 24 48 72 96

МаТи 1 20 (65.4) 10 (57.3) и.о. 26 (73.8) (77.9) 27 (75.3) 20 (66.1)

BRO 0.1 15 (60.3) 7(54.2) н.о. ШШ& 23 (68.2) 18 (65.0) 15 (61.6)

А-549 10 10 (56.7) 2 (49.5) 9Ш& 36 (79.5) 37 (65.3) 20 (66.2) 10 (56.9)

WIDR 1 10 (57.) 3 (48.5) 13 (62.5) 18 (64.1) • Хг- 14 (62.1) 11 (58.1)

В таблице указан процент ОАА-позитивных клеток. В скобках - средняя интенсивность флуоресценции. Стандартное отклонение не более 10%. р<0.05. В случае меланомы BRO оценивалась экспрессия антигена МСА-С1. И.о. -не

определялось

Как и в случае 1а-антигенов в ответ на ГМДП вовлекалась лишь часть клеточной популяции. Попытки повысить процент отвечающих клеток показали, что подобного эффекта можно добиться дополнительным введением ГМДП через 24-48 часов. Например, для аденокарцнномы легкого А-549 число клеток, ставших КЭА-положительными, увеличивалось с 30% (однократное введение) до 45%. Третье добавление ГМДП делало эту цифру еше выше.

Таким образом, сам ГМДП оказывал праймирующий эффект на неотвечающие опухолевые клетки. Необходимо отметить, что оптимальная концентрация повторного введения ГМДП была существенно выше, чем первоначального: так в случае меланомы BRO эти концентрации составляли соответственно 20 и 0.1 мкг/мл.

Данные, полученные в экспериментах in vitro, были подтверждены опытами с меланомой BRO на бестимусных мышах. Животным с хорошо развитой опухолью внутрибрюшинно инъецировался ГМДП в солевом растворе (150-500 мкг/мышь). Через 6-24 часа животные забивались, опухоль гомогенизировалась, и клеточная суспензия анализировалась. Как и в опытах

Время после введения ГМДП (ч)

Рис.8. Влияние ГМДП на экспрессию антигена MUC-18 in vivo. Светлые столбики - 150 мкг ГМДП на мышь, темные - 500 мкг. Цифры в рамках-средняя интенсивность флуоресценции.

in vitro после начального падения уровня экспрессии антигена MUC-18 наблюдалась его усиленная экспрессия (рис.8).

Не только ГМДП, но и его биологически активные аналоги были способны модулировать экспрессию ОАА. Так эксперименты с клетками рака молочной железы продемонстрировали, что ГМДП-лизин более эффективен, чем ГМДП, причем в концентрации на порядок более низкой (табл.6). Еще более активным оказалось липофильное производное ГМДП-стеароил-лизин. В то же время биологически неактивный L-ГМДП не влиял на экспрессию ВСА-2 антигена. Аналогичные результаты были получены и для меланомы. Известно, что липофильные МП, например МДП-аланнл-холестерин и МТР-РЕ, проявляют высокую противоопухолевую активность. Таким образом, повышенная активность ГМДП-Lys-St в индукции ОАА коррелирует с описанным противоопухолевым эффектом липофильных МП, косвенно свидетельствуя в пользу предположения о том, что ОАА-индуцирующий эффект может вносить свой вклад в противоопухолевый эффект ГМП.

Характер действия ГМДП-лизина и ГМДП-Lys-St отличался от действия ГМДП не только по амплитуде, но и по кинетике: для них не наблюдалось начального падения в экспрессии ВСА-2 антигена. Этот факт указывает на то, что молекулярные механизмы действия гидрофильных и

Таблица 6. Влияние некоторых ГМП на экспрессию антигена, ассоциированного с карциномой молочной железы.

ГМП Концентрация, мкг/мл

0.001 0.01 0.1 1 10 50

ГМДП 22 (68.3) 24 (71.8) 28 (75.5) 32 (79.0) 27 (74.3) 23 (69.4)

L-ГМДП 21 (65.2) 22(65.4) 22 (65.1) 21 (64.9) 20 (65.6) 22(65.4)

ГМДП-Lys 25 (73.6) 30(75.1) 39(81.2) 32(79.2) 27(73.9) 26(73.4)

ГМДП-Lys-St 37 (79.4) 46 (85.5) 39 (80.9) 34 (80.2) 32 (78.8) 30 (74.9)

В таблице указан процент ВСА-2-позитивных клеток. В скобках - средняя интенсивность флуоресценции. Стандартное отклонение не более 10%. РС0.05.

липофильных мурамоилпептидов могут быть различны. Об этом же говорят опубликованные Schreck с соавт. (1992) данные о том, что МДП, но не липофильный MurNAc-Thr-D-iGln-Sn-дилальмитоид-глицерин активирует NF-kB транскрипционный фактор.

Как отмечалось выше амплитуда ответа на ГМДП заметно увеличивалась при повторном добавлении ГМДП в культуру через 24 ч инкубации, то есть имело место каскадное вовлечение опухолевых клеток в ответ на ГМДП. Эффект праймирования клеток мурамоилпептидом отменялся при замене культуральной среды перед вторичным внесением ГМДП на свежую. Напротив, внесение инкубационной среды от 24-часовой культуры клеток меданомы BRO, стимулированных ГМДП, в свежую культуру совместно с ГМДП в концентрации, оптимальной для вторичного добавления, индуцировало тот же уровень экспрессии меланомаассоциированных антигенов, что и последовательное двухкратное добавление мурамоилпептида.

Исходя из этих данных можно было предположить накопление в инкубационной среде опухолевых клеток, обработанных ГМДП, фактора, придающего ранее неотвечающим клеткам культуры способность отвечать на мурамоилпептид. Фактор не был специфичным для меланомных клеток: инкубационная среда от ГМДП-индуцированной меланомы BRO могла быть

заменена на таковую от клеток аденокарциномы легкого. Инактивация фактора при нагревании и триптической обработке показали его белковую природу. Замораживание препарата с последующим оттаиванием, напротив, приводило к существенному увеличению активности фактора, что могло объясняться полимерной организацией молекулы, мономерные единицы которой обладают функциональной активностью.

Использованием МА к известным цитокинам, было показано, что активность исследуемого фактора нейтрализовалась только МА к фактору некроза опухолей-альфа (ТХР-а). Наличие ТЫР-а в кондиционной среде меланомных клеток, обработанных ГМДП, подтверждалось цитотоксическим тестом с ТЫР-а-чувствительной линией фибробластов Ь-929, а способность этого цитокина праймировать меланомные клетки - моделированием эффекта с помощью рекомбинантного цитокина, вводимого одновременно с ГМДП или за 2 ч до него (рис.9).

Таким образом, в культуральной среде клеток меланомы ВЯО под действием ГМДП накапливается "ШР-а, который индуцирует чувствительность клеток к повторному введению в культуру мурамоилпептида. Следует отметить, что по имеющимся в литературе данным и для других мурамоилпептидов (мурабутида, МТР-РЕ) характерно кооперативное действие с цитокинами (всеми интерферонами, И-2) в противоопухолевом и противоинфекционном иммунитете.

Рис.9 Праймирующий TNF + ГМДП эффект ГМДП и TNF-a на клетки меланомы TNF BRO.

2х ГМДП

ГМДП

Контроль

о ю » зо «о so 60

% MUC-18+ клеток

Антигены гистосовместимости. Известно, что во многих случаях опухолевые клетки несут пониженное количество или вовсе лишены АГКГ I класса. Это не удивительно, если принять во внимание тот факт, что именно эти молекулы представляют эндогенные клеточные антигены (в том числе опухолевые) Т-лимфоцитам, и поэтому их отсутствие позволяет опухолевым клеткам избегать иммунологического контроля. Исследование экспрессии HLA-ABC антигенов на линиях BRO и МаТи с помощью антител к их легкой цепи - р2-микроглобулину - показало, что соответственно лишь 8% и 5% клеток несут эти маркеры. Попытка увеличить число р2-микроглобулин-позитивных клеток с помощью ГМДП в широком диапазоне концентраций (0.1-10 мкг/мл) и сроков инкубации (24-72 часа) не удалась. Лишь на линии клеток А-549, исходно отрицательных по АГКГ I класса, ГМДП индуцировал их экспрессию.

Как показывают исследования последних лет внутриклеточные антигены могут представляться и АГКГ II класса, в связи с чем присутствие последних на поверхности опухолевых клеток может играть существенную роль в их судьбе. Изучение влияния ГМДП на экспрессию антигенов HLA-DR на поверхности клеток BRO, МаТи и А-549 показало, что модулируюшее действие ГМДП в отношении антигенов HLA-DR, как и для антигенов HLA-ABC, проявлялось только для клеток аденокарциномы легкого А-549, в то время как для линий BRO и МаТи в диапазоне концентраций от 0,01 мкг/мл до 100 мкг/мл изменения числа HLA-DR-несутцих клеток не наблюдалось (табл.7).

Таблица 7. Кинетика индукции ГМДП (1 мкг/мл) экспрессии некоторых поверхностных маркеров сублинией меланомы BRO.

Время СО Антиген

ICAM-1 ICAM-3 HLA-DR MUC-18 МСА-С1

0 0 (49.8) 15( 62.4) 0 (51.2) 15 (60.3) 20 (64.9)

6 0 (49.8) 10 (60.0) 0 (51.2) 10( 56.9) 15 (59.7)

24 0 (49.8) 21 (66.2) 0 (51.2) 20 (68.0) 28 (76.3)

В таблице указан процент антиген-позитивных клеток. В скобках - средняя интенсивность флуоресценции. Стандартное отклонение не более 10%. р< 0.05.

Характер кинетики индукции HLA-DR на линии А-549 был тот же, что и для опухолеассоциированных антигенов.

Молекулы адгезии. Еще одной группой антигенов, необходимых для активации Т-клеток при их взаимодействии с антиген-представляюшими клетками и клетками-мишенями, являются молекулы адгезии и их лиганды, в частности, белки семейства ICAM. Эти молекулы передают Т-клетке коактивационные сигналы, требующиеся для ее полноценной стимуляции. Экспрессию некоторых из таких молекул исследовали на сублинии меланомы BRO, трансплантируемой на бестимусных мышах. Действие ГМДП оценивали in vivo через 24 часа после введения его животным. Как видно из представленных в таблице 7 данных, ГМДП не индуцировал de novo экспрессию антигенов, исходно отсутствующих на поверхности меланомных клеток, а именно антигенов ICAM-1 (CD54), HLA-DR, в то же время модулируя экспрессию ICAM-3 (CD50).

Таким образом, ГМДП обладает избирательным действием в отношении регуляции экспрессии различных антигенов поверхности опухолевых клеток, причем характер влияния определяется как типом антигена, так и характеристиками клетки-мишени.

Функциональные последствия модуляции фенотипа меланомных клеток на их лизис клетками периферической крови человека.

Наличие ОАА показано для опухолей различной этиологии, однако вопрос об их роли в противоопухолевом ответе организма остается открытым. С одной стороны, эти антигены могут инициировать развитие иммунного ответа. Литературные данные говорят о том, что в системе in vitro на эти антигены вырабатываются цитотоксические Т-клетки и что Т-киллеры и антитела, специфичные к ОАА, обнаруживаются в крови раковых больных. С другой стороны среди ОАА имеются рецепторы ростовых факторов, и нельзя исключить, что в некоторых случаях результатом взаимодействия опухолевых клеток с антителами к ОАА может быть не деструкция, а ускорение роста опухоли.

Для проверки предположения о возможной функциональной роли в противоопухолевом эффекте ГМДП индуцируемых им изменений в спектре антигенов опухолевых клеток, в частности, ОАА было проведено сравнение

24

способности мононуклеарных клеток крови (МКК) здоровых доноров лидировать интактнь!е или обработанные in vitro в оптимальных условиях ГМДП меланомные клетки. МКК выделяли центрифугированием в ступенчатом градиенте плотности Фиколл-верографин. Двумя общепринятыми методами оценки литической активности, а именно, по освобождению радиоактивного хрома или в МТТ-тесте, при различных соотношениях МКК:опухолевые клетки были проверены две группы доноров, каждая по ! 3 человек. Результаты оказались практически идентичными.

В первой группе МТТ-тест показал статистически достоверное увеличение чувствительности опухолевых клеток к лизису для 8 из 13 доноров. Незначительное уменьшение было обнаружено для трех, и отсутствие эффекта - для одного донора. В другой группе у 7 из 13 доноров тест на освобождение радиоактивного хрома показал существенное усиление (12-49%) лизиса опухолевых клеток, в то время как у 5 доноров изменения были незначитель ными, а у одного наблюдалось заметное уменьшение лизиса (рис.10). Усиление лизиса не могло объясняться активацией МКК ГМДП, поскольку ГМДП отмывался перед постановкой цитотоксического теста.

100 1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Донор

Рис.10. Повышение под действием ГМДП лизируемости клеток меланомы ВЯО мононуклеарными- клетками крови здоровых доноров. Светлые столбики - интактные клетки ВЯО, темные - обработанные ГМДП клетки.

Как следует из данных, приведенных в таблицах 5 и 7, после 24 ч инкубации с ГМДП у меланомных клеток повышался уровень экспрессии меланомаассоциированых антигенов МСА-С1 и МиС-18, а также 1САМ-3 (С050) - лиганда 1.РА-1 (СОНа/СОЩ. Эти результаты показывают наличие корреляции между экспрессией данных антигенов и подверженностью опухолевых клеток лизису эффекторными клетками крови. Дополнительным подтверждением такой корреляции служит тот факт, что после 6 ч обработки ГМДП - срока, когда наблюдался сброс антигенов с опухолевых клеток, лизируемость меланомных клеток МКК в большинстве случаев несколько падала (5-24%) по сравнению с контрольными, необработанными ГМДП клетками ВЯО. В то же время очевидно, что изменения в экспрессии ОАА и 1САМ-3 не являются единственными факторами, определяющими эффективность лизиса меланомных клеток аллогенными МКК.

С целью идентификации популяции МКК, ответственной за лизис обработанных ГМДП меланомных клеток, было осуществлено фракционирование МКК. Можно было ожидать, что этот эффект обусловливается действием ЫК-клеток или цитотоксических моноцитов, поскольку участие рестриктированных по АГКГ I класса цитотоксических Т-лимфоцитов исключалось ввиду использование аллогенных МКК и краткости срока инкубации. Результаты экспериментов показали, что эффекторные клетки не могли быть удалены адсорбцией на пластик, что исключало из рассмотрения моноциты, а оказывались во фракции очищенных тромбоцитов. Цитотоксический эффект тромбоцитов по отношению к опухолевым клеткам был описан ранее ОгеиЛеп е1 а1. (1985) и Быковской с соавт. (1991), однако наши данные впервые демонстрируют, что тромбоциты специфически реагируют на изменение спектра поверхностных антигенов опухолевых клеток.

Полученные результаты показывают, что ГМП могут участвовать в противоопухолевом ответе с помощью двух тесно взаимосвязанных механизмов, а именно, помимо хорошо документированной активации лейкоцитов они улучшают распознавание опухолевых клеток за счет повышения экспрессии поверхностных макромолекул - молекул адгезии, опухолеассоциированных антигенов, антигенов главного комплекса гистосовместимости.

Функциональная роль внутриклеточных ГМДП-связывающих центров

макрофагов

Наличие у макрофагов как мембранных, так и внутриклеточных центров связывания ГМДП оставляло открытым вопрос о том, какие из них отвечают за проведение биологического сигнала. Против участия первых говорил тот факт, что концентрация ГМДП, вызывающая стимуляцию макрофагов (0.1-10 мкМ), на несколько порядков превышала Кс1 комплекса ГМДП-мембранный рецептор (350 пМ).

Для проверки функциональной активности внутриклеточных центров связывания макрофаги перитонеального эксудата мыши инкубировали с фосфатидилхолиновыми липосомами, несущими ГМДП, или контрольными, не содержащими ГМДП, липосомами. Уровень активации клеток оценивали по экспрессии 1а-антигенов. Макрофаги активно фагоцитировали липосомы, что позволяло ГМДП проникнуть в клетку, минуя поверхностные рецепторы. Как показали результаты экспериментов (рис.11) включенный в липосомы ГМДП вызывал дозозависимый рост числа клеток, несущих 1а-антигены, с максимумом экспрессии при 20 нг ГМДП на 106 макрофагов. Ответ был выше, чем от близкой к оптимальной концентрации растворенного ГМДП (10 мкг/106 клеток), и тем более выше, чем от дозы ГМДП, которая могла бы попасть в клеточную культуру при полном разрушении липосом (20 нг).

ас. = *

о

Г

<Ц

X

а

Т

о.

а

а >

1 - ГМДП (10 мкг)

2 - ЛП + ГМДП (20 нг)

3 - ЛП с ГМДП (0.02 нг)

4 - ЛП с ГМДП (0.2 нг)

5 - ЛП с ГМДП (2 нг)

6 - ЛП с ГМДП (20 нг)

7 - ЛП с ГМДП (200 нг)

Рис.11. Эффект включенного в липосомы (ЛП) ГМДП на экспрессию 1а-антигенов перитонеальными макрофагами мыши.

а

Таким образом, полученные результаты подтверждают, что для реализации своего биологического эффекта ГМП должны попасть внутрь макрофага, где происходит их взаимодействие с внутриклеточными центрами связывания.

Молекулярная характеристика рецепторных молекул.

Для предварительной характеристики ГМП-связывающих молекул был применен метод фотоаффинной модификации с использованием предложенного Цетлиным с соавт. (1989) иод-125-меченного азидосалицилового производного ГМДП-Ьуэ - ГМДП-1уз[('251)А25| (рис.2в). Синтез этого производного осуществляли конъюгацией ГМДП-Ьув с М-оксисукцинимидным эфиром 4-азидосалициловой кислоты и последующего радиоиодирования в присутствии Хлорамина Т. Очистку конъюгата проводили обращенно-фазной ВЭЖХ.

Перфорированные 0,001% дигитонином макрофаги мыши инкубировали с ГМДП-Ьуз[(1251)А25] в отсутствие или в присутствии избытка немеченого ГМДП. Клетки облучали УФ-светом, после чего лизировали горячим буфером для приготовления электрофоретических образцов и анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (505-РАСЕ) с последующей радиоавтографией. Было обнаружено наличие ряда меченных белков (рис.12), однако лишь некоторые из них, а именно, белки с мол.массами 31-34 кДа и 36-39 кДа связывали радиоактивный лиганд специфически, только за счет мурамоилпептидного фрагмента. Связывание лиганда с белками с мол.массой 42-47 кДа ингибировалось немодифицированным ГМДП лишь частично, но в то же время полностью ингибировалось конъюгатом ГМДП-Ьу5[А25], что предполагало участие в связывании всей молекулы.

В дальнейшем для детекции ГМДП-связывающих белков был применен полимерный зонд (ГМДП-Ьу5)-ПАА-(В0, синтезированный Бовиным с соавт. (1993). Этот зонд представлял собой смешанный конъюгат ГМДП-Ьуэ и биотина с полиакрил амидом с мол.массой 30-40 кДа. (ГМДП-Ьуз)-ПАЛ-(В1) содержал 20 мольных процентов ГМДП-ЬуБ и 5 мольных процентов биотина. Связавшийся зонд визуализировали инкубацией со стрептавидин-пероксидаз-

Рис.12. Радиоавтограф геля после

электрофоретического разделения белков перитонеальных

макрофагов мыши, аффинно меченных ГМДП-Ьу5[(1251)Аг5]. Мечение проводилось в отсутствие (сплошная линия) или присутствии (пунктирная линия) избытка холодного ГМДП.

ным конъюгатом и далее со смесью 4-хлорнафтола и 3,3'-диаминобензидина.

Использование данного зонда позволило выявить после БОБ-РАСЕ и вестерн-блоттинга в клетках разной этиологии и разных видов (рис.13, 14) два белка с мол.массами 32 кДа и 34 кДа (р32 и р34), сохранявших способность специфически связывать ГМДП. Очевидно, эти белки были идентичны белкам 31-34 кДа, выявленным с помощью аффинного мечения. Специфичность связывания подтверждалась тем фактом, что для сорбции необходима была интактная молекула гликопептида. Проведение инкубации с зондом в присутствии углеводного фрагмента ГМДП - дисахарида 01с\Ас-Ми^Ас - не отменяло связывание, в то время как дипептид А1а-Б-Ю1п ингибировал связывание зонда лишь в незначительной степени. Высокомолекулярные белки, которые также выявлялись (ГМДП-Ьуз)-ПАА-(ВО, связывали его неспецифически, поскольку окрашивание не отменялось при инкубации с зондом в присутствии ГМДП. В то же время ГМДП-связывающие участки белка 36-39 кДа, обнаруженного с использованием фотоаффинного мечения, в процессе БОБ-РАОЕ, очевидно, претерпевали необратимую денатурацию, так как вестерн-блоттингом этот белок не обнаруживался.

946743-

3020-

1 2 3

Рис.13. ГМДП-связывающие белки макрофагов мыши (1), клеток \\'ЕН1-3 (2) и Т-клеточной линии человека .1игка1 (3) отмечены на блоте стрелками. Окрашивание Соота^е Я-250 и (ГМДП-Ьу5)-ПАА-(В1). Стрелками отмечены белки, связавшие зонд.

Рис.14. ГМДП-связывающие белки макрофагов (1) и Т-лимфоцитов (2) крысы отмечены на блоте стрелками. Окрашивание Сооташе 11-250 и (ГМДП-Ьуз)-ПАА-(В1). Стрелками отмечены белки, связавшие зонд.

Внутриклеточные ГМДП-связывающие белки были достаточно жестко фиксированы на субклеточных фрагментах. Об этом говорило наличие эффекта поляризации флуоресценции при связывании ГМДП-Ьуз-ПиТС. В то же время характеристика свойств р32 и р34 показала, что они не являются интегральными мембранными белками: в случае мышиных макрофагов они элюировались с субклеточных фрагментов 2М КС1, а в случае клеток \УЕНГ-3 - 2М КС1 или 0.01М БЭТА.

Для решения вопроса о том, находятся ли белки р32 и р34 на клеточной мембране или внутри клеток, интактные клетки \VEHI-3 и перитонеальные макрофаги мыши обрабатывали протеолитическими ферментами различной специфичности, а именно, трипсином, папаином или проназой. Клетки лизировали буферным раствором для приготовления электрофоретических образцов, проводили ЗОБ-РАСЕ, и после электропереноса на нитроцеллюлозную мембрану ГМДП-связывающие белки детектировали с помощью (ГМДП-Ьу5)-ПАА-(В1). Во всех случаях обработка интактных

30

клеток протеазами не изменяла молекулярных масс ГМДП-связывающих белков и не отменяла их способность связывать полимерный зонд. Это свидетельствовало о недоступности р32 и р34 для протеолиза, то есть об их внутриклеточной локализации.

Получение монок-юнальных апти-идиотипических антител к ГМДП

На следующем этапе исследования предстояло разработать схему выделения рецепторных белков. Удобным инструментом для решения подобной задачи являются МА. однако их получение осложняется низким содержанием рецепторов на клетках-мишенях. Поэтому для получения МА к ГМДП-связываюшим белкам был применен подход, основанный на получении гибридом, продуцирующих анти-идиотипические (анти-Id) МА к ГМДП. Такие антитела имитируют его внутренний образ и поэтому должны быть способны связываться с его рецепторами.

Сначала были получены МА к ГМДП. Самок мышей линии BALB/c иммунизировали конъюгатом ГМДП с метилированным БСА (МеБСА, 20% ГМДП) и проводили гибридизацию иммунных мышиных спленоцитов с клетками миеломы SP2/0. Отбор положительных клонов проводили на 10-14 сутки с помощью твердофазного ИФА с использованием качестве антигена конъюгата ГМДП-овальбумин (ГМДП-ОВА, 30% ГМДП). В результате клонирования и реклонирования был получен стабильный клон Е6/1.2, продуцирующий МА к ГМДП.

Гибридому Еб/1.2 наращивали в асцитах мышей или in vitro в бессывороточной среде в гранулах гидрогеля, построенных из смеси поли-N-винилкапролактама и альгината кальция. МА выделяли аффинной хроматографией, для чего лиганд (ГМДП-Lys) иммобилизовывали на СН-Сефарозе. Характеристика свойств МА Е6/1.2 показала, что оно

а) принадлежит к классу G, подклассу 1 и несет легкую цепь к-типа;

б) имеет высокую константу связывания с конъюгатом ГМДП-ОВА, а именно 2хЮ9М-';

в) специфично к фрагменту GlcNAc-MurNAc-Ala: МДП практически не ингибировал взаимодействие в твердофазном ИФА МА Еб/1.2 с конъюгатом ГМДП с полилизиналанином (ГМДП-AL). ГМДП, ГМДП-Lys и L-ГМДП

ингибировали связывание примерно в одинаковой степени, а дисахарид GlcNAc-MurNAc был на два порядка менее активен.

Таким образом, MA Е6.1.2 по специфичности напоминало ГМДП-связывающие центры макрофагов, хотя и не было им идентично. Это МА и было использовано для получения анти-Id МА к ГМДП.

Иммунизацию мышей Balb/c проводили Fab-фрагментами МА E6/I.2, конъюгированными с МеБСА. Fab-фрагменты получали расщеплением МА папаином, выделяли ДЭАЭ-хроматографией методом FPLC на колонке Mono Q 5/5 и конъюгировали с МеБСА с помощью водорастворимого карбодиимида. Проверка полученного конъюгата с помощью твердофазного ИФА показала, что Fab-фрэгменты не утратили способности взаимодействовать с ГМДП, что доказывало сохранение нативности структуры ГМДП-связывающего участка.

После гибридизации иммунных спленоцитов с миеломой SP2/0 отбор гибридных клонов производили на основании способности продуцируемых ими антител взаимодействовать с биотинилированными Fab-фрагментами МА Е6/1.2 (Fab Е6/1.2-В). Данный тест позволил выявить 42 клона, специфичных к антигенным детерминантам вариабельной области МА Е6/1.2.

На следующем этапе проводилось выявление клонов, продуцирующих МА (АТ2) против паратоп-ассоциированных детерминант молекулы Е6/1.2. С этой целью гибридомные супернатанты проверяли в конкурентном твердофазном ИФА на способность ингибировать связывание Fab Е6/1.2-В с конъюгатом ГМДП-овальбумин, сорбированным на микропланшете. Результаты конкурентного анализа и последующего клонирования позволили выявить 8 активных субклонов, продуцирующих анти-Id МА, специфичные к паратоп-ассоциированным идиотопам молекулы МА Е6/1.2.

Анти-Id МА к ГМДП выделяли из гибридомных супернатантов или из асцитных жидкостей с помощью аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованным МА Е6/1.2, приготовленной на основе BrCN-Сефарозы 4В. Их свойства суммированы в таблице 8. Следует отметить,что гибридомы C5/F3 и C5/F8 являлись субклонами одного исходного клона С5.

Дальнейшей задачей было выявление МА, несущих внутренний образ ГМДП. Был использован подход, основанный на свойстве подобных анти-Id антител вызывать при иммунизации животных формирование антител к

32

лиганду - в данном случае к ГМДП (анти-анти-Id, АТЗ). Самок мышеи Fl(CBAxC57BL/6) иммунизировали препаратами анти-Id МА к ГМДП с интервалом в 2 недели. Неделю спустя после пятой инъекции сыворотки исследовали с помощью непрямого и конкурентного твердофазного ИФА на наличие АТЗ, специфичных к ГМДП.

Несмотря на то, что практически все иммунные сыворотки в той или иной степени взаимодействовали с ГМДП-AL, специфическое дозозависимое ингибирование в присутствии свободного ГМДП наблюдалось только в случае сывороток мышей, иммунизированных препаратами МА C5/F3, C5/F8 и Е1/В2. Таким образом, из всего набора анти-Id МА к ГМДП только данные три МА обладали способностью индуцировать образование ГМДП-специфичных АТЗ и, следовательно, только они могли нести внутренний образ ГМДП.

Наиболее веским доказательством того, что анти-Id антитело несет внутренний образ лиганда, является способность имитировать его биологическую активность. Известно, что ГМДП обладает адъювантной активностью, повышая гуморальный ответ к белковым и корпускулярным антигенам, в частности, овх!ьбумину (ОВА).

Таблица S. Свойства анти-идиотипических МА к ГМДП.

Название клона Класс, субкласс Константа связывания* Индукция АТЗ Наличие адъювантно-го эффекта Связывание с внутриклеточными сайтами WEHI-3

В/4 В 6 IgM н.о. - - -

C5/F3 IgG2b 1.7х108 + ■ + + - --

C5/F8 IgG2b I.2xl07 + + + .

C10/F9 IgG3 н.о. - - -

D3/G4 IgM н.о. - - -

Е1/В2 IgGI 5.5х107 + - +

E6/F2 IgM н.о. - - -

Е9/С2 IgGI 2.7x107 - - -

* Связывание с Fab МА E6/I.2; н.о. - не определялась

10

0

2

4

6

8

ГМДП C5/F8 CS/F3 Е9/С2 Е1/В2 Контроль Рис.15. Адьювантная активность анти-идиотипических антител к ГМДП.

Адыовантные свойства полученных анти-Id МА к ГМДП исследовались на способность повышать гуморальный ответ к этому же белковому антигену. Введение ОВА совместно с анти-Id МА C5/F3 или C5/F8 вызывало дозозависимое увеличение титра AT соответственно в 3,7-11,0 раз и 2-9 раз (рис.15). Индекс стимуляции при совместном введении ОВА с любыми другими анти-Id МА к ГМДП бьи значительно более низким (не превышал 2) и практически не зависел от количества введенного анти-Id МА.

Таким образом, было показано, что только анти-Id МА C5/F3 и C5/F8 имитируют адъювантное действие ГМДП. Эти данные в совокупности с результатами экспериментов по индукции ГМДП-специфичных АТЗ однозначно указывали на то, что гибридомы C5/F3 и C5/F8 продуцировали анти-Id МА, несущие внутренний образ ГМДП. На основании этого можно было предположить, что данные МА будут способны также взаимодействовать с рецепторами ГМДП клеток-мишеней.

Для проверки этого предположения были использованы клетки линии WEHI-3. Иследование взаимодействия меченных флуоресцеин-изотиоцианатом анти-И МА к ГМДП с фиксированными формальдегидом и перфорированными н-октил-р-О-глюкопиранозидом клетками, проведенное с помощью метода поляризации флуоресценции, показало, что анти-Id МА C5/F3, C5/F8 и Е1/В2 связываются с внутриклеточными рецепторами ГМДП

клеток WEHI-3. Кроме того, эксперименты по конкурентному ингибированию показали, что добавление возрастающих количеств анти-Id МА C5/F3, C5/FS или Е1/В2 к суспензии перфорированных клеток WEHI-3 при обработке их конъюгатом ГМДП-FIuTC приводило к уменьшению связывания последнего с рецепторами. Эти результаты доказывали, что ГМДП и анти-Id МА C5/F3, C5/F8 и Е1/В2 взаимодействовали с одними и теми же внутриклеточными сайтами клеток-мишеней.

Для выяснения того, с какими из белков клеток WEHI-3 способны взаимодействовать анти-Id МА C5/F8, клетки подвергали осмотическому шоку в буфере, содержащем хлорид кальция и фенилметилсульфонилфторид, выделяли мембранную фракцию и подвергали ее SDS-PAGE в восстанавливающих условиях. Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану, и полученные реплики обрабатывали последовательно препаратом анти-Id МА, конъюгатом антител кролика против иммуноглобулинов мыши с пероксидазой хрена, а затем смесью 3,3'-диаминобензидина и 4-хлорнафтола. Проявление нитроцеллюлозных реплик позволило выявить связывание МА C5/F8 с белковыми полосами 45, 32-34, и менее 30 кДа, что коррелировало с данными, полученными методом фотоаффинного мечения (рис.1бА). Специфичность связывания подтверждалась данными ингибиторного анализа: в том случае, когда обработку МА C5/FS проводили в присутствии ГМДП, связывания с вышеупомянутыми белковыми полосами не наблюдалось(рис.1бВ). Таким образом, анти-Id МА C5/F8 специфически распознавало внутриклеточные ГМДП-связывакмцие молекулы клеток линии

WEHI-3.

Рис.16. Вестерн-блот SDS-PAGE лизата клеток WEHI-3.

Визуализация анти-Id МА в отсутствии (А) и присутствии (В) ГМДП.

43

30—► Ü

Выделение и структурная характеристика ГМДП-связывающих белков.

С целью выделения ГМДП-связывающих белков мышиные макрофаги и клетки WEHI-3 разрушали осмотическим шоком в присутствии ингибиторов протеаз, после чего мембранную фракцию осаждали высокоскоростным центрифугированием. ГМДП-связывающие белки солюбилизировали 2М KCl или 0.0IM EDTA.

Были получены два типа аффинных сорбентов, а именно, сорбенты, несущие в качестве лиганда ГМДП или ГМДП-Lys, и сорбенты с антиидиотипическими моноклональными антителами против ГМДП. В первом случае для приготовления сорбентов использовали, соответственно, АН-Сефарозу 4В и СН-Сефарозу 4В. Иммобилизацию проводили с использованием хлоргвдрата 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида. Сорбенты на основе анти-Id МА C5/F8 получали конъюгацией последних с BrCN-активированной Сефарозой 4В или белком А, иммобилизованном на Сефарозе CL-4B. В этом случае после сорбции МА на белок А-Сефарозе проводилась обработка хлоргидратом диметилпимелимидата, не затрагивавшая антиген-связывающих сайтов антител.

Попытка использования перечисленных выше сорбентов для выделения р32 и р34 не увенчалась успехом. Поэтому для очистки р32 и р34 были применены стандартные биохимические методы. В случае клеток WEHI-3 солюбилизированные EDTA белки разделяли методом ВЭЖХ на анионообменной колонке DEAE TSK 5PW. Профиль элюции белков представлен на рис.17. ГМДП-связывающие белки элюировались 0.5 М NaCl практически после всех остальных белков.

Ввиду того, что макрофагальные ГМДП-связывающие белки могли быть элюированы с субклеточных фрагментов 2 М KCl, но не 0.01 М ЭДТА, применение ионообменной хроматографии для их очистки было затруднительным из-за высокой концентрации соли. Удаление KCl диализом или диафильтрацией приводило к потере р32 и р34 вследствие сорбции на мембрану. Поэтому очистку ГМДП-связывающих белков мышиных перитонеальных макрофагов проводили методом гель-фильтрацией в режиме ВЭЖХ. ГМДП-связывающие белки элюировались двумя пиками, соответствовавшими молекулярным массам 130-140 кДа и 25-35 кДа. SDS-

OD226

0.5 }-Tr

0.2

0.3

0.1

0.4

\

2

о

2

4

6

8 Элюат (мл)

Рис.17 Профили элюции белков клеток WEHI-3 (1) и ГМДП-связывающих белков (3) с колонки DEAE TSK-5PW (LKB). Колонка была уравновешена в 2 мМ Трис-HCI, рН 7.6, с 2 мМ EDTA; элюция линейным градиентом NaCl (2).

PAGE показал, что высокомолекулярный пик представляет собой олигомер, состоящий из эквимолярных количеств р32 и р34, а низкомолекулярный - р34 с небольшой примесью р32.

Выделенные р32 и р34 для окончательной очистки подвергали SDS-PAGE и электрофоретически переносили на мембрану Immobilon. Определение N-концевых последовательностей у р32 и р34 показало, что N-концевые аминокислотные остатки у них блокированы. Поэтому был проведен триптический гидролиз этих белков в геле и выделено около 40 гомогенных пептидов. С помощью масс-спектрометрии для некоторых пептидов были определены аминокислотные последовательности. Сравнение с банком белковых последовательностей позволило идентифицировать ГМДП-связывающие белки р32 и р34 как белки семейства гистонов HI (рис. IS).

Тот факт, что число внутриклеточных центров связывания ГМДП, выявленное методом проточной цитофлуориметрии, значительно меньше числа молекул гистона HI в клетке, указывает на то, что не все входящие в состав хроматина молекулы HI являются доступными, что может быть связано с состоянием хроматина.

Ас Б ЕААРААРАААРРАЕКАРАКККААККРАСУКККА5СРРУШЛТКАУАА5 К ЕК5СУ8ЬААЬККАЬМАСШШП<Н8а1КЕОЬК5ЬУ5КС1ЬУ0ТКСТСА5О5Р КЬМККААЗСЕАКРдАККАСААКАККРАСААККРККАТСААТРККААККТР ККАККРААААУТККУАК5 Р ККАКУТКР ККУКБ АБ КАУ КРКААКРКУАКАКК УААККК

Рис.18 Аминокислотная последовательность гистона Н1А мыши. Выделены участки молекулы гистона, идентичные проанализированным пептидам.

Функциональные последствия взаимодействия ГМДП с гистонами Ш.

Ряд полипептидных гормонов, например инсулин, эпидермальный ростовой фактор, интерлейкин 1, имеют специфические центры связывания в ядре. В результате взаимодействия гормонов с хроматином происходят изменения в его структуре и повышается доступность определенных последовательностей ДНК для РНК-полимераз, что приводит к инициации транскрипции.

Известно, что гистоны Н1 связаны с межнузслеосомными участками ДНК и маскируют некоторые специфические регуляторные последовательности, расположенные в линкерных участках ДНК, конкурируя за эти участки с факторами транскрипции. В активированном хроматине содержится меньше гистона Н1, чем в неактивированном. Механизм частичного удаления гистонов Н1 в процессе активации генов неясен, хотя в литературе встречаются сообщения о белках - активаторах транскрипции, способных связываться с гистонами. Аналогичную роль мог бы выполнять и ГМДП, если бы бьш способен конкурировать с ДНК за гистоны Н1. Проведенные нами эксперименты показали, что подобный эффект имеет место, а именно, ДНК фага X вызывает дозозависимое ингибирование связывания (ГМДП-Ьу5)-ПАА-(В1) с гистоном Н1 из куриных эритроцитов, что подтверждает наличие конкурентных отношений между ДНК и ГМДП за участки связывания на молекуле Н1.

Учитывая вышеизложенное можно было предположить, что взаимодействие ГМДП и его аналогов с гистонами Н1 вызывает ослабление связи последних с хроматином, в результате чего меняется его структура и

дпкуклеосомы

моноиуклеосомш

Рис. 19. Расщепление хроматина из ядер эритроцитов курицы микрококковои нуклеазой (0.4 ел.).

без с

ГМДП ГМДП

регуляторные участки ДНК. становятся более доступными для факторов транскрипции и РНК-полимераз. Изменения в структуре хроматина

повышают также чувствительность хроматина к действию эндон\клеаз, что может служить тестом на подобные изменения. Поэтому для того, чтобы проверить, влияет ли ГМДП на структуру хроматина, пронодилея ограниченный гидролиз хроматина из ядер эритроцитов курицы микрококковои нуклеазон. Продукты реакции разделяли в Ьсс полпакрилампдном геле и окрашивали этидинбромидом. Как видно на фотографии геля (рис. 19) нуклеазное щспленис в присутствии ГМДП приполило к более интенсивному образованию моно- и динуктеосомны.х фрагментов, чем в его отсутствие.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об изменениях, происходящих под действием ГМДП в структуре хроматина, что может являться одним из путей его влияния на транскрипцию генов, в том числе генов, кодирующих поверхностные антигены макрофагов и опухолевых клеток. Следует подчеркнуть, что гистоны Н! - не единственные молекулярные мишени ГМП. и полому их действие на клетки-мишени не ограничивается этим механизмом.

Приведенные выше данные позволяют обосновать следующий механизм влияния ГМП на адаптивный иммунитет. Попадая внутрь клетки за счет рецептор-опосредованного или рецептор-независимого эндоцитоза, ГМП

взаимодействуют с внутриклеточными мишенями (гистонами Н1 и пр.), активируя биосинтеза белков (мембранных антигенов, цитокинов). В случае клеток макрофагального ряда в результате усиления биосинтеза АГКГ класса И улучшается презентацию антигенов Т-хелперам, что в дальнейшем приводит к активации и клеточного, и гуморального звеньев иммунитета. В случае опухолевых клеток индуцированная ГМП экспрессия ОАА, АГКГ и молекул адгезии является отправной точкой для их распознавания как классическим Т-киллерами, так и неспецифическими киллерными клетками.

ВЫВОДЫ

1. Впервые продемонстрировано, что мурамоилпептиды модифицируют спектр поверхностных антигенов нормальных и опухолевых клеток-мишеней, усиливая экспрессию определенных групп мембранных белков, важных для развития иммунной реакции. Наличие/отсутствие эффекта определяется как типом клетки, так и типом антигена.

2. Показано, что способность глюкозаминилмурамоилпептидов усиливать экспрессию антигенов гистосовместимости II класса коррелирует с наличием у них адъювантной активности, что свидетельствует о вкладе этого эффекта в иммуномодулирующую активность глюкозаминилмурамоилпептидов.

3. Установлено, что изменения в спектре мембранных антигенов меланомных клеток под действием ГМДП приводит к усилению их лизиса генетически нерестриктированными цитотоксическими клетками крови, что свидетельствует об участии данного эффекта в механизме противоопухолевой активности глюкозаминил-мурамоилпептидов.

4. Показано, что глюкозаминилмурамоилпептиды инициируют биосинтез макрофагами цитокинов звена природного иммунитета, причем уровень секреции интерлейкина 1 и интерлейкина 6 коррелирует со степенью пирогенности мурамоилпептида.

5. Установлено, что макрофаги, Т-лимфоциты-хелперы и опухолевые клетки имеют специфические внутриклеточные центры связывания глюкозаминилмурамоилпептидов, а макрофаги также и мембранные рецепторы. Осуществлена их характеристика, и доказана способность внутриклеточных центров проводить биологический сигнал.

6. Впервые получены моноклональные анти-идиотипические антитела к ГМДГТ. Изучены их свойства, и выявлены антитела, связывающиеся с рецепторами ГМДП и имитирующие его адъювантную активность.

7. Впервые проведена характеристика белков, связывающих глкжозаминил-мурамоилпептиды. Разработана схема их выделения. Микросеквенированием доказана идентичность двух белков гистонам Н1.

8. Показано, что ГМДП конкуририрует с ДНК за связывание с гистонами Н1 и что обработка хроматина ГМДП приводит к структурным изменениям в его межнуклеосомных участках.

9. Сформулирована и экспериментально обоснована гипотеза, согласно которой молекулярный механизм действия глюкозаминилмурамоилпептидов включает активацию биосинтеза ряда белков клеток-мишеней в результате взаимодействия с гистонами Н1, приводящего к обнажению регуляторных межнуклеосомных участков ДНК и инициации транскрипции.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ

Обзоры

1. Несмеянов В.А. Цитокины иммунной системы. В кн. "Белки и пептиды" (ред.В. Т.Иванов, В.М.Липкин). Наука, Москва, 1995, т.I, стр. 368-385.

2. Несмеянов В.А. Рецепторы цитокинов. В кн. "Белки и пептиды" (ред.В.Т.Иванов, В.М.Липкин). Наука, Москва, 1995, т.1, стр. 362-368.

Статьи

1. Nesmeyanov V.A., Golovina T.N., Valyakina T.I., Andronova T.M., Ivanov V.T.

Cellular and molecular mechanisms of biological activity of muramyl peptides. -In "Immunotherapy of Infections", (Ed. Noël Masihi), Marcel Dekker, Inc., 1994, pp. 213-225.

2. fvanov V.T., Andronova T.M., Bezrukov M.V., Rar V.A., Makarov E.A., Kozmin S.A., Astapova M.V., Barkova T.I., Nesmeyanov V A. Structure, design, and synthesis of immunoactive peptides. Pure and Appl.Chem. (1987). 59, 317324.

3. Комалева Р.Л., Несмеянов B.A., Валякина Т.И., Хорлин А.Я. Препаративный метод выделения плазматических мембран лимфоцитов миндалин. Илшунология. (1980). (4), 92-93.

4. Валя кип а Т.И., Головина Т.Н., Петрова Е.Э., Несмеянов В.А. Иммуностимулирующие факторы, продуцируемые лимфоцитами. Иммунология. (1988). (2), 54-57.

5. Несмеянов В.А., Хайдуков С.В., Комалева Р.Л., Андронова Т.М., Иванов В.Т. Влияние Ы-ацетилглюкозаминил-р1-4-Н-ацетилмурамоил-аланил-О-изоглутамина (ГМДП) на экспрессию 1а-антигенов макрофагами мыши. Биол. мембраны. (1989). 6, 245-249.

6. Valyakina T.I., Vershinina N.V., Gilyarevskii S.D., Nesmeyanov V.A. Production of InterIeukin-2 in serum-free medium. MoUmmunol. (1984). 21, 811-814.

7. Гиляревский С.Д., Хайдуков C.B., Лунева H.M., Несмеянов В.А. Фенотипирование и функциональная характеристика клеток лимфосаркомы крысы. Иммунология. (1987). (2), 33-36.

8. Nesmeyanov V.A., Khaidukov S.V., Komaleva R.L., Andronova T.M., Ivanov V.T. Muramylpeptides augment expression of la-antigens on mouse macrophages. Biomedical Sci. (1990). 1, 151-154.

9. Sumaroka M.V., Litvinov I.S., Khaidukov S.V., Golovina T.N., Kamraz M.V., Komal'eva R.L., Andronova T.M., Makarov E.A., Nesmeyanov V.A. and Ivanov V.T. Muramyl peptide-binding sites are located inside target cells. FEBS Letters. (1991). 295, 48-50.

10. Валякина Т.И., Малахов A.A., Макаров E.A., Андронова Т.М., Ревазова Е.С., Несмеянов В.А., Иванов В.Т. Мурамоилпептиды модулируют экспрессию опухолеассоциированных антигенов. Иммунология. (1993). (4), 32-36.

И.Мареева Т.Ю., Котова О.В., Макаров Е.А., Андронова Т.М., Несмеянов В.А. Получение и характеристика моноклональных антител к ^ацетилглюкозаминил-(р1-4)-^ацетилмурамоил-аланил-0-изоглутамину. Биоорг. химия. (1993). 19, 555-561.

12. Nesmeyanov, V.A., Khaidukov, S.V., Komaleva, R.L., Sumaroka, M.V., Litvinov, I.S., Dorodnikh, E.G., Valyakina, T.I., Malakhov, A., and Brisken, K. The molecular mechanism of muramyl peptides' biological activity. -Haemotology and Blood Transfusion, 1992, Vol. 35, In "Modem Trends in Human Leukemia IX", (R.Neth, E.Frolova, R.C. Gallo, M.F. Greaves, B.V. Afanasiev, E. Elstner, Eds.), Springer-Verlag Berlin Heidelberg, pp. 290-293.

13. Golovina T.N., Sumaroka M.V., Samokhvalova L.V., Shebzukhov Yu.V., Andronova T.M., Nesmeyanov V.A. Biochemical characterization of glucosaminyl-muramylpeptide binding sites of murine macrophages. FEBS Letters. (1994). 356, 9-12.

14. Mareeva T.Yu., Kotova O.V., Golovina T.V., Nesmeyanov V.A. Production and characterization of monoclonal anti-idiotypic antibodies to muramylpeptide. -FEBS Letters. (1994). 356, 13-16.

15. Khaidukov S.V., Komaleva R.L., Nesmeyanov V.A. N-Acetylglucosamine-containing muramyl peptides directly affect macrophages. Int.J.Immunophann., (1995). 17, 903-911.

16. Головина Т.Н., Сумарока M.B., Самохвалова Jl.В., Шебзухов Ю.В., Макаров Е.А., Несмеянов В.А. Полипептиды из перитонеальных макрофагов мыши, узнающих глюкозаминилмурамоилдипептиды. Биоорг. химия. (1995). 21, 268-274.

17. Хайдуков С.В., Комалева Р.Л., Несмеянов В.А. Макрофаги - основная мишень дисахаридсодержащих мурамоилпептидов. Иммунология. (1995). (3), 26-30 (1995).

18. Markvicheva Е.А., Khaidukov S.V., Mareeva T.Yu., Bronin A.S., Nesmeyanov V.A., Zubov V.P. Effect of immobilization into hydrogel beads on structure and function of hybridoma cells during cultivation period. Membr.Cell Biol. (1995). 9, 127-134.

19. Markvicheva E.A., Khaidukov S.V., Mareeva T.Yu., Nesmeyanov V.A., Zubov V.P. Effect of cell entrapment in calcium alginate gel on a structure and functions of hybridoma. Exp.Ctin.Cancer Res. (1995). 14, 212-213.

20. Марквичева E.A., Хайдуков С.В., Мареева Т.Ю., Бронин А.С., Несмеянов В.А., Зубов В.П. Влияние иммобилизации в гранулы гидрогеля на структурно-функциональные особенности гибридных клеток в процессе культивирования. Биол. мембраны. (1995). 12, 122-128.

21. Valyakina Т., Malakhov A., Nlalakhova N., Petrova Е., Bykovskaya S., Revazova E., Nesmeyanov V. Glucosaminylmuramyldipeptide-induced changes in phenotype of melanoma cells result in their increased lysis by peripheral blood cells. Int.J.Oncol. (1996). 9, 885-891.

22. Валякина Т.Н., Малахов A.A., Комалева Р.Л., Петрова Е.Э., Михайлов А.Д., Ревазова Е.С., Несмеянов В.А. Дифференциальный

43

эффект глюкозаминилмурамоилдипептида на фенотип сублиний меланомы, различающихся метастатическим потенциалом. Мол. биология. (1996). 30, 1394-1401.

23. Несмеянов В.А. Иммуномодуляторы группы мурамоилпептидов: на пути к пониманию механизма биологической активности. Сборник трудов 1-ой национальной конференции Российской Ассоциации Аллергологов и Клинических Иммунологов (Москва, 1997), ВИНИТИ, Москва, 1997, с.153-159.

Тезисы докладов

1. Несмеянов В.А., Сумарока М.В. Характеристика рецептора мурамоилпептидов плазматических мембран иммунокомпетентных клеток. Тез. докл. I Всесоюз.иммунол.съезда (Сочи, 1989). т. 1, с. 83.

2. Несмеянов В.А., Хайдуков С.В., Комалева P.JI., Андронова Т.М., Иванов В.Т. Мурамоилпептиды усиливают экспрессию поверхностных антигенов макрофагов. Тез. докл. 1 Сов.-яп. симпоз. "Рецепторы: структура и функции" (Москва, 1989). с. 46.

3. Nesmeyanov V.A., Khaidukov S.V., Komaleva R.L. Mechanisms of immunomodulatory activity of muramylpeptides. Abstr. of pap. of the VII intern, congr. of immunology (Berlin, 1989). p. 81.

4. Nesmeyanov V.A., Khaidukov S.V., Komaleva R.L., Sumaroka M.V. The study of molecular mechanism of muramylpeptide biological activity. Abstr. of pap. of the symp. "Molecular factors of hematopoiesis and stem cell" (Moscow-Leningrad, 1990). p. 156.

5. Nesmeyanov V.A., Khaidukov S.V., Komaleva R.L., Valyakina T.I., Sumaroka M.V., Dorodnikh E.G., Andronova T.M., Ivanov V.T. The study of molecular mechanism of muramylpeptide biological activity. Abstr of pap. of the intern, symp. "Problems of immunopharmacology" (Tbilisi, 1990). p. 38.

6. Golovina T.N., Sumaroka M.V., Litvinov I.S., Khaidukov S.V., Nesmeyanov V.A. Intracellular muramyl peptide-binding molecules of macrophages. Abstr of pap. of XI Meet, of Europ.Fed.Immunol.Soc.(Espoo, 1991). p. 137.

7. Khaidukov S.V., Komaleva R.L., Sumaroka M.V., Nesmeyanov V.A. The study of mechanism of muramyl peptide biological activity. Abstr of pap. of XI Meet, of Europ.Fed.Immunol.Soc.(Espoo, 1991). p. 138.

8. Nesmeyanov V.A., Sumaroka M.V., Litvinov I.S., Khaidukov S.V., Dorodnikh E.G., Valyakina T.I., Golovina T.N., Makarov E.A., Andronova T.V., Ivanov V.T. Molecular and cellular basis of muramyl peptide biological activity. Abstrof pap. of 2nd Japan-USSR coop. symp. "Receptors: structure and function", (Kyoto, 1991). p. 10.

9. Golovina T.N., Khaidukov S.V., Litvinov I.S., Samochvalova L.I., Nesmeyanov V.A. Intracellular muramyl peptide-binding molecules. Abstr of pap. of Sth Intern. Congr. of Immunology (Budapest, 1992). p. 578.

10. Golovina T.N., Khaidukov S.V., Samochvalova L.V., Shebzuchov Yu.V., Litvinov I.S., Makarov E.A., Nesmeyanov V.A. Muramyl peptide-binding sites-location and molecular characteristics. Abstr of pap. of symp. "Structure and function of regulatory peptides" (Moscow, 1992). p. 23.

11. Khaidukov S.V., Komaleva R.L., Malachov A.A., Nesmeyanov V.A. Effect of muramyl peptides on murine peritoneal exudate cells (MPECs). Abstr of pap. of symp. "Structure and function of regulatory peptides" (Moscow, 1992). p. 579.

12. Mareeva T.Yu., Kotova O.V., Litvinov I.S., Nesmeyanov V.A. Interaction of anti-idiotypic antibodies with muramyl peptide-binding sites. Abstr of pap. of symp. "Structure and function of regulatory peptides" (Moscow, 1992). p. 43.

13. Nesmeyanov V.A. Molecular and cellular basis of biological activity of muramyl peptides. Abstr of pap. of II Russ.-Israel symp. on peptides and proteins (Moscow-Pushchino, 1992). p. 22.

14. Nesmeyanov V.A. Cellular and molecular mechanisms of biological activities of muramyl peptides. Abstr of pap. of 8th Intern. Congr. of Immunology (Budapest, 1992). p. 581.

15. Nesmeyanov V.A. The study of molecular mechanism of muramyl peptide biological activity. Abstr of pap. of symp. "Structure and function of regulatory

peptides" (Moscow, 1992). p. 51.

16. Головина Т.Н., Самохвалова Jl.В., Литвинов И.С., Мареева Т.Ю., Несмеянов В.А. Поиск и изучение мурамоилпептидсвязывающих молекул клеток иммунной системы и мозга. Тез. докл. I Всероссийской пл.-отчет, конф. по направлению "Белковая инженерия" (Москва, 1993). с. 27.

17. Головина Т.Н., Хайдуков С.В., Шезбухов Ю.В., Несмеянов В.А. Поиск и изучение мурамоилпептидсвязывающих молекул клеток иммунной системы

и мозга. Тез. докл. II Всероссийской пл.-отчет. конф. по направлению "Белковая инженерия" (Москва, 1994). с. 22.

18. Golovina T.N., Samokhvalova L.V., Litvinov I.S., Nesmeyanov V.A. Biochemical characterization of GMDP binding sites of murine macrophages. Abstr of pap. of 3rd Intern, symp. on bioorganic chemistry (Dagomys, 1995). p.77.

19. Nesmeyanov V.A., Golovina T.N., Mareeva T.Yu., Khaidukov S.V. Molecular recognition of glucosaminylmuramyl-peptides. Abstr of pap. of 3rd Intern, symp. on bioorganic chemistry (Dagomys, 1995). p.47.