Синтез аналогов люлиберина - носителей цитотоксических группировок тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

На правах рукописи

¡и сд

? А НО? 'оо?

ЯБЛОКОВА Татьяна Викторовна

СИНТЕЗ АНАЛОГОВ ЛЮЛИБЕРИНА - НОСИТЕЛЕЙ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ГРУППИРОВОК

02.00.06 - химия высокомолекулярных соединений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Санкт-Петербург 1997

Работа выполнена в лаборатории физиологически активных полимеров Института высокомолекулярных соединений РАН

Научные руководители: доктор химических наук, профессор Г.ПВласов

кандидат химических наук С.В.Буров

Официальные оппоненты: доктор химических наук М.В.Соловский

кандидат химических наук С.В.Куликов

Ведущая организация: НИИ Химии Санкт-Петербургского

государственного университета

Защита состоится " í$ " г в 10 часов на заседаниии

диссертационного совета Д 002.72.01 по защите диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук в Инсппуге высокомолекулярных соединений РАН по адресу: 199004, С.-Петербург, ВО, Большой пр. 31

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института высокомолекулярных соединений РАН.

Автореферат разослан " /7 " 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат физ. мат. наук

Д.А.Дмитроченко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Создание высокоселективных препаратов, избирательно поражающих раковые клетки, является одной из актуальных проблем современной науки.

Известно, что цитотоксические противоопухолевые агенты, способные оказывать воздействие на широкий круг злокачественных новообразований, высокой селективностью не обладают и поэтому весьма токсичны.

Гормоны, являясь более селективными противоопухолевыми препаратами, направленно действуют на клетки большого числа гормон-зависимых опухолей, имеющих соответствующие рецепторы. Однако гормональная терапия имеет недостаток, связанный с наличием в любой гормон-зависимой опухоли популяции клеток, не чувствительных к гормональному воздействию, которая в процессе лечения может стать доминирующей.

Возможным подходом к решению проблем, связанных с перерождением гормон-зависимых опухолей в гормон-независимые а также с токсичностью химиотерапевтических агентов, представляется сочетание гормональных и I штотоксических свойств в одном препарате. В такого рода гибридном соединении гормон служит биоспецифическим вектором, способным в организме селективно взаимодействовать с соответствующими клетками-мишенями, за счет чего нитотоксический агент локально концентрируется в зоне злокачественного образования, а следовательно, происходит снижение эффективной дозы и побочных явлений. Кроме того, подобные соединения должны также сохранять способность воздействовать на опухоль по гормональному механизму.

Многообещающими претендентами на роль биоспецифического вектора в гибридных противоопухолевых препаратах являются аналоги люлиберина (рилизинг фактора лютеинизирующего и фолликулостимули-рующего гормонов, ЬН-КН). ЬН-представляет собой амид линейного декапептида: рС1и-Ш5-Тгр-йег-Туг-С1у-Ьеи-А^-Рго-01у->Ш2, Его основная биологическая роль - контроль процессов овуляции и сперматогенеза. Под

воздействием LH-RH гипофизом секретируются лютеш шзирующий и фолликулостимулирующий гормоны, которые в свою очередь стимулируют синтез андрогенов и эстрогенов. С этим опосредованным влиянием на уровень половых стероидных гормонов связан основной механизм тормозящего действия высоко активных аналогов LH-RH на рост гормон-зависимых опухолей молочной железы, простаты, яичников, матки и гипофиза, некоторых хондросарком и остеосарком. В настоящее время этот механизм уже детально изучен, однако существуют и другие пути воздействия аналогов LH-RH на злокачественные новообразования, которые раскрыты не достаточно полно, например, возможное влияние на иммунную систему. Кроме того имеются данные о наличии рецепторов к LH-RH во многих злокачественных новообразованиях и о способности аналогов этого гормона непосредственно тормозить рост опухолевых тканей. Этот эффект может быть усилен путем создания гибридных препаратов, включающих аналог LH-RH и цитотоксический агент. Основы данного направления заложены рядом работ (Bajusz S. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 86, 6313), которые далеко не исчерпывают данной темы, в частности, возможности усиления противоопухолевого действия за счет увеличения количества циготоксического агента в препарате, причем, наиболее рациональный путь для этого - создание системы цитотоксический агент -макромолекудярный носитель - биоспецифический вектор.

Цель и задачи работы. Целью работы является исследование различных аспектов применеия гибридных соединений на основе синтетических аналогов LH-RH и возможности модулирования противоопухолевой активности за счет включения в структуру аналогов цихотоксических или липофильных груптровок, а также в результате связывания пептида и циготоксического агента с полимерным носителем.

С этой целью решались следующие задачи:

1. Синтезировать аналоги лдюлиберина, способные служить в качестве биоспецифических векторов дня целенаправленного транспорта циготоксических веществ

2. Для усиления прямого воздействия аналогов люлиберина на опухоль годифицировать полученные пептиды цитотоксическими группировками и ниофильиыми остатками.

3. Получить соответствующие макромолекулярные конъюгаты, содержащие говышенное количество цитотоксического агента.

4. Провести разноплановое изучите биологической активности интезированных препаратов и продемонстрировать на их примере возможность :омплексного воздействия па опухолевые клетки.

Научная повита. В ходе работы получены 11 новых аналогов LH-RH, окороченных и с полной аминокитслотной последовательноспо, в число которых юпши препараты, содержащие ковалешно связанный гштотоксический агент 5-^торурацил (5-FU) и (или) патьмитоильный остаток.

На основе водорастворимого сополимера вигоштирролидона и крототговой шелоты впервые получены макромолекулярные конъюгаты, содержащие (irroTOKCif'íecKiiií агеггг (5-FU) и аналог LH-RH в качестве биоспецифического зектора.

Проведено исследование противоопухолевой активности синтезированных соединегаш в системах in vivo и in vitro, выявлены высокоактивные препараты, установлена зависимость структура - биологическая функция. Так, в серии аналогов LH-RH с полной аминокислотной последовательностью включение остатка 5-FU сопровождается повышением активности аналога in vivo, введение пальмитоильного фрагмента усиливает прямое воздействие на опухолевые клетки в опытах in vitro. Показана высокая цитотошгческая активность гибридного макромолекулярного конъюгата, которая связана, по-видимому, с акпгоным направленным транспортом щ-гготоксического вещества внутрь клетки и со значительно большей долей 5-FU в препарате.

Для некоторых из синтезированных пептидов впервые обнаружена способность стимулировать синтез интерлейкина-2 в Т-лимфоцигах, что

указывает на возможность существования дополнительного механизма противоопухолевого действия

Практическая значимость работы. В ходе изучения противоопухолевой активности синтезированных соединений выявлены два декапептида: H-Pro-D-Phe-Pro-Ser-I>T-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 и Palm-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys(CMFU> Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, (где Palm - пальмитоил, CMFU - 1- карбоксиметил-5-фторурацил) , обладающих высокой противоопухолевой активностью и представляющих практический интерес.

Апробация работы. Результаты работы докладывались и обсуждались на семинарах ИБС РАН, на Конференции молодых ученых "Современные проблемы получения лекарственных препаратов" (Ленинград, СССР, 1990), 8-й Международной конференции молодых ученых по органической и биоорганической химии (Рига, Латвия, 1991), на 21-м и 24-м Симпозиумах Европейского пептидного общества (Платья д'Аро, Испания, 1990; Эдинбург, Шотландия, 1996), на 1-й к 4-й Междудародных конференциях "СПИД, рак и родственные проблемы" (С.Петербург, Россия, 1992 и 1996), на Международной конференции "Нейроиммуно-взаимо действия и окружающая среда" (С.-Петербург, Россия, 1995) и на Международном симпозиуме по применению аналогов Gn-RH в терапии рака и воспроизводстве человека (Женева, Швейцария, 1996).

Публикации. По материалам диссертации имеется 10 публикаций, в том числе - 2 статьи, получен Патент Российской федерации.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 137 страницах и состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов и экспериментальной части и приложений. Работа содержит 11 таблиц и 11 рисунков. Список литературы включает 137 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1, Выбор слейсерной группировки дляприсоединения 5-РЦ.

В качестве цитотоксического компонента бинарных препаратов нами был выбран 5-фторурацил (5-ри), один из широко используемых питотоксических агентов, принадлежащий к классу антиметаболигов.

При выборе типа связи между компонентами конъюгата мы принимали во втшмания следующие требования: 1). стабильность гибрида в ходе синтеза и при последующей очистке препаратов а также в процессе транспорта в организме к месту действия, 2). возможность расщепления связи с освобождением активных компонентов или реализации бинарного механизма действия.

Исходя из литературных данных и результатов предварительных экспериментов мы остановились на использовании 1-карбоксиметил-5-фторурацила (СМГО). Противоопухолевая активность этого производного значительно ниже, чем у З-Ки, но оно обладает необходимой устойчивостью, СМГО можно использовать в синтезе коньюгатов без существенных ограничений. При этом снижение цитотоксической активности по сравнению с исходным веществом может быть компенсировано за счет повышения его локальной концентрации и облегчения проникновения агента в клетку в случае целенаправленной доставки к месту действия.

СМШ был получен кипячением 5-ри в водном растворе щелочи с избытком хлоруксусной кислоты и выделен с помощью обработки ионообменной смолой "Оо\уех" 2x8. Затем был синтезирован пяра-нигрофешиовый эфир СМри с использованием реактива Сакакибары (трифторацетата пара-нитрофенола). Этот активированный эфир мы использовали в синтезе двух серий аналогов люлиберина: укороченных и декапептидных, то есть с полной аминокислотной последовательностью.

2. Синтез укороченных аналогов Ш-ЯН.

При выборе структуры пептидной части гибридных препаратов на первом этапе остановились на аналогах Щ-КН с укороченной аминокислотной последовательностью. Из литературы известно, что шести- и

семичленные фрагмешы суисрагонистов ЬН-ИН способны сохранять высокий уровень гормональной активности. В такого рода аналогах обычно используются две ключевые модификации: замена гдицина в шестом положении на аминокислоту в I)-конфигурации, а также этнламид вместо глицинамида на С-конце пептида. Сочетание достаточно высокого уровня активности со сравнительной простотой структуры делает заманчивым использование таких соединений в качестве биоспецифического вектора при создании конъюгатов с цитостатиками

В ходе работы синтезированы следующие укороченные аналоги Ш-КН:

I. Н-5ег-Т>т-13-А5р-Ьеи-Агё-Рго-тЕ1

П. СШТГ- Бег-Туг-В-Азр-Ьеи-А^-Рго-КНШ

Ш. Н-Рго- Бег-Туг-О-Азр-Ьеи-А^-Рго-ЫНЕ*

IV. СМБи-Рго- Зег-Туг-Б-Азр-Ьеи-Агв-Рго-Мда

V. ИрМ-Рго- Бег-Туг-Б^р-Ь^и-А^-Рго-ШЕ!

(Где ЫрЫ - Р-нафталинсульфо-группа)

В полученных аналогах в качестве замены в положении 6 использовали 1> аспарагиновую кислоту, СМКи вводили в структуру пептида по И-концевой амино-или иминогруппе.

Синтез препаратов этой серии выполнен методами классической пептидной химии в растворе. Гексапептид (I). исходный для всех укороченных аналогов, получен фрагментной конденсацией по схеме (2+1 )+3, включающей комбинацию азидного и дифенилфосфорилазидного методов (Схема 1).

После финального удаления защитных групп гидрогенолизом и очистки на ионообменном сефадексе БЕ С-25 гексапептид (I) использован при получении остальных аналогов методом активированных эфиров.

Полученные пегггиды очищали с помощью ионообменной хроматографии или гель-фильтрации, конечную очистку и контроль чистоты выполняли с помощью обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Структура соединений подтверждена данными аминокислотного анализа и масс-спектрометрии.

Схема 1. Синтеза исходного гексапешида (I)

Бег

н-

Туг Б-Аэр Ьеи

-ОРср Н—ОМе

-ОМе

-И: Н2

-N3

Ах^

Рго

Вос-

ОВг1

/

Н4-ОН Вое! ОВ71

---он

N02 НВг/ / АсОН г|-орср н-г-мнй N0:

/

-ОЫр н-

; срз сооя

н

ОВ г\

/ ВРРА

Н/Р(1

N02 НВг/ / АсОН

N02

Ж>2

N02

ШРРА - дафенилфосфорилазид)

-МНЕ!

-ЫНЕ1

-ЫНЕ1

-ша

-МНЕ!

3. Изучение противоопухолевой активности укороченных аналогов ЬИ-ИН.

Изучение противоопухолевой активности цроводилось на крысах Аа и мышах СЗН с перевиваемыми гормон-зависимыми опухолями простата и молочной железы соответственно. Эта серия экспериментов была поставлена в Институте экспериментальной диагностики и терапии опухолей при Огосологическогм научном цешре РАМН (Москва). Обработку животных начинали через 3 дня после перевивки опухоли, препараты вводили в дозах 0.1,1,10 и 100 мкг/кг ежедневно в течение 3-х -4-х недель. При этом на модели рака молочной железы укороченные аналоги Ш-1Ш не проявили

заметной активности. Карцинома простаты у крыс оказалась более чувствительной к воздействию исследуемых пептидов. Ка рис. 1а представлена активность синтезированных препаратов на данной модели рака в наиболее эффективной дозе на 28-й день лечения по сравнению с коммерческим препаратом, суперагонистом Ш-1Ш "бусерелином". Однако и в этом случае торможение роста объема опухоли не превышало 40 - 50%, причем включение в структуру пептида производного 5-Ш приводило к снижению активности.

4. Синтез декапегггидных аналогов Ш-ИН.

Полученные результаты заставили нас обратиться к изучению возможностей использования для синтеза соответствующих гибридов аналогов ЬН-Ш! с полной аминокислотной последовательностью (декапептидных). При выборе положения для введения цитотоксической группировки и структуры препаратов мы основывались как на литературных данных, так и на результатах наших предварительных экспериментов. Хорошо известно, что введение О-фенилалаиина в положение 2 природной молекулы приводит к получению эффективных антагонистов люлиберина, а замена глицина в положении 6 В-аминокислотами увеличивает антагонистическую активность. Показано, что включение остатка пролина в положение 1 или Шжзина в положение б является удобным вариантом при проведении последующих модификаций аналога. Поэтому для исследования влияния структуры препарата и степени загрузки вдтотоксическим агентом на его противоопухолевую активность при синтезе гибрида реакцию проводили по Ы-концевой иминогруппе пролина и е-аминогруппе О-лизина в положении 6. Была изучена также возможность модулирования противоопухолевой активности аналога ЬН-ИН путем введения пальмитоильного остатка в положение 1 за счет усиления его взаимодействия с мембраной клетки. Кроме того, остаток жирной кислоты в структуре пегтгада способен придать ему свойства образовывать обратимо диссоциирующие высокомолекулярные ассоциаты и сорбироваться на белках и клетках крови, что может увеличить время циркуляции такого соединения в организме, создавая своеобразный "депо" - эффект.

Синтезированы следующие декапегггадные аналоги LH-RH: VI. H-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Aig-Pro-Gly-Nbb VÏÏ. Ac-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NHz Vin. Palm-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-Nlb

IX. Ас- Pro-D-Phe-Pro-Ser-T>T-D-Lys(CMFU)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

X. CMFU- Pr(>D-Phe-Pro-Ser-T>T-D-Lys(CMFU>Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

XI. Palm- Pro-D-Phe-Pro-Ser-T>T-D-Lys(CMFU)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

Синтез пептидов этой серии проводили твердофазным методом на метилбензгидриламинополимере, при использовании Вос-бсгоильной стратегии на пептидном синтезаторе NPS-4000 фирмы Neosystem Laboratoires. Пептиды отщепляли от полимера действием трифторметансульфокислоты. Остаток CMFU присоединяли в растворе методом иа/ю-нитрофениловых эфиров. Полученные продукты очищали с помощью ионообменной хроматографии и гель-фильтрации, конечную очистку и контроль индивидуальности всех препаратов проводили с помощью высокоэффективной обращеннофазовой жидкостной хроматографии, структуру подтверждали данными аминокислотного анализа и масс-спектрометрии.

5. Изучение противоопухолевой активности декапептидных аналогов LH-RH

Испытания проттоопухолевой активности препаратов этой серии проводили на моделях гормон-зависимой опухоли простаты и молочной железы в условиях, аналогичных использованным для укороченных аналогов LH-RH. В экспериментах на модели рака молочной железы препараты (VI) и (IX) продемонстрировали торможение роста опухоли на конечном этапе выше 50%. На модели карциномы простаты все синтезированные декапептидные аналоги показали активность в разных дозах и на разных этапах лечения. Анализ данных (Рис. 16) позволяет проследить следующие основные тенденции: природа N-kohhcboü группировки оказывает определяющее влияние на величину противоопухолевой активности препарата, а введение CMFU преимущественно приводит к ее усилению.

Рисунок 1. Противоопухолевая активность синтезированных аналогов ЬН-ЛН на модели карциномы простаты у крыс Аа

"Рис. 1а Укороченные аналоги

к

ц

о

X

<я ь

о о.

о й о-2

Buserelin

Рис. 16. Аналоги люлиберина с полной аминокислотной последовательностью

XI*

Buserelin

Представленные данные соответствуют 28 дню лечения и дозе 100 м кг/кг (* -10 мкг/кг)

Для сравнения показана активность в этом тесте суперагониста LH-RH "Buserelin" (pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But )-Leu-Arg-Pro-NHEt).

Как и ожидалось, наиболее интересным оказался аналог (XI), содержащий патьмшоильный остаток и 5-FU. Он продемонстрировал стабильные результаты в широком диапазоне доз (от 0.1 до 100 мкг/кг). Максимальный эффект - 67% торможения роста опухоли в дозе 10 мкг/кг, превзошел эффект "бусерешша"в аналогичном тесте. В то же время, достаточно неожиданным оказался необычно высокий уровень активности для ^модифицированного пептида (VI) со свободной N-концевой иминогруппой в дозе 100 мкг/ кг.

6. Изучение стабильности аналогов LH-RH в плазме крови человека

Для оценки фармакодинамических параметров синтезированных аналогов LH-RH с использованием аналитической обращенно-фазовой ВЭЖХ было проведено исследование стабильности пептидов (Ш), (IV), (VI) и (IX) в плазме крови человека. При этом показана устойчивость аналогов LH-RH, содержащих CMFU в течение 24 часов инкубации. Этот результат свидетельствует о том, что 5-FU, присоединенный к биоспецифическому вектору, в условиях организма будет доставляться к клеткам -мишеням. Немодифицированный декапептид (VI) оказался также стабильным в течение 24 часов, что хорошо согласуется с его высокой биологической активностью, в то время как немодифицированный укороченный пептид (Ш) имел время полужизни 30 минут.

7.Изучение цитотоксической активности аналогов LH-RH in vitro

Для оценки возможного прямого противоопухолевого действия синтезированных соединений было проведено изучение их активности in vitro на культуре клеток карциномы яичников человека CaOv в Институте экспериментальной диагностики и терапии опухолей при Онкологическом научном центре РАМП (Москва). Цитотоксическую активность пептидов определяли по ингибиции включения радиоактивно меченого тимидина. Сравнительное изучение (Табл. 2) показывает значительную акпдаюсть падьмитоияьных аналогов (VH1) и (XI), что в сочетании с отсутствием эффекта для других препаратов и равной активностью пептидов, содержащего и не содержащего 5-FU, подтверждает наше предположение о важной роли

липофильной группировки в процессе взаимодействия аналога Ш-КН с клеточной мембраной. Однако эти же данные свидетельствуют об относительно невысоком вкладе связанного 5-ри в противоопухолевый эффект, вероятно, из-за недостаточного его количества в гибридном соединении.

8. Синтез полимерных гибридных препаратов

"Учитывая результаты биоиспытаний, мы пришли к выводу о целесообразности синтеза гибридного препарата на основе полимерного носителя, в котором можно было бы значительно повысить соотношение количества цитотоксических группировок на одну молекулу пептида и, возможно, усилил, его прямое действие на опухолевые клетки.

С этой целью нами был получен коньюгат, в состав которого вошли 5-ри и декапегггидный аналог Ш-ЯН (VI). В качестве носителя для него использовали сополимер винилпирролидона и кротоновой кислоты (соотношение винилпирролидона к кротоновой кислоте 85 : 15 ; М« = 30 ООО). Этот полимер был синтезировали предоставлен нам сотрудниками лаборатории N 2 ИВС РАН (Завлаб, чл.-корр. РАН, проф. Е.Ф.Панарин). Данное вещество обладает хорошей растворимостью в воде и низкой иммуногенностью.

Для модификации исходнного сополимера винилпирролидона и кротоновой кислоты цитотоксическим агентом мы использовали СМГО, связанный с этилендиамином, синтез которого проведен по следующей схеме:

Вос£>

РтосОЫВи

Ш2-(СН2)2-Ш2 —->Вос-ШЧСН2)2 -ЯНг->Вос-Ш-(СН2)2-№1-Етос->

ТЕЛ

-->ТРАхЫНг(СН2)2-Ш-Ртос-

СМРи-ОКр

->СМЕи-Ш-(СН2)2--КН-Етос->

ЕШ

пиперидин

■> СМРЛ-Ш-(СН2)2-Ш2

ИШ

Полученное производное СМГО карбодиимидным методаом присоединяли

к исходному сополимеру, а затем присоединяли аналог LH-RH (VI): НООС

НООС-

-( (

COOII

VCOOH

CMFU-NH-(CH1)2'NH2 ИЪСО

H2N- ! пептид ); DIC/HOBt

DMF

соон

v-CMFU -

Таблица 1. Полимерные коньюгаты, содержащие пептиды и 5-FU

Препарат Сокращенное наименование Среднее количество молекул на одну полимерную цепь *

5-FU пептида

Сополимер винилшфролидона и кротоновой кислоты, содержащий 5-Г и ПВП-ПКК--ПКК(ГО) 10-11 -

Сополимер винютшрролидона и кротоновой кислота, содержащий 5-ГО и аналог ЬН-КН (VI) 1ТВП-1ГКК-ПКК(Ри)--ПКК(Ш-Ш) 10-11 0.9-1.1

Сополимер виниллирролидона и кротоновой кислоты, содержащий аналог Ш-КН (VI) ПВП-ПКК--ПКК(Ш-1Ш) - 2.2

Сополимер виниллирролидона и кротоновой кислоты, содержащий аналог фрагмента фибриногена и 5-ГО тП-ПКК-ТЖК(ГТТ)--ПКК(1КЮ) 10-11 1.1

* Разброс данных отражает содержание 5-ГО и пептида в различных образцах полимеров.

>

Продукты очищали диализом. Содержание 5-FU определяли спектро-фотометрически (л, = 270 нм), а содержание пептида - с помощью количественной реакции Паули. Полученные образцы конъюгата содержали в среднем 10 - 11 остатков 5-FU и 1 молекулу пептида на одну полимерную цепь.

С использованием аналогичных методик нами были синтезированы контрольные коньюгаты: сополимеры винилпирролидона и кротоновой кислоты, содержащие только 5-FU, или только аналог LH-RH, а также коньюгаты, включающие 5-FU и вместо аналога LH-RH - аналог фрагмента а-цепи фибриногена, так называемый RGD пептид.

Структура синтезированных препаратов представлена в таблице 1. 9. Изучение цитотоксических свойств синтезированных полимерных конъюгатов in vitro

Все полимерные препараты были исследованы in vitro на культуре клеток карциномы яичников CaOv в условиях, аналогичных использованным для аналогов LH-RH (Табл. 2). Коныогат, содержащий аналог LH-RH в качестве биоспецифического вектора и 5-FU в соотношении 1 : 10, продемонстрировал значительную цитотоксическую активность в дозе 10'5 М, в то время как все контрольные полимеры были практически неактивны. Мы полагаем, что этот факт свидетельствует о наличии опосредованной гормон-рецепторным взаимодей-ствием интернализации гибридной макромолекулы в опухолевую клетку и реализации цитотоксического потенциала 5-FU. Коньюгаты, содержащие только 5-FU или только аналог LH-RH, не имеют активности, а это значит, что оба функциональных фрагмента - пептид и ашиметаболит - необходимы для проявления цитотоксических свойств у конъюгата ГОП-ПКК-ЩКК-Ри)-П(КК-ЬН-1Щ). Отсутствие активности у полимера, нагруженного 5-FU, но вместо аналога LH-RH, содержащего другой пептид, подгеерждает наш вывод об избирательности процесса, обусловленного гормон-рецепторным взаимодействием.

Таблица 2 Влияние синтезированных соединений на пролиферацию клеток линии карциномы яичников CaOv_

Соединение Концентрация % CE50 Актив-

M ингибиции M ность *

включения

3Н-т1шидина

Аналоги LH-RH

IV 10"4 11+3 >10"4 -

10-5 0

lO"6 0

V 10"4 15±4 >10^ -

¡o-5 0

Ю"6 0

vm 10"4 98+9 4x10'5 +

5x10"5 58+6

10'5 10+3

10*6 5±2

XI 10"4 98+8 4x10'5 +

5x10"5 55+5

lO"5 20+5

6±2

Полимерные

коныогаты

ПВП-ПКК- 5x10-5 13+3 >5xl0'5 -

-mOC(FU) 10'5 3+1

lO"*5 0

ГЮ1МЖК- 5xl0"5 96+9 lO"5 ++

-ITKK(FU)- lO"5 55±5

-FtKK(LH-RH) 10'° 10+2

пвп-пкк- 5x10"5 5+2 >5xlO'5 _

-Í7KK(LH-RH) 10-5 1±0.3

10"° 0

11В1Н1КК- 5xl0"5 6+3 >5x10"5 -

-raac(FU> 10-5 0

-IIICK(RGD) 10"6 0

*. Препарат считался цитотоксически активным, если СЕ5о<10

10. Влияние некоторых аналогов LH-RH на экспрессию гена интерлейшна-2

Сопоставляя данные биологических испытаний всех синтезированных соединений, следует отметить, что противоопухолевая активность аналога LH-RH (VI) на модели карциномы простаты ш vivo была необычно высокой для гормонального препарата. Тот факт, что он полностью неэффективен в

экспериментах in vitro, наводит на мысль о возможности существования еще одного механизма реализации противоопухолевой активности, в дополнение к гормональному, который может быть связан с активацией иммунной системы. Для проверки этого предположения два вещества, представляющие обе серии синтезированных аналогов LH-RH, пептиды (V) и (VI), были исследованы в Отделе общей патологии и патофизиологии Института экспериментальной медицины РАМН (С,-Петербург). Литеранурные данные о наличии рецепторов к LH-RH в Т-лимфоцитах послужили основанием для исследования способности этих двух соединений стимулировать иммунный ответ Т-клеток, а значит, влиять на синтез интерлейкина-2 (ИЛ-2), являющегося их фактором роста. Данные, полученные в серии экспериментов, свидетилъствуют, что оба аналога LH-RH активируют экспрессию гена интерлейкина-2, причем, точкой приложения для действия пептидов могут являться нуклеотидные Пары самого гена. Такой эффект для коротких пептидов был отмечен впервые.

В таблице 3 представлены результаты одного из опытов по воздействию аналогов LH-RH на экспрессию мРНК ИЛ-2 в Т-лимфоцитах, которую регистрировали методом in situ гибридизации с комплементарной ДНК, меченой дигоксигенином. Данные свидетельствуют, что максимум синтеза РНК наблюдается через 4 часа инкубации Т-клеток с пептидами. Воздействие декапетпида (VI) проявляется при более низких концентрациях, на более раю их сроках а также продолжительнее по действию, чем эффект укороченного аналога (V), что согласуется с высокой противоопухолевой активностью декапептида.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что величина и характер противоопухолевой активности аналогов люлиберина может эффективно модулироваться путем введения в их структуру цитотоксических или липофильных группировок, а также в результате создания полимерных конъюгатов, несущих циготоксический агент и пептид. Кроме того вероятно существование механизма противоопухолевого действия аналогов люлиберина, связанного со стимуляцией иммунной системы.

Таблица 3

Влияние пептидов (V) и (VI) на экспрессию мРНК ИЛ-2 в Т-лимфоцигах селезенки мыши in vitro (метод in situ гибридизации)

% Д11К-РНК гибридов, меченых дигоксигенином

Время инкубации Контроль Концентрация пептида, нг/м.ш клеток

без * ЯБС ** КонА Аналог LH-RII(V) Аналог LH-RH (VI)

ч добавок 110 +рИЛ2 2 5 10 20 2 5 10 20

2 0 0 0 0 .5+0.9 6±4.0 5±2.5 12±3.0 25±8.0 1.5±1.5 0.8+0.5 3±0.8

4 0 0 12+2.0 1.5+1.5 4±2.8 7±4.0 17±5.2 25±11 4+2.0 2±1.5 4+1.8

.6 0 0 18±5.1 10±2.2 9+3.1 6±1.8 9±2.0 21±7.8 5±3.1 0 0.6±0.5

20 0 0 0 0 0 0 0 3±1.8 б±1.5 2±2.0 0

* • ЯБС 110 - белковая фракция 110 кД, полученная из ядерного экстракта клеток селезенки иммунизированных

эритроцитами барана крыс, не обладающая способностью стимулировать синтез ИЛ-2

** - КонА + рИЛ-2 - стимуляция Т-лимфоцитов конканавалином - А в сочетании с рекомбинантным ИЛ-2

ВЫВОДЫ

1. С целью разработки нового типа гибридных противоопухолевых препаратов сшгтезировано 11 аналогов люлиберина, составивших 2 серии: с укороченной и полной аминокислотной последовательностью, в том числе - аналоги, включающие остаток цитотоксического агента 5-фторурацила и пальмигоильный фрагмент.

2. С целью увеличения количества цитотоксического агента в гибридном препарате на основе водорастворимого сополимера винилпирролидона и кротоновой кислоты получены высокомолекулярные коныогаты, содержащие 5-фторурацил и аналог люлиберина в качестве биоспецифического вектора, обеспечивающего активный транспорт конъюгата к клеткам-мишеням.

3. Изучена стабильность некоторых синтезированных аналогов люлиберина в плазме крови человека in vitro.

4. Изучена противоопухолевая активность синтезированных аналогов люлиберина in vivo. Наиболее активными соединениями оказались H-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (VI) и Palm-Pro-D-Phe-Pro-Ser-TyT-D-Lys(CMFU> Leu-Arg-Pro-Gly-NH: (XI).

5. Показано, что введение пальмигоильного остатка в структуру аналога люлиберина усиливает его прямое воздействие на опухолевые клетки.

6. Высокая цитотоксическая активность in vitro высокомолекулярного конъюгата, содержащего аналог люлиберина и 5-фторурацил при отсутствии активности у контрольных полимеров, свидетельствует о наличии опосредованной гормон-рецепторным взаимодействием интернализации гибридной макромолекулы в опухолевую клетку и реализации цитотоксического потенциаоа 5-фторурацила.

7. Результаты исследования влияния некоторых синтезированных пептидов на экспрессию гена ингерлейкина-2 в Т-лимфоцитах указывают на возможность существования дополнительного механизма противоопухолевого действия аналогов люлиберина, связанного со стимуляцией иммунной системы.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Т.В.Семко, С.В.Буров, Г.П.Власов. Синтез укороченных аналогов люлиберина, содержащих остаток D-аспарагиновой кислоты / Конференция молодых ученых "Современные проблемы получения лекарственных препаратов": тез. докл.-Ленинград, 1990, с.25

2. G.P.Vlasov, S.V.Burov, T.V.Semko, O.S.Vesyolkina, V.P.Makusheva, N.F.Sepetov. Synthesis and study of properties of shortend luliberin analogues cordoning of 5-fluorouracil fragment / Peptides 1990 / ed. A.Giralt, Leiden: ESCOM Sci. Publ.B.V. 1991, p.682-683

3. T.V.Semko, S.V.Burov, O.S.Vesyolkina, G.P.Vlasov. Synthesis of truncated luliberin analogues contaning l-carboximethyl-5-fluorouracil residue and investigation of their properties / 8th Conference of young scientists on organic and bioorganic chemistry: Abstr.- Riga, 1991, p.! 16

4. S.V.Burov, T.V.Semko, G.P.Vlasov. Synthesis of luliberin antagonists with high antitumor activity / International conference on AIDS, cancer and retrovirusis: Abstr.-St.-Perersburg, 1992, p.63

5. Г.П.Власов, С.В.Буров, Т.В.Семко. Декапегггид, обладающий противоопухолевой активностью / Российский Патент N 20844558

6. Т.В.Семко, С.В.Буров, О.С.Веселкина, Г.П.Власов. Синтез и исследование противоопухолевой активности укороченных аналогов люлиберина. -Химия природ, соед., 1994, N 5, с. 655 - 663

7. N.S.Novikova, S.V.Burov, O.I.Golovko, L.V.Lebedeva, T.V.Semko, T.B.Kazakova. Analogues of hypothalamic peptide hormone LH-RH in T-lymphocyte cells activation / International conference "Neuroimmuno interactions and environment": Abstr.-St.-Petersburg, 1995, p. 156

8. S.V.Burov, T.V.Semko, T.B.Kazakova, O.I.Golovko, G.P.Vlasov. Investigation of antitumour activity of some GnRH analogues and their influence on EL-2 production / Symposium on GnRH analogues in cancer and human reproduction: Abstr.-Geneva, 1996, p.66

9. Т.Б.Казакова, С.В.Буров, О.И.Головко, Т.В.Гришина, Н.С.Новикова, А.А.Мюльберг, Т.В.Семко, Е.А.Корнева. Биологическая активность аналогов пептидного гормона - люлиберина в регуляции иммунного ответа Т-лимфоцигов. -Бюл. экспер. биол. мед., 1996, т.122, с.334-337

10. T.V.Semko, S.V.Burov, G.P.Vlasov. Polymer conjugate contaning LH-RH analogue as a vector for a targeting of 5-fluorouracil / 4th International conference "AIDS, cancer and related problems": Abstr.- StPetersburg, 1996, p.85

11. T.V.Semko, S.V.Burov, G.P.Vlasov. Hybrid antitumour compounds containing LH-RH analogue and 5-fluorouracil / 24th Symposium of the European Peptide Society: Abstr.- Edinburgh, 1996, p.26

(Т.В.Семко - Т.В.Яблокова)