N-амидино-аминокислоты и их использование в синтезе полипептидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ
|
Москаленко, Юлия Евгеньевна
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Санкт-Петербург
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2008
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.06
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
На правах рукописи
МОСКАЛЕНКО Юлия Евгеньевна
^-АМИДИНО-АМИНОКИСЛОТЫ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В СИНТЕЗЕ ПОЛИПЕПТИДОВ
02.00.06 - Высокомолекулярные соединения
02.00.10 - Биоорганическая химия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
С-Петербург - 2008 год
003167898
Работа выполнена в Институте высокомолекулярных соединений РАН.
Научные руководители:
член-корреспондент РАН, профессор Евгений Фёдорович Панарин, кандидат химических наук Сергей Владимирович Буров
Официальные оппоненты:
доктор химических наук Татьяна Борисовна Тенникова кандидат химических наук Мария Павловна Смирнова
Ведущая организация:
Кафедра высокомолекулярных соединений химического факультета Санкт-Петербургского государственного университета
Защита состоится « 22 » мая 2008 г. в 10 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.229.01 при Институте высокомолекулярных соединений РАН по адресу:
199004, Санкт-Петербург, В.О., Большой пр., д.31, конференц-зал.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института высокомолекулярных соединений РАН.
Автореферат диссертации разослан « 10 » апреля 2008 г.
Учёный секретарь Диссертационного совета
кандидат физико-математических наук
Долотова Н.А.
Актуальность работы. Природные полипептиды и белки применяются при диагност икс инфекционных заболеваний, разработке лекарственных препаратов и систем адресной доставки биологически активных соединений в клетки-мшпени. Однако использование природных соединений в качестве лекарственных препаратов зачастую ограничено из-за широкого спектра действия, недостаточной энзиматической стабильности и невозможности перорального введения. Одним из способов преодоления таких проблем является получение синтетических аналогов, лишенных перечисленных недостатков или создание пептидомиметиков - органических молекул, моделирующих особенности строения активных центров пептидов и белков. При синтезе рассматриваемых соединений широко используются так называемые неприродные аминокислоты. Проведение структурно-функционального анализа позволяет модифицировать первичную структуру пептида или белка таким образом, чтобы способствовать образованию наиболее выгодной для биологического эффекта конформации.
Таким образом, получение новых аминокислот и разработка методов их введения в полипептндную цепь представляется актуальной задачей.
Среди неприродных аминокислот особую роль играют соединения, содержащие гуанидиновую группу, поскольку она входит в состав многих биологически активных веществ: антибиотиков, ингибиторов ферментов, алкалоидов и т. п. Уникальность физикохимических свойств гуанидинов, заключающаяся в сохранении положительного заряда при физиологическом значении pH, обусловливает их важную роль во многих биологических процессах. В современной литературе представлены многочисленные методы, используемые при синтезе замещенных гуанидинов. Вместе с тем, их практическое применение не всегда приводит к положительным результатам, что свидетельствует о необходимости оптимизации способов получения конкретных объектов. Для моделирования ключевых особенностей V-концевой последовательности аргинил-пролин, входящей в состав многих природных пептидов, нами был выбран Я-амвдино-пролин и его аналоги: Ж-амидино-пироглутаминовая кислота и 2-имино-1-имидазолидин-уксусная кислота (циклокреатин).
Цель работы. Целью данного исследования является разработка методов синтеза Ы-амидино-аминокислот и их защищённых производных для получения на их основе биологически активных пептидов, пептидомиметиков и полимеров медицинского назначения.
При этом были поставлены следующие задачи:
1. Синтезировать А'-амидино-пролия и его производные, защищённые по амидиново" группе;
2. Разработать методы синтеза пептидов, содержащих Л’-амидино-пролин, 2-имино-1 имидазолидин-уксусную кислоту (циклокреатин) иЖ-шидино-пироглутаминовую кислоту;
3. На примере аналогов яюлиберина и КСЮ-пешидов изучить особенности применения Ы-амидино-аминокислот в пептидном синтезе и исследовать их влияние на строение и свойства полученных соединений;
4. Разработать методы синтеза полимеров на основе А'-амидино-пролина.
Методы исследования. Для подтверждения индивидуальности и доказательства химической структуры синтезированных соединений использовали методы электрофореза, тонкослойной хроматографии, обращённо-фазовой ВЭЖХ, масс-спектрометрии (ЕБ! МБ) и спектроскопии ЯМР. Пространственное строение полученных ояигопептидов изучали методом двумерной корреляционной спектроскопии ЯМР.
Объектами исследования являлись А-амидино-аминокислоты, их защищённые производные, а также полученные при их использовании пептиды и полимеры.
Особенности применения А^амидино-аминокислот в классическом и твердофазном пептидном синтезе определены на примере аналогов люлиберина и КХЗО-пштидов. Возможности получения гуанидин-содержащих полимеров исследованы при проведении полимеризации А^-(№амидино-пролил)-орнитина.
Научна« новизна:
- разработаны методы синтеза олигопептидов, содержащих Ж-амидияо-пролин, основанные на использовании мезитиленсульфонильного производного или проведении реакции гуакидилироваяия на полимерном носителе;
- выявлено образование бициклического побочного продукта при активации карбоксильной группы свободного А'-амидино-пролина;
- разработан способ получения пептидов, содержащих А/-амидино-пироглутаминовую кислоту, и получены данные об особенностях их поведения в растворе при различных pH;
- предложен простой и эффективный метод синтеза олигопептидов, содержащих 2-имино-1-имвдазолидин-уксусную кислоту (циклокреатии);
- установлено, что замена аргинина на Л'-амидино-пролин приводит к значительному повышению устойчивости КСЮ-пептидов к энзиматическому расщеплению;
- проведен синтез двадцати новых химических соединений, включая производные А-амидино-аминокислот, олигопептиды и продукты побочных химических реакций, структуры которых подтверждены методами физико-химического анализа
Практическая значимость работы. Разработанные методы синтеза ЛГ-амидино-аминокнслот и их защищённых производных могут быть использованы при получении биологически активных полипептидов, пептидомиметиков и полимеров, содержащих JV-амидино-пролин, циклокреатин и А-амидино-пироглутаминовую кислоту. На основе последовательности RGDF, модифицированной циклокреатином, синтезирован высокоактивный аналог, перспективный при разработке систем направленной доставки противоопухолевых препаратов.
Положения, выносимые на защиту:
- при получении олигопепгидов, содержащих Лг-амидино-пролин, наиболее эффективным является метод гуанкдилирования на полимерном носителе;
- замена аргинина на А'-амидино-пролин позволяет значительно повысить устойчивость аналогов RGD-пептвдов к энзиматическому расщеплению;
- проведение реакции внутримолекулярной циклизации является предпочтительным вариантом при синтезе пептидов, содержащих ЛГ-мидино-пироглутаминовую кислоту.
Апробация работы и публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи. Результаты исследований докладывались на 29-м Европейском пептидном симпозиуме (Гданьск, 2006), III российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007) и конкурсе молодых ученых ИВ С РАН (2006).
Работа выполнена в ИВС РАН в Лаборатории синтеза пептидов и полимерных микросфер в соответствии с планом научно-исследовательских работ по теме: «Биологически активные полимерные системы: синтез, структура, свойства».
Личный вклад автора состоял в проведении экспериментальных работ по синтезу производных А^-амидино-аминокислот и исследованию особенностей получения пептидов и полимеров на основе таких соединений.
Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и приложений. Работа изложена на 140 страницах, содержит 4 таблицы, 56 рисунков и 11 приложений* список литературы включает 165 наименований.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Выбор объектов исследования
А^амидино-прояин, А-амидино-пироглутаминовая кислота и 2-имино-1-имвдазолидин-уксусная кислота (циклокреатин), моделирующие основные структурные элементы
последовательности арпишл-пролин (рис.1), могут рассматриваться как аналоги аргинина, которых конформационная подвижность гуанидиновой группы ограничена за счет включени одного или двух атомов азота в гатичленный цикл.
.___ последовательность аргиннл-пролин р-----^
Ц^соон
ИХ'Ч® „ЛХгпптг ^
О n 2-имино-1-имидазолидии-
Л^-амнднво-пролнн I уксусная кислота
HjN 1SH (цнклокреатив)
Л-амидяно-пироглутаминовая
кислота
Рис,1. Неприродные аминокислоты, включающие основные структурные элементы последовательности аргинил-пролян.
Непосредственное использование iV-амидино-аминокислот в пептидном синтезе представляет определенные трудности. Во-первых, вследствие высокой щдрофильности они нерастворимы в обычно применяемых при этом органических растворителях. Во-вторых, такие соединения способны участвовать в ряде побочных реакций, включающих отщепление амидиновой группы, внутримолекулярную циклизацию и ацилирование. Поэтому прежде всего было необходимо разработать простые и надежные методы получения защищенных производных Д'-амидино-аминокислот.
1. iV-Амидино-пролин
1.1. Синтез защищённых производных /У-амидино-пролина
На первом этане работы нами были исследованы два варианта получения производных Л’-амидино-пролина: 1) из незащищенного iV-амидино-пролина и 2) путем гуанидшшрования иролина с помощью реагентов, несущих мезитиленсульфонияьную (Mts) защитную группу (рис. 2).
Лг-амидино-пролин (I) может быть получен в результате взаимодействия цианамида и пролина при кипячении в водно-спиртовой среде (рис. 2), Защита высокоосновной функциональной группы А'-амидино-пролина путем протонирования при использовании яара-толуолсульфокислоты позволяет разрешить проблему растворимости исходного соединения в органических растворителях. В то же время, попытка проведения реакции
конденсации с помощью ,ЧЛ;’-диизопроиилкарбодиимида (В1С) в присутствии 1-щдроксибензотриазола (НОВ{) приводит к практически количественному образованию побочного продукта. Аналогичный результат наблюдается в ходе получения трифторацетильиого производного действием на соединение (I) смеси трифторуксусного ангидрвда и трифторуксусной кислоты. Исследование структуры полученного соединения с помощью масс-спектрометрии и спектроскопии ЯМР позволяет сделать вывод о наличии побочной реакций циклизации д-амидино-пролина, приводящей к образованию выгодного пятичленного цикла (структура II, рис. 2).
гп _________________
N соон NaOH, н
HN=C=NH
гх
^N^COOH
вода-метанол,
с«
(CF^’O^O или DIC
-н,о
кипячение H,N NH
SMc Mts—nh-4
NH,
THF, TEA, кипячение
w>
(П)
Mts-Cl, 0°C, pH 10-11, вода-ацетон
<7-
A
Mts—HN NH
COOH
(Ш)
Рис. 2. Получение №амидино-пролина и его производного.
Ввиду нестабильности исходного соединения (I) в присутствии водоотнимающих агентов, мы исследовали возможность получения его защищенных производных путём гуанидилирования пролина. В качестве защитной была выбрана Mts-группа, широко используемая в твердофазном пептидном синтезе для блокирования гуанидиновой функции аргинина. Из литературы известен ряд методик гуанидилирования с применением защищенных тиомочевин, в т.ч. сульфанильных производных 5-метилтиоизомочевины. .Аналогичная схема была использована нами для получения Mts-iV-амвдино-лролина (рис. 2). Поскольку необходимым условием реакции гуанидилирования является кипячение в основной среде, что может приводить к частичной рацемизации, для количественной оценки оптической чистоты конечного продукта (III) были синтезированы диастереомерные пары Lй Д-/У-амидиио-пролил-£-аланин. Синтез дипептнцов в растворе карбодиимидным методом проходит не менее чем за сутки, что может быть связано со сгерическими препятствиями. Анализ полученных продуктов методом ОФ ВЭЖХ (рис. 3) показывает, что схема синтеза, описанная в литературе, не позволяет получить оптически чистое производное (содержание
13-изомера более 3%). Поэтому в ходе дальнейшей работы была исследована возможность блокирования амидиновой группы путем обработки тУ-амидино-пролина мезитиленсульфонилхлоридом. Реакция протекает в смеси ацетон-вода (О°С, pH 10-11) и позволяет синтезировать соединение (П1) (рис. 2) без потери оптической чистоты и с удовлетворительным выходом. Полученное производное может быть использовано при синтезе пептидов классическим и твердофазным методами.
СНз
(ТУа)
о г~1
~ чтчлсо-ш-сн>ч
7 1 соон
М(5^нкн СНз
Время, мин
(Ш)
Рис. 3. Разделение диастереомерных пар методом ОФ ВЭЖХ
1.2. Твердофазный синтез пептвдов, содержащих Л'-амидино-пролин
В настоящее время синтез на полимерном носителе является наиболее широко распространенным и эффективным методом получения биологически активных полипептидов. Нами были исследованы два варианта твердофазного синтеза пептидов, содержащих Л'-амидино-пролин: 1 - применение защищенных производных ,¥-амииию-пролина и 2 - введение амидиновой группы в процессе гуанидилирования Л^-концевого пролина на полимерном носителе (рис. 4).
Особенности применения М1з-Аг-амидино-пролина в твердофазном пептидном синтезе исследовали на примере получения аналога аргинил-глицил-аспартил-фенилаланина (К<ЗОР). Нами показано, что присоединение М43'Лг-амидино-пролина карбодиимвдным методом (рис. 4), как и в классическом синтезе, вследствие етерических препятствий протекает с трудом и требует увеличения продолжительности реакции конденсации до 24 ч (по сравнению с 1-2 ч в случае стандартного протокола) или применения более эффективных, чем В1С, агентов. Поэтому на следующем этапе работы мы исследовали возможности непосредственного введения гуанидиновой группы в пептидную последовательность, ковалентно связанную с полимерным носителем. В этом случае использовали более кислотолабильную трет-бутилоксикарбонильную (Вое) защитную группу. Анализ современных литературных данных
■казывает на два наиболее перспективных варианта гуанидшшрования аминов: 1. - действие У^'-бис-ире/я-бутилоксикарбонил-тяомочевшш в сочетании с реагентом Мукаямы и 2. -рименение (]'/‘Д’-бис-трет-бу’гилоксикарбонил)-1Я-карбоксамидин-бензотриазола (рис. 4).
^'СООН, шс/нов» нгг\ч-мй
Рис. 4. Твердофазный синтез пептидов, содержащих А^-амюшно-амшкжислоты (X-защитная группа).
Таблица 1
Сравнительная эффективность гуанидилирования первичной и вторичной аминогруппы пегггидил-полимера под действием (АГД Ч?»с-жрет-бупиоксикарбонил)-Ш-карбоксамидин-бензотриазола
Х-ООР-0 Избыток гуанидилирующей смеси Время реакции, ч Выход модифицированного пептида, %*
X = Шу 3 2 22
Х = 01у 3 4 57*
Х = Рго 3 19 54*
Приведен выход продукта, очищенного с помощью ВЭЖХ.
** По данньм нингидринового и изатинового тестов реакция проходит на 100%.
Поскольку в первом случае вместо целевого пептида образуется продукт взаимодействия реагентом Мукаямы неустановленной структуры, то для модификации пептидов, одержащях как вторичную, так и первичную аминогруппу был использован метод уанидилировашга (/УД ’-бис-трет-буттокст&рботп)- Ш-карбоксамидин-бензотриазолом в исутствии А?,]У-диизо11ропилэтиламина (ШРЕА). В этом случае реакция проходит с ысоким выходом и без каких-либо осложнений. Следует отметить, что при прочих равных словиях (избыток реагента, природа и количество основания) первичная аминогруппа лицина модифицируется в течение 2-4 ч, в то время как имино-группа пролина за 12-19 ч табл. 1).
Таким образом, проведенное исследование показывает, что гуанидилирование на полимерном носителе является предпочтительным методом при твердофазном синтезе коротких пептидов, содержащих Л'-амидино-пролин, В то же время при проведении классического синтеза в растворе, представляется целесообразным использовать защищенные производные А^-амидино-пролина.
2. 14-Амидино-пироглутаминовая кислота
Пироглугаминовая кислота, представляющая собой штичленный лаюам глутаминовой кислоты, входит в состав ряда белков и пептидных гормонов. Производные пироглугаминовой кислоты запатентованы как препараты для лечения дерматологических, вирусных и опухолевых заболеваний. Биологическая значимость пироглугаминовой кислоты, структурное сходство с пролитом и возможность использования при синтезе лекарственных препаратов обусловливают интерес к получению её неприродных аналогов. При исследовании принципиальной возможности получения А-амидино-пироглутаминовой кислоты нами были рассмотрены следующие варианты: гуанидилирование эфира пироглугаминовой кислоты, окисление Л-амидшго-пролина и внутримолекулярная циклизация гуанвдино-глутаминовой кислоты с образованием лактама (рис. 5).
Из литературы известно, что реакция ацилирования пироглугаминовой кислоты проходит с большим трудом вследствие делокализации неподеленной электронной пары азота при участии соседней карбонильной группы. Вместе с тем, описан синтез ряда № ацильных и Аралкильных производных при использовании в качестве катализаторов КИ-диметиламинопиридина (ОМАР), гидрида натрия и др. В нашем случае оказалось, что применение (Лг,,¥'-бнс-ире/я-бутилоксикарбонил)-1Я-карбоксамидин-бензагриазола для проведения реакции гуанидилирования в аналогичных условиях не позволяет получить целевого продукта (метод 1, рис. 5). По-видимому, в данном случае пониженная реакционная способность пироглугаминовой кислоты усугубляется наличием стерических препятствий, создаваемых защитными группами.
Альтернативный вариант, основанный на окислении АГ-амидино-пролина, приводит к образованию сложной смеси веществ, содержащей незначительное количество целевого соединения (метод 2, рис. 5). Поэтому в ходе дальнейшей работы мы исследовали схему внутримолекулярной циклизации гуанидино-глутаминовой кислоты (метод 3, рис. 5).
>*
I
Вм-Л-Вое У V
/О^^'СООВ/! ---„ о^\^СООВ*1
№Я -------------------- ^ - ..
2.
(ТЕА), да
ВМАР или ?н'аН в0с Вое
,=0- Г
^СО(Ж К«04 0^4 г1 (Л ГУН
У ---/--> N
^'т7 нмАхн,
1. Гуавддилирование з. Образование
п ______ 2. Деблокирование лакгама
'Г~"\ ,0 0-5/ \ ,0
>
-но и^н
производное производное Ы~амидто~
глутаминовой гуанидино-гяутаминовой трогяутамгтовой
кислоты кислоты кислоты
Рис. 5. Схемы синтеза Л'-амидано-пироглугамшовой кислоты.
С целью повышения эффективности реакции и упрощения процедуры выделения конечного продукта нами был использован метод твердофазного синтеза. На примере модельного дипептвда были отработаны условия циклизации гуанидияо-глутаминовой кислоты. Однако применение жёстких условий для отщепления пептида от полимерного носителя (действие трифторметансульфокислоты) осложняло очистку конечного продукта, а использование этиламина приводило к раскрытию лактама с образованием этиламвда. Поэтому в дальнейшем синтез проводили на полимере Ванга, позволяющем отщеплять пептид в мягких условиях под действием трифторуксусной кислоты (рис. 6). Несмотря на то, что обычно полимерные носители этого типа применяют в сочетании со щелочнолабильными защитными группировками, недавно был предложен метод селективного удаления Вос-защиты, происходящего без расщепления связи пептид - полимер, под действием раствора триметилсилил-трифлата в присутствии основания. Интересно отметить, что реакция деблокирования сопровождается образованием побочного продукта, о котором не упоминают авторы публикации. Данные масс-спектрометрии и спектроскопии ЯМР показывают, что это соединение представляет собой продукт алкилирования триэтиламина фрагментом лшкерной группы полимерного носителя ((X), рис. 6).
о>
Вое—NIV—Вое , ЮРКА
н
о,
ОВи
К/—, и __
*•' ^-р|,е~снК>о-<>-0
ИЧ
Вое—N11 N—Вое
| ТМвОТСТЕА/ВСМ
14, Ш | ШС/НОШ (6 экв.)
оХ^рЬе-С^-О^о-О-О
ЯуМ ЛН I
| ТТЛ/ТШ/И/) (95:2.5:2.5)
ГЛ о , и /=\ ,
0 I ^ье-ш «“Г^-О011 + Н° шИРЬе-ОН Е‘ ИГА- Ц^гЧш
(IX) (X) (XI)
Рис. 6. Синтез Л'-амидано-пироглугамил-фенилаланина (IX) на полимере Ванга
Следует отметить, что в реакционной смеси наряду с пептидом (IX), содержащим Л-амидино-пироглутаминовую кислоту, остается 10-15% нециклического предшественника (XI) (рис. 7а), количество которого не меняется при увеличении продолжительности реакции или применении более эффективных конденсирующих агентов. При этом показано, что очистка целевого продукта значительно упрощается при проведении хроматографического разделения в формиатном буфере за счёт различного удерживания молекул с ионизированными СООН-группами (рис. 76).
Исследование, проведенное методом ОФ ВЭЖХ, показывает, что в водном растворе пептид (IX) устойчив в кислой, нейтральной и слабощелочной средах, а при pH 9 полностью превращается в соединение (XI).
Предложенный метод синтеза может быть использован для введения А'-амидино-пироглугаминовой кислоты в последовательность коротких пептидов, содержащих не более 6-7 аминокислотных остатков. Применение аналогичной схемы для синтеза аналогов люлиберина, включающих десять аминокислотных остатков, не привело к положительным
результатам. Поэтому при получении олигопептидных последовательностей, содержащих № амидино-шроглутаминовую кислоту, представляется целесообразным использовать метод фрагментной конденсации.
Рис. 7. Разделение соединений (IX) и (XI) методом ОФ ВЭЖХ в трифторацегатном буфере при pH 2 (а) и формиате аммония при pH 6 (б).
3.2-имино-1-имидазолвдин уксусная кислота (циклокреатин)
2-имшю-1-имвдазолидин-уксусная кислота (циклокреашн), близкая по структуре к другим объектам исследования - №амидино-пролину и ^У-амидино-пироглутаминовой кислоте, является аналогом креатина - вещества, поддерживающего энергетический баланс в клетках живых организмов. Циклокреатин, напротив, вызывает нарушения в энергетическом обмене, что позволяет использовать его для лечения вирусных и онкологических заболеваний. При этом для доставки циклокреатина в клетки-мишени могут быть использованы синтетические полипептиды, что обусловливает интерес к разработке методов его включения в аминокислотную последовательность. Нам не удалось обнаружить литературных данных относительно использования циклокреатина при синтезе пептидов и пептидомиметиков, вместе с тем, описано применение его производных, которые предложены в качестве аналогов аргинина.
При проведений пептидного синтеза для улучшения растворимости в органических растворителях и подавления побочных реакций ацилирования необходимо использовать защищенное производное даклокреатина. Простейшим вариантом является защита протонированием при использовании «ара-толуолсульфокислоты. Полученный пара-толуолсульфонат обладает хорошей растворимостью в диметилформамиде, что делает возможным его использование при проведении конденсации карбодиимидным методом.
14
Время, мин
10 12 14 16
Время, мин
(а)
(б)
Особенности применения циклохреатина в пептидном синтезе были исследованы нами на примере аналогов пептида ЯООР (ХП) и (ХШ) (рис. 8). При этом оказалось, что реакция ацияирования сопровождается образованием побочных продуктов неустановленной структуры ((ХПа) и (ХШа)).
Н^’уГ^СООН
+ тш
рщ
Ж
ТИИВАЛТА ®^щ~СОР-ОН + (ХПа) Ш (ХП)
Ш^^со^кода-он + (ХШа)
да
(ХШ)
Рис. 8. Схема получения соединений (ХН) и (ХШ), модифицированных шклокреаганом.
Несмотря на образование некоторого количества побочных продуктов, их отделение не представляет трудности благодаря существенному отличию во времени удерживания в условиях проведения ОФ ВЭЖХ. Таким образом, нами предложен оригинальный и простой метод введения циклокреатина в последовательность коротких олигопептидов, содержащих 5-10 аминокислотных остатков.
4. Синтез пептидов, содержащих Л^амидино-аминокислоты
4.1. Получение аналогов 1ШВ-пептидов
Возможность практического использования И-амидино-аминокислот была исследована нами, в первую очередь, на примере синтеза аналогов МЮ-пептидов. Эти короткоцепочечные пептиды с достаточно простой структурой обладают способностью связываться с интегринами - белками наружной оболочки клетки - и могут быть использованы для подавления тромбообразования, в качестве противоопухолевых агентов и при разработке систем адресной доставки лекарственных препаратов. Вместе с тем, из литературы известно, что применение некоторых НОО-пептидов в медицинских целях ограничено вследствие быстрого расщепления связи аргинин - глицин под действием ряда ферментов (трипсин, тромбин, фактор коагуляции Ха и клострипаин).
В качестве исходного соединения при проведении модификаций был выбран пептид, соответствующий последовательности (95-98) a-цепи фибриногена (RGDF), который по литературным данным обладает высокой антиагрегантной активностью, В ходе работы нами синтезировано 6 аналогов, при получении которых Л-концевой остаток аргинина заменяли близкими по структуре неприродными аминокислотами, содержащими гуанидиновую группу, или присоединяли их по ЛГ-концевой аминогруппе (рис. 9). Результаты сравнительного изучения устойчивости полученных соединений при инкубации в плазме крови человека представлены на рис. 10. Методом ОФ ВЭЖХ показано, что содержание петида с JV-амидино-прояином остается практически неизменным в течение часа, количество аналога, модифицированного циклокреатином, уменьшается примерно на 40%, а природная последовательность RGDF расщепляется полностью (рис. 10). Высокая стабильность аналога (XIII) свидетельствует о перспективности его применения при разработке методов доставки циклокреагана в опухолевые клетки. На следующем этапе работы в С-ГГетербургском Государственном Медицинском Университете им. ак. Павлова было исследовано влияние синтезированных аналогов на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов in vitro. По данным биологических испытаний замена аргинина на неприродные аминокислоты оказывает существенное влияние на антиагрегантнуто активность пептидов (табл. 2). Полученные результаты могут быть использованы при поиске эффективных ингибиторов агрегации тромбоцитов на основе фрагментов a-цепи фибриногена.
4.2. Синтез аналогов люлиберина
Возможности применения Т\г -аммдино-продяна при синтезе более длинных олигопептидных последовательностей были исследованы нами на примере аналогов люлиберина. Люлиберин является пептидным гормоном, оказывающим влияние на репродуктивную функцию организма, а его аналоги широко используются при лечении эндокринных и опухолевых заболеваний.
Для определения влияния природы УУ-концевого аминокислотного остатка на конформацию аналогов и оценки возможности стабилизации P-изгиба за счёт ионного взаимодействия концевых группировок нами были получены соединения (XVIH) и (XIX): gPro1-#-/%ei-Pro3-Ser4-Tyr5-/>-Z>,s6-Leu7-Arg8~Pro9-Gly10-OH (XVIII) gPro1-Z)-/’/ig2-Pro3-Ser4-Tyr5-Z)-ij.’,v6-Leu7-Arg8-Pro9-Gly10'NH2 (XIX).
НК
ник'
СВР
N¡1,
ВСПР
(XIV)
7
Л ° иум*ш
gPro-GDF
(V)
(Ж
Д
-■у«
ни
Еау-сок
(XV)
и
I о Н,М ГчН
§Рго-СТ,ОГ
(XVI)
савг
ш
НК
6
о
N11
' N11,
Огп^Рго)-СПГ (XVII)
1---1 ?
ШТ*А;№
N11
соевг
(ХП)
- ! (?
Т исю ш
сСг-НСОК
(XIII)
Ряс 9. Структуры синтезированных аналогов пептида КОВБ (XIV).
Время, мин
Ряс. 10. Исследование стабильности пептидов в плазме крови человека.
Таблица 2
Исследование влияния КОО-пешндов на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов крови человека___________________
Соединение 1С50
10‘3 моль/л (доверительный интервал, р < 0,05) мкг/мл
(XIV) 2.0-10’^ (1,7-10"2; 2,5' 10"2) 10
(V) 1,09 (0,87; 1,34) 518
(XV) 1,93 (1,78; 2,09) 842
(XVI) ■ 2,97 (2,38; 3,61) 1563
' (XVII) 3,76 (1,03; 6,54) 1734
(XII) 1,05 (0,40; 1,80) 392
(ХШ) 4,38-10‘3 (6,62-10-4; 2,90- №2) 3
Синтез пептидов проводили твердофазным методом. Для введения в структуру аналогов ¿V-амидино-пролина использовали два различных подхода. Присоединение Mts-iV-амидино-прояияа карбодиямидным методом приводило к образованию лишь незначительного количества целевого продукта, несмотря на увеличение продолжительности реакции. В то же время, гуанидилирование JV-концевого остатка пролина под действием (N,N'-6uc-mpem-бутаяоксикарбоюш)-1#-карбоксамидин-бензотриазола проходило с высокой эффективностью. В этом случае по данным шахтового теста реакция завершается за 18 ч и позволяет получить пептиды с достаточно высоким выходом. Таким образом, гуанидилирование на полимерном носителе является предпочтительным методом синтеза олигопептидных последовательностей, содержащих jV-амидшо-пролин.
Известно, что пептидная связь преимущественно принимает «рдноконформацию, однако для имидной связи с участием пролина характерна цис-транс-шожрт (рис. И), и определение влияния остатков пролина на соотношение образующихся конформеров представляет интерес, поскольку это может влиять на биологическую активность синтезируемых пептидов. Следует отметить, что для аналогов люлиберина, содержащих N-концевой iV-амидино-пролин, характерна изомеризация пептидной связи, образуемой остатками пролина в положениях 3 и 9 аминокислотной последовательности. Содержание цис-форм Pro'’ и Pro9 по интенсивности соответствующих сигналов в ’Н-ЯМР спектре составляет 17% и 5% соответственно. Стабильность образующихся конформеров подтверждается данными ОФ ВЭЖХ (рис. 12) и спектроскопии ЯМР (рис. 13).
Рис. 11 Изомеризация пептидной связи, образованной пролитом.
4.3. Использование производных Л^-амидино-пролина при синтезе полимеров
Разработка методов синтеза полимеров, содержащих тУ-амвдияо-пролин, представляет важную задачу, поскольку такие соединения могут рассматриваться в качестве аналогов полиаргинина с ограниченной конформационной подвижностью гуанидиновой группы. При
О
яграис-пептид
О
цис- пептид
Рис. 12. Аналю аналога (ХУЛ!) методом ОФ ВЭЖХ. Слева - при комнатной температуре, справа - при 50°С.
Время, мин
Рис. 13. Фрагменты спектров ЯМР аналога люяиберина (ХУШ): слева - область амщшых протонов в ‘Н-спектре (стрелками отмечены сигналы минорных (цшс) конформеров); справа - корреляционный (1Н-13С)-ЯМР спектр, различия в химических сдвигах протонов при С^-углеродных атомах для цис- и /ярянс-конформеров пролина
этом представляет интерес как изучение влияния пространственной структуры боковой цепи на физико-химические свойства соответствующих полимеров, так и возможностей их практического использования в качестве антимикробных агентов или носителей биологически активных веществ.
Для синтеза ноли-а-аминокисяот широко используется метод полимеризации Л-карбоксиангидридов, получаемых в результате взаимодействия а-аминокислот с фосгеном. В случае А^амидино-пролина применение этого метода невозможно из-за отеугсгвия а-аминогруппы, поэтому в качестве мономера был выбран дипептид А^-(бис-тргт-бутилоксикарбонил-Лг-амйдино-пролил)-орнт'ин ((ХХУШ), рис. 14). Для предотвращения побочных реакций амидиновую группу блокировали с помощью Вос-защиты. Получение
мономера из свободного орнитина требует меньших затрат времени, однако из-за сложности выделения промежуточного соединения (XX) выход целевого продукта невысок (рис. 14а). Поэтому в дальнейшем синтез проводили с использованием защищённого производного орнитина (рис. 146). При этом было обнаружено, что отщепление Вос-защиты с последующей обработкой в щелочной среде сопровождается циклизацией с образованием 3-бензилоксикарбониламино-2-щтеридона ((XXIV), рис. 146). Следует отметить, что, несмотря на образование энергетически выгодного шестичленного цикла, высокая реакционная способность достаточно стабильного бензилового эфира яйляется неожиданной. Тем не менее, предложенная схема синтеза (рис. 146) обеспечивает хороший выход целевого продукта и может использоваться при получении мономеров, содержащих iV-амидино-пролин.
Попытки синтеза полимера методом полимеризации АГ-карбоксиангидридов (рис. 15) оказались безрезультатными по причине низкой растворимости мономера в стандартных условиях реакции получения АЧсарбоксиангидрида. В связи с этим при проведении полимеризации был использован метод активированных эфиров, полученных in situ (рис. 15).
По данным гель-фильтрации на сефадексе G-75 объём элюции для синтезированного соединения соответствует выходу поликатионяых молекул, использованных в качестве репера. Вместе с тем, несмотря на применение буфера с ионной силой, равной 0.5, наблюдается эффект удерживания из-за электростатического взаимодействия положительно заряженных групп полимера и остаточных карбоксильных групп еефадехса. что приводит к совпадению времени выхода полимеров с широким диапазоном масс (табл. 3).
Структурный анализ синтезированного соединения методом масс-спектрометрии в нашем случае также не дал однозначного ответа вследствие возможной фрагментации полимера в эксперименте. Поэтому для определения содержания концевых групп был привлечен другой структурный метод - спектроскопия ЯМР (рис. 16). Это позволило оценить степень полимеризации полученного полипептида, равную 10, что соответствует молекулярной массе около 2500. Определённое значение молекулярной массы хорошо коррелирует с ее оценочной величиной, рассчитанной по данным масс-спектрометрического анализа.
Таким образом, на примере поликонденсации А^-(Л?-амидино-пролил)-орнитина впервые показано, что при получении полимеров, содержащих iV-амидино-пролин, наиболее предпочтительным является метод акт ивированных эфиров.
Таблица3
Анализ катионных, полимеров методом гель-фильтрации’
Полимер ММ Константа распределения
Поли-Ь-орнитин 41000 1.17
Гистон (тип УШ-8) 14 300 1.23
Поли-Ь-гистидин 10300 1.14
Иоли[^-(Я-амидино-пролил)-орнитин] (XXIX) около 2 500** 1.14
* Условия: сефадекс 0-75, колонка 8 х 600 мм, буфер 0.1 н. КагЮ4, скорость потока 0.5 мл/мин; ** по данным ЯМР.
нгк^ч'-"у°
ООН
1,
ВосРгоОЙа, ацетои-вода о
2.3-оксвхянолин
М* N1
3. 20$и,ЯягС0у вода - дноксан-1,4
,СООН
1ЧН,
Вое
5.ТТА
^ХЧ^СООН О 6. Вос:САВ1,
1 4.Вг1-Вг,ТЕАг---у1иш1['^^уСООШ ГЕА
^ н" " Цм N-2 *■
ЧВ«с Н
(XX)
^уЯ^^-^уСООВг!
-
ШК
“К^-Вос Г2
Вое
г н,/ра
. 1. Си8045Н,0, 3.20ви, ¡Ч^СС^,
ВосгО, ацетон-вода вола - диоксан-1,4
----------- ---------------- во^^ч^СООН ■ ......►
ЭТЕЦ 2*8_оксихинолия ®
(XXI)
(XXII)
(ХХШ)
у-СООйе!
б. ВосРгоОРер
ч> 9
Вое
(XXVI)
х-*. К-г
уаЛ-Вос н Вое
(XXVII)
Рис. 14. Схема синтеза мономера (ХХУШ).
4. Вг!-Вг, ТЕА гплп. 5.ТЕА
Вос-Г^^СООН ---------------„ ------^уС(ЮШ -----------
и 1-г н Г7
Я Н
СООВг!
Ъ
7.ТГ А
8. Во^САВе, ТЕА
Ч А7 Г* ?Ш.
у&>[—Вое •-
НТ<к
Вое
соон
трнфосген, ТНК
Вое -К**
Н
1
Вое
О
О " 1, ШС (4 экв.),
НОР£р (4 экв.),
О
^^¡Ч-Вос ГО Вое
Шз РН9
(ХХУПГ)
~ОН
н-
» \ «4в
Ш Ьг О
2. ТГА
3. гель-фильтрация
М-он сО""“
<
[Н
О
N—Вое Н
гш2
(XXIX)
Рис. 15. Схема синтеза полй[Л^-(Л?-амвдино-пролш1)-орнитащ].
мономер
Рис. 16. Сопоставление 'Н-ЯМР спектров Л/^СА^-амвдшо-пролилУорюгшна и полимера (XXIX).
В ходе выполнения настоящего исследования синтезировано двадцать новых химических соединений, включая производные Я-амидино-аминокислот, олиголептвды и продукты побочных химических реакций, структуры которых подтверждены методами физикохимического анализа.
ВЫВОДЫ
1. Разработаны методы синтеза олнгопептвдов, содержащих Аг-амидино-пролин, М-амидино-пироглутаминовую кислоту и 2-имино-1-имидазолидин-уксусную кислоту (циклокреатин), основанные на использовании защищенных производных или реакции гуанвдилирования на полимерном носителе.
2. Исследование особенностей применения производных Л'-амидино-пролша показывает, что активация карбоксильной группы свободной аминокислоты сопровождается образованием бициклического побочного продукта.
3. В ходе оптимизации методов твердофазного синтеза олигопептидов, содержащих Ы-амидино-аминокислоты, установлено, что предпочтительным вариантом является гуанидилирование на полимерном носителе.
4. Впервые разработан метод синтеза пептидов, содержащих /У-амидино-пироглутаминовую кислоту, основанный на реакции внутримолекулярной циклизации на полимерном носителе. Показано, что такие соединения устойчивы в диапазоне pH 2-7.4, в то время как при pH 9 наблюдается быстрое раскрытие цикла с образованием производных гуанидино-глутаминовой кислоты.
5. Показано, что включение И-амидино-аминокислот в последовательность ЕОО-псптидов путем замены остатка аргинина или присоединения по ,¥-концевой аминогруппе повышает устойчивость аналогов к ферментативному расщеплению в плазме крови человека.
6. Разработан способ получения полимеров, содержащих в боковой цепи Л'-амидино-пролин, путём полимеризации активированного эфира Лгг-(Лг-амидино-пролил)-орнитина.
Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:
I. Буров С.В., Москаленко Ю.Е., Панарин Е.Ф. Синтез №[АГ,-(2Л,6-триметш1фенилсульфонил)-карбамидоия]-Ь-пролина // ЖОХ. 2006. Т. 76. № 4. С. 700702.
2. Moskalenko Yu., Burov S., Leko M, Dorosh M, Shkarubskaya Z, Panarin E. A'-Amidino-proline derivatives and their application in peptide synthesis // Proc. 29th Eur. Pept. Symp. 2006. P. 482-483.
3. C.B., Москаленко Ю.Е., Леко M.B., Дорош М.Ю., Панарин Е Ф. Производные N-амидинопролина и их использование в синтезе пептидов классическим и твердофазным методом // Биоорг. Химия. 2006. Т. 32. № 6. С. 1-9.
4.Москаленко Ю.Е., Дементьева И.Н., Кадинская М.И., Буров С.В. Влияние аналогов RGD-пептидов и низкоинтенсивного светодиодного облучения на АДФ-инцуцированную агрегацию тромбоцитов // Клинико-лабораторный Консилиум. 2007. № 18. С. 37-41.
5. Москаленко Ю.Е., Бурое С.В., Леко М.В., Дорош М.Ю., Шкарубская З.П., Панарин Е.Ф. Производные Лг-амидино-пролина и их использование в пептидном синтезе // III Рос. симпозиум «Белки и пептиды». Сб. тезисов стендовых докладов. 2007. С. 29.
Бесплатно
Автореферат отпечатан в ИВС РАН. Ризография. Тираж 100 экз.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Неприродные аминокислоты.
1.2. Природные соединения, содержащие гуанидиновую группу.
1.3. Методы синтеза гуанидинов.
1.4. Особенности получения и применения полимеров на основе производных гуанидина.
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Выбор объектов исследования.
2.2. N-амидино-пролин.
2.2.1. Синтез защищённых производных N-амидино-пролина
2.2.2. Твердофазный синтез пептидов, содержащих УУ-амидино-пролин.
2.3. N-амидино-пироглутаминовая кислота.
2.3.1. Гуанидилирование эфира пироглутаминовой кислоты.
2.3.2. Окисление УУ-амидино-пролина.
2.3.3. Модификация глутаминовой кислоты.
2.4. 2-имино-1-имидазолидин уксусная кислота (циклокреатин).
ГЛАВА 3. СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ, СОДЕРЖАЩИХ TV-АМИДИНО-АМИНОКИСЛОТЫ.
3.1. Получение аналогов RGD-пептидов.
3.2. Синтез аналогов люлиберина.
3.3. Использование производных N-амидино-пролина при синтезе полимеров.
ГЛАВА 4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
4.1. Материалы и методы исследования.
4.2. Синтез N-амидино-пролина и его производных.
4.3. Синтез пептидов твердофазным методом.
4.4. Синтез поли|>[а-(ЪГ-амидино-пролил)орнитина].
4.5. Изучение стабильности RGD-пептидов.
Природные полипептиды и белки применяются при диагностике инфекционных заболеваний, разработке лекарственных препаратов и* систем адресной доставки биологически активных соединений в клетки-мишени. Однако использование природных соединений в качестве лекарственных препаратов зачастую ограничено из-за широкого спектра действия, недостаточной энзиматической стабильности и невозможности перорального введения. Одним из способов преодоления таких проблем является получение синтетических аналогов, лишенных перечисленных недостатков или создание пептидомиметиков — органических молекул, моделирующих особенности строения активных центров пептидов и белков. При синтезе рассматриваемых соединений широко используются так называемые неприродные аминокислоты. Проведение структурно-функционального анализа позволяет модифицировать первичную структуру пептида или белка таким образом, чтобы способствовать образованию наиболее выгодной для биологического эффекта конформации.
Таким образом, получение новых аминокислот и разработка методов их введения в полипептидную цепь представляется актуальной задачей.
Среди неприродных аминокислот особую роль играют соединения, содержащие гуанидиновую группу, поскольку она входит в состав многих биологически активных веществ: антибиотиков, ингибиторов ферментов, алкалоидов и т. п. Уникальность физико-химических свойств гуанидинов, заключающаяся в сохранении положительного заряда при физиологическом значении рН, обусловливает их важную роль во многих биологических процессах. В современной литературе представлены многочисленные методы, используемые при синтезе замещенных гуанидинов. Вместе с тем, их практическое применение не всегда приводит к положительным результатам, что свидетельствует о необходимости оптимизации способов получения конкретных объектов. Для моделирования ключевых особенностей TV-концевой последовательности аргинил-пролин, входящей, в состав многих природных пептидов, нами был выбран TV-амидино-пролин и его аналоги: TV-амидино-пироглутаминовая кислота и 2-имино-1-имидазолидин-уксусная кислота (циклокреатин).
Целью данного исследования является* разработка методов синтеза TV-амид ино-аминокисл от и их защищённых производных для получения на- их основе биологически активных, пептидов, пептидомиметиков и полимеров медицинского назначения.
При этом были поставлены следующие задачи:
1. Синтезировать TV-амидино-пролин и его производные, защищенные по амидиновой группе;
2. Разработать методы синтеза пептидов, содержащих TV-амидино-пролин, 2-имино-1-имидазолидин-уксусную кислоту (циклокреатин) и N-амидино-пироглутаминовую кислоту;
3. На примере аналогов люлиберина и RGD-пептидов изучить особенности применения N-амидино-аминокислот в пептидном синтезе и исследовать их влияние на строение и свойства полученных соединений;
4. Разработать методы синтеза полимеров на основе TV-амидино-пролина.
Методы исследования. Для подтверждения индивидуальности и доказательства химической структуры синтезированных соединений использовали методы электрофореза, тонкослойной хроматографии, обращённо-фазовой ВЭЖХ, масс-спектрометрии (ESI MS) и спектроскопии ЯМР. Пространственное строение полученных олигопептидов изучали методом двумерной корреляционной спектроскопии ЯМР.
Объектами исследования являлись. TV-амидино-аминокислоты, их защищенные производные, а также полученные при их использовании пептиды и полимеры.
Особенности применения TV-амидино-аминокислот в классическом и твердофазном пептидном синтезе определены на примере аналогов люлиберина и RGD-пептидов. Возможности получения гуанидин-содержащих полимеров исследованы при проведении полимеризации амидино-пролил)-орнитина.
Научная новизна:
- V
- разработаны методы синтеза олигопептидов, содержащих тУ-амидино-пролин, основанные на использовании мезитиленсульфонильного производного или проведении реакции гуанидилирования на полимерном носителе;
- выявлено образование бициклического побочного продукта при активации карбоксильной группы свободного TV-амидино-пролина;
- разработан способ получения пептидов, содержащих тУ-амидино-пироглутаминовую кислоту, и получены данные об особенностях их поведения в растворе при различных рН;
- предложен простой и эффективный метод синтеза олигопептидов, содержащих 2-имино-1-имидазолидин-уксусную кислоту (циклокреатин);
- установлено, что замена аргинина на TV-амидино-пролин приводит к значительному повышению устойчивости RGD-пептидов к энзиматическому расщеплению;
- проведен синтез двадцати новых химических соединений, включая производные TV-амидино-аминокислот, олигопептиды и продукты побочных химических реакций, структуры которых подтверждены методами физико-химического анализа.
Практическая значимость работы. Разработанные методы синтеза N-амидино-аминокислот и их защищенных производных могут быть использованы при получении биологически активных полипептидов, пептидомиметиков и полимеров, содержащих TV-амидино-пролин, циклокреатин и тУ-амидино-пироглутаминовую кислоту. На основе последовательности RGDF, модифицированной циклокреатином, синтезирован высокоактивный аналог, перспективный при разработке систем направленной доставки противоопухолевых препаратов.
Положения, выносимые на защиту:
- при получении олигопептидов, содержащих W-амидино-пролин, наиболее эффективным является метод гуанидилирования на полимерном носителе;
- замена- аргинина на TV-амидино-пролин позволяет значительно повысить устойчивость аналогов RGD-пептидов к энзиматическому расщеплению;
- проведение реакции внутримолекулярной* циклизации является предпочтительным вариантом при синтезе пептидов, содержащих N-амидино-пироглутаминовую кислоту.
Апробация работы и публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи. Результаты исследований докладывались на 29-м Европейском пептидном симпозиуме (Гданьск, 2006), III российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007) и конкурсе молодых ученых ИВС РАН (2006).
Работа выполнена в ИВС РАН в Лаборатории синтеза пептидов и полимерных микросфер в соответствии с планом научно-исследовательских работ по теме: «Биологически активные полимерные системы: синтез, структура, свойства».
Личный вклад автора состоял в проведении экспериментальных работ по синтезу производных TV-амидино-аминокислот и исследованию особенностей получения пептидов и полимеров на основе таких соединений.
Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и приложений. Работа изложена на 140 страницах, содержит 4 таблицы, 56 рисунков и 11 приложений, список литературы включает 165 наименований.
ВЫВОДЫ
1. Разработаны методы синтеза олигопептидов, содержащих iV-амидино-пролин, iV-амидино-пироглутаминовую кислоту и 2-имино-1-имидазолидин-уксусную кислоту (циклокреатин), основанные на использовании защищенных производных или реакции гуанидилирования на полимерном носителе.
2. Исследование особенностей применения производных TV-амидино-пролина показывает, что активация карбоксильной группы свободной аминокислоты сопровождается образованием бициклического побочного продукта.
3. В ходе оптимизации методов твердофазного синтеза олигопептидов, содержащих iV-амидино-аминокислоты, установлено, что предпочтительным вариантом является гуанидилирование на полимерном носителе.
4. Впервые разработан метод синтеза пептидов, содержащих iV-амидино-пироглутаминовую кислоту, основанный на реакции внутримолекулярной циклизации на полимерном носителе. Показано, что такие соединения устойчивы в диапазоне рН 2-7.4, в то время как при рН 9 наблюдается быстрое раскрытие цикла с образованием производных гуанидино-глутаминовой кислоты.
5. Показано, что включение N-амидино-аминокислот в последовательность RGD-пептидов путем замены остатка аргинина или присоединения по TV-концевой аминогруппе повышает устойчивость аналогов к ферментативному расщеплению в плазме крови человека.
6. Разработан способ получения полимеров, содержащих в боковой цепи N-амидино-пролин, путём полимеризации активированного эфира N^-fN-амидино-пролил)-орнитина.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В ходе выполнения настоящего исследования синтезировано двадцать новых химических соединений, включая производные TV-амидино-аминокислот, олигопептиды и продукты побочных химических реакций, структуры которых подтверждены методами физико-химического анализа.
В результате исследования двух различных схем синтеза защищённого производного TV-амидино-пролина разработана методика, позволяющая получить оптически чистое производное. Количественная оценка оптической чистоты соединений проведена методом ОФ ВЭЖХ для диастереомерных пар L- и £>-7У-амидино-пролил-/,-аланина.
В ходе исследования было установлено, что активация карбоксильной группы свободного TV-амидино-пролина в присутствии водоотнимающих агентов сопровождается побочной реакцией циклизации с образованием выгодного пятичленного цикла.
Особенности применения защищённых производных TV-амидино-пролина были исследованы на примере широко используемых на практике классического пептидного синтеза в растворе и твердофазного метода, основанного на применении полимерных носителей. При этом показано, что в последнем случае предпочтительным вариантом синтеза пептидов, содержащих TV-амидино-пролин является гуанидилирование пептидил-полимера.
В ходе выполнения исследования предложен оригинальный и простой метод получения защищённого производного циклокреатина для синтеза олигопептидов. Показано, что защита протонированием с помощью пара-толуолсульфокислоты позволяет добиться хорошей растворимости циклокреатина в органических растворителях.
При разработке методики синтеза TV-амидино-пироглутаминовой кислоты исследованы три различные схемы и показана высокая эффективность метода внутримолекулярной циклизации гуанидино-глутаминовой кислоты на полимерном носителе. В результате варьирования длины синтезируемой аминокислотной последовательности установлено, что для получения полипептидов, содержащих более десяти аминокислотных остатков, может быть рекомендован метод фрагментной конденсации. В ходе исследования обнаружено, что методика удаления трет-бутилоксикарбонильной защиты с помощью триметилсилил-трифлата на полимере Ванга, описанная в литературе, сопровождается побочной реакцией алкилирования триэтиламина фрагментом линкерной группировки полимерного носителя.
При разработке метода синтеза полимеров, содержащих в боковой цепи TV-амидино-пролин, проведено сравнительное изучение эффективности двух схем получения мономеров. Показано, что при проведении полимеризации Д^-(Лг-амидино-пролил)-орнитина может быть использован метод активированных эфиров.
1. Watanabe К., Nakazawa М., Izawa К., Yokozeki К. Novel and efficient technologies for the production of unnatural amino acids and peptides // Suppl. Chimica Oggi/ Chemistry Today. 2005. V. 23. N. 3. P. 29-32.
2. Madau A., Porzi G., Sandri S. Stereoselective synthesis of unnatural amino acids m-4-hydroxyproline and bulgecinine // Tetrahedron: Asymmetry. 1996. V. 7. N. 3.P. 825-830.
3. Gude M., Piarulli U., Potenza D., Salom В., Gennari C. A new method for the solution and solid phase synthesis of chiral P-sulfonopeptides under mild conditions // Tetrahedron Lett. 1996. V. 37. N. 47. P. 8589-8592.
4. Carloni A., Porzi G., Sandri S. Stereoselective synthesis of uncommon a,a'-dialkyl-a-aminoacids. Part 1 // Tetrahedron: Asymmetry. 1998. V. 9. P. 29872998.
5. Ma J.S. Unnatural amino acids in drug discovery // Chimica Oggi/ Chemistry Today. 2003. V. 21. N. 6. P. 65-68.
6. Anthony-Cahill S.J., Magliery T.J. Expanding the natural repertoire of protein structure and function // Curr. Pharm. Biotech. 2002. V. 3. P. 299-315.
7. Hodgson D.R.W., Sanderson J.M. The synthesis of peptides and proteins containing non-natural amino acids // Chem. Soc. Rev. 2004. V. 33. P. 422-430.
8. Forster A.C., Tan Z., Nalam M.N.L., Lin H., Qu #., Cornish V.W., Blacklow S.C. Programming peptidomimetic syntheses by translating genetic codes designed de novo И Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. N. 11. P. 63536357.
9. Beene D.L., Dougherty D.A., Lester H.A. Unnatural amino acids mutagenesis in mapping ion channel function // Curr. Opin. Neurobiol. 2003. V. 13. P. 264270.
10. Santagada V., Fiorino F., Perissutti E., Severino В., De Filippis V., Vivenzo В., Caliendo G. Microwave-enhanced solution coupling of the a,a-dialkyl amino acid, Aib // Tetrahedron Lett. 2001. V. 42. P. 5171-5173.
11. Sia S.K., Carr P.A., Cochran A.G., Malashkevich V.N., Kim P.S. Short constrained peptides that inhibit HIV-1 entry // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. N. 23. P. 14664-14669.
12. Wang Q., Sasaki N.A., Potier P. Asymmetric synthesis of 4-substituted prolines as conformationally constrained amino acid analogues // Tetrahedron. 1998. V. 54. P. 15759-15780.
13. Gunther R., Thust S., Hofmann H.-J. Trypsin-specific acyl-4-guanidinophenyl esters for a-chymotrypsin-catalized reactions // Eur. J. Biochem. 2000. V. 267. N. 12. P. 3496-3501.
14. Zhang Z., Aerschot A.V., Hendrix c., Busson C., Busson R., David F., Sandra P., Herdewijn P. Synthesis of alanine and proline amino acids with amino or guanidinium substitution on the side chain // Tetrahedron. 2000. V. 56. P. 25132522.
15. Wen K., Han H., Hoffman T.Z., Janda K.D., Orgel L.E. The synthesis of p-peptides containing guanidine groups // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001. V. 11. N. 5.P. 689-691.
16. Barbul A. Arginine: biochemistry, physiology, and therapeutic implications // J. Parenter. Enteral Nutr. 1986. V. 10. P. 227-238.
17. Nitric oxide donors. Edited by Wang P. G., Cai T.B., Taniguchi N. Wiley-VCH: Weinheim. 2005. 390 p.
18. Jia O., Jannuk A. J, Cai Т., Xian M., Wen Z., Wang P.G. NO donors with anticancer activity // Expert Opin. Ther. Patents. 2002. V. 12. N. 6. P. 819-826.
19. Shiraki K., Kudou M., Fujiwara S., Imanaka Т., Takagi M. Biophysical effect of amino acids on the prevention of protein aggregation. // J. Biochem. 2002. V. 132. P. 591-595.
20. Shiraki K., Kudou M., Nishikori S., Kitagawa H., Imanaka Т., Takagi M. Arginine ethylester prevents thermal inactivation and aggregation of lyzozyme // Eur. J. Biochem. 2004. V. 271. P. 3242-3247.
21. Histones and other basic nuclear proteins. Hnilica L.S., Stein G.S., Stein J.L. (Eds.) (CRC series in the biochemistry and molecular biology of the cell nucleus.) CRC Press, Inc. 1989. 424 p.
22. Кокряков B.H. Биология антибиотиков животного происхождения. СПб.: Наука, 1999. 162 с.
23. Афиногенов Г.Е., Панарин Е.Ф. Антимикробные полимеры. СПб.: Гиппократ, 1993. 264 с.
24. Nishikawa М., Ogawa К. Antimicrobial activity of a chelatable poly(arginyl-histidine) produced by the ergot fungus Verticillium kibiense // Antimicrob. Agents Chemother. 2004. V. 48. N. 1. P. 229-235.
25. Frankel A.D., Pabo C.O. Cellular uptake of the Tat protein from human immunodeficiency virus // Cell. 1988. V. 55. P. 1189-1193.
26. Vives E., Brodin P., Lebleu B. A truncated HIV-l Tat protein basic domein rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 16010-16017.
27. Berlinck R.G.S. Natural guanidine derivatives // Nat. Prod. Rep. 1999. V. 16. P. 339-365.
28. Kim K.S., Qian L. Improved method for the preparation of guanidines // Tetrahedron Lett. 1993. V. 34. N. 48. P. 7677-7680.
29. Poss M.A., Iwanowicz E., Reid J.A., Lin J., Gu Z. A mild and efficient method for the preparation of guanidines // Tetrahedron Lett. 1992. V. 33. N. 40. P. 5933-5936.
30. Li J., Zhang G., Zhang Z., Fan E. TFA-sensitive arylsulfonyl-assisted synthesis of N,N''-substituted guanidines // J. Org. Chem. 2003. V. 68. P. 1611-1614.
31. Manimala J.C., Anslyn E.V. Highly efficient method for the synthesis of guanidinium derivatives. // Tetrahedron Lett. 2002. V. 43. P. 565-567.
32. Yong Y.F., Kowalski J.A., Lipton M.A. Facile and efficient guanylation of amines using thioureas and Mukaiyama's reagent // J. Org. Chem. 1997. V. 62. P. 1540-1542.
33. Kent D.R., Cody W.L., Doherty A.M. Two new reagents for the guanilation of primary, secondary and aryl amines // Tetrahedron Lett. 1996. V. 37. N. 48. P. 8711-8714.
34. Lai В., Gangopadhyay A.K. A practical synthesis of free and protected guanidino acids from amino acids // Tetrahedron Lett. 1996. V. 37. N. 14. P. 2483-2486.
35. Cunha S., de Lima B.R., de Souza A.R: Bismuth nitrate pentahydrate: a new and environmentally benign reagent for guanidilation of iV-benzylthioureas // Tetrahedron Lett. 2002. V. 43. P. 49-52.
36. Yong Y.F., Kowalski J.A., Thoen J.C., Lipton M.A. A new reagent for solid and solution phase synthesis of protected guanidines from amines // Tetrahedron Lett. 1999. V. 40. P. 53-56
37. Wu Y.-Q., Hamilton S., Wilkinson D.E., Hamilton G.S. Direct synthesis of guanidines using di(imidazole-l-yl)methanimine // J. Org. Chem. 2002. V. 67. P. 7553-7556.
38. Katritzky A.R., Rogovoy B.V., Chassaing C., Vvedensky V. Di(benzotriazole-l-yl)methanimine: a new reagent for the synthesis of tri- and tetrasubstituted guanidines // J. Org. Chem. 2000. V. 65. P. 8080-8082.
39. Musiol H.-J., Moroder L. iV,iV'-Di-ter^-butoxycarbonyl-l//-benzotriazole-l-carboxamidine derivatives are highly reactive guanidinylating reagents // Org. Lett. 2001. V. 3. N. 24. P. 3859-3861.
40. Zahariev S., Guarnaccia C., Lamba D., Cemazar M., Pongor S. One pot synthesis of azole carboxamidines and guanidinylation of amines // Proc. 28th Eur. Pept. Symp. 2004. P. 370-371.
41. Guisado О., Marti'nez S., Pastor J. A novel, facile methodology for the synthesis of Ar,Ar-bis(/er^-butoxycarbonyl)-protected guanidines using polymer-supported carbodiimide // Tetrahedron Lett. 2002. V. 43. P. 7105-7109.
42. Ho K.-C., Sun C.-M. Liquid phase parallel synthesis of guanidines // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999. V. 9. P. 1517-1520.
43. Honda Т., Yoshida S., Arai M., Masuda Т., Yamashita M. Synthesis and anti-influenza evaluation of polyvalent sialidase inhibitors bearing 4-guanidino-Neu5Ac2en derivatives // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2002. V. 12. P. 1929-1932.
44. Reddy P.M., Bruice T.C. Solid-phase synthesis of positively charged deoxynucleic guanidine (DNG) oligonucleotide mixed sequences // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003. V. 13. P. 1281-1285.
45. Jermakowicz-Bartkowiak D., Kolarz B.N., Tylus W. Sorption of aurocyanide and tetrachloroaurate onto resin with guanidine ligand — an XPS approach // Polymer. 2003. V. 44. P. 5797-5802.
46. Fernandez-Carneado J., Van Gool M., Martos V., Castel S., Prados P., De Mendoza J., Giralt E. Highly efficient, nonpeptidic oligoguanidinium vectors that selectively internalize into mitichondria // J. Am. Chem. Soc. 2005. V. 127. P. 869-874.
47. Funhojf A.M., Van Nostrum C.F., Lok M.C., Fretz MM, Crommelin D.J., Hennink W.E. Poly(3-guanidinopropyl methacrylate): a novel cationic polymer for gene delivery // Bioconjug. Chem. 2004. V. 15. P. 1212-1220.
48. Структура и функции низкомолекулярных пептидов. Чипенс Г.И., Полевая JI.K., Веретенникова Н.И., Крикис А.Ю. Рига. Зинатне. 1980. 328 с.
49. Kaddurah-Daoyk R. Creatine Analogues for Treatment of Obesity // U.S. Pat. 5998457. 1999.
50. Slepokuraa K., Gawlowska M. /V-Amidino-4-hydroxy-L-proline monohydrate and iV-amidino-L-methionine monohydrate // Acta Crist. 2005. V. C61. P. 2528.
51. Якубке Х.-Д., Ешкайт X. Аминокислоты, пептиды, белки: Пер. с нем. М.: Мир, 1985. 465 с.
52. Solid-phase peptide synthesis. Abelson J.N., Simon M.I., Fields G. B. (Eds) // Methods in Enzymology. V. 289. Acad. Press: San Diego. 1997. 780 p.
53. Девени Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды и белки: Пер. с англ. М.: Мир, 1976. 364 с.
54. Bartoli S., Jensen К.В., Kilburn J.D. Trifluoroacetyl as an orthogonal protecting group for guanidines //J. Org. Chem. 2003. V. 68. P. 9416-9422.
55. Nissim I., Yudkoff M., Terwilliger Т., Segal S. Rapid determination of guanidino-15N.arginine in plasma with gas chromatography — mass spectrometry: application to human metabolic studies // Anal. Biochem. 1983. V. 131. P. 75-82.
56. Alexander J., Higuchi T. Pyroglutamic acid esters used as dermal penetration'enhancers for drugs //U.S. Pat. 4762851.1989.
57. Rennie P. J., King S.P., Biedermann K.A., Morgan J.M. Compositions for preventing and treatment of cold and influenza-like symptoms and their methods of use // Int. Pat. WO/2001/028556.2001.
58. Rubenstein E. Methods for the use of nonprotein amino acids as therapeutic agents // U.S. Pat. 6191168.2001.
59. Lever Brother Company. Pyroglutamic acid esters, their synthesis and use in topical products // U.S. Pat. 4774255.1988.
60. Burman A.C., Mukherjee R., Jaggi M., Singh A.T., Kapoor K.K., Prasad S., Ray M. Anticancer activity of imino acid conjugates or methylglyoxal // U.S. Pat. 6613793. 2003.
61. Paul P.K.C., Osguthorpe D.J., Campbell MM. Design requiiments for pyroglutamic acid substitotions in peptides // J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1. 1990. N. 12. P. 33633365.
62. Abraham G.N., Podell D.N. Pyroglutamic acid // Mol. Cell. Biochem. 1981. V. 38. N. l.P. 181-190.
63. Awade A.C., Cleuziat Ph., Gonzales Th., Robert-Baudouy J. Pyrrolidone carboxyl peptidase (Pep): An enzyme that removes pyroglutamic acid (pGlu) from pGlu -peptides and pGlu proteins // Prot. Struct. Funct. Gen. 1994. V. 20. N. 1. P. 34-51.
64. Mozdzanowski J. Deblocking of proteins containing TV-terminal pyroglutamic acid // Protein sequencing protocols. Smith B.J. (Ed.) Methods in molecular biology. V. 211. 2nd edition. HumanaPr. Inc. 2003. P. 365-369.
65. Goswami R., Moloney M.G. Novel peptidomimetic structures: enantioselective synthesis of conformationally constrained lysine, ornithine and alanine analogues from pyroglutamic acid// Chem. Commun. 1999. N. 23. P. 2333-2334.
66. Najera C., Yus M. Pyroglutamic acid: a versatile building block in asymmetric synthesis // Tetrahedron: Asymm. 1999. V. 10. P. 2245-2303.
67. Bernardi К, Garavelli М., Scatizzi M, Tomasini С., Trigari V., Grisma M., Formaggio F., Peggion C., Toniolo C. Pseudoproline foldamers: the homo-oligomers ofpyroglutamic acid // Chemistry. 2002. V. 8. N. 11. P. 2516-2525.
68. Feinberg R.S., Merrifield R.B. Modification of peptides containing glutamic acid by hydrogen fluoride — anisole mixture. y-Acylation of anisole or the glutamyl nitrogen // J. Am. Chem. Soc. 1975. V. 97. P. 3485-3496.
69. Tomasini C., Villa M. Pyroglutamic acid as a pseudoproline moiety: a facile method for its introduction into polypeptide chains // Tetrahedron Lett. 2001. V. 42. P. 52115214.
70. Sheehan J.C., Tulis R.W. Oxidation of cyclic amines with ruthenium tetroxide // J. Org. Chem. 1974. V. 39. N. 15. P. 2264-2267.
71. Chulin A.N., RodionovI.L., Ivanov V.T. Synthesis of 10- and 9-membered dilactams derived from aspartic and glutamic acids // J. Peptide Res. 2005. V. 65. P. 292-297.
72. Methods for the oxidation of organic compounds; alkanes, alkenes, alkynes, and arenes. Haines A.H. I I Academic Press: London. 1985. P. 192-195.
73. Subra G., Amblard M, Martinez J. Glutamic acid as a new linker for attachment of alcohols to solid support // Tetrahedron Lett. 2002. V. 43. P. 9221-9223.
74. Sabatino G., Alcaro M.C., Pozo-Carrero M.C., Chelli M., Rovero P., Papini A.M. Assesment of 6Cl-HOBt-based coupling reagents in solid-phase cyclopeptidesynthesis // J. Pept. Sci. 2003. V. 71. N. 3. P. 304-336.
75. One-bead one-compound combinatorial library method. Liu G., Lam KS. И Combinatorial chemistiy (Ed. by Fenniri H.). Oxford: Oxford University Press. 2000. P. 33-49.
76. Lejeune V., Martinez J., Cavelier F. Towards a selective Boc deprotection on acid cleavable Wang resin // Tetrahedron Lett. 2003. V. 44. P. 4757-4759.
77. Zhang A. J., Russell D.H., Zhu J., Burgess K. A method for removal of iV-Boc protecting group from substrates on TFA-sensitive resins // Tetrahedron Lett. 1998. V. 39. P. 7439-7442.
78. Sakaguchi S. Uber die bindungsweise und quantitative bestimmung des arginins im proteinmolekule // J. Biochem. (Tokyo). 1925. V. 5. N. 25. P. 133-142.
79. Wang S.-S. /?-Alkoxybenzyl alcohol resin and p-alkoxybenzyloxycarbonylhydrazide resin for solid phase synthesis of protected peptide fragments // J. Am. Chem. Soc. 1973. V. 95. N. 4. P. 1328-1333.
80. Griffiths G.R., Walker J.B. Accumulation of analog of phosphocreatine in muscle of chicks fed l-carboxymethyl-2-iminoimidazolidine (cyclocreatine) // J. Biol. Chem.1976. V. 251. N. 7. P. 2049-2054.
81. Kaddurah-Daouk R., LillieJ.M., Widlanski T.S., Burbaum J.J., Forsyth C.J. Creatine analogs having antiviral activity // U.S. Pat. 5321030.1994.
82. Martin К J., Winslow E.R., Kaddurah-Daouk R. Cell cycle studies of cyclocreatine, a new anticancer agent// Cancer Res. 1994. V. 54. N. 19. P. 5160-5165.
83. Schimmel L., Khandekar V.S., Martin K.J., Riera Т., Honan C., Shaw D.G., Kaddurah-Daouk R. The synthetic phosphagen cyclocreatine phosphate inhibits the growth of a broad spectrum of solid tumors // Anticancer Res. 1996. V. 16. N. 1. P. 375-380.
84. Ml. Bennett J.S, Vilaire G. Exposure of platelet fibrinogen receptors by ADP and epinephrine // J. Clin. Invest. 1979. V. 64. N. 5. P. 1393-1401.
85. Marguerie GA, Plow EF, Edgington TS. Human platelets possess an inducible and saturable receptor specific for fibrinogen // J. Biol. Chem. 1979. V. 254. N. 12. P. 5357-5363.
86. ШитиковаА.С. Тромбоцитарный гемостаз. СПб.: СпбГМУ, 2000.227 с.
87. Ruoslahti Е, Pierschbacher MD. New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins // Science. 1987. V. 238. N. 4826. P. 491-497.
88. Pollina E. Design and synthesis of RGD mimetics as potent inhibitors of platelet aggregation // J. Undergrad. Sci. 1996. V. 3. P. 119-126.
89. Rubin B.G., McGraw D.J., Sicard G.A., Santoro S.A. New RGD analogue inhibits human platelet adhesion and aggregation and eliminates platelet deposition on canine vascular grafts //J. Vase. Res. 1992. V. 15. N. 4. P. 683-691.
90. Nichols A. J., Rujfolo R.Jr., Huffman W.F., Poste G., Samanen J. Development of GP Ilb/IIIa antagonists as antithrombotic drugs // Trends Pharmacol. Sci. 1992. V. 13. N. 11. P. 413-417.
91. Ugen K.E., Mahalingan M., Klein P.A., Kao K.J. Inhibition of tumor cell-induced platelet aggregation and experimental tumor metastasis by synthetic Gly-Arg-Gly-Asp-Ser peptide // J. Natl. Cancer Inst. 1988. V. 80. N. 18. P. 1461-1466.
92. Hersel U., Dahmen С., Kessler H. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond //Biomaterials. 2003. V. 24. P. 4385-4415.
93. Bettelheim F.R., Bailey K. The products of the action of thrombin on fibrinogen // Biochim. Biophys. Acta. 1952. V. 9. N. 5. P. 578-579.
94. Lor and L., Middlebrook W.R. Studies on fibrino-peptide // Biochim. Biophys. Acta. 1952. Y. 9. N. 5. P. 581-582.
95. Labouesse B. L'Hydrolyse du glucagon par la clostripaine // Bull. Soc. Chim. Biol. 1960. V. 42. N. 11. P. 1293-1304.
96. Hypothalamic and other peptide hormones. Schally A. V., Comaru-Schally A.M. // Cancer Medicine 5th edition. Ontario.: B.C. Dekker Publishers, 2000. Ch. 53. P. 715-729.
97. Zompra A.A., Spyroulias G.A., Magafa V., Cordopatis P. Synthesis and structuralinvestigation of a synthetic LHRH analogue in solution. // Chemlnform. 2005. V. 36. N. 13. P. (March 29,2005)
98. Ferland L., Labrie F., Savary M., Beaulieu M., Coy D.H., Coy E.J., Schally A V. Inhibitory activity of analogues of luteinizing hormone-releasing hormone (LH-RH) in vitro and in vivo // Clin. Endocrinol. (Oxford). i976. N. 5. Suppl. P. 279S-289S.
99. Fujino M., Fukuda Т., Shinagawa S., Kobayashi S., Yamazaki I. Synthetic analogs of luteinizing hormone releasing hormone (LH-RH) substituted in position 6 and 10 // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1974. V. 60. N. 1. P. 406-413.
100. Stewart D.E., Sarkar A., Wampler J.E. Occurrence and role of cis peptide bonds in protein structures //J. Mol. Biol. 1990. V. 214. P. 253-260.
101. Mac Arthur M.W., Thornton J.M. Influence of proline residues on protein conformation//J. Mol. Biol. 1991. V. 218. P. 397-412.
102. Henderson D.E., Horvath Cz. Low-temperature HPLC of cis trans proline dipeptides //J. Chromatogr. 1986. V. 368. P. 203-213.
103. Kalman A., Thunecke F., Schmidt R., Schiller P., Horvath Cz. Isolation andidentification of peptide conformers by reversed-phase high-performance liquid chromatography and NMR at low temperature // J. Chromatogr. A. 1996. V. 729. N. 1-2. P. 155-171.
104. Misicka A., Verheyden P.M.F., Van Binst G. Equilibrium of the cis-trans isomerisation of the peptide bond with 7V-alkyl amino acids measured by 2D NMR // Lett. Pept. Sci. 1998. V. 5. P. 375-377.
105. Reimer U., Scherer G., Drewello M, Kruber S., Schutkowski M., Fischer G. Side-chain effects on peptidyl-prolyl cis/trans isomerisation // J. Mol. Biol. 1998. V. 279. p. 449-460.
106. Sanclimens G., ShenH., Giralt K, Albericio F., Saltzman M.W., Royo M. Synthesis and screening of a small library of proline-based biodendrimers for use as delivery agents //Biopolymers (Pept. Sci.). 2005. V. 800. P. 800-814.
107. Fernandez-Carneado J., Kogan M.J., Castel S., Giralt E. Potential peptide carriers: amphipatic proline-rich peptides derived from the TV-terminal domain of gamma-zein // Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 2004. V. 43. P. 1811-1814.
108. Farrera-Sinfreu J., Giralt E., Castel S., Albericio F., Royo M. Cell-penetrating cis-y-amino-L-proline-derived peptides // J. Am. Chem. Soc. 2005. V. 127. P. 9459-9468.
109. WiejakS., Masiukiewicz E, Rzeszotarska B. Improved scalable synthesis of mono-and bis-urethane derivatives of ornithine I I Chem. Pharm. Bull. 2001. V. 49. N. 9. P. 1189-1191.
110. Bodanszky M. Peptide chemistry (A practical textbook). Springer-Verlag: New1. York, 1988.200 р.
111. The Peptides: analysis, synthesis, biology. Vol. 3. Protection of functional groups in peptide synthesis. (Eds. Gross E., Meienhofer J.). Academic Press: New York, 1981. 435 p.
112. Daly W.H., Poche D. The preparation ofiV-carboxyanhydrides of a-amino acids using bis(trichloromethyl)carbonate // Tetrahedron Lett. 1988. V. 29. N. 46. P. 5859-5862.
113. Okamura A., Hirai Т., Tanihara M., Yamaoka T. Synthesis and properties of novel biodegradable polyamides containing a-amino acids // Polymer. 2002. V. 43. P. 35493554.
114. Ai H., Ikeda A., Matsuoka Y. Polyamide preparation from polycarboxylic acid and polyamine with carbodiimide condensing agent // U.S. Pat. 4645823. 1987.
115. Kohn J.В., Fiordeliso J. J. Polyarylates containing derivatives of the natural amino acid Z-tyrosine//U.S. Pat. 5317077.1994.
116. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии. Под ред. Хеншен А., Хупе К.-Л., Лотшпайхф Ф., и др. Пер с англ. М.: Мир, 1988.476 с.
117. IzdebskiJ., WitkowskaE., KunceD., Oriowska A., Baranowska В., Radzikowska M., Smoluch M. New potent hGn-RH analogues with increased resistance to enzymatic degradation //J. Pept. Sci. 2002. V. 8. N. 7. P. 289-296.
118. Introduction to cleavage techniques // Applied Biosystems. Strategies in peptide synthesis. 2nd ed. Foster City, 1995.71 p.
