Протеиназы как катализаторы реакций сегментной конденсации пептидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПРОТЕИНАЗ В РЕАКЦИЯХ ГИДРОЛИЗА-СИНТЕЗА ПЕПТИДНОЙ СВЯЗИ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Общие принципы ферментативного синтеза пептидов

12. Пепсин. Характеристика и биокаталитические свойства

1.2.1. Строение молекулы

1.2.2. Механизм действия

1.2.3. Специфичность в реакциях гидролиза пептидных связей

1.2.4. Применение в пептидном синтезе

1.2.5. Специфичность в реакциях синтеза пептидов

Актуальность проблемы. Протеиназы широко распространены в природе и играют важную роль в процессах жизнедеятельности. Ферменты этого класса находят применение в научных исследованиях и используются для решения многих прикладных задач в пищевой и фармацевтической промышленности, в биотехнологии и медицине. Использование протеиназ в практических целях основано, главным образом, на их способности катализировать реакции протеолиза - гидролитического расщепления пептидных связей. Эта функция протеолитических ферментов изучается давно, и к настоящему времени исследована глубоко и всесторонне.

При изменении ряда внешних условий протеиназы способны функционировать не как гидролазы, а как синтетазы. Эта способность протеиназ катализировать реакции образования пептидных связей представляет принципиальный интерес для разработки новых методов ферментативного синтеза. К началу выполнения данной работы (1983) сведения о синтетазной активности протеиназ носили отрывочный характер, а конкретные результаты обладали невысокой степенью общности, что не позволяло целенаправленно использовать протеолитические ферменты для решения синтетических задач. Прежде всего, отсутствовали систематические исследования влияния среды и других внешних условий на функциональнзто активность протеиназ как катализаторов реакций образования пептидных связей. Большинство исследований было выполнено в водной среде.

Систематическое изучение субстратной специфичности, активности и стабильности протеиназ в реакциях пептидного синтеза в различных средах существенно расширяет представления об их функциональных возможностях и позволяет выявить такие свойства этих ферментов, обнаружение которых бьшо бы невозможно в рамках традиционной «водной» энзимологии.

С другой стороны, использование потенциальных возможностей ферментов, связанных с их стерео- и региоизбирательностью, субстратной специфичностью, особенностями структуры и механизма действия, представляется весьма эффективным для катализа различных синтетических процессов, в том числе реакций пептидного синтеза.

Современный синтез пептидов предусматривает возможность применения двух стратегий: ступенчатого синтеза и сегментной конденсации пептидов. Важным преимуществом стратегии сегментной конденсации является возможность получения целевых пептидов без примесей близких по структуре и свойствам пептидных предшественников, отделение которых представляет собой трудную задачу и резко снижает эффективность синтеза. Однако существенным ограничением этой стратегии является необходимость защиты ф}гнкциональных групп боковых цепей, а также опасность рацемизации на стадиях взаимодействия активированной карбоксильной компоненты с аминокомпонентой.

При ферментативном синтезе пептидных связей с применением протеиназ эти ограничения устраняются. Реакции пептидного синтеза, катализируемые протеиназами, не требуют защиты боковых цепей, исключают опасность рацемизации и позволяют существенно упростить процесс пептидного синтеза. Знание каталитических свойств протеиназ в реакциях образования пептидных связей создает предпосылки для разработки новых эффективных методов получения различных биологически активных соединений и практически важных пептидов - методов, основанных на сочетании стратегии химического способа сегментной конденсации пептидов с достоинствами ферментативного синтеза пептидных связей.

Таким образом, систематические исследования свойств протеиназ и изучение закономерностей влияния различных факторов на способность этих ферментов катализировать реакции не расщепления, а синтеза пептидных связей - актуальны, представляют несомненный научный интерес и способствуют углубленному пониманию общих закономерностей функционирования протеиназ как биокаталитических систем.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось исследование ферментативных свойств протеиназ в реакциях синтеза пептидной связи и изучение возможностей и условий применения протеиназ различных классов в качестве катализаторов реакций сегментной конденсации пептидов.

Для достижения поставленной цели потребовалось решить следующие задачи:

1. Провести исследования по выбору ферментов, пригодных для катализа реакций фрагментной конденсации пептидов.

2. Изучить закономерности влияния состава среды, количества фермента, времени реакции и структуры субстратов на эффективность реакций ферментативной сегментной конденсации.

3. Выявить способы минимизации побочных процессов при ферментативной сегментной конденсации пептидов.

4. Исследовать возможности сочетания методологии химического твердофазного пептидного синтеза с преимуществами ферментативного способа образования пептидных связей.

5. На основе установленных закономерностей разработать препаративные методы получения пептидов с применением катализируемых протеиназами реакций сегментной конденсации.

Научная новизна работы. Изучены закономерности влияния среды, стехиометрии, времени контакта и иммобилизации на способность аспартильных и сериновых протеиназ катализировать реакции синтеза пептидных связей. Установлено, что в водно-органических средах пепсин способен эффективно катализировать синтез пептидов, а его гидролазная активность может быть подавлена. Показано, что пепсин, сорбированный на поверхности инертных неорганических носителей, является эффективным катализатором реакций сегментной конденсации пептидов в органических средах. Изучены закономерности катализа субтилизином реакций пептидного синтеза в полярных органических средах. Определены условия минимизации побочных процессов. Обнаружено, что введение в реакционные смеси денатурирующих агентов позволяет использовать протеиназы различных классов в качестве эффективных катализаторов при синтезе протяженных гидрофобных пептидов. Установлено, что субтилизин, ковалентно иммобилизованный на криогеле поливинилового спирта, эффективно катализирует реакции сегментной конденсации пептидов без активации карбоксильного компонента и без защиты реакционноспособных групп в остатках трифункциональных аминокислот. Показана возможность применения субтилизина в форме комплекса с додецилсульфатом натрия (8П8-субтилизина) в качестве катализатора сегментной конденсации пептидов различного строения, включая пептиды, содержащие остатки неприродных и полифункциональных аминокислот. Разработан способ твердофазной сегментной конденсации пептидных блоков, сочетающий достоинства химического твердофазного синтеза пептидов с преимуществами ферментативного образования пептидных связей. Практическая значимость работы. На основе установленных закономерностей катализа протеиназами реакций сегментной конденсации пептидов предложены способы минимизации побочных процессов, разработаны препаративные методы получения различных олигопептидов и их производных, а также осуществлен синтез ряда высокоспецифичных хромогенных и флуорогенных субстратов практически важных протеиназ различных классов.

выводы

1. Изучены закономерности влияния среды, температуры, стехиометрии, времени контакта и иммобилизации как факторов, определяющих способность аспартильных протеиназ (пепсин) и сериновых протеиназ (субтилизин) катализировать реакции синтеза пептидных связей.

2. Установлено, что в водно-органических средах пепсин способен эффективно катализировать реакции пептидного синтеза, а его гидролазная активность может быть подавлена.

3. Обнаружено, что при использовании пепсина как катализатора пептидного синтеза в растворах может происходить соосаждение фермента с образующимся целевым пептидом. Изучены условия подавления нежелательных побочных процессов и разработаны препаративные методы катализируемого пепсином синтеза эфиров и я-нитроанилидов олигопептидов различного состава и строения.

4. Показано, что пепсин, сорбированный на поверхности инертных неорганических носителей, также является эффективным катализатором реакций пептидного синтеза в органических средах. На основе этого подхода разработаны методы ферментативного синтеза гидрофобных олигопептидов.

5. Изучены закономерности катализа субтилизином реакций пептидного синтеза в полярных органических средах. Установлено, что при увеличении содержания субтилизина в реакционных смесях не исключено образование побочных продуктов и может происходить соосаждение субтилизина с целевым пептидом. Определены условия минимизации побочных процессов и разработаны препаративные методы ферментативного синтеза п-нитроанилидов и амидов олигопептидов в ацетонитриле и тройных смесях состава ацетонитрил-диметилформамид-вода.

6. Разработан новый эффективный метод вьщеления тиолсубтилизина и определены кинетические характеристики фермента, свидетельствующие о его низкой амидазной активности. Установлено, что тиолсубтилизин может катализировать реакции пептидного синтеза при условии применения увеличенных количеств ферманта и активации карбоксильной компоненты пептидной конденсации.

7. Исследовано влияние денатурирующих агентов на каталитические свойства аспартильных (пепсин), сериновых (субтилизин) и металлопротеиназ (термолизин) в реакциях пептидного синтеза в водно-органических средах. Установлено, что указанные протеиназы способны катализировать реакции пептидообразования при высоких концентрациях мочевины, гуанидинхлорида, додецисульфата натрия. На основе этих наблюдений разработаны препаративные способы ферментативного синтеза различных олигопептидов.

8. Изучены условия катализа реакций пептидного синтеза иммобилизованными протеиназами в органических средах. Установлено, что субтилизин и термолизин, ковалентно иммобилизованные на криогеле поливинилового спирта, являются эффективными катализаторами и позволяют проводить реакции сегментной конденсации пептидов с высокими выходами, дезактивации компонентов и без защиты ионогенных грзшп в остатках трифункциональных аминокислот. Иммобилизованные протеиназы легко удаляются из реакционных смесей и в средах с низким содержанием воды могут быть использованы многократно без существенной потери каталитической активности.

9. Установлена возможность применения в качестве катализатора реакций пептидного синтеза комплекса субтилизина с додецилсульфатом натрия (8В8-субтилизина). Показано, что с применением этого катализатора может быть успещно осуществлен синтез пептидов различного строения, в том числе содержащих остатки неприродных и полифункциональных аминокислот.

10. Впервые разработан способ твердофазной сегментной конденсации пептидных блоков с применением 8В8-субтилизина, сочетающий достоинства методологии химического твердофазного пептидного синтеза с преимуществами ферментативного образования пептидных связей.

11. На основе установленных закономерностей катализа протеиназами реакции пептидообразования разработаны неизвестные ранее методы препаративного синтеза и осуществлено получение различных олигопептидов, их производных, а также ряда высокоспецифичных хромогенных и флуорогенных субстратов сериновых, тиоловьк, аспартильных и металлопротеиназ.

2.2.3. Заключение

Таким образом, мы показали, что модифицированный фермент - тиолсубтилизин с крайне низкой амидазной активностью - может успешно катализировать реакцию образования пептидных связей в водно-органической среде. Для эффективного катализа необходимы большие количества тиолсубтилизина и активированные эфиры ацилирующих компонентов, обладающие низкой растворимостью. Это несколько ограничивает область применения фермента для синтеза протяженных пептидов, в том числе путем блочной конденсации.

1. Степанов В.М. Структура и функции белков. // Молекулярная биология. Под ред. Спирина А. С. Москва. Высшая школа. 1996.

2. W. Kallmann. Enzymatic peptide synthesis. CRC Press. Inc. Boca Raton, Florida. 1987

3. Stepanov У.М. Proteinases as catalysts in peptide s5Tithesis. // Pure & Appl. Chem. 1996. V.68.P.1335-1339.

4. Gill I., Lopez-Fandino R., Jorba X., Vulfson E. Biologically active peptides and enzymatic approaches to their production/ // Enz. Microb. Technol. 1996. У. 18. P. 162183.

5. H.-D. Jakubke. Enzymatic synthesis. // In : Futwe aspects in peptide chemistry. Ed. by W. yoelter, G. Fisher. Collection. 1999. У. 1. P. 47-67.

6. Schechter I., Berger A. Size of the active site in proteinases. (I) Papain. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1967. У. 27. No. 2. P. 157-162.

7. Fersht A. Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein folding. // Ed. by W.H. Freeman and Company. New York. 1999.

8. Андреева H. C, Гинодман Л. М. Протеиназы и белковые ингибиторы. Пепсин. В кн.: Белки и пептиды. М., Наука. 1995. Т. 1. С. 145-154.

9. Barret А. J. An introduction to the proteinases. // In: Proteinase Inhibitors. Ed. by A.S.Barret, G.Salvesen. Elsevier, Amsterdam. 1986. P.3-22.

10. Tang J., Lin X. Engineering aspartic proteases to probe structure and function relationships. // Curr. Opin. Biotech. 1994. V. 5. P. 422-427

11. Andreeva N. S. Why and what for is pepsin stable and active at pH 2? // Mol. Biol. 1995. y.28.No. 6. P.797-801.

12. Foltman B. Structure and function of proparts zymogens for aspartic proteinases. // Biol. Chem. Hopper-Seyler. 1988. V. 369. P. 311-314.

13. Sielecki A. R., Fedorov A. A., Boodhoo A., Andreeva N. S., James M. N .J. Molecular and crystal structures of monoclinic porcine pepsin refined at the 1.8 A resolution. // J. Mol. Biol. 1990. y. 214. P. 143-170.

14. Cooper J. v., Khan G., Taylor G., Tickle I. J., Blundell T .L. X-ray analyses of aspartic proteinases. II Three-dimensional structure of the hexagonal crystal form of porcine pepsin at 2.3 A resolution. // J. Mol. Biol. 1990. V. 214. P. 199-222.

15. Pearl L., Blundell T. The active site of aspartic proteinases. // FEBS Lett. 1984. V.174. No.l.P.96-101.

16. Fruton J. S. The specificity and mechanism of pepsin action. // Adv. Enz. 1970. V. 33. P. 401-443.

17. Fruton J. S. The mechanism of the catalytic action of pepsin and related acid proteinases // Adv. Enz. 1976. V. 44. P. 1-36.

18. Antonov V. K., Ginodman L. M., Rumsh L. D. et al. Mechanism of pepsin catalysis: General base catalysis by the active site carboxylate ion. // FEBS Lett. 1978. V. 88. No. LP. 87-90.

19. Fersht A. Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein folding. // Ed. by W.H. Freeman and Company. New York. 1999. P. 486-491.

20. Антонов В. К., Гинодман Л. М., Румш Л. Д. Механизмы протеолиза. // Биоорган, химия. 1984. Т. 10. № 8. С. 1044-1058.

21. Pearl L.H. The catalytic mechanism of aspartic proteinases. // FEBS Lett. 1987. V. 214. No. 1 P. 8-12.

22. Polgar L. The mechanism of action of aspartic proteinases involves "push-pull" catalysis. // FEBS Lett. 1987 V. 219. No. 1. P. 1-4.

23. Park H., Suh J., Lee S. Ab initio studies on the catalytic mechanism of aspartic proteinases: nucleophilic versus general acid/general base mechanism. // J. Am. Chem. Soc. 2000. V. 122. P. 3901-3908.

24. Bott R., Subramanian E., Davis D. R. Three-dimensional structure of the complex of the rhizopus chinensis carboxyl proteinase and pepstatin at 2.5 A resolution. // Biochem. 1982. V. 21. No. 26. P. 6956-6962.

25. Cooper J., Foundling S., Hemmings A., Blundell Т., Jones D. M., Hallet A., Szelke M. The structure of a synthetic pepsin inhibitor complexed with endothiapepsin. // Eur. J. Biochem. 1987. V. 169. No. 1. P. 215-221.

26. Bailey D., Cooper J. B. A structural comparison of 21 inhibitor complexes ofthe aspartic proteinase from Endothia parasitica. // Prot. Sci. 1994. V. 3. No. 11. P. 2129-2143.

27. James M. N. G., Sielecki A. R. Stereochemical analysis of peptide bond hydrolysis catalyzed by the aspartic proteinase penicillopepsin. // Biochem. 1985. V. 24. No. 14. P. 3701-3713.

28. James M. N. G., Sielecki A. R., Hayakawa K., Gelb M. Crystallographic analysis of transition state mimics bond to penicillopepsin: difluorostatine- and difluorostatone-containing peptides. // Biochemistry. 1992. V. 31. P. 3972-3886.

29. Veerapandian B., Cooper J. B., SaH A., Blundell T. L., Rosati R. L., Dominy B. W., Damon D. B. Direct observation by X-ray analysis of the tetrahedral " intermediate" of aspartic proteinases. // Prot. Sci. 1992. V. 1. P. 322-328.

30. Beveridge A. J., Heywood G. C. A quantum mechanical study of the active site of aspartic proteinases. // Biochem. 1990. V. 32. No. 22. P. 3325-3333.

31. Coates L., Erskine P. T., Wood S. R., Myles D. A. A., Cooper J. B. A neutron Laue diffraction study of endothiapepsin: implications for the aspartic proteinase mechanism. // Biochemistry. 2001. V. 40. P. 13149-13157.

32. Inouye K., Fruton J. S. Studies of the specificity of pepsin. // Biochemistry. 1966. V. 6. No. 6. P. 1765-1777.

33. Sachdev G. P., Fruton J. S. Pyridyl esters ofpeptides as synthetic substrates ofpepsin. // Biochemistry. 1969. V. 8. No. 11. P. 4231-4238.

34. Sachdev G.P., Johnston M.A., Fruton J.S. Fluorescence studies on the interactions of pepsin with its substrates. //Biochem. 1972. V. l l.No.6. P. 1080-1086.

35. Medzihradszky К., Voynick I. M., Medzihradszky-Schweiger H., Fraton J. S. Effect of secondary enzyme-substrate interactuions on the cleavage of synthetic peptides by pepsin. //Biochemistry. 1970. V. 9. No. 5. P. 1154-1162.

36. Yonezawa H., Terada S., Izumiya N. Action of pepsin on synthetic substrates. //J. Biochem. 1973. V. 73. No. 5. P. 861-870.

37. Зинченко A. A., Румш Л. Д., Антонов В. К. Статистический анализ специфичности пепсина в отношении гидролиза белков. // Биоорган, хим. 1976. Т. 2. № 6. С. 803810.

38. PovAers J. С, Harley А. D., Myers D. V. Subsite specificity of porcine pepsin. // In: Acid Proteases. Structwe, Function and Biology. Ed. by Tang J. 1977. Plenum Press. New York, London. P. 141-157.

39. Durm B. M., Hung S.-H. The two sides of enzyme-substrate specificity: lesson from the aspartic proteinases///Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1477. P. 231-240.

40. Hollands T. R., Voinick I. M., Fruton J. S. Action of pepsin on cationic synthetic substrates. //Biochemistry. 1969. V. 8. No. 2. P. 575-584.

41. Kohigsberg W., Hill R. J. The structure of human hemoglobin. V. The digestion of the a-chain of human hemoglobin with pepsin. // J. Biol. Chem. 1962. V. 237. No. 10. P. 31573162.

42. Huang W.-Y., Tang J. On the specificity ofhuman gastricsin and pepsin. // J.Biol. Chem. 1969. V. 244. No. 5. R1085-1091.

43. Sachdev G. P., Fruton J. S. Secondary enzyme-substrate interections and specificity of pepsin. // Biochemistry. 1970. V. 9. No. 23. P. 4465-4470.

44. Dunn B. M., Jimenez M., Parten В., Valler M. J., Rolph C. E., Kay J. A systematic series of synthetic chromophoric subtrates for aspartic proteinases. //Biochemistry. 1986. V.237. No. 3. P. 899-906.

45. Durm B.M., Kay J. Design, synthesis and analysis of a new synthetic substrates for aspartyl proteinases. //Biochem. Soc. Trans. 1985. V. 13. No. 6. P. 1041-1043.

46. Fruton J. S. Proteinase-catalyzed synthesis of peptide bond. // Adv. Enz. 1982. V. 53. No. lp. 239-306.

47. Determann H., Bonhard K., Kohler R., Wieland Т. Untersuchungen über die PiasteinReaktion. VI. Einfluss der Kettenlange und der Endgruppen des Monomeren auf die Kondenseierbarkeit. // Helv. Chim. Acta. 1963. B. 46. N. 7. S. 2498-2509.

48. Newmann H., Levin Y., Berger A., Katchalski E. Pepsin-catalyzed transpeptidation of the amino-transfer type. // Biochem. J. 1959. V. 73. No. 1. P.33-41.

49. Balbaa M., Blum M., Hofmaim T. Mechanism of pepsin-catalyzed aminotranspeptidation reactions. // Int. J. Biochem. 1994. V. 26. No. 1. P. 35-42.

50. Lutek M. K., Hofmaim Т., Deber C. M. Transpeptidation reactions of porcine pepsin. Formation of tetrapeptide from dipeptide substrates. // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. No. 17. P.8011-8016.

51. Михайлова A. Г., Пожарский A. Б., Костецкий П. В., Румш Л. Д., Антонов В. К. Кинетика катализируемой пепсином реакции транспептидации по типу аминопереноса: зависимость от рН. // Биоорган, химия. 1977. Т. 3. № 8. С. 10901099.

52. Тиходеева А. Т., Румш Л. Д., Антонов В. К. Стадийность катализируемого пепсином гидролиза пептидов. //Биоорган, химия. 1975. Т. 1. № 7. С. 993-994.

53. Antonov V. К. Chemical approches to the mechanism of aspartic protenases. In: Aspartic proteinases and their inhibitors. Ed. by V.Kostka. Walter de Grayter. Berlin. 1985. P. 203-220.

54. Pellegrini A., Luisi P. Pepsin-catalyzed peptide synthesis. // Biopolymers. 1978. V. 17. No. 7. P. 2573-2580.

55. Morihara K., Oka T. Peptide bond synthesis catalyzed by subtilisin, papain and pepsin. // J.Biochem. 1981. V. 89. No. 3. P. 385-395.

56. Isowa Y., Nagasawa Т., Kuroiwa K., Narita K. Verfahren zur Herstellung eines peptids. //Pat. Swiss 597158 (CI.: С 07 С 103/52, 31 Mar 1978).

57. Malak С. А. А. Pepsin as а catalyst for peptide synthesis: formation of peptide bonds not typical for pepsin substrate specificity. // J. Pept. Res. 1999. V. 53. P. 606-610.

58. Isowa Y., Ohmori М., Ichikawa Т., Kurita Н. The synthesis of peptides by means of proteolytic enzymes. //Bull. Chem. Soc. Jpn. 1977. V. 50. No. 10. P.2762-2765.

59. Kuhl P., Wilsdorf A., Jakubke H.-D. Modelluntersuchungen zur Pepsinkatalysierten Peptid-Synthese im Wasser-organischen Zweiphasensystem. // Monats. Chem. 1983. B. 114. S. 571-579.

60. Bemquerer M. P., Theobaldo F. C, Tominaga M. Pepsin-catalyzed peptide synthesis in biphasic systems. // Biomed. Biochim. Acta. 1991. V. 50. No. 10/11. P. 94-97.

61. Kraut J. Serine proteases: structure and mechanism of catalysis. // Aim. Rev. Biochem. 1977. V.46. P.331-338.

62. Руденская Г. Н. Новые подсемейства субтилизинов. // Биоорг. химия. 1994. Т. 20. N 5. С. 475-484.

63. Siezen R. J., Leunissen J. A. M. Subtilases: The superfamily of subtilisin-like serine proteases. //Protein Science. 1997. V. 6. P. 501-523.

64. Rao M. В., Tanksale A. M., Ghatge M. 8/ Deshpande V. V. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. // Microbiol. Molec. Biol. Rev. 1998. V. 62. P. 597-635.

65. Акпаров В. X., Белянова Л. П., Баратова Л. А., Степанов В. М. Субтилизин 72-сериновая протеиназа Bacillus subtilis штамм 72, близкая субтилизину Карлсберг. // Биохимия. 1979. Т. 44. No 5. С. 886-891.

66. Bode W., Papamokos Е., Musil J. The high resolution X-ray crystal structure of the complex formed between subtilisin Carlsberg and eglin c. // Eur. J. Biochem. 1987. V. 166. P. 673-692.

67. McPhalen C. AS., James M. N. G. Structraal comparison of two serin proteinase-protein inhibitor complexes: eglin с subtilisin Carlsberg and CI-2-subtilisin Novo. // Biochemistry. 1988. V. 27. P. 6582-6598.

68. Alexander P. A., Ruan В., Bryan P. N. Cation-dependent stability of subtilisin. // Biochemistry. 2001. V. 40. P. 10634-10639.

69. Alexander P. A., Ruan В., Strausberg 8. L., Bryan P. N. Stabilizing mutations and calcium-dependent stability of subtiUsin. // Biochemistry. 2001. V. 40. P. 10640-10644.

70. Fersht A. Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein folding. // Ed. by W.H. Freeman and Company. New York. 1999. P. 40-43, 473476.

71. Kuhn P., Knapp M. Soltis S. M., Ganshaw G., Thoene M., Bott R. The 0.78 A structure of a serine protease: Bacillus lentus subtiHsin. // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 1344613452.

72. Bryan P., Pantoliano M. W., Quill S. G., Hsiao H.-Yu. Poulos T. Site-directed mutagenesis and the role of oxyanion hole in subtilisin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 3743-3745.

73. Carter P., Abrahmsen L., Wells J. A. Probing the mechanism and improving the rate of substrate-assisted catalysis in subtilisin BPN'. // Biochemistry. 1991. V. 30. P. 61426148.

74. O'Connel T. P., Day R. M./ Torchilin E. V., Bachovchin W. W., Malthouse J. G. A 13c-NMR study of the role of Asn-155 in stabilizing the oxyanion of subtilisin tetrahedral adduct. // Biochem J. 1997. V. 326. No. 3. P. 861-866.

75. Carter P., Wells A. Dissecting the catalytic triad of e serine protease. // Nature. 1988. V. 332. P. 564-568.

76. Carter P., Wells A. Functional interaction among catalytic residues in subtilisin BPN'. // Proteins. 1990. V. 7. P. 335-342.

77. Peracchi A. Enzyme catalysis: removing chemically essential residues by site-directed mutagenesis. // Trends Biochem Sci. 2001. V. 26. P. 497-503.

78. Frey P. A., Whitt S. A., Tobin J. B. A low-barrier hydrogen bond in the catalytic triad of serine proteases. // Science. 1994. V. 264. P. 1927-1930.

79. Halkides C. J., Wu Y. Q., Murray C. J. A low-barrier hydrogen bond in subtilisin: IH and 15 N N M R studies with peptidyl trifluoromethyl ketones. // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 15941-15948.

80. Ash E. L., Sudmeier J. L., De Fabo E. C, Bachovchin W. W. A low-barrier hydrogen bond in the catalytic triad of serine proteases? Theory versus experiment. // Science.1997. V. 278. P. 1128-1132.

81. Dobson G., Wlodawer A. Catalityc triads and their relatives. // Trends. Biochem. Sci.1998. V. 23. P. 347-352.

82. Moult J. Electrodensity calculations as an extension of protein structure refinement. Streptomyces griseus protease A at 1.5 A resolution. // J. Mol. Biol. 1985. V. 182. P. 555556.

83. Carter P., Abrahmsen L., Wells J. A. Probing the mechanism and improving the rate of substrate-assisted catalysis in subtilisin BPN'. // Biochemistry. 1991. V. 30. P. 61426148.

84. Bryan P. N. Protein engeineering of subtilisin. // Biochem. Biophys. Acta Prot. Struct. Mol. Enz. 2000. V. 1543. No. 2. P. 203-222.

85. Perona J. J., Craik C. S. Structural basis of substrate specificity in the serine proteases. // Prot. Sci. 1995. V. 4. P. 337-360.

86. Gron H., Meldal M., Breddam K. Extensive comparison of the substrate preferences of two subtilisins as determined with peptide substrates which are based on the principle of intramolecular quenching. // Biochemistry. 1992. V.31. P.6011-6018.

87. Гололобов M. Ю., Морозова И. П., Воюшина Т. Л., Тимохина Е. А., Степанов В. М. Влияние температуры и рН на стабильность и каталитическую активность сериновой протеиназы из Bacillus subtilis штамм 72. // Биохимия. 1991. Т. 56. С. 230-239.

88. Morichara K. Comparative specificity of microbial proteinases. //Adv. Enzymol. 1974. V.41.P. 179-243.

89. Gron H., Breddam K. Interdependency of the binding sites in subtilisin. // Biochemistry. 1992. V.31.P.8967-8971.

90. Rheinnecker M., Baker G., Eder J., Fersht A. R. Engineering a novel specificity in subtilisin BPN'. // Biochemistry. 1993. V. 32. P. 1199-1203.

91. Dordick J.S. Enzymatic catalysis in monophasic organic solvents. // Enzyme Microb. Technol. 1989. V. 11. R 194-211.

92. Dordick J.S. Designing enzymes for use in organic solvents. // Biotechnol. Prog. 1992. V.8. P.259-267.

93. Narayan V. S., Klibanov A- M. Are water-immiscibility and apolarity of the solvent relevant to enzyme efficiency? // Biotechnol. Bioeng. 1993. V. 41. P. 390-393.

94. Hailing P. J. Thermodynamic predictions for biocatalysis in nonconventional media: theory, tests, and recommendations for experimental design and analysis. // Enzyme Microb. Technol. 1994. V.16. P.178-206.

95. Гладилин А. К., Левашов А. В. Стабильность ферментов в системах с органическими растворителями. //Биохимия. 1998. Т. 63. С. 408-421.

96. Tuena de Gomez-Puyou М., Gomez-Puyou А. Enzymes in low water systems. // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1998. V. 33. P. 53-89.

97. Chmelnitsky Yu. L., Rich J. O. Biocatalysis in nonaqueous solvents. // Curr. Opinion Chem. Biol. 1999. V. 3. P. 47-53.

98. Hailing P. J. Biocatalysis in low-water media: understanding effects on reaction conditions. // Curr. Opinion Chem. Biol. 2000. V. 4. P. 74-80.

99. Klibanov A. M. Improving enzymes by using them in organic solvents. // Nature. 2001. V. 409. P. 241-246.

100. Mattos C, Ringe D. Proteins in organic solvents. // Curr. Opinion Struct. Biol. 2001. V. 11. P. 761-764.

101. Bracey E., Stenning R., Brooker B. Relating the microstructure of enzyme dispersions in organic solvents to their kinetic behavior. // Enz. Microbiol. Techn. 1998. V. 22. P. 147-151.

102. Chang N, Hen S. J, Klibanov A. M. Protein separation and purification in neat dimethyl sulfoxide. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. V. 176. P. 1462-1468.

103. Chen S.-T., Chen S.-Y., Chen-Chen Т., Chiou S.-H., Wang K.-T. Physicochemical properties of alkaline serine proteases in alcohol. // J. Protein Chem. 1995. V.14. P.205-215.

104. Xu K., Griebenow K., Klibanov A.M. Correlation between catalytic activity and secondary structure of subtilisin dissolved in organic solvents. // Biotech. Bioeng. 1997. V.56. P.485-491.

105. Castro G. R. Enzymatic activities of proteases dissolved in organic solvents. // Enzyme Microb. Technol. 1999. V.25. P.689-694.

106. Rariy R.V., Klibanov A.M. Correct protein folding in glycerol. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1997. V.94. R13520-13523.

107. H. Kise. Difference in catalytic activities of subtilisin Carlsberg and immobilization-activation for ester synthesis and transesterification in ethanol. // Bioorg. Chem. 1990. V.18.P.107-115.

108. Yamamoto Y., Kise H. Catalysis of enzyme aggregates in organic solvents. An attempt at evaluation of intrinsic activity of proteases in ethanol. // Biotechnol. Lett. 1993. V.15.P.647-652.

109. Zaks A.,. Klibanov A. M Enzymatic catalysis in nonaqueous solvents. // J. Biol. Chem. 1988. V.263.P.3194-3201.

110. Guo Y., Clark D. S. Activation of enzymes for nonaqueous biocatalysis by denaturating concentrations of urea. // Biochem. Biophys. Acta. 2001. V. 1546. P. 406-411.

111. Griebenow K., Klibanov A.M. Can conformational changes be responsible for solvent and excipient effects on the catalytic behavior of subtilisin Carlsberg in organic solvents? // Biotech. Bioeng. 1997. V.53. P.351 362.

112. Fitzpatrick P.A., Ringe D., Klibanov A.M. X-ray structure of cross-linked subtilisin Calsberg in water vs. acetonitrile. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. V.198. P.675-681.

113. Fitzpatrick P.A., Steirmietz A.C.U., Ringe D., Klibanov A.M. Enzyme crystal structure in a neat organic solvent. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1993. V.90. P.8653-8657.

114. Schmitke J.L., Stem L.J., Klibanov A.M. Comparison of x-ray structures of an acyl-enzyme intermediate of subtilisin Carlsberg formed in anhydrous acetonitrile and in water. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1998. V.95. P.12918-12923.

115. Schmitke J.L., Stem L.J., Klibanov A.M. The crystal stracture of subtilisin Carlsberg in anhydrous dioxane and its comparison with those in water and acetonitrile. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1997. V.94. P.4250-4255.

116. Kidd R.D., Sears P., Huang D.-H., Witte K., Wong C.-H., Färber G.K. Breaking the low barrier hydrogen bond in a serine protease. // Protein Sei. 1999. V.8. P.410-417.

117. Zheng Y.-J., Omstein R.L. A molecular dynamics study of the effect of carbon tetrachloride on enzyme stmcture and dynamics: subtilisin. // Protein Eng. 1996. V.9. P.485-492.

118. Zheng Y.-J., Omstein R.L. A molecular dynamics and quantum mechanics analysis of the effect of DMSO on enzyme structure and dynamics: subtilisin. // J. Am. Chem. Soc. 1996. V.118.P.4175-4180.

119. Schmitke J.L., Stem L., Klibanov A.M. Organic solvent binding in mostly aqueous media and in the neat solvents. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. V.248. P.273-277.

120. Toba S., Merz K.M. The concept of solvent compatibility and its impact on protein stability and activity enhancement in nonaqueous solvents. // J. Am. Chem. Soc. 1997. V.119. P.9939-9948.

121. Gorman L.S., Dordick J.S. Organic solvents strip water off enzymes. // Biotechnol. Bioeng. 1992. V.39. P.392-397.

122. Zaks A., Klibanov A.M. The effect of water on enzyme action in organic media. // J. Biol. Chem. 1988. V.263. P.8017-8021.

123. Correa de Sampaio T., Melo R.B., Moura T.F., Michel S., Barreiros S. Solvent effects on the catalytic activity of subtilisin suspended in organic solvents. // Biotechnol. Bioeng. 1996. V.50. P.257-264.

124. Sears P., Witte K., Wong C.-H. The effect of counterion, water concentration and stirring on the stability of subtilisin BPN' in organic solvents. // J. Mol. Catal. B: 1999. V. 6. P. 297-304.

125. Kise H., Hayakawa A. Shirato H., Noritomi H. Protease catalyzed synthetic reactions and immobilization - activation of the enzymes in hydrophihc organic solvents. // J. Biotech. 1990. V.14. P.239-254.

126. Affleck R., Xu Z.-P., Suzawa V., Frocht K., Clark D.S., Dordick J.S. Enzymatic catalysis and dynamics in low-water environments. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V.89.P.1100-1104.

127. Partridge J., Deimison P.R., Moore B.D., Hailing P.J. Activity and mobility of subtilisin in low water organic media. // Biochim. Biophys. Acta. 1998. V.1386. P.79-89.

128. Bell G., Hailing P.J., Moore B.D., Partridge J., Rees D.G. Biocatalyst behaviour in low-water systems. // Trends Biotechnol. 1995. V.13. P.468-473.

129. Cabral J. M. S., Aires-Barros M. R., Pinheiro H., Prazeres D. M. F. Biotransformation in organic media by enzymes and whole cells. // J. Biotechnol. 1997. V. 59. p. 133-143.

130. Kazlauskas R. J., Weber H. K. Improving hydrolases for organic synthesis. // Curr. Opinion Chem. Biol. 1998. V. 2. R 121-126.

131. Lloyd R., Dickmaim M., Jones J. Probing the specificity of the Si' leaving group, site of subtilisin Bacillus lentus using an enzyme -catalyzed transesterification reaction. // Tetrahedron: Asymmetry. 1998. V. 9. P. 551-561.

132. Kise H., Fujimoto K. Enzymatic reactions in aqueous-organic media. Medium effect and nucleophile specificity in subtilisin-catalyzed peptide synthesis in organic solvents. //Biotechnol. Lett. 1988, V.IO. P.883-888.

133. Cerovsky V., Martinek K. Peptide synthesis catalyzed by native proteinase K in water-miscible organic solvents with low water content. // Collect. Czech. Chem. Commun. 1989. V.54. P.2027-2041.

134. Barbas C.F., Matos J.R., West J.B., Wong C.-H. A search for peptide ligase: cosolvent-mediated conversion of proteases to esterases for irreversible synthesis of peptides. // J. Am. Chem.Soc. 1988. V.l 10. P.5162-5166.

135. Wang Y.-F., Yakovlevsky K., Zhang B., Margolin A.L. Cross-linked crystals of subtilisin: versatile catalyst for organic synthesis. // J. Org. Chem. 1997. V.62. P.3488-3495.

136. Sergeeva M.V. Paradkar V.M. Dordick J.S. Peptide synthesis using proteases dissolved in organic solvents. // Enzyme Microb. Technol. 1997. V.20. P.623-628.

137. Kise H., Hayakawa A. Immobilization of proteases to porous chitosan beads and their catalysis for ester and peptide synthesis in organic solvents. // Enzyme Microb. Technol. 1991. V.13.P.584-588.

138. Gaertner H., Puigserver A. Kinetics and specificity of serine proteases in peptide synthesis catalyzed in organic solvents. // Eur. J. Biochem. 1989. V. 181. P. 207-213.

139. Wescott C.R., Klibanov A.M. Solvent variation inverts substrate specificity of an enzyme. // J. Am. Chem. Soc. 1993. V. 115. P. 1629-1631.

140. Wescott C.R., Klibanov A.M. The solvent dependence of enzyme specificity. // Biochim. Biophys. Acta. 1994. V.1206. P. 1-9.

141. Cerovsky V., Jakubke H.-D. Nucleophile specificity of subtilisin in an organic solvent with low water content: Investigation via acyl transfer reactions. // Biotechnol. Bioeng. 1996. V.49. P.553-558.

142. Klein J. U., Prykhodzka A., Cerovsky V. The applicability of subtilisin Carlsberg in peptide synthesis. // J. Pept. Sci. 2000. V. 6. P. 541-549

143. Voyushina T. L., Terent'eva E. Yu., Stepanov V. M. The synthesis of chromogenic peptide substrates containing p-nitroanilides of arginine and lysine. // Biomed. Biochim. Acta 1991. V. 50. P. 209-212.

144. Stepanov V. M., Voyushina T. L., Terent'eva E. Yu., Golobov M. Yu. Subtilisine or a-chymotrypsine catalyzed synthesis of peptides containing arginine or lysine p-nitroanilides as C-terminal moieties. // Bioorg. Med. Chem. 1995. V. 3. P. 479-485.

145. Terent'eva E. Yu., Stepanov V. M. Voyushina T. L. Enzymatic synthesis of YIGSR -laminine pentapeptide fragment derivatives. // Bioorg. Med. Chem. 1995. V. 5. P. 2523-2526.

146. Milgotina E. I., Shcheglov A. S., Lapa G. B., Chestukhina G. G., Voyushina T. L. Enzymatic synthesis of chromogenic substrates for Glu, Asp-specific proteinases. // J PeptRes. 2001. V. 58. ?. 12-16.

147. Potetinova J. V., Voyushina T. L., Stepanov V.M. Enzymatic synthesis of peptidyl amino alcohols and peptidyl amino aldehides serine proteinase inhibitors. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1997. V. 7. P. 705-710.

148. Voyushina T. L., Potetinova J. V., Milgotina E. I., Stepanov V.M. Synthesis of peptide aldehides via enzymatic acylation of aminoaldehide derivatives. //Bioorg. Med. Chem. 1999. V. 7. P. 2953-2959.

149. Polgar L., Bender M. L. A new enzyme containing a synthetically formed active site. Thiol-subtilisin. // J. Am. Chem. Soc. 1966. V. 88. P. 3153-3154.

150. Neet K., Koshland D. The conversion of serine at the active site of subtilisin to cystein: a "chemical mutation". // Proc. Nat. Acad. Sci. 1966. V. 56. P. 1606-1611.

151. Polgar L., Bender M. The reactivity of thiol-subtilisin, an enzyme containing a synthetic functional group. // Biochemistry. 1967. V. 6. P. 610-620.

152. Polgar L., Bender M. Chromatography and activity of thiol-subtilisin. // Biochemistry. 1969. V. 8. ?. 136-141.

153. Polgar L Modified preparation of thiolsubtilisin and their purification on agarose-mercurial column. //Acta Biochim. Biophys. Acad. Sci. Hung. 1976. V. 11. P. 81-86.

154. Polgar L., Sajgo M. Peptic peptide of thiolsubtilisin. // Biochim. Biophys. Acta. 1981. V. 667. P. 351-354.

155. Neet K., Nanci A., Koshland D. Properties of thiolsubtilisin. // J. Biol. Chem. 1968. V. 243. R 6392-6401.

156. Philipp M., Tsai I. H., Bender M. L. Comparison of kinetic specificity of subtilisin and thiolsubtilisin toward p-nitrophenyl esters. //Biochemistry. 1979. V. 18. P. 3769-3773.

157. Tsai I. H., Bender M. L. Conformation of the active site of thiolsubtilisin: reaction with specific chloromethyl ketones and arylacryloylimidazoles. // Biochemistry. 1979. V. 18. R 3764-3768.

158. Brocklehurst K., Malthouse J. P. G. Evidence that the lack of high catalytic activity of thiolsubtilisin toward specific substrates may be due to an in appropriately located proton-distribution system. // J. Biochem. 1981. V. 193. P. 819-823.

159. Polgar L. Common feature of the four types of the protease mechanisms. // Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 1990. V. 371. P. 327-331.

160. Philipp M., Bender M. L. Kinetics of subtilisin and thiolsubtilisin. // Mol. Cell. Biochem. 1983. V. 51. P. 5-32.

161. Halasz P., Polgar L. Negatively charged reactants as probes in the study of the essential mercaptide-imidazolum ion-pair of thiolenzymes. // Eur. J. Biochem. 1977. V. 79. P. 491-494.

162. Abrahmsen L., Tom J., Bumier J., Butcher K. A., Kossiakoff A., Wells J. A. Engineering subtilisin and its substrates for the efficient ligation of peptide bonds in aqueous solution. //Biochemistry. 1991. V. 30. P. 4151-4159.

163. Nakatsuka T., Saski T., Kaiser E. T. Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiolsubtilisin. // J. Am. Chem. Soc. 1987. V. 109. P. 3808-3810.

164. Jackson D. Y., Bumier J., Quan C, Stanley M., Tom J., Wells J. A. A designed peptide ligase for total synthesis of riboniclease A with unnatural catalytic residues. // Science. 1994. V. 266. P. 243-247.

165. Chang T. K., Jackson D. Y., Bumier J., Wells J. A. Subtiligase: a tool for semisynthesis of proteins. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. No. 26. P. 12544-12548.

166. Braisted A. C, Judice J. K., Wells J. A. Synthesis of proteins by subtiligase. // Methods Enzymol. 1997. V. 289. P. 298-313.

167. Welker E., Sheraga H. A. Use of benzyl mercaptan for direct preparation of long polypeptide benzylthio esters as substrates of subtiligase. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. V. 254. No 1. P. 147-151.

168. Jackson D. Y., Bumier J., Wells J. A. Enzymatic cychzation of linear peptide ester using subtiligase. //J. Am. Chem. Soc. 1995. V. 117. P. 819-820.

169. Filippova I. Yu., Lysogorskaya E. N., Anisimova V. V., Abdel Malak C. A., Lavrenova G. I., Stepanov V. M. Pepsin behaviour as a catalyst in equilibrium-controlled peptide synthesis. //Biomed.Biochim. Acta. 1991. V. 50. P. 98-101.

170. Лысогорская E. H., Филиппова И. Ю., Абдель Малак К. А., Лавренова Г. И., Анисимова В. В., Оксенойт Е. С, Степанов В. М. Пепсин в ферментативном синтезе эфиров и п-нитроанилидов пептидов. //Биоорган.химия. 1992. Т. 18. С. 1081-1088.

171. Abdel Malak С. А., Lavrenova G. I., Lysogorskaya Е. N., Filippova I. Yu., Terent'eva E. Yu., Stepanov V. M. Synthesis of tetrapeptide p-nitroanilides catalyzed by pepsin. //Int. J. Pept. & Prot. Res. 1993. V. 41. P. 97-101.

172. Gololobov M. Yu., Voyushina T. L., Stepanov V. M., Adlercreutz P. Nucleophile specificity in a-chymotrypsin- and subtilisin-(5ac/7/MA subtilis strain 72) catalyzed reactions. // Biochim. Biophys. Acta. 1992. V.l 160. P.188-192.

173. Cassels J. M., Hailing P. J. Protease-catalyzed peptide synthesis in low-water organic two-phase systems and problems affectig it. //Biotechnol. Bioeng. 1989. V. 33. No. 6. R 1489-1494.

174. Анисимова В. В., Лысогорская Е. Н., Филиппова И. Ю., Оксенойт Е. С, Степанов В. М. Катализируемый пепсином синтез пептидов в органических растворителях. //Биоорган, химия. 1994. Т. 20. С. 316-322.

175. Ahmad F., McPhie P. Characteresation of a stable intermediate in the unfolding of diazoacetylglycine ethyl ester-pepsin by urea. //Can. J. Biochem. 1979. V. 57. No. 8. P. 1090-1092.

176. Pain R. H., Lah Т., Turk V. Denaturation studies of aspartic proteinases. //Biochem. Soc. Trans. 1985. V. 13. No. 6. P. 1032-1035.

177. Колобанова С. В., Лысогорская Е. Н., Филиппова И. Ю., Анисимова В. В., Оксенойт Е. С, Степанов В. М. Тиолсубтилизин как инструмент пептидного синтеза. Получение и свойства. //Биохимия. 1997. Т. 63. С. 384-393.

178. Isowa Y., Ohmori M., Ichikawa Т., Kurita H., Sato M., Mori K. The synthesis of peptides by means of proteolytic enzymes. // Bull. Chem. Soc. Jpn. 1977. V.50. P.2762-2767.

179. Michels P. C, Khmelnitsky Yu. L., Dordick J. S., Clark D. S. Combinatorial biocatalysis: a natural approach to drug discovery. // Trends Biotechnol. 1998. V. 16. P. 210-215.

180. Schmid A., Dordick J. S., Hauer В., Kiener A., Wubbohs M., Witholt B. Industrial biocatalysis today and tomorrow. // Nature. 2001. V. 409. P. 258-268.

181. Гетун И. В. Филиппова И. Ю., Лысогорская Е. П., Колобанова С. В., Оксенойт Е. С, Анисимова В. В., Степанов В. М. Синтез три-и тетрапептидов, катализируемый субтилизином в органических растворителях. // Биоорган, химия. 1998. Т. 24 С. 306-312.

182. Bacheva А. V., Filippova I. Yu., Lysogorskaya Е. N., Oksenoit E. S. Stability and catalytic properties of subtilisin 72 in acetonitrile/dimethylformamide mixtures with low water content. //J. Mol.Catalysis. B: Enzymatic. 2000. V. 11. P. 39-96.

183. Лозинский В. И. Криотропное гелеобразование растворов поливинилового спирта. // Успехи Химии. 1998. Т. 67. С. 641-655.

184. Lozinsky V. I., Plieva P. M. PoIy(vinyl alcohol) cryogels employed as matrices for cell immobilization. 3. Overview of recent research and developments. // Enz. Microb. Technol. 1998. V. 23. P. 227-242.

185. Bacheva A. V., Plieva F. M., Lysogorskaya E. N., Filippova I. Yu., Lozinsky V. I. Peptide synthesis in organic media with subtilisin 72 immobilized on poly(vinyl alcohol)-cryogel carrier. //Bioorg.& Med. Chem. Lett. 2001. V. 11. P. 1005-1008.

186. Powers M.E., Matsuura J., Brassell J., Manning M. C, Sheftter E. Enhanced solubility of proteins and peptides in nonpolar solvents through hydrophobic ion pairing. // Biopolymers. 1993. V. 33. P. 927-932.

187. Matsuura J., Powers M. E., Manning M. C, Sheftter E. Structure and stability of insulin dissolved in 1-octanol. // J. Am. Chem. Soc. 1993. V. 115. P. 1261-1264.

188. Paradkar V. M., Dordick J. S. Aqueous-like activity of a-chymotrypsin dissolved in nearly anhydrous organic solvents. // J. Am. Chem. Soc. 1994. V. 116. P. 5009-5010.

189. Wangikar P. P., Michels P. C, Clark D. S., Dordick J. S. Structure and function of subtiHsin BPN' solubilized in organic solvents. // J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. P. 70-76.

190. Meyer J. D., Matsuura J. E., Kendrick B. S., Evans E. S., Evans G. J., Manning M. C. Solution behavior of a-chymotrypsin dissolved in nonpolar organic solvents via hydrophobic ion pairing. // Biopolymers. 1995. V. 35. P. 451-456.

191. Gimel J. C, Brown W. A light scattering investigation of the sodium dodecyl sulfate-lysozyme system. // J. Chem. Phys. 1996. V. 104. P. 8112-8117.

192. Okazaki S., Goto M., Furasaki S. Surfactant-protease complex as a novel biocatalyst for peptide synthesis in hydrophilic organic solvents. // Enz. Microb. Technol. 2000. V. 26. P. 159-164.

193. Гетун И. В., Филиппова И. Ю., Лысогорская Е. Н., Бачева А. В., Оксенойт Е. С. Пептидный синтез, катализируемый субтилизином 72 в органических растворителях. //Биоорган, химия. 1999. Т. 25. С. 591-596.

194. Getun I. v., Filippova I. Yu., Lysogorskaya E. N., Oksenoit E. S. SDS-subtilisin. catalyzed synthesis of tetrapeptides containing multifunctional amino acid residues in ethanol. //J. Mol. Catalysis B: Enzymatic. 2001. V. 627. P. 1-6.

195. Воюшина Т. Л., Люблинская Л. А., Степанов В. М. Синтез пептидов, катализируемый сериновыми протеиназами. Применение эфиров ацилпептидов в качестве карбоксильных компонентов. // Биоорган, химия. 1985. Т. 11. С. 738-744.

196. Воюшина Т. Л., Люблинская Л. А., Тимохина Е. А., Степанов В. М. Синтез п-нитроанилидов ацилированньк пептидов, катализируемый термолизином. // Биоорган, химия. 1987. Т. 13. № 5. С. 615-622.

197. Юсупова М. П., Новгородова С. А., Степанов В. М. Последовательное присоединение остатков аргинина к пептидам, катализируемое субтилизином. I. Влияние состава органического растворителя. // Биоорг. химия. 1996. Т. 22. С.523-527.

198. В. Merrifield. Solid phase peptide synthesis: new chemistry and new directions. // In : Future aspects in peptide chemistry. Ed. by W. Voelter, G. Fisher. Collection. 1999. V. l.P. 12-33.

199. Seneci P. Solid phase synthesis and combinatorial technologies. //. Ed. by J. Wiley & Sons, Inc. 2000.

200. Стюарт Дж., Янг Дж. Твердофазный синтез пептидов: Пер. с англ. М.: Мир, 1971.

201. Колобанова С. В., Филиппова И. Ю., Лысогорская Е. Н., Оксенойт Е. С, Степанов В.М|. Ферментативная блочная конденсация пептидов на твердой фазе в органической среде. // Биоорган, химия. 2001. Т. 27. С. 348-352.

202. Renil M., Ferreras M., Délaisse J.M., Foged N.T., Meldal M. PEGA supports for combinatorial peptide synthesis and solid-phase enzymatic library assays. // J. Peptide Sci. 1998. V.4.R 195-210.

203. Лурье Ю. Ю. Хроматографические материалы. M. : Химия. 1988.

204. Морозова О.В., Воюшина Т.Л., Степанов В.М. О взаимодействии с носителями протеолитических ферментов, используемых для энзиматического синтеза пептидов в органических растворителях. // Прикл. биохимия и микробиология. 1994. Т.ЗО. С.786-793.

205. Stepanov V.M., Rudenskaya G.N., Gaida A.V., Osterman A.L. Affinity chromatography of proteolytic enzymes on silica-based biospecific sorbents. // J. Biochem. Biophys. Methods. 1981. V.5. P. 177-186.

206. Соловьева T. A., Беляев C.B., Степанов В.М. Очистка пепсина ионообменной хроматографией на аминосилохроме. // Химия природ, соед. 1977. Хо 3. С.398-403.

207. Люблинская Л. А., Юсупова М. П., Ваганова Т. И., Иванова Н. М., Степанов В. М. Твердофазный синтез биоспецифического сорбента для аминопептидаз, // Биоорган, химия. 1984. Т. 10. No 11. С. 1490-1495.

208. Koeimeke A., Dettllaff S., Jakubke H.-D. Model studies on the utility of nucleophyles bound insoluble supports for enzymatic peptide synthesis. // Monatsh. Chem. 1982. V. 113. P. 331-337.

209. Лысогорская Е. Н., Филиппова И. Ю., Бойцова С. Е., Оксенойт Е. С, Люблинская Л. А., Степанов В. М. Ферментативный синтез п-нитроанилидов пироглутамилпептидов хромогенных субстратов пепсина. //Биоорган, химия. 1983. Т. 9. С. 470-477.

210. Филиппова И. Ю., Лысогорская Е. Н., Оксенойт Е. С, Люблинская Л. А., Степанов В. М. Новый хромогенный субстрат пепсина п-нитроанилид пироглутамил-аланил-аланил-фенилаланил-лейцина. //Биоорган.химия. 1984. Т. 10. С. 90-393.

211. Filippova I. Yu., Lysogorskaya Е. N., Oksenoit E. S., Rudenskaya G. N., Stepanov V. M. L-pyroglutamyl-L-phenylalanyl-L-leucine -p-nitroanilide a chromogenic substrate for thiol proteinase assay. //Anal. Biochem. 1984.V. 143. P. 293-297.

212. Stepanov V. М., Rudenskaya G. N., Revina L .P., Gryaznova Yu. В., Lysogorskaya E. N., Filippova I. Yu., Ivanova I. I. A serine proteinase of an archaebacterium Halobacterium mediterranei. //Biochem. J. 1992. V. 285. P. 281-286.

213. Филиппова И. Ю. Лысогорская Е. Н., Оксенойт Е. С, Комаров Ю. Е., Степанов В. М. Флуоресцентные субстраты аспартатных протеиназ с внутренним тушением флуоресценции. //Биоорган, химия. 1986. Т. 12. С. 1172-1180.

214. Filippova 1. Yu., Lysogorskaya Е. N., Anisimova V. V., Suvorov L .1., Oksenoit E. S., Stepanov V. M. New fluorogenic substrates for assay of aspartyl proteinases. // Anal. Biochem. 1996. V. 234. P.113-118.

215. Старовойтова В. В., Филиппова И. Ю., Лысогорская Е. Н., Оксенойт Е. С, Лавренова Г. И. Флуорогенные субстраты химозина. //Биохимия. 2000. Т. 65. С. 836-841.

216. Филиппова И. Ю., Лысогорская Е. Н., Лавренова Г. И., Оксенойт Е. С, Суворов Л. И., Старовойтова В. В. Пептидные субстраты с внутримолекулярным тушением флуоресценции для изучения аспартильных протеиназ. //Биоорган, химия. 2000. Т. 26. С. 197-202.

217. Филиппова И. Ю., Лысогорская Е. П., Оксенойт Е. С, Трощенкова Е. П., Степанов В. М. Новые флуоресцентные субстраты металлоэндопептидаз с внутренним тушением флуоресценции. //Биоорган.химия. 1988. Т. 14. С. 467-471.

218. Дельфин X., Диас X., Чавес М., Ларионова Н. И., Казанская Н. Ф., Руденскпя Г. П., Филиппова И. Ю. Универсальный ингибитор протеиназ из морской анемоны Stoichactis helianhus. //Вести. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. 1990. Т. 31. С. 300-305.

219. Авенирова Е. Д., Руденская Г. П., Филиппова И. Ю., Степанов В. М. Протеиназа геммул пресноводной губки. //Биохимия. 1992. Т. 57. С. 1222-1229.

220. Гордон А., Форд Р. Спутник химика. // Москва. Мир. 1976.

221. Гершкович А. А., Кибирев В. К. Химический синтез пептидов. //Киев. Наукова Думка. 1992.

222. Люблинская Л. А., Ластовецкая Л.В., Шехватова Г. В., Ваганова Т. И., Степанов В. М. Хромофорный субстрат металлопротеиназ Бпр-А1а-А1а-11е-Аг§-ОИ. // Химия природ, соедин. 1976. С. 75-80.

223. Автор благодарен Л.А.Люблинской, совместно с которой были выполнены первые работы в области ферментативного синтеза пептидов.

224. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам ВНИИ генетики и селекции микроорганизмов Г.Г.Честухиной, Т.Л.Воюшиной, Е.К.Котловой и М.П.Юсуповой за полезные дискуссии и ценные практические советы.

225. Большую помощь в работе оказали сотрудники отдела хроматографии Л.А.Баратова, А.Л.Ксенофонтов, Н.В.Федорова, за что автор их искренне благодарит.