Ферментативный анализ пептидов, содержащих остатки аргинина и лизина тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Р Г 5 ОД

МОСКОВСКИ! ОРДШД ЛЕШНА И ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ

0 Ч АКТ Г^аАРСТВШНЫ;! УНИВЕРСИТЕТ Екенп М.З. ЛОМОНОСОВА

1 О и1\1 1ЗДЭ. УШИЧТОККЙ бАТШтТТТГ

На правах рукописи

ТлРШТЬЕВА ШИНА ЮРЬ2ША

УДК 577.152

ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ ПЕПТИДОЗ, СОДЗРШЖ ОСТАТКИ АРПЙИНА И ЛИЗИНА

Специальность - 02.СО.10 Еиоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1995

Работа выполнена в Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научные руководители: доктор химических наук,

профессор В.М. Степанов,

. кандидат химических наук с.н.с. Т.Л. Воннина

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор Ю.П. Швачкин

доктор химических наук, Л.В. Козлов

Ведущая организация: Институт Сиоорганиче-ской химии РАН

им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Защита состоится НкК()кР1ЪЪЬ г. в 16 ч. на заседании

специализированного совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете им. Ы.В.Ломоносова по адресу II95'99 ГСП, Москва В-234, Ленинские горы, МГУ, лаСороторный корпус "А", аудитория

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета ¡.{ГУ.

Автореферат разослан ¿ЩА'АУ 1ЭЭ5 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук / ^ К.Г.Смирнова

лгЩАа Т<ШтЛ'гт,ТГТЖГ'ФТГ1Г* ТЭДЕУУПМ

Актуальность теиы. Использование ферментов в качестве катализаторов является перспективном подходе;,; при синтезе 'нолсгически активных соединений, поскольку позволяет в мягких услс=лях получать препараты высокой степени химической и оптическсй чистоты. Успешно развизается ферментативный синтез пептидов, з котором видная рель прпнадлезгит сериновым претекназам. Е-^пт'зрнальные фс-р-менты этого класса до недавнего времени еае недостаточно широко применялись для этой цели, поэтому избранная нами гг.ча - применение суотилигпка для синтеза пептидов, соде ржаных остатки аргинина и лизина - является актуальней.

Цель и задачи исследования. Основная

оЗди Чс5 с! ■„•'„гТ1*. О а 0/1»ЛЗ л-!

дальнейшем раэЗътхм летхода ферлеьгхяшбного сикпеза. '«етлхмЗсв с использоЕ-знием з качестве катализаторов сериновых протеиназ, прежде всего субтилизина. Уд -поставили своей целью создаете экзи-матичеексго подхода к получению пептидов, включающих зжнокислоты с функциональными группами в боковой цепи - аргинин и лизин. Помимо развития общего метода в нашу задачу _входила разработка ферментативного синтеза хралогенких субстратов для протеиназ системы гемостаза. Для этого был получен ряд пептидов, содержащих на С-конце я-нитроанилиды аргинина и лизина. Еще одним приложением разработанного нами подхода стал синтез пептида, влгязощего на клеточную адгезия - пенжпеглшдного фрогленли .юлижнг - Ас-Туг-Ие-О1у-Зег-Аг§-Он и его аналогов. В эти соединения потаю остатков аргинина и тирозина входит остаток серина, содеркгдий гидрок-силъную группу в боковой цепи, что делает их ферментатдвный синтез интересной в методическом отношении задачей.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впегзие ферментативный метод синтеза использован для получения болыгого набора п-нитроанилидов пептидов, содержащих на С-конце остаткж аргинина или лизина. Впервые с использованием ферментов, сорбированных на носителе, синтезирован пентапептидный фрагмент ламинина, ответственный за связывание рецепторов опухолевых клеток. Практическая значимость работы состоит в- возможности осуществления масштабного синтеза хромогенных субстратов сериноЕых протеиназ, в том числе протеиназ систеш гемостаза, а также пегстда адгезии Туг-НеЧЛу-

5-r-Arg и его аналогов - потенциальных ингибиторов лгминина.

Публикация и апробация работы. Материалы исследования по те. лиссёотчции ОПУбЛИКОВSHH в Четырех CTäTbriX, 2 ТЙКЖ9 бЫЛИ ПреДСТ';

r.--7öri на Бсеес-йбных снмпс-?иумй>: но химий пептидов и белков в !?Э0 г. и ~ Москве в ' гЭ1 г., на семинаре "Ферменты -ятттг!синтезе" в Богеньее, Германия, в 1931 г. и на III Сил по хиуии протеолйт:^ческ»5х ферментов в Москве в 1S93 г.

Структура и объеу диссертации. Диссертация состоит из ВЕеде.1 ля, обзора литераторы, посвященного возможностям и проблем* ферментативного синтеза в органической среде с м^лым содержание вода, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов списка цитируемой литературы [ ссылок]. Диссертация содержа ^ рисунков и 9 таблиц. Полный обьем работы /^страниц .

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Еабор фермента - катализатора.

В качестве катализаторов синтеза пептидов мы использовали ода ;:з субтияизиков бацилл - еериновую протеина:? у Вас.subtills шт.1 ,'субтнлизин V2), стабильный, доступный фермент достаточно широкс специфичности. Важное значение имел и опыт работы с этой протез назой, накопленный в нашей лаборатории. В некоторых случаях П] синтезе коротких пептидов мн использовали а-химотрипсин, - прот* иназу, менее т-ребователъну» к длине цепи карбоксильного и амине компонента.

Синтез ацилпептидов, содержащих п-нитроанилиды основных аминокислот, катализируемый ферментом в растворе.

В качестве аминокомпонентов использовали п-нитроанилиды арп нина и лизика, а в качестве ацилирущих компонентов - метилоы гфгры бензилоксикарбонил (£) да- и трипептидов, синтез катализ] ровался субтилизином 72. Первоначально реакции проводили в вод» органической среде при рН 7,5-8,4, содержащей минимальное колич( ство.ДМФ для растворения исходных реагентов.

Рассмотрим механизм реакции на примере синтеза 2-А1а-А1а-РЬ

АТ£ I -лМ-'^'Л яге* ира крайним /еОМ'укОя

2-А1а-А1 а-РЬе-ОСН~, введенном для камп^-ясации про те к а ?.чде го параллельно ферментативного гидролиза эфирной связи. Типичные кинетические кривые представлены на рисунке 1.

Piic. 1. Зависимость содержания компонентов реакционном смеси от времени при синтезе Z-A!a-Ala-I'he-Arg-/>NA, катализируемом субпсишшом 72 в растворе. Условия: 40% ДМФ, рН 8.4. (I )-Z- Ala-Ala- Phe-OC Н3.

(2)-Z-Ali-Ah-Phe-Arg-/)NTA,

(3)-Z-Ala-Ah-Phe-OH.

• 50 -

100 usra 20ч

Синтез протекает через стадию образования ацилфермента ш следующей схеме: _ • ■ - . '

г-А1а-А1а-РЬе-А1^-рНА + Е-ОН

Z-Ala-Ala-Phe-ОСНз + Е-ОН ■'

С)

(2)

+H-Arg-pNA

(-2)

-H-Arg-pNA

(фермент) (-1 )

Z-Ala-Ala-Phe-O-E + СН3ОН

(3) +1^0

(-3) -H2°

Z-Ala-Ala-?he-OÏÏ + Е-ОН

Ацилфермент - г-А1а-А1а-Р11е-Ф-Е - быстро образуется по реакции (1), чему способствует использование активированного эфиром кар-5оксильного компонента й-АХа-АХа-РЬе-ОСНд. Далее он подвергается гуклеофильной атаке аминокомпонентом Н-Аг^-рМ (реакция 2), кото-зая приводит к образованию целевого продукта г-А1а-А1а-Р11е-А^-зМА (кривая 2, рис. 1.), или водой (реакция 3), результатом чего гвляется гидролиз ацилфермента и, соответственно, исходного эфира

с образованием Z-Ala-AIa-beu-OK (кривая (3), рис. !,,. ре-з 2 мин выход п-нитро&нилида тетоапептида достигает г^^ксимальног значения - 355, - после чего постепенно уменьшается нз-за актив» псотека^дего вторичного гидролиза 2-Ala-AIa-?hy-Ar¿-pNA по син-rt зированкой связи.

Качественно аналогичная картина повторяется и при . синте: Z-füa-AIa-Leu-Arg-pNA с той лишь разницей, что максимальный вкхс - 25% достигается за 4,5 мин. В конечном счете в обоих случа весь ацшшруулций компонент превращается в продукт гидролиза. .

Б ряде случаев эффективность гидролиза хромогенных субстратс (производных трипептидов) 'трипсиноподобными протеиназами сущес венно повышается, если подцентр Sg занят D-аминокислотой субстр; та írozsgay, 1930, 1?ЗП. Учитывая это, мы попытались найти огга мальные условия для синтеза Z—D—Ala—Leu—Arg—рКА и 2—D—Ala—Leu—Ъ; —p*v\. Рисунок 2. иллюстрирует ход синтеза Z—D—Ala—Ъви—I^ys—pNA -ттгат рплчшпгюшлт^ карбоксильного и аминочомпонентоз

О/

.-Л

Рис. 2. Зависамосгь содержания компонентой . реакционной смеси о

BpCMCllH IIpII ClllITwC

D-.Ala-Lcu-L.vs-/jN А, катализируемом субтнлилшом 72 п • растворе. Услошш: 2 ДМФ, pH 13. ; (!)-Z-D-A!a-Leu-OCH3, (:)-Z-D-Ala-L«j-I.vs-/fN.' (3)-Z-D-Ala-Leu-OH.

160

320

•4S0 мин

Скорость этих реакций значительно ниже, чем в синте п-нитроакилидов тетрапептидов, что объясняется кеблагеприятн влиянием В—аминокислоты к меньшей длиной эфира дипептида по ср внению с трипептидом. Максимальный выход 2—13—А1 а—Ьей-лг^—р составил около 20%, а г-С-Лха-Ьеи-Ьуз-рМ около 50%.

Одним из способов уменьшить первичный и вторичный гидрол является повышение содержания органического растворителя в ре

кцисккой смеси [Бокаина, 1935ï. Однако, высокие концэнтрышл ДМЗ могут инактивировать растворенный фермент iDordick, 19391. ¥яьгл было найлено, что при выдергивании в 62£-ом активность субти— лизкнэ 72 уменьшается 5 32 pasa за 4,5 часа, а в 92?-ом - в 29 раз уже за 45 мин. Синтез Z-Ala-AIa-Phe-Arg-pNA в 925- ьоинсч останавливается через 13 мин при 30S выходе тетрапептнда и 58« неизрасходованного эфира тр-ипептида.

Использование менее концентрированного - T-Zv-SSZ водного рае? вора Л?.'Ф и на порядок большего количества фермента (Таблица 1 > дало более приемлемые результата. В этих условиях были получены Z-Ala-Ala-Leu-Arg-pNA с выходом реакции 84À и выходом Енделения 5GS, и Z-D-AIa-Leu-Arg-pNA с 70% выходом реакции и 46% выходом ьыделекия.

В этой части работы мы показали возможность синтеза aцитированных три- и тетрапептидов с С-концевым n-нитроанилидом этгинина и лизина по реакции, катализируемой субтилизином 72, находящемся в растЕоре. Выходы полученных соединений и условия их синтеза суммированы в Таблице 1.

Таблица 1. Синтез пептидов, катализируемый субтилизином 72, в водных растворах, содержащих

ПЕПТИД

Исходная концентрация реагентов

RC00CH мМ

Xaa-piíA мм

фермент мкМ

Время Выход реакции продукта

ЛМФ

%

Ala-Ala-Leu-Arg-pNA

Ala-Ala-Phe-Arg-pNA Z-Ala-Ala-Arg-pNA

Z-D-Ala-Leu-Arg-pNA Z-D-Ala-Leu-Lys-pNA

38,3 152

33,8

163

168

40

40

19,4

76

19,4

83

88

20

20

0,24 8,7

0,24

9,6

9,6

0,17

0,19

Z-D-Ála-Leu-Arg-pNA 200 100 138

20 83

40

80

80

20

20

70

4 МИН

22 ч 22 мин

5 мин 4 ч

7 ч

8 ч 7 ч

25 Ы

35

3-0

37

20

50

70

У этого способа, однако, имеются и серьезные недостатки - ина-

кт;;ьаиия фермента при высоком содержании ДМФ и большой вкла; гидролитических процессов, затру дня?жий достижение ъысокнх выходе з пептидов. Трудоемко и выделение продукта из реакционной смес; сложного устава, включающее неоднократную экстракции неполярны/-растворителем и колоночную хтзоматогоафию на ионнообменнике.

Синтез пептидов, включающих основные аминокислоты, в среде органических растворителей с малым содержанием вода, катализируемый сорбированными протеиназаки.

Для радикального подавления гидролитических процессов мы обратились к проведению пептидного синтеза в смеси ДМФ и ацетонитрил; с низким содержанием вода, используя в качестве катализатор; оубтилизин и.тл а-химотрипсин, сорбированные на макропористо» стекле С?й-1П или силохроме [АсИегоге^г е1 аХ, 1938]. Поверхность этих сорбентов насыщена гидроксильными силанольными группами (-31-0К) и при высушивании катализатора удерживает связанную < ней гидратную воду. При перенесении сорбированной протеиназы ■ органический растворитель водное микроокружение предохраняв' фермент от инактивации. В то же время показано [Уеппаиаг а! 1994, е+, а1, 19931, что конформация активного центр:

а-химотрипсикл и субтилизина в органической среде аналогична той которую они имеют в воде, и механизм катализа одинаков в любы: растворителях.

При катализе реакций сорбированным субтилизином 72 в большинстве случаев не требовалось введения в систему воды, хотя небольшое ее количество, очевидно, содержится в растворителях, носите ле, ферменте. Рассмотрим'более подробно реакцию - " '

субтилизин

г-АХа-АХа-РИе-ОСНз + Н-Аг£-рКА -► г-А1а-А1а-?Ь.е-Агз-рМ

в 28%-ои ДМФ в СН^СН при молярном соотношении аминокомпонента : сложного эфира трипептида 1:1,1 (Рис 3.)

В течение первого часа наблюдается активный синте: п-нитроанилида ацилтетрапептида (кривая 2), содержание эфир трипептида быстро падает (кривая 1), и лишь небольшая его дол

(около 12%) гпдролизуется с образованием 2-А1а-А1з-?пе-0К. Чтобы перекрыть потери за счет гидролиза ^ этс« опыте вполне достаточным был 10% избыток 2-А1а-А1а-Р11е-0СК^. Основное отличие рассматриваемого подхода от ферментативного с;шт-зза з водяо-отзганической среде состоит в подавлении первичного и коричного гидролиза, что приводит к высокому выходу целевого пептида, который составил 99«, выход после выделения - 85%.

%

Рис. 3. Зависимость содержания компонентов реакционной смеси от времени при синтезе Z-А!л-АЬ-РЬе-АгЕг-/;\'А. ■ катализируемо:.; сорбированным субталзпшюм 72. • Условия: 28% ДМФ з гшмошгтрилс. (1>-г-ЛЬ-.Л1з-Р!1е-ОСИз, (^^АЬ-АЬ-РЬе-Аг^чА, (3>-г-А!п-А!а-РЬе-ОН.

По нашему мнению, в случае применения сорбированного фермента концентрация аминокомпонента - Н-Агз-рйА алн Е-Ьуз-рИА в гидрат-ном слое вокруг протеиназы может быть весьма велика, т.к. используемые нуклеофилы достаточно гидрсфиьнн. Это обстоятельство способствует преимущественному взаимоде£стБШ> -ацилфермента с молекулами нуклеофила с образованием целевого пептида, а не с молекулами гидратной воды..п-Нитроанилид ацщщрованного пептида,' видимо, переходит в органический растворитель, удаляясь от сорбированной протеиназы, что, в йзою очередь, затрудняет вторичный гидролиз продукта.

Высокий выход и простота состава реакционной смеси делает удобным и выделение полученного пептида. 15? окончании синтеза и отделения катализатора раствор концентрируют и осавдают п-нитроанилид защищенного тетрапептида этадацетатом или толуолом.

Ферментативный синтез набора п-ннтроанилидов пептидов -потенциальных субстратов трипсиноподобных протеиназ

В нашу задачу входил синтез субстратов для ферментов систем! гемостаза, родственных трипсину по первичной специфичности, н-. сблада;сщих хорошо выраженной вторичной специфичностью. Ка основ разработанного метода мы синтезировали набор тетрапептидов обще! Формулы Z—А 1а-А1&-лаа-"в&-р1<"А, где Хаа (положение F«) - остатю ijí'-i, Trp, 1 уг, HÍ5, Met, Ala, Ile, Píie, - a Y&a (положение Pj) остатки Arg или Lys. Б качестве катализатора ь этой серии опыте: был 'использован сорбированный субтилизин 72. Основные условия ¡ выходы полученных соединений приведены в таблице 2. Почти вс синтезы проведены с высокими выходами реакции - 75-100% - и выде ления - 70-77%. Исключение составили два тетрапептида с Не I-Ala-Ala-Ile-Arg-pNA (17%) и Z-Ala-Ala-Iie-Lys-pNA и лизин содержаний пептид с Hís - Z-AI&-Aia-His-Iys-pN*A.

Отметим, что в предложенных нами условиях удается ввести в синтез ацилирущие компоненты, содержащие в качестве С-концевы остатки триптофана, тирозина и гистидина - аминокислот с функци опальными группами в боковой цепи, которые нередко требуют допол нительной защиты в химическом синтезе. Все три соединения - Z АIа-А1a-Trp-Arg-pNA, Z-Ala-Aia-Ty^-Arg-pNA и Z-Aia-Ala-Hís-Arg-р-:,'А - были получены с высокими выходами - 100%, 100« и 83%, соот ьетственнно. Выхода выделенных пептидов составили 78% для триптофан- и 79% - для тирозин-содержащих пептидов.

С использованием субтилизина 72 было также получено нескольк« тг-нитроанилидов трипегггидов, три из которых содержали остати В-аминокислот в положении Рд (Таблица 3). Выходы реакции составили 61-33«, выходы выделения около 70%.

Почти все ацилирущие компоненты, использованные для получени: аргинин-содержащих пептидов, были введены также в синтез с H-Lys pNA (таблица 2), например:

субтилизин

Z-Ala-Ala-Trp-0CH3 + H-Lys-pNA-» Z-А1 а-А ia-Trp-Lys -pNA

Хотя лизин имеет £-аминогруппу в боковой цепи, ее защита : синтезе не потребовалась, что объясняется региоселективность;

Таблица 2. Синтез гс-нитроанилидоз тетрапептидов с использованием в качестве катализатора сорбированного субтилизина 72. Условия: 2о% 72« ацетонитрила, 20° С.

Пептид Молярное ИСОССНд Выход продукта

соотношение концентра- по !выделе—

Н( К) -рНА :НС00СН3:Е ЦИЯ, реакции ни я

мМ % %

¿-А1а-А1а-Ьеи--»А^-рНА 1 :1.1 1.9*10-4 —4 17.1 97 70

П Пг, Пп П^а V и— дха~«хс*— х ис—*п1 ¿^—у^п 1 :1.1 1.9*10 17.1 99* 85

2-А1а-А1а-А1а—>Агг-р"А 1 :1.5 8.4*10-4 —4 21.4 ' 93 83

г-А1а-А1а-7гр-~* Аг£-рИА 1 : 1.5 7.5*10 -4 42.1 100* 78

г-А1а- А Ха-Туг—► Аг§-рМ 1 :1.5 7.' *10 —4 / о »э • о 100* 79

2-А1а-А1а-?,Гег—АГ£-рТИ * : 1.5 3.3*10 42.3 100 83

2-А1а-А1а-Н1з-*Аг5-рНА 1 :1.5 3.8*10 о «♦¿I «о 83** -

2-А1а-А1а-11е-*Аг£-р?«тА 4 < : 2 1.6*10 41.7 17** -

г-АХа-АХа-Пе—»Ьуз-рНА 1 :.. с- 3.3*10-3 57.2 48** -

2-А1а-А1а-РЬе—»Ьуэ-риА 1 :1.1 3.3*10"3 34.2 95 77

г-АХа-АХа-Ьеи-^Ъуз-рЯА 1 :1.1 3.3*1 о"3 3^.2 85 -

2-А1а-А1а-Тгр—Ъув-рМА 1 :1.5 3.8*10-4 42.8 76 -

г-АХа-АХа-Туг—Ьуэ-рКА 1 :1.5 3.8*10"4 42.8 75 -

г-АХа-АХа-ЯХв—Ьуз-рЯА 1 :1.5 3.8*10-3 42.8 40** -

*Время реакции 4ч. В остальных случаях время реакции 24 ч.

*Время реакции 72 ч

ToCví/IiI3 о . C»IH?63 П.—КйТрОйпЛ-чДЛОБ ТргТПвПТИДОВ, К Э 7 S ЛИ. 3 Иру 'г Vü Л о *'рб;гр о б SKKK м с у б та лл о FlH о м 72. Многократное и спол ь з о ь а ни

пТо.

— _ , ^Г-» ^ ir» TJ Г> -IT --V /-> 'J /-»

•«^v.VDh". . ' , < 't-Xf О . — * ** » ^ •

К он и с н т р.^ 'J>i я H-Arg-pNA 17,2 мУ, H-Lys-pNA - 7-¿ мУ.

Молярное Номер Бремя Выход

Пептид соотношение цикла реакции по pea

R (К ) -pliА : RCCGCE-J : S Ц ЦК!-,

гт ¿J" -Е-Al a-Leu— Arg-pNA 1:2:5. 4* 10"3 1 39 96

? 52 96

г" -1 93

1:2:8.5*10~~ 1 24 9-3

2 42 96

3 46 9:

4 69 9 ¿

2;. -D-rro-Fïie—»Arg-pNA 1:2:1. 4* 1 G~~ 1 24 8;

2 26 7{

3 84 61

¿j- -B-7al-Leu—Arg-pNA t:1,8:9,8«10~2 1 168 т:

г» ¿>- о -Ala-Ala—Arg-pNA 1:1.5:4.'»'G ~ 1 1.5 9(

2 1.5 8=

3 20 8'

F7 ь- -Ala-Ala—Lys-pNA 1:1.5:3.4*1 G-3 1 1.5 9<

2 2 9

3 19 9

4 72 8'

Фермента. Четыре тетрапептида - 2-А1а-А1а-?Ье-1у8-рг<А, 2-А1а-А1а-Ьеи-Ьуз-р^А, 2-А1а-А1а-1гр-1уз-рКА уи 2-А1а-А1а-Туг-Ьуз-р«А были получены с хорошими выходами - 55?, 85-, 75? и 75%, соответствен но. Фенилалакин-содераащий пептид был выделен препаративно с выходом 77?.

Субтилизин обладает протяженной зоной связывания, поэтому в синтезах, катализируемых этим ферментом, эффективными ацилирукщи-мя агентами являются производные трипелтидов. При синтезе коротких субстратов - да- и трипептицов, по нашему мнению, более эффективен сорбированный с-химотрипсин - фермент, .менее требовательный к длине цепи ацилирунцего компонента.

Таблица 4. Синтез п-нктроанилидов трнпептадов, катализируемый сорбированном с-химотрипеином.

Условия: 2655 Д®, 2,2% Н~0, 69.8% СН3СК, 20° С, 24 ч. Концентрация К-А^-р»ЧА - 15,1 мМ, Н-Ьуз-рЯА - 30,2 мМ.

Пептид Молярное Выход продукта, %

соотношение .по выде-

К (К) ■-р«у А: ЯС00СН3: Е реакции ления

1:2:3.8 10"3 97* 75

г-РИе—>Аг£-рМ 1:2:7.5 10~3 97 60

Бос-С1у-РЬе—*Аг£-рКА 1:2:7.5 10~3 98 44

Зос-СИу-РЬе—»Ьуз-рМ 1:2:3.8 10~3 53 -

г-А1а-?11е— ЬуБ-рМ 1:2:3.8 Ю-3 63 • -

*Выход через 6 ч.

Нами было синтезировано пять пептидов по реакциям, катализируемым этой протеиназой (Таблица 4), например:

•

а-ХИМОТрИПСИН г-РЪе-ОСНз + Н-АгЕ~рКА -» £-?Ъ.е-кТ£-рК\

Все синтезы проводились при соотношении аминкого и ацилирующ; го компонентов 1:2 в 28Ж-ом ДМФ в ацетонитриле в присутстну 2,25-ов воды. Степень превращения H-Arg-pNA в этих синтезах бли; ка к количественной. При образовании пептидной связи с H-Lys-p* в тех не условиях она была ниже. Видимо, для «д-химотрипси*-я-нитроанилид лизша менее предпочтителен в качестве нуклеофила.

Таким образом, каш были синтезированы двадцать четы£ п-нитроанилида пептида с остатками аргинина или лизина на C-kohl при использовании в качестве катализаторов сорбированных субтша-зина 72 и а-химотрипсина. Все это указывает на общность предлс женного метода и его пригодность для масштабирования.

Исследование гидролиза полученных я-нитроанилидов пептидов различных« сериновыми протеиназами.

Заключительной стадией этого этапа работы стало исследована возможности использования полученных соединений в качестве хроме генных субстратов для ферментов системы гемостаза. Поскольку si протеиназы по первичной специфичности близки трипсину, для част пептидов были определены кинетические параметры их гидроли; трипсином (Таблица 5).

Все испытанные пептиды хорошо гидролизуются трипсином с отще плением п-нитроанилина, наиболее эффективно - Z-Ala-Ala-Arg-pJ (N°1) и Z-Ala-Ala-Ala-Arg-pHA (N°3).

Тетрапептиды, содержащие остатки фенилаланина, триптофана метионина в положении Pg несколько хуже гидролизуются этим фе^ ментом, возможно, из-за стерических препятствий. Наши даннъ находятся в соответствии с данными Пожгай и сотрудников, tPozsgi et al, 19811 которые показали, что S2 участок трипсина предпоч* тает гидрофобные неароматические аминокислотные остатки. Дипепта Z-Phe-Arg-pNA наименее эффективно гидролизуется трипсином из-: недостаточной длины и несоответствия ароматического остатка фе нилаланина характеру S2 подцентра фермента и Z-группы - специф^ ности Sg сайта.

Двенадцать пептидов были проверены на расщепляемость фермент? ми системы гемостаза: тромбином, урокиназой и плазмином в Инсп

туте гематологии РАМН в .--бсратории профессора В.А.Макарова при рН 8,3. Полученные данные открываютувозможность подбора оптимальных хрсмогенных субстратов для тромбина, плазмина и урекиназы, основанного на различиях з специфичности этих Ферментов гемостаза в откоаении остатков и Так, mpQ.tC-.vH. предпочитает субстраты с С-концевым остатком арггнзяа и аминокислотой с небольшой боковой цепью в положении Р-. Плазлин из числа испытанных предпочтительно гидролизует субстраты с С-концевым п-нитроакилидом аргинина, в которых положение занято крупным гидрофобным остатком. Неожиданным оказался легкий гидролиз уронтазой субстрата, содер-. жащего остаток триптофана. :

Таблица 5. Кинетические параметры гидролиза хромогеЕных субстратов'трипсином при рл 8,15 и 20°С.

7М % :"-кэт/кМ

Субстрат ьеталь/мин М М-1 с-*

1. 2-А1а-А1а-Аг£-рЯА « ( .6*10" -1 1.7*10" -5 1, .2*10б

2. 2-А1а-Р1ге-А^-рКА т .9*10" -2 9.2*10" -5 5, .4*105

3. Z-Aia-AIa-Ala-Arg-pNA 1 .5*10" -1 3.3*10' -5 3, .8*106

4. г-А1а-А1а-РПе-Аг£-рКА 6 .5*10" -2 1.8*10" -4 2. .5*105

5. г-А1а-А1а-Мег-Агв-рЫА 1 .4*10" -1 1.1*10" ■4 7, .5*1О5

6. г-А1а-А1а-Тгр-А^-рМ л "у .3*10" -2 1.6*10" -5 1, .3*105

7. г-РЬе-Агё-рМ 2 .5*10" -2 _ 4.0*10" -4 4. .4*104

Существенно, что предажнкнЯ нами способ синтеза хроуогенных субстратов указанного типа удобен для масштабирования.

Ферментативный синтез фрапента лаыинина - пентапептида Ас-Туг-11е-С1у-5ег-Аг£-Ш, его л-нитроанилида и амида.

Развитый нами подход к" ферментативному синтезу аргинин-

сскрхигг.к пептидов в органических, раствори гелях с использованием в ка-естье катализатора гтротеиназы, сортированной на макропористом носителе, мы применили для .получения защищенного пентапептида Ac-Tyr-IIe-GIy-Ser-irg-OH, его n-нитроанилида и амида.

7Г-;-.тапептид Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg является фрагментом аминокислотной последовательности 51 цепи ламинина - гликопротеина соединительной ткани, основного компонента базальных мембран. Обычные и опухолевые клетки имеют рецепторы, проявляющие высокое сродство к ламин1?ну. Их связывание с ламинкном - ниобходш/лй момент в метастаг-проБании опухолей и секреции злокачественными клеткам! Ферментов деградации межклеточного матрика ilwamoto et al, 1937].

Было обнаружено, что нонапептид Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Зег-Arg - фрагмент аминокислотной последовательности BI цепи лауинтг-а - конкурирует с ламияином за связывание с клеточными рецепторами и подавляет взаимодеиствие клеток с ламинином, тем cavb'v препятствуя их закреплению б соединительной ткани [Теггапо-va et al, 19361 Амид нонапептида значительно более действен как конкурентный ингибитор ламинина, а пентапептид Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg сохраняет около 50 % активности амида нонапептида. Амида обс;пс пептидов приблизительно одинаково эффективны [Grai et al,

4 Г>Ог* ч (j•

Хз^пчеткий синтез пентапептида Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg и его аналогов ослогнен необходимостью защиты боковых функциональных групп Туг, Ser, Arg. Обычно эти пептида получают, используя пептидный синтезатор [Graf et al, 1937]. Имея в виду перспективу масштабирс ванил синтеза этого соединения и его производных, мы поставили перед собой задачу получить эти пептиды, используя, в основном, ферментативные метода образования пептидной связи.

Схема синтеза выглядит следующим образом:

H-c-l^-Gi'.-Nd

+H- Л гг-N Н,. с\ ó i и-ппя н

Rcc-F^-G^-Ser-Are-NH.

сксоон

100%

H-IIi-C-iy-Ser-Ars-NH,

+Ac-T>t-OC,H}. 95".

а-химотрилеин

Ас-Ту r-lio-Giy-Ser-Ars-NH,

+H-Ar?-pNA. с\01и.ипин

Hoc-I'í-GW-Se.-- \r?-pN.\

¡0£T.

CF-COOH

+Ac-Tyr-OC,H5, я-тнмогряпсия

Ас-1 >i-tí-G;> -Sar-.Uf-pXA

трипсин

.^-T^-ík-C.iy-Ser-.Vri-OII

V

Первоначально конденсацией производных аминокислот с помощью карбодиимида был получен дипептлд Бос-Ile-Gly-OCH- с выходом 66%.

* О

Далее ферментативным гидролизом папаззом, сорбированным на сило-хроме, получили Eoc-Ile-Gly-CH с выходе« SQ%:

папаин "

Бос-IIe-Gly-OCKg + HgO --» Бос-Ile-Gly-OH

Гидролиз проводили в ацетонитриле, ссдерзадем воды при рН 7,6 и температуре 20° С.

Ацилирование H-Ser-0CH3 пент&^тор'енялозым эфиром Boc-Ile-Gly-0-С6Р5 с количественным выходом дало Boc-Ile-Gly-Ser-OCHg -

дцгк

Boc-Ile-Gly-OH + C6F50H-» Boc-Iie-Gly-O-CgFg + H-3er-0CH3 —>

-<• Boc-IIe-Gly-Ser-OCH3 + CgFgOH

Был возможен и другой путь синтеза эфира Вос-трипептида -

реакция, катализируемая папаиноы, сорбированным на силохроме, в

ацетстатршю ■ _

■ папааа

Вос-11е-С1у-0СН3 + Н-Зег-ОСЕз -» Вос-11е-С1у-Зег-0СН3

•Однако, максимальный выход этого синтеза составил 502.

Вос-11е-С1у-Зег-0СН3 конденсировала далее с Н-Аг£-р»А в 28Х-ом даф в ацетонитриле, используя 1,5-кратный избыток эфира трипепти-

да. Реакция катализировалась сорбированным субтилизинс

'Л" су бтилизин Бос-Пе-иХу-Нег-ССН^ + Н-Аг£-рЛ*А -■-» Бос-11е-01у-5ег-Аг2-р!\

Через 2 ч выход продукта достиг 93%. Выход выделения - 92%.

Значительно труднее было обеспечить высокий выход при синтез Бос-11е-С1у-Зег-Аг£-!чН2.

субтилизин

Вос-11е-01у-5ег-0СН3 + Н-Аг£-КК? -► Вос-11е-01у-Зег-Аг£-иЕ

Реакцию проводили в 25% ДГ^СО в ацетонитриле, при 1,8-кратнс избытке амида аргинина. 37% еыход продукта достигался лишь чере 1С дней, причем через 5 дней требовалось ввести в реакционну смесь свежу® порцию сорбированного фермента. По нашему мненик столь дргл'яттгческое замедление реакции -интеза объясняется боль з",".; различием в связывании субтилизином амида и п-нитроакилил аггинина. А;«кд асгикина может взаимодействовать только с одю п-~."центром фер?/екта - . В отличие от этого, п-нитроакилкд арги ник а закинет, пс-ьидгчому, три подцентра - Зр , Компенси решать замэчлечие реакции увеличением содержания фермента ил избытка амида аргинина в смеси было нельзя, поскольку это могл привести к включению в продукт второго остатка аргинина [Юсупова Новгородова, 13Э5 3.

После удаления Вос-защиты трифторуксусной кислотой с количественном выходом были получены Н-11е-С1у-Зег-Аг£-рКА и Н-11е

01у-Зег-Аг£-НН2-

Конденсацией п-нитроанилида тетрапептида и Ас-Туг-ОС2Нд бы получен гс-нитроанилид пентапептида

а-химотрипсин

Ас-Туг-0С2Н5 + Н-11е-С1у-5ег-Аг£-рНА -►

Ас-Туг-11е-С1у-3ег-Аг§-рКА

В качестве катализатора был выбран а-химотрипсин, - как фермент менее чувствительный, по сравнению с субтилизином, к длине цеп ацилирукщего компонента. Синтез проводили в 18£ ДМСО в ацетони трале в присутствие 3,6« вода, при четырехкратном избытке Ас-Туг 0С2Н5. Через пять дней выход-продукта составил 98%. Выход пр

вклеленпп 85%.

Заключительной стали«« синтеза ац*гатентапепткяа со свободной -СССН-группой являлось отцепление -ч-нитроакилина трипсином -

ттапеин

Ac-Tyr-IIe-GIy-Ser-Arg-p-N-4 - Ну,0 —-» Ac-I^-I±e-Gly-Ser-Arg-OK

-fSi

Количественное отщепление n-нитроанилидной группы происходило при рК 7,4-7,6 в течение 15 мин. г^л предотвращения дальнейшего гидролиза пептидной цепи трипсин ингнбировэли соевым ингибитором трипсина. После удаления ~г-нитроанилннэ экстракцией этилацетатом и отделения комплекса трипсин - ингибитор ультрафильтр^цией, раствор был лиофильно Еысушен, что дало целевой продукт - Ас-Гуг-11е-Г,Iу-5ьг-Аrg-GH с небольшим содержанием солей и выходом

Амид пентапептида А с -Туг-71 е-"- ] у-- ~ г-Аг£-?."Н2 также синтегиро-вали по реакции, катализируемой сорбированным а-химотрипсиком, -

о-2ИМ0ТРИПСИН

Ас-Тут-ОС?п5 + H-Ile-Gly-Ser-Arg-iH- -:-»

Äc-Tyr-IIe-GIy-Ser-Arg-Tin?

в 13% ДМСО з ацетонитриле в присутствие 3,5%-эоды, при 4-х кратном избытке Ас-Туг-ОС^Нг;. Через сутки выход амида пентапептида составил 37%.

ВЫВОДЫ

1. Изучен .ферментативный подход к синтезу пептидов, содержащих в качестве С-ксниевых остатки аргинина и лизина. Показано, что сериковые протеиназы - субтилизин и а-химотрипсин - с высоким выходом могут катализировать ецилирование »-аминогруппы тг-нлтроанилидов этих аминокислот. Наиболее удобным является использование органических растворителей с очень малым содержанием волы в качестве реакционной среды синтеза, катализируемого протеиназами, сорбированными на макропористых кремнеземах. При этом подавление гидролитических процессов обеспечивает высокие выходы и упрощает схему выделения целевых продуктов.

2. С использованием разработанного метода синтезировано 24

генными суСстгыгьи. р-^личных серкноныл 7тпг>7£-уг~?<з - гг-ичин*, плазмина, -тромбина и урокиназы.

3. Разработан способ синтеза пэнтапептидного фрагмента ламикике Tyr-Ile-Giy-Ser-Arg и его производных - перспективных ингибиторе? процесса клеточкой адгезии. Предложенный подход предусматривает исполь -ование знзиматического синтеза на основных стадиях.

Результаты работы отражены в следующих публикациях:

1. Т.Л.Вошина, Е.Ю.Терентьева, Л.А.Люблинская, Б.В.иозднев, А.В.Гайда, М.Ю.Гололобов, В.М.Степанов Ферментативный синтез .«ПТЛПоПТИдоб, содержащих n-нитроанилиды основных аминокислот. // Биоорган. химия.- 1991.— Т. 17.- С. 1056-1073.

2. T.L.Voyushina, E.Yu.Terent'eva, v.tf.Stepanov The Synthesis oi chrorr,o££r,io peptide substrates containing p-nitroanilides ol argir.ine -and lysine. // Biomed. Biochim. Acta.- 1991.- 7. 50.- P.

r-y J

CU7-ClС.

3. V.".otepanov* T.L.Voyushina, E.Yu.Terent'eva, tf.Yu.Goiolobov, Subtillsine or ^-Chyrr.otrypsin Catalysed Synthesis оГ Peptides: Contaning Argir.ine or Lysine p-IJi':>oanilides as C-Terminal Moieties. // Bioorganic & Medicinal Chemistry.- 1995.- V. 3.- P.-479—¿Я5

4. E.Yu.Terent'eva, T.L.Voyushina, V.M.Stepanov Enzymatic Synthesis of YIGSR - Larainln Pentapeptide Fragment - Derivatives. // Biomed, Chem Lett.- 1995