Синтез и исследования пептидного морфогена гидры и его структурных аналогов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

московский

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ТОНКОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи

РУБИНА АЛЛА ЮРЬЕВНА

СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЯ ПЕПТИДНОГО МОРФОГЕНА ГИДРЫ И ЕГО СТРУКТУРНЫХ АНАЛОГОВ.

02.00.10. Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА - 1991

Работа выполнена в лаборатории синтеза пептидов Института экспериментальной кардиологии ВКНЦ АМН СССР и в совместном советско-германском предприятии "Константа".

Научный руководитель :

доктор химических наук, профессор М. И. Титов.

Официальные оппоненты :

доктор химических наук, профессор Е. Н.Звонкова, кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник А.Л.Кузе.'

Ведущая организация : Институт белка АН СССР (г.Пущино)

Защита диссертации состоится ___1991 г.

в часов на заседании специализированного совета Д 063.41.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Московском институте тонкой химической технологии им.М.Б.Ломоносова по адресу : 117571, г. Москва, проспект Вернадского, д. 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского института тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан

___1991 г.

Ученый секретарь специализированного .совета кандидат химических наук

А. И. Лютик.

Актуальность темы. В настоящее время большой интерес вызывают пептидные биорегуляторы, выделенные из органов и тканей животных, находящихся на ранних этапах эволюционного развития. Эти же пептиды либо их структурные аналоги как правило присутствуют в организмах высших животных, сохраняя свою исходную биологическую функцию. Вместе с тем пептидные регуляторы, выделенные из низших организмов, у высших животных могут выполнять и другие, более сложные функции, возникшие в процессе эволюции. Исследование пептидов, обладающих эволюционной- консервативностью, имеет важное практическое значение, поскольку выявление специфических функций филогенетически древних пептидов у высших животных может служить основой для поиска и создания новых высокоэффективных лекарственных препаратов.

Одним из наиболее древних в филогенетическом отношении пептидов является пептидный морфоген гидры (ПМГ) Glp-Pro-Pro-Gly--Gly-Ser-Lys-Val-Ile-Leu-Phe-OH, выделенный в 1981 году Шаллер и Боденмюллером из нейросекреторных клеток пресноводной гидры Hydra attenuate. Впоследствии пептид идентичной структуры был обнаружен в органах и тканях различных животных, в том числе млекопитающих и человека. Важнейшей особенностью ПМГ является высокая консервативность его структуры, заключающаяся, с одной стороны, в том, что в процессе эволюции от гидры до человека она не претерпела никаких изменений, и, с другой стороны, в том, что не было выявлено, несмотря на значительные усилия, ни одного природного или синтетического структурного аналога этого пептида, обладающего исходной морфогенетической активностью.

Установлено, что в организме гидры ПМГ выполняет функции фактора роста и дифференцировки тканей и активирует регенерацию головного конца тела. В то же время, хотя данный пептид присутствует в самых различных органах и тканях млекопитающих, вопрос,

как трансформировались его биологические функции в ходе эволюции от кишечнополостных и в чем заключается специфическая роль ПМГ у млекопитающих, оставался открытым.

Очевидно, что для проведения исследований по выяснению биологических функций пептидного морфогена гидры требуются значительные количества пептида, которые можно получить только путем химического синтеза.

Цель работы. Целью работы является разработка рациональной схемы синтеза пептидного морфогена гидры классическими методами пептидной химии в растворе, синтез и исследование биологических свойств его структурных аналогов, синтез аналогов, содержащих радиоактивные метки и и разработка методов направ-

ленной конъюгации данного пептида с различными белками-носителями. В задачи исследования входит также проведение ряда физико-химических исследований и компьютерный анализ структуры ПМГ.

Научная новизна. Разработаны рациональные схемы синтеза ПМГ, его структурных и меченых аналогов. Предложен способ введения тритиевой метки. Получен меченный тритием ПМГ, удельная активность которого значительно превышает приводимые в литературе данные. Проведены физико-химические исследования и компьютерный анализ структуры ПМГ. Показано отсутствие упорядоченной структуры у молекулы ПМГ в водном растворе. Определен минимальный активный фрагмент молекулы. Выявлена структурно-функциональная зависимость биологических свойств в ряду аналогов ПМГ. Синтезирован высокоактивный аналог [Агд^ПМГ. Высказано и подтверждено предположение о возможности сохранения исходных биологических функций филогенетически древнего пептида у высших животных. Выявлено специфическое для высших организмов биологическое действие ПМГ.

Практическая ценность работы. Разработаны оптимальные схемы синтеза, позволяющие получать ПМГ и [дгд^ПМГ в количествах,

необходимых для проведения расширенных медико-биологических исследований. Результаты биологических исследований позволяют рассматривать пептидный морфоген гидры и его [Arg''']-аналог в качестве потенциальных лекарственных препаратов.

На защиту выносятся следующие положения:

- синтез ПМГ, его структурных аналогов и аналогов для введения радиоактивных меток, получение конъюгатов;

- физико-химические исследования и компьютерный анализ структуры ПМГ; минимальный активный фрагмент молекулы ПМГ;

- взаимосвязь структура - биологическая активность в ряду структурных аналогов ПМГ; [Агд^ПМГ - высокоактивный аналог.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации докладывались на I Всесоюзной конференции "Нейропептиды, их роль в физиологии и патологии", Томск, 1985 г., на VII Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов, Таллинн, 1987 г., на II Всесоюзном рабочем совещании по изучению роли морфогенетически активных факторов в различных процессах, Пущино, 1988 г., на Всероссийской конференции "Олигопептиды как регуляторы функций организма", Москва, 1988 г. По теме диссертации получено одно авторское свидетельство и опубликовано четырнадцать научных статей.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, в котором систематизированы и кратко изложены опубликованные к настоящему моменту результаты исследований ПМГ, обсуждения результатов, экспериментальной части и выводов. Диссертация содержит 120 страниц машинописного текста, включая 8 таблиц, 14 рисунков, 4 схемы, список цитируемой литературы (114 наименований) и приложения.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

I. Выбор аналогов.

Аналог [Агд^ЗПМГ получен заменой остатка лизина в положении 7 на остаток аргинина - максимально приближен по структуре к природному пептиду, поскольку при такой замене сохраняется положительный заряд в центре молекулы и остаются неизмененными ее М- и С-концевые части. Как показано ниже (разделы 5 и 6), у этого аналога не происходит существенного изменения физико-химических свойств, сохраняется пространственная структура природного пептида и, как следствие, сохраняется его биологическая активность.

Аналог [т1еЮ]ПМГ получен заменой остатка лейцина в положении 10 на остаток неприродной аминокислоты |_-трет-лейцина. Синтез проводили с целью получения соединения, устойчивого к ферментативной деградации.

В литературе, посвященной пептидному морфогену гидры, этот пептид сопоставляют с брадикинином. Брадикинин - единственный из известных пептидов, гомологичный ПМГ - совпадают аминокислотные остатки в положениях 2,3,4,6. Синтезирован аналог ПМГ с дополнительным С-концевым аргинином - [Агд^]пмг, в результате чего обе молекулы преобретают сходство и в С-концевой части: Х-Рго--Рго-СТу—Х-Бег-...-РЬе-Агд. Был также синтезирован поскольку к этому моменту по ряду тестов [дгд7]ПМГ уже проявил высокую биологическую активность.

Для изучения распределения ПМГ в тканях млекопитающих, разработки .радиоиммунологического и рецепторного анализов были синтезированы аналоги ПМГ, меченные радиоактивными изотопами.

Синтезированы аналоги для введения двух типов метки: [0аЬ^]ПМГ, где ОаЬ - 1-2,6-диамино-4-гексиновая кислота, который после каталитического тритирования превращался в нативный пептид с включением четырех атомов ^Н на молекулу и аналог с модифицированным С-концевым карбоксилом, для введения Аналог ПМГ, меченный 2^ сохраняет иммунореактивность нативного пептида, однако не обладает его биологической активностью, которая сохраняется в случае введения тритиевой метки.

Были также разработаны методы направленной конъюгации ПМГ с БСА и гемоцианином по £ -аминогруппе лизина и С-концевой карбоксильной группе.

2. Синтез пептидного морфогена гидры и его аналогов.

Синтез ПМГ и его аналогов [Т1е10]ПМГ, [Агд7]ПМГ, [Агд12]ПМГ, [Лтд7'ПМГ проводили классическими методами пептидной химии в растворе. Были разработаны схемы синтеза - I и 2, с использованием фрагментной конденсации: (1-5)+(6-11), либо (1-5)+(6-12).

При разделении аминокислотной последовательности на фрагменты необходимо учитывать возможность рацемизации при последующей конденсации фрагментов. С этой точки зрения разделение на фрагменты (1-5)+(6-11) по связям у глицина является оптимальным. При этом м-концевой пентапептид является общим для морфогена гидры и его аналогов, что позволяет проводить параллельно синтез нескольких С-концевых фрагментов и одного, общего для них, н-концевого.

Рго Рго в1у Эег 1_уз Уа1 Не

1_еи РЬе (Агд) <Т1е )

2

ОМр н

1

г-кжр н

2

г4оир н

К тплекс

ОН ОНа ОН 0№ ОН 0№ ОН

НОЫВ

ТРА, НВг

г

ОРср н

г-

Вос г Г-^ОЧр н рос

£о

Т

г

2-\0Ыр Н

г

ОИр н

ОИр н

-ОВи (ОН)

ОВи (ОН)

ОВи (ОН)

ОВи (ОН)

ОВи (ОН)

ОВи (ОН)

ОВи (ОН)

ОВи (ОН)

ОВи (ОН)

ОВи (ОН)

ОВи (ОН)

ОВи (ОН)

ОН

Схема I. Синтез ПМГ, [Т1е10]ПМГ, [Агд12]ПМГ

Фрагменты 1-5, 6-11 и 6-12 были получены методом последова-

I ИЛЬ

тельного наращивания пептидной цепи с использованием п-нитрофениловых (-ОИр), пентахлорфениловых (-ОРср) и и-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидных (-оив) эфиров карбобензоксиамино-кислот. Избыток активированного эфира и выделившийся в результате реакции п-нитрофенол (либо соответственно ноРср или нсш) удаляли переосаждением. В ряде случаев, когда растворимость целевого продукта и п-нитрофенола была близкой, п-нитрофенол удаляли обработкой амберлитом и*А-410 в ОН-форме, контролируя процесс с помощью ТСХ.

При синтезе С-концевого дипептида г-Пе-РЬе-ови * этой процедуры оказалось недостаточно.' Активированный эфир г-Пе-ОИр и дипептид н-т1е-РЬе-0Ви1 подвергали дополнительной очистке с помощью жидкостной хроматографии на силикагеле. Выход на стадии получения дипептида, включая очистку, составил 47% (средний выход реакций конденсации методом активированных эфиров составлял 95%).

Выбор комбинации защитных групп во многом определяет стратегию и тактику дальнейшего синтеза. Например, использование защитных групп уретанового типа, независимо от метода конденсации, уменьшает вероятность рацемизации. Выбор комбинации защитных групп зависит, в свою очередь, от конкретной аминокислотной последовательности и определяется возможностью селективного деблокирования временных и постоянных защитных групп. Поскольку в ПМГ и его аналогах отсутствуют серосодержащие аминокислоты, в качестве временной защитной группы была выбрана бензилокси-карбонильная группа (г), отщепляемая гидрогенолизом, в качестве постоянных защитных групп при этом были использованы группы трет-бутильного типа, устойчивые к гидрогенолизу и отщепляемые ацидолизом (см. схемы 1,2 и 3).

В последнее время отмечается повышенный интерес к кислотоустойчивым временным защитным группам, отщепляемым в слабощелочных условиях. Такие группы используют в комбинации с постоянными защитными группами трет-бутильного типа. Такая комбинация

защитных групп была выбрана нами при синтезе [ о а И ПМГ, где в качестве временной защитной группы использовали флуоренил-9-метоксикарбонильную группу (Ршос-), удаляемую обработкой пиперидином (схема 4).

Применение метода активированных эфиров в ступенчатом синтезе позволяет использовать тактику минимальной защиты функциональных групп. Так карбоксильную группу С-концевого глицина при синтезе фрагмента 1-5 защищали солеобразованием, гидроксильную группу серина при синтезе ПМГ, [Т1е10]ПМГ и [дгд12]ПМГ оставляли незащищенной (схема I), а в остальных случаях применяли трет-бу-тильную защиту (схема 2). На стадии присоединения аргинина в аналогах [Агд^ПМГ и [Агд^>12]ПМГ использовали п-нитрофениловый эфир три-карбобензоксиаргинина, а далее пептиды, содержащие аргинин, вводили в реакцию с незащищенной гуанидиновой группой (схема 2).

в1р Рго Рго в1у в!/ Бег Агд

Уа1

Не иеи РЬе

Т' ИЛ

он

ноыв

Ви

г-^нв н

гг

г-}омР н г

г4-окр н I 2

Г-ОМр Н ОВи

г

ОМр н

ОВи ОВи ОВи «Ви

ОВи ОВи ОВи ОВи ОВи ОВи

ОВи

Агд>

(он) ¡он) (он) ■

(ОН) (ОН) (ОН)

(он) (он) юн) (он) (он)

(ОН)

Схема 2. Синтез [лгд7]1ШГ и [дгд7'12]ПМГ

осс

При синтезе пептидов с С-концевым аргинином аргинин вводили в реакцию без защиты гуанидиновой и карбоксильной групп, что

значительно упрощало весь процесс синтеза, поскольку исключались

трудоемкие стадии введения и удаления соответствующих защитных групп.

На стадии выделения м-защищенных пептидов со свободным С-концевым аргинином был использован метод очистки, позволяющий избежать многократных переосаждений, трудностей, связанных с близкой растворимостью защищенных и свободных аргининеодержащих пептидов и, кроме того, при использовании данного метода отпадает необходимость введения в реакцию избытка активированных эфиров М-защищенных аминокислот. Этот метод представляет собой хроматографию на силикагеле в системе хлороформ-метанол, сущность данного метода состоит в наличии специфической сорбции на силикагеле пептидов, содержащих на С-конце свободный аргинин. Не обсуждая природу этой сорбции, необходимо отметить, что она позволяет избирательно выделять аргининеодержащие пептиды из реакционной смеси.

Конденсацию фрагментов осуществляли карбодиимидным методом в присутствии нонв либо с помощью "комплекса г" (кристаллический аддукт I М осс и 3 М НОргр). Эти методы являются фактически комбинацией метода активированных эфиров и карбодиимидного метода.

Все конденсации фрагментов, содержащих С-концевой свободный аргинин, проводили с предактивацией м-концевого пентапептида, переведением его в н-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидный либо пентафторфениловый эфир, который сразу же после выделения вводили в реакцию конденсации. Получение активированного эфира пентапептида не вызывало проблем, связаных с рацемизацией, поскольку активировался в данном случае С-концевой остаток глицина.

Конечные продукты, получаемые после удаления защитных групп ацидолитическим расщеплением бромистым водородом в трифтор-уксусной кислоте, либо, в случае отсутствия карбобензокси-защит-ной группы, трифторуксусной кислотой, подвергали очистке методом распределительной хроматографии на сефадексе с-25 или методом противоточного распределения с использованием планетной центри-

фуги в системе н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:5). Для очистки, разделения и характеризации пептидов и их фрагментов использовали также ВЭЖХ.

Кроме ПМГ и перечисленных аналогов был синтезирован и охарактеризован также ряд фрагментов для проведения физико-химических и биологических исследований. Так, например, для •'■Н-ЯМР исследований пространственной структуры ПМГ был синтезирован метиловый эфир и-кондевого пентапептида 01р-Рго-Рго-С1у-31у-ОМе, который получали обработкой метанольного раствора С1р-Рго-Рго—й1у—й1 у-ОН эфирным раствором диазометана.

Синтезированные ПМГ, его аналоги, а также все промежуточные фрагменты имели корректный аминокислотный состав, были гомогенны при контроле методами ТСХ и ВЭЖХ. Полученные соединения охарактеризованы величиной удельного вращения и температурой плавления. Структура синтезированных пептидов подтверждена спектрами ^Н-ЯМР. Для ПМГ и [Т1е]-0]ПМГ получен масс-спектр, в соответствии с которым молекулярный вес ПМГ и [т1еЮ]ПМГ равен 1125 Да, что совпадает с расчетными данными. Абсолютное содержание ПМГ в сухом веществе определяли спектрофотометрически по фенилаланину и количественным аминокислотным анализом. Среднее содержание ПМГ в образце составило 97,5%.

Основной проблемой, возникающей при синтезе ПМГ и его аналогов по схемам I и 2, является плохая растворимость С-концевых фрагментов. Начиная с С-концевых тетрапептидов, эти соединения с трудом удавалось растворять в РМР. Фрагментные конденсации в ряде случаев приходилось проводить в смеси ОМР и гексаметилтриамида фосфорной кислоты. В результате плохой растворимости С-концевых фрагментов реакции конденсации проходили не полностью, и на стадии выделения конечного продукта методом ВЭЖХ в случае [Агд7]ПМГ и [А^7'I2]ПМГ был выделен соответствующий С-концевой фрагмент.

Поэтому для [А гд^]ПМГ нами была разработана альтернативная схема синтеза, при которой разбивка на фрагменты выглядит следу-

ющим образом: [(1-5)+(6-7)]+(8-И) (схема 3). Преимущество этой схемы состоит также в том, что фрагменты (6-7) и (1-7), содержащие С-концевой свободный аргинин, можно выделять с помощью описанной выше очистки на силикагеле.

Конденсацию фрагментов (1-5) и (6-7) проводили методом активированных' эфиров (ноыв/осс) с выделением активированного эфира пентапептида, который сразу же использовали для конденсации.

Конечную конденсацию фрагментов (1-7) и (8-11) проводили дифенилфосфорилазидным (орра) методом.

1234 6 в 7 8 в 10 II

Рго Рго в!у в!у вег Агд Уа! Не 1-еи РИе

г г он н номв Ви* £>ыв н ^и1 . Ей' он он

исс, ^и1 он н ОРРА

тм, НВг

Схема 3. Альтернативная схема синтеза [дгд7]ПМГ.

При конденсации фрагментов (1-7) и (8-11) активируемым фрагментом является М-концевой гептапептид (1-7), имеющий свободный аргинин на С-конце. Этот остаток аргинина находится в виде внутренней соли и не нуждается в дополнительной подготовке к активации добавлением основания в реакционную смесь. Таким образом, проведение конденсации ОРРА-методом в данном случае имеет существенное преимущество: отсутствие избытка основания в реакционной смеси практически исключает возможность рацемизации (один из, основных недостатков азидного метода - неизбежное добавление избытка основания при контроле рН раствора). Выход на этой стадии составил 98%. Идентичность [Агд7]ПМГ, полученного по схемам 2 и 3, подтверждена ТСХ, ВЭЖХ и ^Н-ЯМР методами.

Предложенная схема синтеза может служить основой для разработки крупномасштабной схемы синтеза [Агд7]ПМГ.

3. Синтез аналогов ПМГ для введения радиоактивной метки.

3.1 Синтез ГраЬ71ПМГ. Аналог пептидного морфогена гидры для введения тритиевой метки был получен заменой остатка лизина в положении 7 на остаток 1-2, 6-диамино-4-гексиновой кислоты (эаь).

Синтез [ОаЬ7]ПМГ проводили, как показано на схеме 4.

1 г з « в в 7 в Glp Pro Pro Gly Gly Ser Dah Val

9

lle

10 11 Leu Phe

Fmoc-Fmoc ОН н ¡icc'F" Fmoc Fmoc Bu' 4>н н Вое Н Вое

КоНПЛЕ PC "F"

^ос Pipe ridln

рос КомОЛ! КС -F"

рос р|р€ -»dir

Комг»л рос

TFA

OBu OH

Схема 4. Синтез [оаЬ7]ПМГ.

Фрагменты (1-5) и (8-II) были синтезированы последовательным наращиванием пептидной цепи методом активированных эфиров (схема I). Фрагмент (1-5) вводили в реакцию конденсации после предварительного удаления z-защитной группы каталитическим гидрогенолизом над палладиевым катализатором.

L-2,6-диамино-4-гексиновую кислоту вводили в реакцию в виде производного Fmoc-L-Dah(Вос)-ОН, которое получали из Ac-L, D-Dah(ßoc)-OH. При этом был использован метод ферментативного разделения L и D изомеров. Ac-L,D-Dah(ßoc)-0H переводили в натриевую соль, добавляли фосфатный буфер (pH 7,0) и обрабатывали ацилазой. Полученная смесь Ac-D-Oah(вос)-он и H-L-Dah(ßoc)-OH

плохо поддавалась разделению методом ВЭХХ, поэтому н-1.-РаЬ(Вос)-он переводили в Ртос-1.-Оа11(Вос:)-ОН обработкой Ртос-(Ши. Смесь Ас-О-ОаЬ(Вос)-ОН и Ртос-1_-0аЬ(Вос)-ОН разделяли методом препаративной ВЭЖХ. На рисунке I представлена хроматограмма разделения этой смеси, отмечена выделяемая фракция.

Рис.1 Препаративная ВЭЖХ Ргаос-оаь(вос)-он на колонке ЗПаэогЬ ЯРИ мкм- I6 х

250 мм) в системе 0,01% водная СРзСООН (А) - метанол, содержащий 0.01% СРзСООН (В); градиент концентрации В от 50 до 100% за 40 мин.; скорость элюции 10 нл/мин.

Таким образом было получено оптически чистое производное 2,6-диамино-4-гексиновой кислоты, которое использовали в дальнейшем синтезе.

Конденсацию Ршос-ОаЬ(Вос)-ОН и фрагмента (8-11), как и все последующие конденсации, проводили с использованием в качестве конденсирующего агента "комплекса

При синтезе [ОаЬ^]ПМГ использовали следующую комбинацию защитных групп: для временной защиты ¡¿-аминогрупп была выбрана 9-флуоренилметоксикарбонильная группа (Ргаос), в качестве постоянных защитных групп при этом были использованы группы трет-бутильного типа.

Деблокирование Ртос-защитных трупп осуществляли обработкой пиперидином. Конечное удаление всех защитных групп проводили обработкой трифторуксусной кислотой. Полученный [оаЬ?]ПМГ подвер-

гали очистке методом препаративной ВЭЖХ.

Синтезированный [0аЬ7]ПМГ и промежуточные фрагменты имели корректный аминокислотный состав. Гомогенность полученных соединений проверяли методами ТСХ и ВЭЖХ в нескольких системах. Все соединения охарактеризованы величиной удельного вращения и температурой плавления. Структура [оа^ПМГ подтверждена спектром 1Н-ЯМР.

Меченный тритием ПМГ получали методом твердофазного каталитического гидрогенолиза [ОаЬ7]ПМГ при 160°С. В качестве катализатора использовали 5% Р<1 на ВаБО^ Полученный Г[ ^н] 41-у 57] ПМГ выделяли методом ВЭЖХ. Выход пептида с молярной радиоактивностью 63 Ки/ммоль составлял 26%. Тритирование пептида проведено в Институте молекулярной генетики АН СССР Д.А.Зайцевым и Ю. А. Золотаревым.

Для контроля чистоты полученного продукта нами были подобраны условия аналитического разделения ПМГ и [0аЬ7]ПМГ. Разделение осуществлялось методом ВЭЖХ на двух последовательно соединенных колонках 1)Нга$р(1еге 1Р (рис.2).

Об" 1

3. 2 Получение ПМГ. меченного тритием.

2

СН,С/7% 40

20

Рис.2 ВЭЖХ смеси: ПМГ (I) и [ОаЬ7]ПМГ (2) на двух последовательно соединенных колонках иНгаврЬеге 1Р (5 мкм, 4,6x250мм) в градиенте концентрации ацето-нитрила (20-40%) в 0,05 М КН2РО4 (рН 3,0), содержащем 5 мМ пентан-сульфонат натрия. Скорость элюции 0,5 мл/мин.

32 40 4В МИН.

Поскольку ПМГ и [[^H]4Lys7]nMr хроматографически идентичны, в подобранных условиях возможен контроль полноты тритирования [Dah7]nMr с точностью до 10%. ВЭ1Х полученного [[Зн]4Lys7]ПМГ показала отсутствие исходного [Dah7]ПМГ.

В результате, был получен меченный тритием пептид с высокой удельной активностью, который использовали для разработки радиоиммунологического и рецепторного анализов ПМГ.

3.3 Синтез аналога ПМГ для введения радиоактивной метки

Синтез аналога для введения радиоактивной метки -^5; проводили по методике, предложенной Ф.Кардино (Sandos, Швейцария). Модификации подвергали [Агд7]ПМГ, к которому присоединяли 2-(4-гидроксифенил)-этиламин карбодиимидным методом в присутствии I-гидроксибензотриазола. Полноту прохождения реакции контролировали ТСХ. В результате был получен аналог ПМГ с выходом 17%: G1 р -Pro - Pro - Gly - Gly - Ser - Arg - Val - Ile - Leu - Phe - N - 2 - (4-гидрок.сифенил) - этиламид.

Для йодирования применяли йодоген хлоргликоурил (I,3,4,6 -тетрахлордифенилгликоурил, Serva). Работа проведена ¡0.В. Милосер-довым и В.А. Тищенко в лаборатории фармакологии пептидов, ИЭК ВКНЦ АМН СССР. Полученное монойодпроизводное использовали для разработки радиоиммунологического метода количественного определения ПМГ в органах и тканях.

4. Получение конъюгатов.

Для проведения радиоиммунологического и иммуноферментного

анализов были разработаны способы направленной конъюгации ПМГ с

i

различными белками-носителями.

В качестве белков-носителей использовали бычий сывороточный альбумин (БСА) и гемоцианин (ГЦ). Конъюгацию пептида с белками-носителями проводили по £ -аминогруппе лизина обработкой глута-ровым альдегидом, по С-концевому карбоксилу - методом активиро-

ванных эфиров, предварительно получая и-окси-5-норборнен-2,3-ди-карбоксиимидный эфир защищенного по £ -аминогруппе лизина пептида. Кроме того, для получения конъюгатов по £ -аминогруппе лизина был использован метод активированных эфиров, включающий активацию карбоксильных групп предварительно сукцинилированного белка-йосителя с помощью трансэтерифицирующего реагента - n-трифтор-ацетоксисукцинимида (tfs).

5. Физико-химические исследования и компьютерный анализ пептидного морфогена гидры.

Из литературных источников следует, что для пептидного морфогена гидры характерно наличие предпочтительной пространственной структуры в водном растворе. Шаллер и сотр. полагают, что ПМГ в организме функционирует в виде комплекса с крупной молекулой белка-носителя ( 600 - 800 кДа) и что при отделении от носителя пептид быстро инактивируется за счет димеризации. В качестве экспериментального подтверждения наличия у ПМГ структуры, для которой образование димера является наиболее вероятной формой существования в водном растворе, авторы приводят расчеты вторичной структуры ПМГ по эмпирической программе Гарнье, а также спектры КД пептидного морфогена гидры в водном растворе.

Нами также был проведен компьютерный анализ аминокислотной последовательности ПМГ и его аналогов с помощью программы Гарнье (Garnier et al. 1978). Действительно, исходя из результатов расчета, можно сделать вывод о наличии у ПМГ предпочтительной вторичной структуры, а именно, 45% /3 -структуры и жесткого изгиба в N - концевой части молекулы. Более того, из наших расчетов по программе Гарнье следует, что уЗ -структура предсказывается практически во всех известных аналогах ПМГ. Исходя из этих расчетов, действительно логично предположить, что для пептида наиболее вероятным является состояние димера,при котором образуется стабилизированная, антипараллельная ß-структура за счет участия в ней пяти С-концевых аминокислотных остатков двух молекул. При этом три аминокислотных остатка в N-концевой части каждой из молекул

образуют жесткий изгиб.

Все это было бы справедливо для данного пептида в гидрофобном окружении или для данной последовательности аминокислот, входящей в состав крупной молекулы белка, поскольку программа Гарнье "Мтсгобегпе" и другие подобные программы предназначены для исследования вторичных структур крупных белковых молекул и не учитывают таких параметров, как влияние растворителя, рН раствора, температура и т.д. В данном же случае речь идет о поведении олигопептида в физиологических условиях, т.е. & водном растворе, при нейтральных рН и температуре 25°С.

Программа,' учитывающая все эти параметры и позволяющая предсказывать наиболее вероятную конформацию пептида в заданных условиях, разработана А. В. Финкелыитейном ( ин-т Белка АН СССР). В соответствии с этой программой отдельная молекула ПМГ в указанных условиях имеет лишь 1% -структуры.

Для экспериментального изучения конформации пептидного мор-фогена гидры в водном растворе мы использовали два наиболее информативных метода: КД - спектроскопию (совместно с Н.Кальни-ным, ин.Белка АН СССР) и ^Н-ЯМР спектроскопию (совместно с Н. Ф. Сепетовым, ИЭК ВКНЦ АМН СССР)

Форма полученных КД - спектров ПМГ в дистиллированной воде при концентрации Ю-3 М и температуре 25° С свидетельствовала об отсутствии упорядоченной структуры (рис.3).

205 210

220 225 230 235 240 245 250

Рис.3: I - ПМГ (С Ю-3 м, Т 25°с); 2 - ПМГ после предварительного нагревания образца до 60°С и последующего охлаждения до 25°С, что, как видно из рисунка, не влияет на форму кривой КД-спектра; 3 -ПМГ . в трифторэтаноле (С Ю-3 н, Т 25°С)

Нами также были подробно изучены ^Н-ЯМР спектры ПМГ и его [дгд7]-аналога в водном растворе (фосфатный буфер, рН 7,4).

При сравнении спектров ^Н-ЯМР ПМГ и [дгд7]ПМГ (рис.4) обращает на себя внимание тот факт, что замена остатка лизина в положении 7 на остаток аргинина практически не изменяет спектра ЯМР (за исключением изменений, прямо связанных с модификацией химической структуры).

Рис.4 Спектры %-ЯМР (500 МГц, фосфатный буфер, pH 7,4, 27°С) ПМГ (а) И [Агд7]ПМГ (б).

Это может быть объяснено либо наличием у обоих пептидов сходной пространственной структуры, либо быстрым обменом между различными возможными конфорыациями, то есть отсутствием у пептидов упорядоченной структуры. В пользу второго предположения может свидетельствовать сравнение спектров [Агд7]ПМГ и его фрагментов 1-5 и 6-II (рис.5). Для того, чтобы исключить дополнительное влияние зарядов аминогруппы (фрагмент 6-II) и карбоксила (фрагмент 1-5), были получены соответственно ацетильное производное и метиловый эфир.

Как видно из рисунка, спектр [Агд7]ПМГ представляет собой практически суперпозицию спектров к- и С-концевых фрагментов. Это может наблюдаться только в том случае, если поведение молекулы в растворе описывается набором самых различных конформаций либо если в упорядоченной структуре молекулы N- и С- концевые части

А

совершенно не взаимодействуют между собой. Последнее представляется весьма маловероятным.

А. й'Ци. Х,1

Мл ~ А. .к_/мА

Рис.5 Спектры ^К-ЯМР (500 МГц, фосфатный буфер, рН 7,4, 27°С) смеси фрагментов Ас-5ег-Агд-Уа1-11е-1.еи-РЬе-0Н И С1р-Рго-Рго-С1у-61у-0Ме (а), и [йгд^ПМГ (б).

Известно, что пептидный морфоген гидры имеет сходство в первичной структуре с брадикинином. В состав н-концевых частей обоих пептидов включена последовательность -Рго-Рго-Ыу-Х-Зег-. Был проведен анализ соответствия химических сдвигов гомологичных аминокислот, входящих в состав ПМГ и брадикинина (табл.1).

Таблица I. Значения химических сдвигов аминокислотных остатков, входящих в состав гомологичных последовательностей -Рго-Рго-С1у-пептидного морфогена гидры (ПМГ) и брадикинина (БК)*

Л /3" Г г"' Г Г

пыг 4 ,750 1,902 2 ,343 2,022 2, 022 3,737 3,553

Рго-1

БК 4 ,776 1,890 2 ,420 2,015 2, 027 3,852 3,474

ПМГ 4 ,427 1,951 2 ,317 2,067 2, 067 3,847 3,668

Рго-2

БК 4 ,443 1,920 2 ,315 2,070 2, 070 3,851 3,689

ПМГ 3 ,949 3 ,998

БК 3 ,947 3,867

* Данные о значениях химических сдвигов аминокислотных остатков брадикинина взяты из работы Оеиуэ ег а 1.1982.

Поскольку к настоящему времени считается установленным, что

молекула брадикинина в водном растворе не имеет свернутой структуры, близкое соответствие химических сдвигов гомологичных аминокислотных остатков свидетельствует в пользу того, что у ПМГ также отсутствует упорядоченная структура в водном растворе.

Рассмотрим теперь ситуацию взаимодействия пептида с рецептором. При таком взаимодействии свойства активного участка молекулы, вовлекаемого в этот процесс, однозначно определяются пространственной структурой активного центра рецептора. Очевидно, что при этом вся молекула или ее активный участок должны обладать более или менее жесткой конформацией, соответствующей по профилю активному центру рецептора (комплементарной пространственной структуре рецептора) и обеспечивающей тем самым "узнавание". При этом эффективность связывания пептида со специфическим рецептором зависит от степени комплементарности.

-Для предсказания наиболее вероятной структуры (конформации) ПМГ при взаимодействии с рецептором мы можем воспользоваться расчетами по программе Гарнье, поскольку в данном случае можно пренебречь влиянием' растворителя.

Исходя из расчетов по этой программе,- для молекулы ПМГ наиболее вероятным является образование уЗ- структуры в С - концевой части молекулы (45% р - структуры). По - видимому, именно пять С - концевых аминокислотных остатков, способных к образованию /3 -структуры взаимодействуют с гидрофобным "карманом", а точнее "щелью" рецептора, при этом возможна стабилизация как за счет гидрофобных взаимодействий, так и за счет водородных связей. Гидрофильный же участок молекулы, с положительно заряженным лизином, конформационно более подвижен и может в данном случае играть роль "якоря" при первичном взаимодействии с липидной мембраной.

Данные о биологической йТстивности ПМГ, его фрагментов и аналогов, приведенные ниже в разделе 6, находятся в соответствии с высказанным нами предположением, что именно С - концевой участок молекулы пептида вовлечен во взаимодействие со специфическим рецептором и ответственен за биологический эффект молекулы в целом.

6. Исследование биологической активности ПМГ, его фрагментов и аналогов.

Исследование биологических эффектов пептидного морфогена гидры велось по нескольким направлениям. Поскольку ПМГ был обнаружен у большинства видов животных, от гидроидов до млекопитающих и человека, логично было предположить сохранение пептидом в процессе эволюционного развития своих исходных свойств - фактора регенерации, роста и дифференцировки тканей. Вторым направлением исследований явился поиск специфического для организмов высших животных биологического действия пептидного морфогена гидры. Кроме того, поскольку известно, что первичная структура ПМГ частично гомологична первичной структуре брадикинина, была проделана работа по сопоставлению биологических эффектов этих пептидов.

Биологическое тестирование проводилось в лаборатории фармакологии пептидов ИЭК ВКНЦ АМН СССР под руководством Б.А.Виноградова, в институте биофизики АН СССР X.П.Тирасом, во 2 ММИ им. Н.И.Пирогова под руководством Г.М.Косицкого, в институте биологии развития им. Н.К.Кольцова АН СССР под руководством В. И. Миташова.

Влияние ПМГ, его фрагментов и аналогов на процессы регенерации было исследовано на следующих биологических объектах: планарии, личинки мучного хрущака, тритоны (регенерация хрусталика), крысы (регенерация печени, регенерация кожных ран). Во всех перечисленных случаях ПМГ, [Агд7]ПМГ и С-концевые фрагменть ПМГ, начиная с фрагмента (6-11) и до (9-И), оказывали явно выраженное стимулирующее действие на процесс регенерации, и-кон-цевые фрагменты не проявляли регенераторной активности. [т1еЮ]ПМГ ингибировал синтез ДНК в регенерирующей печени крыс, замедляя процессы регенерации. Аналоги с дополнительным С-конце-вым аргинином либо не обладали биологической активностью, либс имели слабо выраженный ингибируюций эффект. В результате былс подтверждено предположение, что именно С-концевая часть молекул! ответственна за проявление биологической активности молекулы з целом и выявлен минимальный активный фрагмент молекулы - С-конце-

вой трипептид Н-11е-1.еи-РЬе-0Н.

С помощью радиоиммуяологического анализа было определено содержание ПМГ в органах и тканях млекопитающих. Высокое содержание пептида наблюдалось в поджелудочной железе и гипоталамусе, несколько меньшее в гипофизе, селезенке и почке. Гипоталамическая локализация ПМГ позволила предположить, что он может оказывать влияние на процессы роста и репродуктивную систему. Было изучено влияние ПМГ и его аналогов на рост тела и некоторые гормональные показатели функционирования оси гипоталамус-гипофиз-половые железы. В результате было установлено, что ПМГ и [дгд7]ПМГ ускоряют половое созревание крыс (подтверждением этому является усиление активности ключевых ферментов метаболизма половых стероидных гормонов под влиянием ПМГ), стимулируют прибавку массы тела, стимулируют функцию щитовидной железы, что проявляется в изменении ряда ее морфофункциональных показателей (увеличении размера фоликул, количества тироцитов и др.).

В результате сопоставления биологического действия ПМГ и брадикинина был сделан вывод об отсутствии у ПМГ способности влиять на большинство из стандартных рецепторных систем периферических органов. Следует отметить, однако, наличие у ПМГ периферического брадикининпотенциирующего действия, что отражает определенную гомологию аминокислотной последовательности этих пептидов.

Проведенные биологические исследования подтвердили функциональную значимость ПМГ у млекопитающих. Показано, что с одной стороны филогенетически древний пептид сохраняет свои исходные свойства фактора регенерации у высших животных, с другой стороны обладает специфическим действием, оказывая регулирующее влияние на репродуктивную и эндокринную системмы. [дгд7]ПМГ является высокоактивным аналогом ПМГ и может быть использован в качестве синтетического стимулятора регенераторных процессов. Этот аналог в перспективе может быть использован также в качестве препарата, регулирующего функции половой и эндокринной систем. Интерес в

плане клинического применения может представлять и [Т1е1°]ПМГ. Его выраженная способность ингибировать синтез ДНК в регенерирующей ткани печени, напоминающая действие гаммаинтерферона, может быть использована для подавления новообразований.

ВЫВОДЫ

1. Классическими методами пептидной химии в растворе синтезирован пептидный морфоген гидры (ПМГ).

2. Проведены физико-химические исследования и компьютерный анализ структуры ПМГ. Показано отсутствие упорядоченной структуры у молекулы ПМГ в водном растворе. Определен минимальный активный фрагмент молекулы. На основании полученных результатов был осуществлен направленный синтез структурных аналогов ПМГ.

3. Для аргинин-содержащих аналогов разработаны схемы синтеза с использованием эффективного метода очистки м-защищенных пептидов, содержащих в качестве С-концевой аминокислоты остаток аргинина со свободными гуанидиновой и карбоксильной группами.

4. Синтезированы аналоги для введения радиоактивных меток двух типов <3Н и Получен меченный тритием ПМГ, удельная активность которого значительно превышает приводимые в литературе данные. Получены конъюгаты ПМГ с БСА и ГЦ. Все это позволило разработать радиоиммунологический, иммуноферментный и рецепторный анализы.

5. Установлена структурно-функциональная зависимость биологических свойств в ряду аналогов ПМГ. Выявлен высокоактивный аналог [Агд7]ПМГ для которого разработана оптимальная схема синтеза, позволяющая получать [Агд7]ПМГ в количествах, необходимых для проведения расширенных медико-биологических исследований.

6. Результаты биологических исследований позволяют рассматривать пептидный морфоген гидры и его [Агд7]-аналог в качестве потенциальных лекарственных препаратов.

Основное содержание диссертации отражено в работах:

1. Рубина А. Ю., Беспалова I. Д., Сепетов Н. Ф., Исакова 0. Л., Титов М.И. Синтез и исследование пептидного морфогена гидры.// VII Всесоюзный симпозиум по химии белков и пептидов.: Тез.докл.-Таллинн, 1987. - С. 232-233.

2. Рубина А.Ю. Синтез и исследование пептидного морфогена гидры и его аналога для введения тритиевой метки. // Онтогенез. -1988. - Т. 19, N 5. - С. 550.

3. Рубина А. Ю., Беспалова Х.Д., Сепетов Н.Ф., Исакова 0. Л., Молокоедов A.C., Титов М.И., Зайцев Д.А., Золотарев Ю.А. Синтез и исследование пептидного морфогена гидры. // Биоорган.химия.-1988.

- Т. 14, N 7. - С. 869-877.

4. Кривошеев 0.Г., Дегтярь В.Г., Милосердов Ю.В., Рубина А.Ю. ,^Титов М.И., Виноградов В.А. Влияние нового пептида -морфогена гидры на репродуктивную систему крыс. .// Онтогенез. -1985. - Т. 16, N 5. - С. 34

5. Ярыгин К. Н.,. Казимирский А. Н., Косицкий Г. И., Рубина А.Ю., Виноградов В.А., Пылаев А. С. Модуляция активности орнитин-декарбоксилазы в нормальной и регенерирующей печени крыс различными дозами пептидного морфогена гидры. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1986. - Т. 101, N 6.- С. 680-682.

6. Григорян Э.Н. , Мальчевская И.Е., Миташов В. И., Титов М.И. , Рубина А.Ю., Виноградов Б.А. Стимуляция регенерации хрусталика из клеток вентральной радужки тритонов. // Онтогенез.

- 1987. - Т. 18, N 6. - С. 605-613.

7. Казимирский А.Н., Ярыгин К. Н., Косицкий Г. И., Рубина А.Ю., Виноградов В.А., Пылаев А.С. Влияние низких доз пептидного морфогена гидры на биосинтез белка в интактной и регенирирующей печени крыс. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.

- 1988. - N 4. - С. 424-426.

8. Спевак С.Е., Соловьева А.И., Рубина А. Ю., Беспалова Ж. Д. Пептидный морфоген гидры и его фрагменты в регенерации ран у

крыс. // Онтогенез.. - 1988. - Т. 19, n 5. - С. 552.

9. Тирас X. П., Рубина А.Ю., Милосердов Ю. В., Тищенко В.А. Морфоген гидры - возможный эндогенный регулятор регенерации планарий. // В кн. Морфогенетически активные вещества.- Пущино.: НЦБИ, 1990,- с. 134-145.

10. A.C. I486I26 А I (СССР), МКИ4 A0IK 61/00. Способ получения половых продуктов от карповых рыб. Бурлаков А. Б., Титов М. И., Виноградов В. А., Беспалова Ж. Д., Крымов А. П., Рубина А. Ю., Зуморин A.B., Годович П.Л., Шмаков А.Н., Шило А.П., Демченко Б. И., Милосердов Ю.В., Екутич А. С. (СССР). 4319607/28-13 (СССР); заявлено 22.10.87; опубл. 15.06.89; бюл. n 22. - 20 с.

Тираж ПО экз.

Бесплатно

ВНИИ

Заказ №¿0/