Синтез и изучение пептидов, родственных дерморфину тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

московский ордш ленина, ордена трудового красного знанени и ордена октябрьской революции государственный университет

тни и.в. Ломоносова

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

КАРСТЕН ГРЁГЕР

удк

смнте8 И и8ученив пептидов, родственных дшоршу

Специальность 02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных а фиаиологичаокн акгиваых веществ

АВТОРЕФЕРАТ диооертации ив соиоканме ученой слеповд кандидата химических наук

иоокяа - 1990

Работа выполнена на кафедре хшим природных соединений Химического факультета МГУ им, М.В.Ломоносова.

«

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

K1.II. 1!13А!КИЯ

кавдвдат химических наук, старший научны.": сотрудник Г. A. K0PiliyiI0i3A

г>

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор.,

l-.ü. ;.sroi:i

кандидат медицинских наук P.fJ. ¡üXAiiAlICÜ

Ведущая организащш: «»статут бпооргашгческой гол. ;«.!-!.Шемдкша Ali СССР

Занята состоится 2 ноября 1390 г. в ¿6 час, "i яаооданш Специализированного совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственной университете им. М.В. Ломоносо 'по адресу: Москва, В-234, Ленинские гори, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитории 501.

Автореферат разослан " h " ô'rtTjtçtyX^ ¿990 г.

/

Учений секретарь Специализированного совета кандидат хгашческих наук, доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблем». Нейропептиды широко распространены в природе и играют вакну» роль в процессах жизнедеятельное in. Среди йАйропоптидоа особое вникание исследователе 11 привлек в последние годы гептапептид дерморфин, обнаруживший высокую анальгетичеокую • активность.

В настоящее время осуществлен синтез дерморфина и ведется интенсивна»! рз боив по получению и исследованию различных структурных аналогов этого природного нвйроиептида.

Наряду с дериор'$инои, интересные (фармакологические свойства проявил родственный нейропептид дельторфин.

Однако до сих пор систематические исследования по влиянию на активность дерморфина и дельторфина хииичо" ,, модификации «ли замещений отдельных амииокислотшх остатков проводились недостаточно.

Поэтому весьма актуальной проблемой является разработка методов синтеза аналогов дерморфина и дельторфина и иослолоьоние их . биологических и фармакологических свойств.

. Цель работа. В настоящей работе мы поставили своей целью осуществить целенаправленный синтез и изучить свойстве неизвестных ранее структурных аналогов дерморфина и дольторфнна.

Научная новизна-и практическая значимость работа. В результате проведенного исследования синтезированы новые структурные аналоги дерморфина, отличающиеся от'природного нейропептида модификацией остатка тирозина в положении I, либо его замощением на остатки нуклеоаминокислот. Осуществлен синтез серии укороченных аналогов дерморфина, содержащих аминокисдртные остатки с изменяющейся степень«! гвдрофобности. Синтезирована новые структурные аналоги дельторфина, отличающиеся от .природного пептидазамещениями эиипо-кислотшх остатков в положениях 2,4,5 и 6. В тестах in vitro установлено, что получение синтетические аналоги дерморфина способ-

ны специфически связываться с опватныыи рецепторами, приЧей« «не торые новые пептиды обладают высокой 6 -селективностью'. В orrtfT&x in vivo обнаружено, чго ряд аналогов деркорфина являются еитгпчЖиО тэим дэрморфмна и могут существенно изменять анальготическую tftfTift ность природного нейропептида. Покавано также, что замещение ctótffft ка тирозина в положения I на остатки нуклеоашшокислот приводит*6» аналогам дерморфина, проявляющим анальгетическую активность. ■•

Результаты нас?Ъящего исследования имеют общий характер и^йв-гут бмть испольаолаан при дальнейших исследованиях по синтеаулЬЙ5г овдшх пептидов к их аналогов, а также при изучении закономерностей связи между структурой и активностью нейропептидов.

Апробзция работы. Материалы диссертации докладывались "на Всесоюзной симпозиуме по химии пептидов (Рига, 1990 г.).

Ст1№'.ура и объем работы. Диссертация состоит иа введения, обзора литоратуры, посвященного изучению структурно-фуккциональ-, ных отношений в ряду аналогов дерморфинз и дельторфина, обсужден» результатов, экспериментальной части, выводов м списка литератур! Работа содерю!Т1бО страниц машинописного текста, включая тз< лиц, II схои, 2 рисунка и список цитируемой литературы ( 140 сен, лек ) .

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ I. Синтез гептапептидных аналогов дерморфина Дерморфин представляет собой природный гептапаптид строения

* т,

n~Tyr-v-AiA-Phe~aiy-Tyr-Pro-ser-nH2. В структурном отношении этот нейропелтид интересен тем, что в положении 2 пептидной цеп» аминокислотный остаток аланина имеет о-конфигурацию. Дериорфиа

относится к классу опиоидных пепти»"" обдадает исключительно i --—.

оцесь и далее, если не у ia аминокислотные оста:

ки i - ряда.

сокой энальгетической активностью. Наиболее вакшы для проявлен«« биологической активности дерморфша является и-концевой остаток тирозина. Модификация остатка тирозина-! в большинстве случаев по д?ла аналогов дериорфияа с внсохой биологической активность?). Однако ряд соединений, содержащих остатки основных аиинокнслот, обладают анальгетической активностью, пропивающей активность де4;морфина в опытах in vivo. Билет также'показано, что остаток тирозина-5 в дерцорфииэ MOS6T бить с успехом заменен.на остатки нуклаоашто-кислот. 7

Поэтому в настоящей работе ш поставили своей 'задачей, осуцест вить синтез и изучить свойства серии гептапептидшх аналогов дар-иорфипа, содержащих в положении I остатки модифицированных аминокислот 'и нуклеоаминокислот, сходных по структуре с тпро&инои:

' H-x-T>-Ala-rhe-Gly-Tyr-Pro-Ser-í!H2, ГД6 X = Туг (I), Туз.- (3HH¿) (II), Туг (ЗМ02) (III), Pile (4NH2) (IV), Tal (V), Ual (VI), Kua (VII).

Аналоги I-УП были получены твердофазный пептидна:' синтезом с использование!! бензгздриламииной сиолы (.EHА) с 2% сшивки. Пептидную цепь наравдвали с С-конца (схещ I). Реакции конденсации озу-цествляли с помоць» предварительно приготовленных 1-гядроксибензо-триазоловнх акгивироьаншх эфнров :t" -защищенных о «инок пел от. Аминогруппа защищали трет.-бутилоксикарбонильноп группировке:!, а гидроксилыше группы гирозииа и серина - бонзишнип группировкой. Для отцвилопия пептидов от носителя использовали смесь три^тормо-тансульфокиолоты, дииетилсульфида и трифторуксусной кислоты.

Все целевые гентапептиды были очищены с поиощьо голь-фнль'.ра-ции ка Сефадексах g-io и ut-20, Строение и индивидуальность полученных соединений подтверждены данныии аминокислотного анализа, ТСХ и ВЭйХ. Сведения о некоторых константах и выходах rerw.;-неп-ригллх ан;лг,гс:; j^puopí-1;«" пгяготаьданн а тас.м.це I.

V -Ala

Phe

Gly

Схема I.

туг

Pro

Ser

Вое

Soc

Вое -Вое -OBt н-

«

Вое Вое -OBt к

Вое Бос OBt H

TFMSA

Вое Бос Bt H

TFA

ÏFA

DM S

Boc Во с

Bt н-

TFA

TFA

TFA

Boe

БНА

14

Boc

TFA

■OBt H

TFA

TFA

OSt Sil ~ BHA

Bzl

к— а«л.

— ВЙА ч821 .

— BHA 4Bzl

— ВНА 4Bzl

— ВНА 4Bzl

ВНА

Bzl

— B HA

4Bzl

— В HA SBzl

— BHA

w

BHA BilA

'Bzl

BHA

Bzl

BHA

Bzl

NH„

X = Туг (I), Туг(ЗИН2) (XX), Tyr(3N02) (ИГ), Pile (IV), Tal (V), Ual. (VI), Hua (VII).

2. Синтез' пентапептидных аналогов дерморфина

С целью исследования влияния положительного заряда и гидро-фобности молекулы на связывание с/*'- и <f -опиатными рецепторами проведен синтез серии пентапептидных аналогов дерморфина, содерж£ щих аминокислотные остатки с изменяющейся степенью гидрофобности;

H-Tyr-0-Ala-Phe-Gly-Tyr-NH^ (VIII), H-Tyr-o-Ala-Tyr-Tyr-Tyr-lIHg (1

о

i

Таблица I. с

Константы и выход гептапептвдных аналогов дерморфина

Соединение

!Т.пл.,°С!ТСХ, к£ в !гй1 1 Бых0Д Цразл.) ! системах !1си и ! % ! ! „ 2»! ,3* ! (с1 ,КеОН) !

Н-Туг-т>-А1з-РЬе-СХу-Тут-Рго-Зег-КН2 ; (I) 151-153 0. 22 0, ,79 -0, 2° 364*

Н-Туг(ЗКН2)-&-А1а-РЬе-С1у-Туг-Рго-г ег- (XI) 172-173 о, 18 0, ,88 + 1 . 3° 62

Н-Туг(ЗИО )-э-А1а-РЬе-в1у-Гуг-Гго-Зег- ■КК2 (III) 173-175 0. 28 0, ,76 -б, 1° 55

Н-РЬе(4КН„)-1—А1а-РЬе-31у—Туг-Рго—Б ег—НН - (IV) 159-161 о, 14 0, ,90 + 1 . 8° 52

Н-Та1-1>-А1а-РЬе-а1у-Туг-Гго-£ег-ЛгК 2 • (V) 180-181 о, 29 0, ,86 -в, 8° 4*

3-Ца1-г-А1а-РЬе-С1у-Туг-Рго-Зег-КН2 (VI) 193-195 0, 25 0, ,88 -4, до 3.5

Я-Ниа-Т>-А1а-ГЬе-С1у-Туг-Рго-Зег-КНг (VII) 189-191 0, 30 0, .87 -в. 0° 4* 31

В виде ацетата.

""Состав системы 2: 1-6^/анол-водз-уксусная кислота (4:1:1). **Ъостаз скстеш 3: 2-пропанол-да он - всдз (14:1:5).

и

расчете на неходкое количество аминогрупп на поли'-'-зре.

- б -

Н-Туг-э-Ala-l'he-PhG-Phe-HHg (х), Н-Т>-т-в-А1а-РПетРПе-Туг-ВН2 (Хх), H-Tyr-T-Het-Piie-Piie-Phe-WHa (хгг), Ji-Tyr-t>-Arg-Phe-Phe-Piie-MH2 (XI lit) ll-Tyr-D-AÍ a-Phe-»-I'he-Phe-N»2 (XIV) , H-Tyr-2)-Ala-Phe-Plie( 3?") -Viie-JW^ (XV), H-Tyr-T-Ala-Phe-Phe(4HH2)-Phe-NH2 (XVl), H-Tyr(3NH )-j»-Ala-Phe-Phe-Phe-NUg (XVII), H-Phe(4WH2)-J?-Ala-Phe-Phs-Phc-NHa {xvm)¡, H-Tyr-u-Aln-Phe-Phe-Phe-NKAd (XiX), H-Tyr-v-Ala-Phe-Phe-Phe-KHCJi^ii (XX), U-Phe(4JlH2)-a-Ala-Phe-Fhe-phe-HHCH2-Ph (xxx), n-Tyr-s-Ala-Phe-Arg-Tyr-MH2 (XXII), H-'Vyr-Arg-Phe-Artj-Tyr-,\TH2 (XXIII), H-Tyr-i>-Arg~Rb Arg-Tyr-HH (XXIV).

Пептиды (УЩ-Я1 и ХХП-ХХ1У) синтезировали твердофазным методом, последовательно наращивая цепь с С-кокца с использованием бензгид-рилампнового полимера (0,65 «экв аминогрупп/ir) (схема 2).

Схема 2.

Туг

D -Ala

Pht

Arg

Вое

Soc

Вое

Вое

- ОН H Bzl

Bzl

X

Bzl

Вое — BOG OH H

HP'. PMS ■

Вое Вое он H

rFA/LCM

pCÇ.HOBt

TFA/ЬСИ

p-cresole

Туг

Boc -U- ОН

DCC,HOBt I Bzl Зое' -j^- BHA

ГГА/DCli

ou Tos

H -

PCC,HOBt

Tos

туа/dcm

Tos

DCC, HOBt

Tos

TFA/PCM

Tos

Tos

Tos

Тоз

к

BHA Bzl

BHA Bzl r- BHA Bzl

— BHA Bzl

— BHA Bzl

<- BHA

Bzl Г- BHA

Bzl e BHA Bzl ■ BHA Bzl ' NH_

\

Для защиты н" -аминогрупп использовали трет.-бутил-лжоикар-бонильнув группировку, которую затем удаляли 50;^-ним растворои трм-фторукоуоной кислоты в дихлорметане. Гидроксильну« группу тирозина защищали бензильной группой, а гуаниднновую группу аргинина - то-ЗГ(ЛЪН0Й группировкой, которые снижали одновременно с отцепленной пептида от полимерного носителя. В качестве конденсирующего агента использовали дициклогексилкарбодшшид с добавкой эквимоляриого количества 1-гидроксибензотриазола. Пептиды снимали с полимера обработкой фтористым водородом в присутствии протекторов (диыетилсуль-фид, пара-крезол). ^

Пептида ХП в Х1У-ХХ1 получали способом фрагментной конденсации по схеме 3, с применением карбодиимидного метода с добавкой 1-гидроксибензотриазола. Для защиты аминогрупп аминокислот использовали трет-бутилоксикарбонильную группировку, чонцевив кэрбоксиль-ние группы защищали ^тарификацией. Применявшаяся схема синтеза показана на примере получения соединения ХЛ (схема 3).

СХ!: 3.

Туг

V-.net

РНе

РЬе

рне

Вое Вое Вое Вое Н

Вое Вое Н Н

он

тга/ьсн

рсс.новг

он

ОЕГ ОЕС

ОЬЧ Вое -ОЕГ Ьос -ОН 11 -

цсс,новг

ТРА/ДОМ

он

тра/ьсм

ИНа нн? кн£

нн.

Указанная схема синтеза предусматривала получение амида фенил-апапина и замещенных амидов фонила лапша. Синтез амида фе-нигйланп-на вели через пеитафторфениловий афир ■ и-трет.-бутилоасикарбоиил-I.-фенилалвпипа с поолзд.'О'.ий во8дби<тием него ьод:,пго счел-,н

н

аммиака в сысса с деоксвноу, Всс-грулду .сншяди 4 н, раствором ~ хлористого водорода в диоксоне. Замеченные амида фенилаланина,ш>-луча ли с помогав дивдюгорексстякарбодиикидз в {г рисутстрт! 1-гидро-окскбснзотриагола, Зосг-грулпу снимали 50,%-ным раствором трифтойу: сусной кислоты в дихлоркетане. Соединение ХЗ получали ковдевсйдаи вос-туг-ои и к~1>-лгд-рье-р?;в-рне-кн2 в присутствии, дидавдоувз сялкарбодиииидз к 1^гпдро:ссибензотриазолз,

Все целевые "онтапептпдь: были очкцекк переосаадедае:!-жхз? фильтрацией. Строение и кндквидуадьносгь.-полу-чеетых аналогов дер иорфйна подтвергдоны аминокислотный авззшзои, -данными ТСХ и ВЭД Сведения о некоторых константах и выходах-лентапептидных аналого: дер;,:орфина представлены з таблицах 2.и.'5.

3. Синтез гептапептидшх пкзлогоз дельтовфина

С целью нзучеаяц 'взаимосвязи' иекду структурой и бкологическ функцией нового природвргэ аналого дорморфина - дельторфина •» мы осуществили синтез последнего: (ХХУ) я ряда его гептапептидных ан логов с заменами, аьтноккслотшх оеззздвкг з вряояопз.'т Р.4,5 или а именно; н-туг-р-маг-рье-К15-ье»-кеСг^р^я552 (XXV), н»ту ■ Н1э-г1-еи-Ие1:-Л8р-.ИН2 (XXVI), Н-Туг-»-А1а-рг-,ег.К45-Ье»-Кв1^Азр-Шг (XXVII.)Н-тТуг-г-ИеС-Р11е-и1з-1-е.и-1.еи-Азр-*»Ч12 (ХХПИ). рЬе-К1з-Туг-МеГ-Лзр-ЛИ2 (XXIX), Н-Туг-Э-Хо^РЬе-К^з-Туг-иш-Азр-К] (ххх); •11-Туг-'1)-Мв^РПе-РЬе-Туг-1.еи-А5р-МН2 (XXXI), С1у-Туг-КеГ-Лзр-^гН2 (XXXII). ' : : . .

Мы зыбраяи -для синтеза карбодкиииднай. метод- с добавкой 1-ги, роксибакэотриазола, а такие «етод активированных эфиров, так как эти истоды наиболее эффокгивны и отличэится'низкой степенью раца иизации. Соединения ХХУ-ХХХ1 получали способов фрзгмонтной конде сации по схеме 4.-Для эавдоты аминогрупп использовали Вос-группу. С-концевые карбоксильные группа заада.ли с помощью этерификации.

" Таблица 2-,

Константы и выход пентапвптидшх аюлогов двр«ор$ина, полученных твордофазянм методом синтеза

Соединение* !C<¡ ¡ !(С1,вода)! !'TCX i i» B систе 2 rax 3 i

H-TyT-TJ-Ala-Phe-Gly-iyr-NHg (VIII) +25,9o 0, 14 0, ,66 0,86 35

H-Tyr-í-Ala-Tyr-Tyr-Tyr-NHg (IX) + 6,6° 0, 20 0, ,77 0,95 28

H-Tyr-O-Ala-Pbe-Phe-Phe-KH (X) + 13,4o4* 0, 24 0, ,78 0,93 20

H-Tyr-D_A1 a-Phe-Phe-Tyr- NH (XI) + 8,2o4* 0, i ¡r 0, ,&3 0,85 27

Н-Туг-Б-Al a-Phe-Arg-Tyr-KH 0 (XXII) +12,6° 0, 10 0, ,26 0,36 30

H-Tyr-Arg-Phc- 4гд_Туг-:;н (XXIII) -11,9o 0, 04 0, ,10 0,08 25

H-Tyr-D-Arg-Phe-Arg-Tyr-I.TH2 (XXIV) + 6,6« 0. 05 0, ,10 0,08 16

*■> В виде ацетата.

Состав систеии I: хлоро$орк-иеганол (4:1).

з»)

Зуход в расчете на ксх'-дпое количество амллогрутш 2:а полимере.

' Кетэяол.

Таблзаз 3.

Константы и выход пактапвптаднах аналогов дердорфняа, полученных мзтодом фрагментов конденсации

Соединение* • С°0{р(С1| !ТСХ 2£ ¡растворитель.' 2 з систешх! 3 ! Выход,

(XIX) +11,Зв(в«ш) 0,81 0,89 71

К-Туг-х'-Агд-Рке-?Ье-РЬе~1Ш2 (XIII) •»•17,6'>(Е10Н) 0,40 0,91 42

Н-Туг-г-А1а-Рйе-1?-РЬе-РЬе-КН2 (XIV) +14.8°(КеОН) 0,85 0,95 51

Н-Туг-Т!-А1а-Рйе-РПе { ЗГ)-РЬе-КН2 (XV) +10,б°(ме0н) 0,89 0,85 64

Н-Туг-0-А1а-РПе-РПе(4гШ2)-РЬе-1Шг (г/1) + 7,1С(МС0Н) 0,65 0,93 27

Н-Тут(3}Ш2)-Г-А1а-РЬе-РЬе-Р:1е-{Шг + 4,б°(Ие0Н) 0,70 0,87 63

Н-РЬе (41Ш2)-®-А1а-РЬе-РЬе-РЬе-КН2 (XVIII) + 5.1в(Е«)Н) 0,55 0,89 49

К-Туг-о-А1а-РЬе-РЬе-РЬе-КНАа (XIX) +22,1"(СИР) 0,92 0,94 72

Н-Туг-о-А1а-РНе-РЬе-РЬе-ШСНгРЬ (XX) + б,8°(Ш-1Г) 0>94 .0,91 64

Н-РЬе(4;Ш2)-0-АХа-Рйе-РЬе-РЬе-:П-;СН2РЬ (XXI) + 4,?°(Е10Н) 0,95 52

о ■

*'В виде ацетата.

Ридрокеияькую группу тирозина и имидазолькое кольцо гистидииа но защипли. Задшяшшнй г»-концевой тетрапептид полупали способом фрагментной конденсации по схеме 3+1 методом активированных офиров с использование« пентафторфенола (схема Зацищешшй С-копцовой ярипептид получали последовательным нарощивонием цепи с С-конца карбодиинидяыы методой. Фрагиоптную конденсацию по схскс 4+3 (схо-ка 4) осуществляли с помощью дициклогексилкарбодиимида с добавкой

в

1-гидроксибонзотриазола в абсолютном дииетилформзмиде.

Схема

Туг

1> -Met

Вое Вое Вое Во с Вое Вое Вое Вое

Вое Вое

он н

Phe His

ОМе

Ьеи

Ис^

А<зр

- ОН Н

ВСа<>Ю1Ц оме тта/рси

fCC,HOBt

он

pCC.PfpOH

он

ОНе ОНе

он

OPfp н

DCC

TFA

-Olle Вое

Оме Вое

ОН н HODt

он

оси

Вое Вое

он н

Вое — DCC.PfpO Doc -

NU ОН

4

вое tfa/dcm

- он

DCC,НОВt

гтл/рсм

— Ol! i Böl

— OPfp BSl

N11.

Bzl

---N11

Bzl

- !IH Bzl

- na

Bzl

- NU Uz).

- !Ш Bzl

- NH Bzl^

- Uli

ШГ

Соединений ХХХП получали с помощью фрагментной конденсации, ИСХОДЯ ИЗ ВоС-Туг-В-А1а-РЬе-01у-Туг-0Н И Н-»еЬ-Аяр(Вг1)-Ш1 . Конденсация осуществляли в растворе с использованием дициклогск-силкарбодиимида и 1-гидроксибонзотриазола.

Все целевые пептиды (ХХУ-ХХХП) била очищены гель-фнльтрлциой на Сефадексе я-ю и перекристаллизацией. Строагпте и нндивидуллг.-

ность полученных соединений подтверждены аминокислотным анализов~ и данными ТСХ, Константы и выход гептапептидных аналогов дельтор^ фина представлены в таблице Ь. •

4. Закономерности связи между структурой и активностью аналогов дершрфита и деяьторфчна

Все синтезированные соединения (1-ХХХП) исследовали на связывание о центральными опиатныыи рецепторами, содержащимися'в гомо-генате мозга крысы с помощью радиорецепторного анализа (РРА) в тестах in vitro и на анальгетическую активность в опытах in vive

При радиорецепторном анализе в качестве специфических /I -и <f-опиатных лигандов использовали меченные тритием dago» и dadle» соответственно,

Анальгетическое действие аналогов дерморфина и дельторфииа оценивали в опытах на белых беспородных мышах с помощью модифицированного метода Гафнера при интрацистернальном введении.

Результаты исследования влияния положительного заряда молекулы на ее активность и на селективность пентапептидных аналогов дериорфина прадотавлены в таблице 5. Включение остатков положите«] но вараженных зиинокислот приводит в большинстве случаев к аналогам с повышенной /< -селективностью (соединения ХЩ, ХУ1, ХХШ, XXI по сравнению о л-концевыи пентапептидом дерморфина (УШ). Замена розниц в положении 1 на остатки положительно заряженных аминокислот привела к неактивным соединениям (ХЛ1, ХУШ). Пептиды, содержа щие остатки положительно варякенных аминокислот во втором и четве том положениях, обладают наибольшей -рецопторной селективность (акачание /</<f & 0,3). При одновременном увеличении положительного ааряда и гидрофобноети молекулы было получено соединение ХШ, которое обладает высоким сродством и селективностью к /*■ -рецепте рйм. Соединения ХУ1 и Ш не проявляли анальгетическую активность

»

Таблпаз

Константы и ïïКОД гзптзпептидншс aналorоз дельторфина

Соединение11

ГОЗ ê5 1 ТСХ, Rf в системах Выход, 1(С1,ЫеОН)1 12 3 1 %

H-Tyr-,D-Het-Phe-His-Leu-Ket-Asp-KHg (XXV) +12,2" 0,03 0,10 0,70 87

H-Tyr-Ka t-Phe~Hi S-Leu-Ke t-Аз p~ÎJH2 (XXVI) - 3.2° 0,03 0.07 0,70 55

H-Tyr-D-Ala-Phe-Hiä-Leu-Kst-Asp-KHj ■ (XXVII) - 0.6" 0,05 0,14 0.72 71

H-Tyr-iy-Kat-Phe-His-Leu-Li;u-Aîp-HH2 (XXVIII) - 4,0° 0,04 Q, 24 0.71 53

H-iTyr-t)-í!st-Phe-Kis—Тут-Hôt-Asp—¡íHg (XXIX) + i,¿a Q.Q7 0.30 0.74 79

H-Tyr-H-Mat-Phe-His-Tyr-Lsu-Asp-ííHg (XXX) + 2,7° 0,05 0.29 0.73 84

H-Tyr-O-Met-Phc-Phe-Tyr-Leu-Asp-í.'Hg (XXXI) - 3,7° 0.11 0.35 0,75 78

H-Tyr-s-Ala-Phe-CJly-Tyr-Ket-Asp-Iffig . (XXXII) - 1 ,9" 0,05 0,57 0.76 80 ■

VM I

зиде ацетата.

Таблица 5.

Акти'ыгос.т!. пвнхапептвдннх аналогов деукор$пна, содеркзЕЩ; остатки по;то:-::-гтсльно ззрягекккх

аиивокислот

Сое дине ние"1

ю50 (нм)

3 |

} 1>А&0* { БАБЬЕ*

I !Констакта ¡Ан&лъгезкя, Г УсГ ! ностк пеп-!, г5.9„,....г

к-Т>т-1>-А5 а-РЬе-31у-Туг-КН2

итуг-Агд-РЬе~Агд-Туг-ИНг

-Туг-в-Агд-Мге-Агд-Туг-ш^

Н-Туг-г>-Аг£?-РЬе-Рйе-РЬе-1гн2

Н-'Г)а--»-А1а-РЬе-1>Ье(4КН2)-РЬе-КН2

Й-Зут( ЗНН2 )-г>-Айа-РЬе-РЬе-РЬе-КНг

В-РЬе{4КН.)-Р-А1а-РЬе-РКе-РЬе-НК.

2 2

(VIII) 2,9+0,9

(XXII) 77+11

(XXIII) 142+29

(XXIV) 18+3,5 (XIII) 5.7+1,7

(XVI) 12,5+ЗГ,€

(XVII) >1ООО

(XVIII) 146+71

10,6+2,8 0,27 6,3

254+63 0,30 5,3

2177+201 0,06 5.0

686+137 0,03 4,9

59+18 0,10 5,8

206+47 0,06 6,4

5092+139 -

903+81 0,16 6,1

0,4(0,1-1,1) 10(3-33) 6(1-35) 0,9(0,3-2,3) ЗС2-&) 2© 4(г-то) 20

I

■"■'В виде ацетата. 2) Тх - Т

С* «

, где Тх - время выхода пептида В32Х.,шггазричге-ОБз •■'.''{10x250' ки, 5 нет); эдцция: градиент вода - метанол ; Т0 - вреня кассда свободного объе»_га. .

Таблица -6»

Активность гсектапептидкых анзлогоз дериорфяна

— — .-М. 1 — 1 - .... ..,-1. - || - — ———- 1, 1 II.— Соединение \ 1 1С50 | РАСО» (НИ) | БАБЬЕ* 1 ! ИЛ 1 - ! К' ! Анальгезия, 1 (нм/мыыъ).

Н-Туг-и-А1а-Туг-Туг-Туг-НН (IX) 13,7+4,2 305+39 0,04 5,8 8(1-57)

Н-Туг-э-А1а-РЬе-РЬе-Рйе-НН2 ■ (х) О,9+0,1 5.2+1,5 0,17 7,2 9(1-61)

Н-Туг-о-А1а-РЬе-РЬе-Туг-ИН ' (XI) 11,4+2,8 457+67 0,02 5,6 8(1-47) '

н-Туг-в-м^-РЬе-РЬе-РПе-нн (XII) 12,0+6,0 516+54 0,02 6.9 7(2-41) ,

Н-Туг-э-А1а-РЬе-о-РЬе-Р!1е-;;н2 (XIV) 5,1 + 2,7 24_*4 0,25 7.3 16(4-27)

Н-Туг-в-А1а-РЬе-Рйе(ЗК )-РЬе-Ш2 (XV) 1,3+0.7 15,3+1.6 0,03 7.2 14(3-31)

Н-Туг-з-А1а-Рйе-РЬе-РЬе-^/НСН2Рп (XX) 1,7+0,3 1,1+0,8 1.54 8.4 20

Н-РЬе ( 4НН) -г -А1 а-РЬ-а-РЬе-РЬе-:1НСН2РЬ • (XXI) 23,8+6,3 16,1+7,1 1 .65 7.5 20

БАСО 1,1+0,3 77,2+5,2 0,01 - -

^ В виде ацетата.

о

в концентрациях до 20 яИ/шмь. Наиболее сильным анальгетвчеекиы \ свойством обладает соединение ХХ1У, вызывающее пролонгированную анальгезию в течение 3 часов.

Результаты изучения влияния гидрофобности на связывание с опиатними рецепторами и на анальгетическую активность лентапептид ных аюлогов дорморфина представлены в таблице б. Постепенное уве личенио гидрофобности.(соединения IX, XI, X) приводит к увеличени сродства Су" -рецепторами. Включение й положения 4 и 5 гидрофобнь яамастителей (соединения X, Х1У и ХУ) и одновременное включение гидрофобных групп на С-конце ('соединение XX) благоприятно сказала ется на взаимодействии с /* -опиатними рецепторами. Пентапептиды 1Х-ХП, Х1У и ХУ обладали низкой аналъгетиЧеской активностью, а соединения XX и XXI не проявляли анальгетическую активность в koi цонтрициях до 20 нИ/мышь. ' 4

Пеитопептидныо аналоги дерморфина, показавшие высокое с роде: во к /с-рецепторам и не активные.in vivo (соединения X, Х1У, X, ХУШ-ХХ1), изучали на присутствие антагонистических свойств. Анта гониетическое действие пептидов оценивали по конкурентному дейот вию в опытах на белых беспородных мышах, nynfu внутримозгового введения изотонического раствора дерморфина и исследуемого пепти да в разных соотношениях. Результаты проведенных экспериментов представлены в таблице 7. Все представленные в таблице 7 пептидь существенно снижают анальгетическую активность дерморфина. Наибе ший эффект наблюдается у соединений (Х1У, XIX и XXI).

Из анализа взаимоотношений структуры и активности пентапеп-тидшх аналогов дорморфина (таблицы 5, б и 7) следует, что пели нив аналоги, содержащие в положениях^ и .5 остатки либо фенилалг ни на, либо модифицированного фенила лани на являютоя антагониоташ дврыорфинвг. и. могу* существенно сникать анальгетическую активное: последнего.

Таблица 7.

Антагонистическая активность пентапептиднъгх аналогов дерморфина

¡Константа ин-l Отн.

Соединение ¡гибирозашш HK50 (nii) ! акт !

H-Tyr-d-Ala-Phe-Phe-Phc-:;il2 (x) 0,15+0,01. 55

fi-iyr-s-Ala-^he-c-Piie-Phe-NHg (XIV) 0,08+0,02 100

' * H-Tyr-p-Ala-Phe-Phe(3F)-Phe-KH2 (XV) 0,I4+0-,04 - 50

H-Phe(4NH2)-P-Ala-Phe-Phe-Phe-KH2 (xvm)0,I8+0,05 '+5

H-Tyr-B-Ala-Phe-Phe-Phe-NHAd (XIX) 0,07+0,02 115

H-Tyr-S-Ala-Phe-Fhe-Phe-NHCHg-Ph (XX) 0,11+0,03 70

H-Phe(4NH2)-D-Ala-Phe-Phe-Phe-HHCH^Fh (XXI) 0,09+0,03 SO

налоксоп 0,08+0,02 ICO

Результаты исследования гептапептидных аналогов дерморфина, в которых остаток тирозинз в положении I был заиопон на остаток модифицированных аминокислот (ПЛУ) или на остатки нуклеооюшокис-лот (J-lTt), представлены в таблице 8. Замена остатка тирозина-I на остатки модифицированных аминокислот (П-1У) приводит к снижению связывания с /л - и <f -рецепторами.Нуклеоаминокислотнне апологи дерморфина (У-УП) теряют способность специфически связываться с опизтными рецепторе га. Потеря активности in vitro у этих соединений, по-видимому, обусловлена отличием в-физико-химических свойствах нуклеоаминокислот. Изучение анальгетического действия гептапеп-тидных аналогов дерморфина показало, что они уступают по активности дерморфину (I), что соответствует результатам экспериментов по связыванию с опиатшми рецепторами. Полученные данные подтверждают решающую роль тирозина в положении I дерморфина для проявления анальтетической активности. Единственное соединение, которое сохраняло относительно высокую анальгетическую активность - это аналог

Таблице S.

Акгкзность- гептапепткдкых аналогов деркорф::на

Соединение*

J IC50 (нМ) ! Анайьгазия,

i -dago* í paule* | (вм/кьш,)2

K-ïyr-s-Ala-Piie-Gl у-Туг-Fro-Ser-NK^ (I) 6,8+0,8 205+30 0,02(0,01-0,05)

K-Tyr(3KH0)-n-Ala-Pi!e-G3y-T>'r-Prc-Ser- 2 (II) 853+112 10000 1,6(1,1-2,0)

H-Tyr(3.V02)-25_Ala-Phc-Gly-Tyr-Pro-£f:r- ■NH. (III) 930+91 1ÛC00 13,3(10-17)

H-Piie(4HHg)-Z)-Ala-Ehe-Cly-TjT-Pro-Ser- •KHg (IV) 74Б+84 240E+1S5 > 25

B-Tal-x>-Ala-Phe-GJy-Tvr-Pr'0-Scr-NH„ (V) > 1000 >10000 0,2(0,1-0,6)

,-í-tJal-z?-Ala-Phe-Sly-TyT-Pro-Ser-tíH2 (VI) > 100Ö >10000 9.1(5,7-14,5) '

4-Kua-D-Ala-Phe-Gly-T>T-Fro-Ser-KH2 (VII) > 1000 >10000 > 25

CO 1

-'Ь виде ацетата ^ Интрацистернальиое введение

о •

'X, содержащий остаток тиминилаланина в первом положении. Нуклео" йШ-нокислотные аналоги дернорфина (У-УП) более подробно изучали i<n Vivo -с помощь» разных тестов на анальгезию. Результаты продстав-"в адбяице 9.

Таблица 9.

^деяигоЧичоская активнооть нуклеоаминопислотных аналогов дорморфика

<4 •Соединение ! 1 1 Анальгезия, ТОХ ЕД^о (нМ/шжь) ТШ ТЗХ

ФН (I) 1,1 1,1 1,1

(V) 1,1 0,6 1,1

£ual3 -РН (VI) 5 5 5

^ОХ - тест отдергивания хвоста. ТТЛ - тест горячей пластинки. ТЗХ - тест защемления хвоста.

Соединение У обнаруживает наиболее высокую анальгетическую активность, достигающую уровня знзльгезии дсркорфикв. Анзльготичес-кий эффект, вызываемый соединением У, вероятно, не опосредован взаимодействием с опиатш'ми рецепторами," о обусловлен другим механизмом.

Результаты исследования активности гептапептидных аналогов дельторфина представлены в таблице 10. Исследование показало, что дельторфик (ХХУ) и его аналог (XXX) проявляют высокое сродство к 6 -опиатным рецепторам и только в незначительной степе»« связываются с -рецепторами. Селективность к (Г -рвцопто]вм этих соединений - одна из самых высоких среди известных -лигандов опиат-кых рецепторов. Байона остатка ь-мотионина-г на остаток ь-ме-тионина приводит к снижению связывания с опиатшми рецептораьш, что свидетельствует о важности ь-конфигурации аминокислотного остатка во втором положении для связывания с рецепторами. Замени

Таблица 10.

Активность гептапептидньж аналогов дельторфкна

т | СнМ)

Соединение ; ,

: раэо* ; рлрье*

(XXV) 4900+280 23,3+5,2 210 22(14-30)

К-Туг-КсЬ-Яге- Н1й-Ьеи-Мег-аБр-МН2 (XXVI) >5000 145+П 32(21-45)

Н-Туг-в-А1а-РЬе-Н15-Ьеи-Кег-А5р-ЯК2 (XXVII) 4410+200 60,3г8,1 73 16(12-24)

К-Тут-о-Нег-РЬе-Нгь-Ьеи-Ьеи-Агр-Ш^ (XXVIII) >5000 48,6+10,5 - 24(11-41)

,Ч-Туг-г)-Мег-РЬе-К15-Туг->".ег-Азр-ЫК2 (XXIX) 2220+170 76,0+16,2 29 12(6-21)

Н-Лут-р-МеГ-РЬе-Наг-Туг-Ьеи-Аьр-т^ (XXX) 3780+190 23,7+7,0 160 14,5(13,4- •15,7)

Н-Т>т-р-Ке1-РЬе-РЬе-Туг-Ьеи-А2р-;.тК2 (XXXI) 9,7+1.1 14,6+3,9 0,66 13(5-35)

Н-Тут-я-АДа-Р.Че-С1у-Туг-Ке1:-Авр-1ГН . - £. (XXXII) 64,5+6,7 110+14 0,59 15,8(13,1- •17,2)

.13,5+1,9 8,9+3,4 1,5 ' -

^В виде ацетата.

к положениях 5 и 6 no оказшшют влилтш на проявление <f -солок-™' хивности дольто^чиа (соединения ХХЭТ2-ХХХ). Замена остатка гисти-дииа-4 но остаток фен ила лани на (соединения XXX и XXXI) приводит ¡i смещению селективности от ¡Р-н -рецепторам, что и наблюдается у соединения ХХХП. По-видимому, гистидин в четвертом положении и отрицательно заряженная Соковая группа остатка аспарзгииовой кислоты в седьмом положении являются важным условием для проявления <f-селективности дельторфином. Биологические испытания показали, что дельтор^ии и его гептапептидныв аналоги проявляют низкую аяальгетическуи активность. .

Анализ взаимосвязи мезду структурой и активностью зпалогов Дельторфина покззал, что дельтор^ин и ряд его аналогов способны специфически связнвзтъсп с <f -рецепторами, а замена остатка гно-тпдннэ-4 на остатки фонила л энияз а глицина приводит к существенному изменению роцепторпой сслективности.

выводи

1. Осуществлен синтез неизвестных ранее структурных аналогов дорморфина, отличающихся от природного нейропептидз модификацией остатка тирозина в положении I, либо его замещением на остатки нуклеоаиинокислот.

2. Проведен синтез сери» укороченных аналогов дерморфииа, содержащих аминокислотные остатки о изменяющейся степенью гидрофобное™ .

3. Синтезированы новые структурные аналоги дельторфивп, отличающиеся от природного гзптапептида замещениям аминокислотных остатков в положениях 2,^,5. и 6.

Ь. В тестах in vitro установлено, что полученные синтетические аналоги дерморфииа способны специфически связываться с опиптными рецепторами, причем некоторые пептиды обладают высокой

сf-селективностью. ~

5. В опытах iп vivo обнаружено, что ряд аналогов, дерморфи-на являются антагонистами дерморфина и могут существенно

6. Показано, что замещение остатка тировика в положении I

являющим анальгетическуо активность.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ В СЛЕДУЮЩИХ ПУБЛИКАЦИЯХ:

1. Грбгер К., Коршунова Г,А,, Швачкин Ю.П. Синтез пентапептидных аналогов дерморфина .//Ш. 1989. Т. 59. Вып.12. С, 2801-2802.

2. Грёгер К., Кориунова Г.А., Швачкин Ю.П. Синтез тиминилаланинав аналогов опиоидных пептидов.// Вестник UI7. Сер. Хим. 1990. . Т. 31. № 3. С. 323.

3. Грёгер К., Коршунова Г.А., Швачкин Ю.П. Синтез и изучение сво! пегтидов, родственных дерморфвну. // Тез. докл. Всесоюзного симп. по химии пептидов. Рига. 1990. С. 71.

Грёгер К., Коршунова Г.А., Швачкин Ю.П. Синтез и изучение овя эывания с опиатныии рецепторами аналогов двриэнквфалиаа.// 10. в печати.

5. Korshunova Q.A., Groger К., Shvachkin Yu.P. A simplified synthi sis of dernorphin analogues containing ftucleoainino acid residu //int. J. Pept. Prot. Res., В ПбЧаТИ.

анальгетическую активность последнего

на остатки нуклеоаминокислот приводи! к аналогам дерморфина, про-

300-ÍO- 4001 л