Структурно-функциональные исследования дерморфина и его аналогов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР

Институт экспериментальной кардиологии Всесоюзного кардиологического центра АМН СССР

На правах рукописи УДК 577.169.15.07

Ярова Елена Петровна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ДЕРМОРФИНА И ЕГО АНАЛОГОВ

02.00.10. Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА - 1990

Работа выполнена в Институте экспериментальной кардиологии ВКНЦ АМН СССР

Научный руководитель:

кандидат химических наук В.И.ДЕЙГИН

Официальные оппоненты:

Доктор химических наук, профессор Г.П.ВЛАСОВ Доктор химических наук, профессор Ю.П.ШВАЧКИН

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии АН СССР

Защита диссертации состоится " 1990 г.

в 4о час на заседании Специализированного совета Д 002.35.01 по защите диссертаций на соискание учейой степени доктора наук при Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР по адресу: 117871 ГСП Москва В-4Э7, ул.Миклухо-Маклая 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР

Автореферат разослан " 1990 г. '

• Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

.Несмеянов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В 70е годы началось интенсивное изучение нового класса природных биорегуляторов - нейропептидов, способных специфично и в низких концентрациях воздействовать на ряд функций центральной и периферической нервной системы. Многообразен спектр биологического действия этих соединений: анальге-тическая активность, стимуляция запоминания и долговременной памяти, формирование рефлексов, регуляция сна и поведенческих реакций. Описаны многочисленные■эффекты опиоидных пептидов на эндокринную систему, включающие влияние на секрецию практически всех гормонов. Опиоиды участвуют в регуляции обменных процессов в почках.

Наиболее интенсивно изучаются эндогенные пептиды-анальгетики.

Современные методы химического синтеза биологически активных пептидов позволяют получать не только сами эндогенные пептиды, но и, что особенно важно, их многочисленные аналоги, отличающиеся высокой селективностью биологического действия, повышенной стабильностью в физиологических условиях организма и, следовательно, пролонгированным эффектом.

Настоящая работа является составной частью комплексных исследований функционального действия биологически активных пептидов и посвящена изучению взаимосвязи между химической структурой- и биологической активностью в ряду дерморфиновых пептидов. Дерморфин (ДМ), один из наиболее сильнодействующих опиоидных пептидов, обладает исключительно сильным пролонгированным анальгетическим действием, сохраняющимся при центральном и при периферическом введении препарата.

До настоящего времени физиологические эффекты ДМ систематически не изучены, значительная часть исследований проведена in vitro, практически не исследованы особенности влияния этого уникального пептида на функции центральной нервной системы.

Цель работы. Целью настоящей работы является изучение структурно-функциональной взаимосвязи в ряду дерморфиновых пептидов, получение новых высокоселективных аналогов ДМ, пригодных в качестве потенциальных лекарственных средств, а также сравнение применимости для синтеза дерморфиновых пептидов классического и

твердофазного методов синтеза пептидов, разработка удобных схем синтеза ДМ и ряда его аналогов.

Научная новизна. Синтезировано 47 новых аналогов ДМ. Разработаны универсальные лабораторные схемы синтеза ДМ и ряда его структурных аналогов. Проведены биологические исследования ряда аналогов in vitro и in vivo и показано, что практически все соединения, полученные в данной работе, проявляют опиоидную активность; введение D-A1а в положение 4, а также наличие гуанидиногруппы вблизи Туг-*- приводит к соединениям, проявляющим ярковыраженную мю-селективность. Получены пептиды, обладающие сильным и пролонгированным анальгетическим действием, а также ряд соединений, проявляющих противоалкогольные эффекты.

Практическая ценность. Разработаны методы синтеза, очистки и контроля, позволяющие получать ДМ и его аналоги в препаративных количествах. Исследование биологической активности показало, что соединения, обладающие сильным анальгетическим и противоалкогольным эффектами перспективны для использования в медицине, для двух соединений разработаны лекарственные формы и препараты переданы на доклинические испытания.

Апробация и публикации работы. О результатах настоящей работы сообщалось на ряде всесоюзных и международных- симпозиумов: У1 Двустороннем симпозиуме СССР-Франция, "Структура и функция белков и нуклеиновых кислот" (Цхалтубо, 1982), 18ом Европейском пептидном симпозиуме, (Швеция, 1984), У11 Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов (Таллин, 1987), Всесоюзном симпозиуме "Физиология пептидов" (Ленинград, 1988), Всесоюзной конференции "Сравнительная физиология высшей нервной деятельности человека и животного" (Ленинград, 1988), 7ой Всесоюзной конференции по экологической физиологии (Ашхабад, 1989), Всесоюзном симпозиуме по химии пептидов (Рига, 1990).

По материалам диссертации опубликовано 15 работ в научных журналах и сборниках.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, посвященного опиоидным пептидам, обсуждения результатов и выводов. Диссертация содержит 192 страницы машинописного текста, а также 14 рисунков, 8 схем, 15 таблиц и список цитируемой литературы, насчитывающий 201 ссылку.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Синтез дерморфина и его.аналогов. \

С целью исследования взаимосвязи между химической структурой и биологической функцией в ряду дерморфиновых пептидов был предпринят синтез ДМ (1.0) и ряда его аналогов (рис.1). Получены аналоги без изменения длины пептидной цепи, укороченные и удлиненные. Замены проводились по 2,4, а также одновременно по 2 и 4, по 2 и 7 положениям молекулы.

I 2 3 4 5 6 7 H-Tyt-D-Aia-Phe-Gly-Iyr-Pro-Ser-

-Gly-

-Oly-Gly--D-Lyg--D-Orn—

■-D-Aia-

-D-Orn—■— D-Al a-

-D-Arg-D-Ala—

—Lye-

-D-Lys-

-D-Orn".....D-Ala—

-D-Orn—

-D-Orn—

(l.0> (2.0) (3.0) (7.0> (12.0) (17.01 (20.0) <23.OJ (26.0) (27.0) 133.0) (29.0) (29.0) (30.0)

12 3 -15 H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH

—D-Lye--O-Orn-

-D-Ala—

D-Orn»"—O-Ala«— D-Arg ——в-M»-

'D-Arg——D-Ala-NH

D-Arg-D-Ala-NH, (U.O)

ПГ..0)

I 37.0)

(ib.Ol (U.O)

11 . о ) < 13.f») (21.0) ( 25. 4< \ ( 4 . 0 I

D-Arg-

-Туг- 3-AU-Tyr-Pro-Ser-NH -Tyr-e-Ahx-Tyr-Pro-Ser-NH

D-Tyr-3-Ala-Tyr-Pro-Ser'NH2 (38.0) D-Tyr-C-Ahx-Tyr-Pro-S«r-NH3 (J9.0)

H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe^Gly-Tyr-Pro-Ser-NHj - - . i. i. -p-Lyg-»------ - -..... - — - ■■■

»D-Arg—

-»D-AU-

-D-Orn—D-Al«--D-Arg—D-Al«-—D-Oro----D-Ala—

D-Arg-O-Orn—■

-D-Ar»

-D-Ali-

(46.0) (9.0) (14.0) (15.0) (19.0) (22.0) (24.0) (44.0) (45.0) (47.0) (48.0)

H-Tyr-D-Al«-Phe-C2y-OH ■ ■ Lya-----------

-D-Lye— -D-Har— -D-Orn—

--Ü-Srg- - - ■ - - ——

— - ■■-D-Orn1-" D-Clu— —— D-Arg—-D-Clu — ———D-Orn—D-Ala-NU. ———D-Arg—D-AU-NH. H-Tyr-Tyr-Pro-Ser-NHj O-Tyr-Tyr-Pro-Ser-NH,

N.O) (5.0) (6.0) (10.0) (Ii.Ol (31.01 (32.0) IÎJ.0) (41.0) (34.0) 135.0)

Рис Л Структуры аналогов дерморфина.

Для выяснения сходства и различия в пространственных структурах энкефалинов (ЭК) и ДМ, и влияния этих различий на биологическую активность были синтезированы соединения, которые являются аналогами как ЭК, так и ДМ, и содержат глицин и глицил-глицин во втором положении молекулы Методами теоретического конформацион-ного анализа (ТКА) рассчитана пространственная структура молекулы

ДМ. Получен набор низкоэнергетических конформаций пептидного остова ДМ, • среди которых можно было выделить ряд низкоэнергетических конформеров, имеющих квазициклическую структуру. По данный расчетов остаток С-концевой аминокислоты у этих конформеров сближен с боковой цепью остатка D-A1 а во втором положении молекулы. С целью получения циклических аналогов ДМ синтезированы пептиды, содержащие D4ys во втором положении и Glu - в седьмом. Для изучения влияния размера цикла на биологическую активность аналогов был введен D-Orr во второе положение. На основании данных ТКА было показано, что квазициклическая конформация может реализоваться за счет изгиба молекулы по связи Phe^-Gly4. Поэтому представлял интерес аналог с заменой остатка Gl у в четвертом положении на аминокислотный остаток, устойчивый к протеолизу и близкий по размеру к Gl у, в частности, на 0-А1а.

Известно, что гуанидилированные по oL -аминогруппе аналоги ДМ имеют высокую биологическую активность, поэтому определенный практический интерес представляло выяснение зависимости биологической активности соединения от расположения гуанидиногрупп относительно N-концевого тирозина. С этой целью были получены соединения, содержащие D-Arg или D-Har в положении 2, а также аналоги, удлиненные по tL-аминогруппе Туг-'- остатками !- и D-Arg.

В ходе работы было показано, что аналог, содержащий О—Al а в четвертом положении обладает более высоким, чем ДМ и пролонгированным анальгетическим эффектом. В связи с этим была получена серия соединений, содержащих o-ai а в четвертом положении молекулы и имеющих многоточечные замены. Для получения синтетического ДМ первоначально нами бьи выбран классический метод синтеза в растворе с использованием стратегии максимального блокирования функциональных групп. Синтез ДМ проводили по схеме 4+3. Последовательность гептапептида разбивали на фрагменты по оптически неактивному остатку Gly^. Гидроксильные группы Туг и Ser защищали бензиловыми эфирами. Для блокирования карбоксильной группы использовали либо трет-бутиловые эфиры, либо солеобразо-вание с ионами Na+, проводя синтез в водно-органической среде при рН=8,5. Для ob -аминогруппы использовали либо трет-бутилоксикар-бонильную защиту, удаляемую разбавленной трифгоруксусной кислотой либо карбобензокси-группу, удаляемую каталитическим гидрогено-лизом.

С-концевой трипептид получали конденсацией по схеме 2+1, поскольку метод последовательного наращивания цепи с С-конца привел к неудовлетворительным результатам: , в процессе синтеза образуется значительное количество побочных продуктов и, в частности, дикетопиперазин С-концевого дипептида. Дипептид получали с помощью пентафторфенилового эфира вос-т.уг(вг1). Физико-химические характеристики полученного дипептида соответствовали описанным в литературе. Конденсация пентафторфенилового эфира дипептида с амидом н-5ег(вг1) приводила к образованию трипептида. Синтез трипептида протекал без особых осложнений; после стандартного выделения трипептид использовали в качестве одного из сегментов при получении ДМ и ряда его аналогов.

м-концевой тетрапептид молекулы да получали двумя методами. Первоначально синтез проводили с трет-бутильной защитой карбоксильной группы 01используя для удлинения пептидной цепи активированные эфиры карбобензоксиаминокислот (схема I). Остаток

Туг

D-Ala

)

Phe Cly

Z-f-ОРГр Н—K>Bu

-CNSU H-"Bzl

'Bzl

■OH H-NUU;

H^Pd.

lBu'OCOCl

OBU

OBu OBu

OBU

Туг

Boc-

Boe-

Boc-HgO

OH Boc-

OP/p H-

Kg.Pd.MeOH

-OPfp H-Bzl

OH Boc^rOH Bzl

OH Boc—j^MK.

, JZl*"

ТУА/ CHCl-

OPfp H-t-NHo I Bzl"

TPA /н^о

-4-NI1-,

! Bzl"

'Bzl

^zl"

^.ЧНр Bzl'

-Ш,

Схема I. Синтез дерморфина.

фенилаланина вводили в пептидную цепь в виде пентафторфенилового эфира, а для введения г-0-А1а более удобным оказался метод оме-

шанных ангидридов. Для присоединения остатка тирозина использовали комерческий активированный эфир Z—Tyr(Bzl)-OSu. На каждой стадии синтеза тетрапептида выделяли индивидуальные кристаллические соединения с высокими выходами. Z-группу на стадии да- и трипептида удаляли каталитическим гидрогенолизом над палладиевым катализатором в присутствии НСООН. Трет-бутилъную защитную группу с С-концевого глицина удаляли обработкой 70% водной tfд. После получения- пентафторфенилового эфира тетрапептида с помощью "f"- комплекса проводили конденсацию N-концевого тетрапептида с С-концевым трипептидом. Вос-группу с трипептида удаляли также, как и с тетрапептида, действием 70% водной tfа. После стандартной обработки защищенный ДМ выделяли в индивидуальном виде с достаточно высоким выходом - 77%. Удаление всех защитных групп проводили гидрогенолизом над палладиевым катализатором в присутствии НСООН. ДМ растворяли в буфере для хроматографирования и очищали с помощью высокоэффективной обра-щеннофазовой жидкостной хроматографии (БЭЮС) на колонке с силикагелем "LiChrosorb RP-I8" (Du Pont). Выделенный нами ДМ имел корректный аминокислотный состав, а его физико-химические характеристики полностью соответствовали литературным. Синтетический ДМ дополнительно был охарактеризован данными ЯМР высокого разрешения (500 МГц) и обладал полной биологической активностью во всех проведенных тестах.

Для отработки более гибкой схемы получения ДМ был предпринят синтез с использованием комерческого Boc-Tyr(Bz1 ). N-Концевой тетрапептид в этом случае получали исходя из трипептида со свободной карбоксильной группой и пентафторфенилового эфира Вос-Tyr(Bzl). Этот вариант синтеза ДМ оказался таким же удобным, что и первоначальный способ. Удаление защитных групп проводили последовательно: каталитическим гидрогенолизом, а затем обработкой 70% водной TFА. Для предотвращения окисления тирозина в реакционную массу в , процессе ацидолиза добавляли 2-меркаптоэтанол. Оба варианта синтеза ДМ сравнимы с точки зрения трудоемкости получения и очистки и могут быть рекомендованы для получения ДМ в препаративных количествах.

К методу получения каждого аналога подходили индивидуально, с учетом особенностей синтезируемых структур, изменяя либо защитные

группы, либо методы конденсации. Пептиды, состоящие из 7-8 аминокислотных остатков разбивали на фрагменты по оптически неактивному а 1 у в четвертом положении, либо по 0-А1а4 и проводили синтез по схеме 4+3 или 5+3. Синтез пента- и тетрапептидов проводили либо путем последовательного наращивания цепи с С-конца молекулы, либо конденсацией фрагментов по схеме 2+3. я-концевые фрагменты получали также двумя путями - ступенчатым наращиванием пептидной цепи с С-конца фрагмента молекулы или конденсацией активированных эфиров более коротких фрагментов. Конденсацию фрагментов проводили с помощью "Р-комплекЬа" с выделением активированного эфира тетра- или пентапептидов, либо методом смешанных ангидридов с использованием изобутилхлорформиата в присутствии м-метилморфолина.

Для защиты <£-амино- и £ -амино-групп использовали трет-бутилоксикарбонильную группу, удаляемую водным или органическим раствором А, либо бензилоксикарбонильную группу, для деблокирования которой использовали каталитический гидрогенолиз над палладиевой чернью в МеОН.

Карбоксильные группы в ходе синтеза защищали солеобразовани-ем, проводя реакцию в водно-органической среде при рН=8, 5, бензи-ловыми, либо трет-бутиловыми эфирами, удаляемыми каталитическим гидрогенолизом, или ацидолизом в условиях, аналогичных удалению Вос-группы.

Гидроксильные группы тирозина и серина бензилировали. Для блокирования гуанидиновой группы аргинина использовали г- и нит-ро-группы.

Синтез аналогов [в1у2]-ДМ (2.0) и [(б1у-а1у)2]-ДМ (3.0) протекал без особых осложнений. Для получения соединения (3.0) использовали комерческий дипептид глицил-глицин. Очистку обоих соединений проводили с помощью ВЭЖХ.

Серию соединений, содержащих основные аминокислоты, получали по схеме 4+3 или 5+3. Преимущества этой схемы заключаются в том, что защищенный трипептид'деблокировали в одну стадию обработкой 50% ТРА/СНС1.3, а конденсацию фрагментов проводили методом смешанных ангидридов,' сократив дополнительную стадию получения активированного эфира. По этой схеме получены не только тетра- и гептапептидные аналоги ДМ, . но и пента- и октапептиды. Соединения (4. 0), (5. 0) и (10. 0) получали деблокированием соответствующих

защищенных тетрапептидов. Все промежуточные соединения легко кристаллизовались и были выделены в индивидуальном виде с высокими выходами.

Ряд соединений -(6.0), (II. 0), (15. 0), (23. 0) -(25. 0), (32.0), (43.0), (45.0) и (48.0), - получали модификацией орнитин-и лизинсодержащих предшественников 0-метилизомочевиной. Первоначальные эксперименты по синтезу аргининсодержащих пептидов и дополнительные сложности в процессе деблокирования нитроаргини-новых пептидов заставили нас искать альтернативные пути синтеза. Мы воспользовались известным методом превращения орнитина в аргинин обработкой 0-метилизомочевикой в сильно щелочной среде. Для этого были синтезированы аналоги, содержащие орнитин, либо d-орнитин, а затем соединения модифицировали в аргининсодержащие пептиды.

Для синтеза соединений, содержащих D-Ala в четвертом положении молекулы, были опробованы две схемы Отличие этих схем состоит в разных методах конденсации фрагментов. Первоначально конденсацию фрагментов проводили с помощью "F" - комплекса, выделяя активированные эфиры n-концевых сегментов молекулы. Соединение (17.0), полученное по такой схеме на стадии защищенного гептапептида нуждалось в дополнительной очистке, которую проводили с помощью высокоэффективной эксклюзионной хроматографии на фракционированном сефадексе LH-20 в МеОК После деблокирования и ВЭЖХ аналог [о-А1а^]-ом был выделен в индивидуальном виде. В данном случае метод конденсации с помощью "F" - комплекса оказался не совсем подходящим, поскольку не удалось достаточно полно сдвинуть равновесие реакции в сторону образования конечных продуктов. После стандартной обработки и кристаллизации конечный гептапептид содержал примеси исходных фрагментов, в связи с чем понадобилась дополнительная очистка защищенного гептапептида. Соединения (20. 0), (22. 0), (33. 0) получали конденсацией фрагментов методом смешанных ангидридов с помощью изобутилхлорформиата по схеме 2. В этих условиях реакции протекали более полно, защищенные соединения после стандартной обработки и кристаллизации были выделены с удовлетворительной степенью чистоты. Аналоги, полученные по схеме 2, после деблокирования очищали методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Таким образом, на основании наших экспериментов можно сделать вывод, что для синтеза препаративных количеств

аналогов ДМ, содержащих э—А1а в четвертом положении, оптимальной оказалась схема 2.

Гут й-А1а

Рйе П-Л1а

Туг

Рго

йег

Вое

Вое Вое

Вое Н-

г-кжБи н-г-

<5Й

Вг1

Вг1

-ОРГр Н-

н^ра.

-он

-ОН Вое

ИеОН

-ОН Вос-

>РГр Н-В21

Вг1

-ОН Вос--ОН Вое-

Ёг1

-ОН Н-

1Ви'ОСОС1

Нг|

ра.иеон

ТРА/Н^О

Вх1

ТРА/

Вг1

Вг1

-ОН Вое—Сон I Вг1

-ОН Вое—

ВгГ

-0Р1р. Н-

{^0

-Щ,

-ННз Вг1

ПН, 1

Вг1

к-ННо -КНз -НН2

Схема 2. Синтез [э-А1 а4]-дерморфина.

Для синтеза серии аналогов, содержащие модифицированный С-концевой фрагмент ДГЛ. была использована фрагментная конденсация 2+3. Выбранные нами соединения (34. 0) -(39. 0) содержали дополнительный остаток тирозина или остатки оптически неактивных аминокислот ( § -АЬх), которые были использованы в

качестве С-концевых при конденсации фрагментов. В качестве амино-компонента использовали С-концевой трипептид ДМ. Защищенные пентапептиды очищали колоночной хроматографией на силикагеле в градиенте 1¥еОН в снс!-з. После деблокирования каждое соединение было получено в индивидуальном виде.

Синтез циклических аналогов.

На основе предположения, что ДМ действует на те же рецепторы, что и ЭК, Никифоровичем с сотр. (ИОС АН Латв. ССР), как уже упоминалось выше, был проведен ТКА молекулы ДМ и рассчитана пространственная структура цикло-[о-0гп2, и7]-ДМ. Рассчетные данные показали, что этот аналог обладает ограниченным набором компактных низкоэнергетических конформаций.

Нами был предпринят синтез цикло-Cû-Lys2, G1 и7]- и цикло-[о-Orn2, G1 и7]-ДМ из линейных предшественников [D-Lys2, Glu7]- и [о-Orn2, Glu7]-ДМ.

Синтез циклических аналогов проводили классическим методом в растворе по схеме 3. % - Карбоксильную группу глутаминовой

Туг D-Lys Ffte Cly Туг

Z--OPfp H—f-OBll' Z-

Boc-

Boc-jç-

Boc

Boc-(JPtj H-

Boc-

B.-1C-HBoc-

Boc-H.

Boc-ûPîp HZ

I^.Pd,

-OBu' UeOH

-OBu* Boc-U0Pip H--OH Boc Bzl

"г'

■OBu' Boc-t-h« Boc-

-OPIp H—^

■он Boc-v-

-OPip H-

Boc—ç—OH Bzl

pa

н^га.

ти/HjO

Hg.Pd.Py

'I «2°

-KIlj -RH^

-кнг

—SHg -KHj -,

-KHg

-Ifflg —KHof-J

roFcp^

-КНз

Схема 3. Синтез [D-Lys2, Glu7]- и цикло-to-Lys2, с1и7]-дерморфинов кислоты защищали только при получении изоглутамина, который использовали в дальнейшем синтезе в виде Иа+-соли. Пептидные связи образовывали методом активированных эфиров. В ходе работы было проведено сравнение применимости пара-нитрофениловых эфиров в присутствии HOBt в качестве катализатора, пентахлор- и пента-фторфениловых эфиров. Бензильную группу удаляли гидрированием над палладиевым катализатором, Вос-группу - ацидолизом 50% TFA/CHCL3. N-Концевой тетрапептид, полученный конденсацией активированного эфира Boc-Tyr(Bzl) с трипептидом, превращали в пентафторфениловый эфир с помощью "F"-комплекса и вводили в конденсацию с •С-концевым трипептидом в присутствии этилдиизопропиламина. Защищенный [D-Lys2, Glu7]-DM был получен с выходом 55,6%. Индивидуальность,. полученного соединения, подтверждали данными ТСХ и аминокислотного анализа. Защитные

группы удаляли гидрированием над палладиевой чернью с последующей обработкой TFА. Конечный гептапептид был выделен с выходом 70,0%. Аналитическая обращенно-фазовая ВЭЖХ на колонке "U1 trasphere ODS" (4,6мм х 25см, "Altex") в градиенте ацетонитрила в 0,05% водной TFА подтвердила индивидуальность полученного соединения. N-Концевой тетрапептид последовательности [D-0rn2, Glu7]-DM получали аналогично N-концевому тетрапептиду последовательности [D-Lys2, Glu'7] —ДТЛ. Защищенный [D-0rn2, G1 u7]-0M после конденсации двух сегментов был выделен с выходом 72%. Удаление защитных групп проводили в условиях, аналогичных приведенным для синтеза аналога (27.0). Линейные защищенные гептапептиды использовали для циклизации. ^-Карбоксильную группу остатка глутаминовой кислоты при получении циклических соединений превращали в пентахлорфениловый эфир. Циклизацию пентахлор-фенилового эфира гептапептида проводили в пиридине с одновременным удалением защитных групп бензильного типа каталитическим гидрогенолизом над палладиевой чернью. При этом аминогруппа тирозина была блокирование трет-бутилоксикарбонильной защитной группой. Для уменьшения вероятности протекания межмолекулярной поликонденсации и полициклизации реакцию проводили при высоком разбавлении (500 мг пептида гидрировали в 400 мл пиридина). После завершения реакции гидрирования реакционную смесь перемешивали еще двое суток. Очистку защищенных циклических соединений проводили с помощью ВЭЖХ на колонке с силикагелем "Silasorb -600" (1.6 х 25 см, размер частиц 7.5 мкм) в системе 3.5% МеОИ/снс 1 з (рис.2). . Выход защищенных Вос-цикло-[ D-Lys2, G1 и7]- и Вос-цикло-[0-0гп2, G1 и7] -ДО после очистки составил 15,5% и 10,7%, соответственно. Вос-группу удаляли обработкой tfa, пептид очищали в режима обращенно-фазовой ВЭЙХ на колонке "Zorbax С8" (0.46 х 25 см, "Du Pont") в системе 60% ацетонитрила в воде, содержащей 0.05% TFА. Выход цикло-[D-Lys2, G1 и7]- и цикло-[D-0rn2, G1 и7]-ДМ составил 33,3% и 44,0%, соответственно ( в пересчете на исходный линейный гептапептид). Полученные аналоги охарактеризованы данными' аминокислотного анализа, ТСХ и аналитической ВЭЖХ на колонке с обращенно-фазовым силикагелем "U1trasphere ODS". Структуру циклических соединений подтверждали данными ЯМР-спектроскопии высокого разрешения (500 МГц). Методом дейтерообмвна в ДМСО-dg показано,. что полученные соединения

представляют собой циклические структура Линейные аналоги не имели преимущественной конформации в о2о и содержали набор конформеров, находящихся в равновесии. Б спектрах ЯМР произведено отнесение сигналов для всех аминокислотных остатков.

Рис.2 Препаративное выделение Вос-цикло-ГD-Lys , Glu 1-дерморфина на колонке с сорбентом Silasorb-600" (I. 6x25 см, размер частиц 7,5 мкм) в системе 3.5%

МеОН в CHClo. Детектирование при 280 нм. Скорость потока 9 мл/мин.

Использование твердофазного метода синтеза аналогов дерморфина.

Ряд аналогов ДМ (соед. (40. 0) -(48. 0)) бьи получен твердофазным методом путем ступенчатого наращивания пептидной цепи. Синтез проводили по стандартной схеме, предложенной Меррифилдом на полистирольном носителе, содержащем 1% дивинилбензола, без использования каких-либо спейсерных групп. С-концевую аминокислоту в виде с$+-соли присоединяли к хлорметилированному полимеру, создавая связь бензильного типа. Эта стратегия была выбрана нами в виду небольшой длины синтезируемых пептидов, поскольку потери продукта на стадиях деблокирования незначительны. На заключительном этапе связь пептида с полимером разрушали аммонолизом с образованием амидов защищенных пептидов. Используемые условия являются более мягкими по сравнению с обработкой пептидил-полимеров жидким фтористым водородом, приводящей к побочным продуктам и требующей сложного аппаратурного офор-

мления. Однако при использовании згой схемы возникли проблемы со стабильностью некоторых защитных групп в ходе аммонолиза, в частности, нитрогруппы аргинина. При аммонолизе мы наблюдали протекание побочной реакции превращения нитроаргининовых пептидов в орнитиновые. После удаления всех защитных групп желаемый пептид получали в смеси с аналогом, имеющим замену аргинина на орнитин. Побочные соединения были выделены и охарактеризованы с помощью ВЭЖХ и аминокислотного анализа. После обработки смеси пептидов раствором О-метилизомочевины при рН^П, приводящей к гуанидилированию остатков орнитина, вновь количественно получали только аргининсодержащий пептид. Протекание реакции контролировали ВЭЖХ. Нам удалось подобрать условия хроматографии, в которых полностью разделялись аналоги, содержащие остатки аргинина и орнитина. В условиях ВЭЖХ четко наблюдалась динамика количественного перехода орнитина в аргинин в процессе обработки смеси соединений 0-метилизомочевиной в щелочной среде. Дальнейшие эксперименты показали, что синтез орнитиновых пептидов с их последующим превращением в аргининсодержащие соединения более приемлем для получения аргининовых аналогов ДМ. Соединения (8.0), (9.0), (13.0), (14.0), (16.0), (18.0), (19.0), (21.0), (22.0), в которых остаток аргинина является М-концевым, синтезировали с использованием пентафторфенилового эфира Агд(г)3. Окончательное деблокирование защищенных амидов, полученных после аммонолиза пептидил-полимера, проводили в два этапа: гидрогенолизом над палладиевым катализатором с последующей обработкой 70% водной ТРА. Пептиды очищали с помощью обращеннофазо-вой ВЭЖХ в условиях , индивидуально подобранных для каждого аналога.

Использование ВЭЖХ для очистки и анализа дерморфиновых пептидов.

К моменту начала работы бьши известны литературные данные по хроматографическому поведению ДМ. В процессе работы мы воспроизвели эти условия и показали, что хроматографические характеристики синтетического ДМ полностью идентичны приведенным в литературе. Нами разработаны методы препаративной очистки пептидов с помощью ВЭЖХ. Конструктивные особенности колонок и условия хроматографирования позволяют высокопроизводительно и воспроизводимо получать препаративные количества синтетических пептидов в защищенном и свободном виде.

К очистке и анализу каждой серии аналогов подходили индивидуально, оптимизируя конкретные условия анализа и выделения. Очистку проводили на жидкостных хроматографах фирм "Waters" (СМ) и "Knauer" (ФРГ), используя колонки, полученные в нашей лаборатории. Были исследованы два типа сорбентов: "LiChrosorb RP-18" и "Sllasorb C-I8". В процессе очистки ДМ получены сопоставимые результаты для обоих типов сорбентов. При переходе к очистке аналогов лучше зарекомендовал себя "Silasorb C-I8"; на этом сорбенте получены более высокие выходы, по-видимому, за счет меньшей остаточной адсорбции "Silasorb С-18" по сравнению с "LiChrosorb RP-I8". Препаративную очистку аналогов проводили на колонках с сорбентом "Silasorb с-18".

Для анализа полученных соединений использовали хроматографи-ческие системы фирм "Waters" (США), "Knauer" (ФРГ), (США), используя колонки с сорбентами "Zorbax "Spherisorb OOS (рис. 3).

%CH3CN

Рис. 3

Аналитическая хроматография L G1 у ] -дерморфина на колонке с сорбентом "U1trasphere - ODS" (0, 46x25 см) в градиенте ацетонитрила в 0, 05% водной TF А,

детектирование при 226 нм.

50

¿0

30

20-

или "AItex" rp-8" или л

/

/

/

30 35 ¿0 V.JH

Биологические испытания ДМ и его аналогов.

Биологические исследования да и его аналогов проводились в лаборатории биохимии и фармакологии пептидов ВКНЦ АМН СССР, в отделе проблем памяти Института биофизики АН СССР и на биологическом факультете МГУ им. М. R Ломоносова (кафедра физиологии человека). Основной задачей проводимой работы являлся поиск эффективных аналогов да со специфической биологической активностью. Исследования биологических свойств ДМ проводили по двум основным направлениям: изучение рецепторных свойств аналогов ДМ на изолированных органах и тканях in vitro и исследования биологического действия ДО и-его аналогов in vivo.

Для работы in vitro использовались классические тесты на опиоидную активность на моделях изолированной подвздошной кишки морской свинки (тест gpi) и изолированного семявыносящего протока мыши (тест MVD).

Оценку биологического влияния ДМ и его аналогов in vivo проводили как на интактных животных, так и на животных с патологией. В процессе экспериментов на животных in vivo было проведено сравнение эффектов препаратов при различных способах введения: внутримышечном, внутрибрюшинном, внутривенном, интрана-зальном и непосредственно в желудочки мозга.

Для проявления полного спектра биологической активности да кроме N-концевого фрагмента молекулы необходимо наличие С-концевой гидрофобной части, поэтому структурно-функциональные исследования да проводили по двум основным направлениям -исследование N-концевой - функциональной части молекулы ДМ и С-концевой - адресной.

Исследование биологической активности Дм и его аналогов in vitro.

Для выяснения структурно-функциональных закономерностей синтетических аналогов ДМ были использованы классические модельные тесты на опиоидную активность, такие как gpi и mvd. В качестве препаратов сравнения использовали мю-агонист dago и дельта-агонист dtlet, антагонист - налоксон.

Сделать выводы о влиянии конкретных аминокислотных остатков молекулы на специфичность и селективность связывания на рецепторном уровне достаточно сложно, для этого необходимо проведение дополнительных исследований отдельных соединений. Но

анализ результатов испытаний, проведенных по всей группе аналогов, показал, что практически все соединения, полученные в данной работе, в той или иной мере, проявляли опиоидную активность. Можно выделить ряд аналогов - (И. 0), (17.0), (19.0), (25.0) и (42.0), которые обнаружили ярко выраженную мю-селективность: они проявили более высокую степень связывания с мкьрецепторами, чем. DAGO, и в то же время, перечисленные соединения, исключая (17.0) и (19. 0) имеют, как минимум, на порядок меньшее связывание с дельта-рецепторами, по сравнению с DAGO. Кроме того, результаты испытаний аналогов ДМ подтвердили предположение о том, что наличие гуанидиногруппы в непосредственной близости от остатка тирозина в первом положении приводит к повышению сродства к мю-рецепторам и к увеличению мю-селективности (йю.4).

На биологическом факультете МГУ проведены исследования влияния ДМ на холинэргические хронотропные эффекты на изолированном сердце лягушки, вызываемые стимуляцией парасимпатической системы или апликацией экзогенного ацетилхолина. ДМ вызывал дозозависимую от концентрации блокаду парасимпатических отрицательных хронотропных эффектов и тормозных эффектов экзогенного ацетилхолина. Дозы ДМ, вызывающие 50% инги-бирование (ДИ5о), в первом случае равнялись ICT^M, а во втором -Ю^М. Налоксон не блокировал эффекты ДМ. Эти результаты свидетельствуют в пользу предположения об экстраопиатной природе воздействия ДМ на изолированное сердце лягушки.

Сравнение холинолитического действия ДМ и аналогов с метацином, наиболее эффективным из блокаторов периферических мкъ холинорецепторов, показало, что ДИдо ДМ примерно в 1000 раз меньше Д^д метацина. Следует отметить, что ни в одной из исследуемых концентраций ДМ не влиял на исходную частоту сердечных сокращений. Таким образом, впервые показана высокая холинолитическая активность ДМ не опосредованная . активацией опиатных рецепторов.

Центральные эффекты ДМ и его аналогов.

Известно, что антиноцицептивные свойства ДМ и других опиоидов являются определяющими в их физиологической активности. Поэтому все дозозависимые характеристики и продолжительность действия препарата во времени первоначально оценивались по его противоболевым эффектам. Как упоминалось выше, исследование

g p i

PDo

MVD

10

dago (ц-агонист) dtlet (б-агонист) dm

ID-Ala4l-DM Arg-[D-Ala4]-DM H-ArgTyrD-OrnPheGly-OH H-ArgTyrD-LyaPheGly-OH Arg-[D-Lys2]-DM Arg-[D-Orn2]-DM H-ArgTyrD-OrnPheD-Ala-OH H-ArgTyrD-ArgPheD-Ala-NH2 H-ArgTyrD-LysPheGly-OH H-TyrD-HarPheGly-OH H-TyrD-OrnPheGly-OH H-TyrD-ArgPheGly-OH

Я?

F

ншшта

m

r-r

3

□ □ □ □ □ □

Q

5

6

4

L

pD2=-log IC50 (p<0.05)

РИС.. i

ВЕЛИЧИНА РЕЦЕПТОРНОГО СВЯЗЫВАНИЯ В У0ДЕЛЯХ IN VITRO ХАРАКТЕРИЗУЮЩАЯ J4- (ТЕСТ GPI) И Г-(ТЕСТ ШГО) ОПИОИДНУЮ АКТИВНОСТЬ ДЕИЮРКША И РЯДА ЕГО АНАЛОГОВ.

анальгетической активности ДМ проводили при различных способах введения препарата. Зависимость анальгетической активности о® дозы при внутрибрюшинном, интраназальном и внутримозговов введении препарата представлена на рис. 5 При внутрибрюшинном введении ДМ установлено, что стойкая и длительная анальгезия наблюдается при введении ДМ в дозах не менее 5 и 10 мг/кг. Необходимо отметить и то, что при использовании дозы 0.03 мг/кг возникает небольшой анальгетический эффект, исчезающий при уве-

А%

Рис.5 Зависимость анальгетической активности от дозы при

интраназальном ( • ), внутрибрюшинном ( 1 ) и внутримозговом (О) введении.

По оси ординат - величина анальгезии в % (р<0, 05)

По оси абсцисс - доза в логарифмической жале.

Для каждой исследуемой дозы использовано 20-24 животных.

личении дозы до 0.1-I. О мг/кг. Длительность анальгетического эффекта оценивали при использовании дозы 5 мг/кг. В этом случав препарат эффективен в течение 60-90 минут после введения. При интраназальном способе введения значительная анальгезия наблюдалась при введении малых доз да от 0. 001 до 0.1 мг/кг. Увеличение дозы приводило не только к исчезновению эффекта, но даже к повышению болевой чувствительности при дозе I. О мг/кг и 5 мг/кг. Для изучения длительности эффекта при интраназальном введении выбрали наиболее эффективную дозу - 0. 006 мг/кг. В этом случае препарат сохранял свою активность около трех часов после введения. Непосредственно в желудочки мозга вводились различные дозы ДМ и кроме анальгетических эффектов в данной серии опытов оценивалось общее состояние животного. Меньшая из исследуемых доз (0. 2 мкг/ кг) не приводила ни к изменению болевой чувствительности, ни к заметным нарушениям поведения. При увеличении доз, которые при внутримозговом введении приводили к появлению анальгезии, возникали глубокие побочные действия, приводящие к различной степени развития кататонии. Доза 0.5 мкг/кг вызывала состояние ступора с явлениями восковой гибкости, которое проходило через 20-25 минут после введения препарата, в то время как анальгети-ческие эффекты сохранялись до конца времени регистрации (60 минут). Высокие дозы (1.0 мкг/кг и 2. 5 мкг/кг) вызывали наиболее сильное мышечное напряжение, оцепенение, длящееся до 40-60 минут. Во всех случаях предварительное введение налоксона снимало состояние полной анальгезии, а также явления кататонии. С целью поиска новых соединений, более эффективных по величине анальгетической активности или продолжительности действия, был исследован ряд аналогов ДМ. Для сравнения анальгетической активности новых соединений с активностью ДМ была выбрана "стандартная доза" - 0. 005 мг/кг и интраназальный способ введения, т.к. в этих условиях наблюдается максимальный по величине и длительности анальгетический эффект ДМ. Наиболее перспективными в плане получения анальгетического эффекта оказались соединения: (15. 0) -(17. О), (19. О), (20. 0), (23. 0) и (46. 0). По длительности эффекта перечисленные соединения, за исключением соединения (17.0), уступали природному прототипу. Длительность анальгетического эффекта соединения (17. 0) достигала 7 часов, а величина анальгетического эффекта при интраназальном введении, в целом,

совпадала с величиной эффекта ДМ. Использование интраназального способа введения препарата является перспективным не только в плане теоретических исследований механизмов действия нейротроп-ных пептидов, но и в плане разработки новых неинъекционных способов доставки пептидных препаратов в организм при лечении различных заболеавний.

Антиалкогольное действие ДМ и его аналогов.

Имеются многочисленные сведения о важной роли нарушений деятельности эндогенной опиоидной системы организма в механизмах возникновения алкогольного влечения. Одним из наиболее перспективных путей профилактики и лечения алкоголизма является поиск противоалкогольных и антистрессорных (адаптогенных) препаратов. С этой целью ДМ, [D-A1а4]-ДМ и модифицированный С-концевой фрагмент - тетрапептид (34. 0) были исследованы на алко-голизированных животных для выяснения наличия или отсутствия антиалкогольного действия у этого класса соединений. Эксперименты проводили на крысах, предварительно подвергнутых длительному принудительному спаиванию и имеющих стойкое алкогольное влечение. В качестве препарата сравнения использовали пептид дельта-сна (ПДС), подавляющий алкогольное влечение. Эффективность действия препаратов оценивали по изменению потребления 15% раствора этанола и воды в условиях свободного выбора. ДМ и [D-А 1 а -ДМ вводили крысам ежедневно в дозах 100-150 мкг/кг внутрибрюшинно втечение 10 дней. В последующих экспериментах был исследован интраназальный способ введения.

Дозы препаратов для проведения экспериментов по купированию алкогольного влечения выбирали с учетом отсутствия поведенческих эффектов у нормальных (неалкоголизированных) животных. В эксперименте использовались препараты в дозах, не вызывающих изменения двигательной активности в тесте "открытое поле".

Из результатов работы следует, что ДМ и его аналог (17. 0) вызывают снижение потребления алкоголя у "много" пьющих животных (рис.б). После 10-дневного курса введения пептидов у ряда животных полный отказ от потребления алкоголя наступал приблизительно через 12-14 дней после отмены препаратов и продолжался на протяжении всего периода наблюдений за животными '(более 40 суток).

<РОН ВВЕДЕНИЕ ПОСЛЕДСТВИЕ

ПРЕПАРАТА

Рис. 6 Изменение потребления алкоголя и воды под влиянием

дерморфина у алкоголизированных крыс в условиях свободного выбора.

Эффект ПДС в той же концентрации, в период его введения, был менее выражен и более вариабелен. Характерной особенностью исследуемых препаратов явилось их отсроченное действие, проявившееся в нарастании противоалкогольного эффекта в период после отмены препарата.

Ряд алкоголизированных "много" пьющих животных (<30%) не изменяли потребления алкоголя после введения ДМ или [о-А1а4]-ДМ. В этом случае для снижения потребления алкоголя дополнительно вводился аналог (34.0), при этом потребление алкоголя "много" пьющими животными резко снижалось вплоть до полного отказа, что в целом позволило добиться противоалкогольного эффекта у 100% "много" пьющих животных.

Подобный корректирующий эффект соединения (34.0) наблюдали и в случае неэффективности применения ПДС.

Параллельно с изучением влияния ДМ, [D-A1 а4]-ДМ, ПДС и соединения (34.0) на алкогольное влечение животных было исследовано воздействие этих пептидов на уровень содержания моноаминов в мозге. Биохимические исследования мозга экспериментальных животных после введения опиоидов показали, что в случаях введения ДМ, [о-А1а4]-ДМ, ПДС наблюдали снижение содержания

серотонина и его метаболита в гипоталамусе и увеличение уровня норадреналина в коре больших полушарий, в то время, как введение тетрапептида (34.0) вызывало прямо противоположный эффект, возрастание содержания серотонина и падение уровеня норадреналина. Таким образом, можно сделать вывод, что тетрапептид (34.0) является функциональным антагонистом опиоидных пептидов, по крайней мере, в случае купирования алкогольного влечения и воздействия на моноаминэргические структуры мозга крыс.

Исходя из полученных результатов, соединения [о-А1а^]-ДМ и тетрапептид (34.0) бьши выбраны для дальнейших доклинических испытаний в качестве антиалкогольных и адаптогенных препаратов. В настоящее время для этих двух препаратов разработаны лекарственные формы и они проходят токсикологические и доклинические испытания.

ВЫВОДЫ

1. Осуществлен синтез ДМ и 47 его аналогов.

2. Проведено экспериментальное сравнение твердофазного и

классического методов синтеза аналогов ДМ.

3. Разработаны оптимальные схемы синтеза ДМ и его аналогов, позволяющие получать препаративные количества соединений.

4. В классических тестах проведено исследование опиоидной активности синтезированных соединений.

5. Получены новые высокоселективные мю-агонисты. 4

6. Показана высокая эффективность соединений [о-А1а ]-ДМ и тетрапептида (34.0) в качестве противоалкогольного препарата.

7. Разработаны лекарственные формы для двух новых соединений (17. О и 34. 0) и переданы на доклинические испытания в качестве противоалкогольных и адаптогенных препаратов.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Дейгин EU, Харламова Е.П.. Михалева НИ., Иванов ET. Синтез дерморфина и его аналогов. //Тез. докл. У1 двусторон. симпоз. СССР-Франция. - Цхалтубо, 1982. - С. 140-142. •

2. Dei gi n V.l., Yarova.E.P. Synthesis of dermorphin and its analogs. // Abstracts of I8ln European Peptide Symposium.- 1984.-P. 123.

3. Deigin V.l., Yarova E.P. Synthesis of dermorphin and its analogs, //in: Peptides 1984. - P. 325-328.

4. Ашмарин И. П., Обухова М. Ф., Федорова Т. М., Зайцев Д. А., Дейгин Е И., Макарова К Е , Ярова Е. П. Получение и исследование некоторых физико-химических свойств коньюгатов дерморфина с высокомолекулярными антигенами - носителями. // Тез. докл. У11 Всес. симпозиума по химии белков и пептидов. - Таллин. - 1987. -С. 151.

5. Ярова Е П., Дейгин Е И. Синтез аналогов дерморфина. // Тез. докл. У11 Всес. симпозиума по химии белков и пептидов. Таллин. - 1987. - С. 264-265.

6. Монастырская А. Р., Фролова в. II, Востряков А. П., Гуткин Е С., Горбатов Е А., Дейгин Е И., Ярова Е П., Роговин Е Е Влияние in vitro [D-Alа ]-дерморфина на люминолзависимую хемилюминесценцию цельной крови мышеи при фагоцитозе. // Вопр. мед. химии. - 1987. - Т. 33, вып. 3. - С. 56-58.

7. Соколова Н. А., Дейгин Е И., Ярова Е И Опиоид дерморфин подавляет холинэргические хронотропные эффекты на сердце лягушки. // Докл. Акад. Наук СССР, 1988, Т. 298, n1, С. 254-256.

8. Батурина Е Ю., Сарычева Н. Ю., Дейгин Е И., Ярова ЕЕ,. Каменский А. А. Физиологическая активность дерморфина и его аналогов. // Тез. докл. симпоз. "Физиология пептидов", Ленинград, 1988, С. 20.

9. Батурина Е Ю., Сарычева Н. Ю., Дейгин Е И., Ярова Е Е , Каменский A. А. , Ашмарин И. П. Парадоксальные соотношения* эффективности интраназального и внутрибрюшинного введения дерморфинов крысам. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -

1988. - N2. - С. 177-179.

10. Батурина Е Ю., Сарычева Н. Ю., Дейгин Е И., Ярова Е Е , Каменский А. А. Регуляция поведения белых крыс. Дерморфин и его аналоги. // Материалы Всесоюзн. конф. "Сравнительная физиология высшей нервной деятельности человека и животного". Ленинград. - Т. I9B8. - часть I. - С. 19.

11. Емельянова Т. Г., Усенко А. Б.-, Батурина Е Ю., Дейгин Е И., Ярова Е Е , Каменский А. А. Влияние дерморфина на терморегуляцию крыс в условиях« экстремальных температурных воздействий. // Тез. докл. 7 Всесоюз. конф. по экологич. физиол. Ашхабад. -

1989. - С. 106.

12. Громова Е А., Бобкова К В., Елакхинас Л. А., Дейгин Е И., Ярова Е Е, Михалева И. И. Противоалкогольное действие дерморфина и пептида дельта-сна в сопоставлении с их влиянием на обмен биогенных аминов мозга. // Тез. докл. Всесоюз. конф. "Пептиды, нейрогормоны и поведение." Ленинград. - 1988.- С. 46.

13. Громова Е. А., Бобкова Е Е , Елакхинас JL А., Дейгин Е И., Ярова Е Е Противоалкогольное действие опиоидного пептида дерморфина и его связь с обменом биогенных аминов мозга. // Докл. АН СССР. - 1988. - Т. 303, N3. - С. 746-749.

14. Громова Е А., Бобкова Е В., Елакхинас Л. А., Дейгин Е И., Ярова Е Е , Михалева И. И. Роль моноаминергических систем мозга в противоалкогольном действии дерморфина и пептида дельта-сна. //Физиологический журнал СССР. - 1989. - Т. 75, N5. - С. 633-637.

15. Ярова Е Е, Дейгин Е И. Синтез и исследование активности дерморфина и его аналогов. // Тез. . докл. Всесоюзного симпозиума по химии пептидов. Рига. - 1990. - С. 70.

сак.459-0 Тир.100 экз.