Расчетное моделирование, синтез и биологические испытания иммуномодуляторов пептидной природы. тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ БІООРГАНІЧНОЇ ХІМІЇ ТА НАФТОХІМІЇ

ХОЛОДОВИМ Владислав Валентинович

УДК 577.152.313

РОЗРАХУНКОВЕ МОДЕЛЮВАННЯ, СИНТЕЗ ТА БІОЛОГІЧНЕ ВИПРОБУВАННЯ ІМУНОМОДУЛЯТОРІВ ПЕПТИДНО!ПРИРОДИ

02.00.10 - біоорганічна хімія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України

Науковий керівник

доктор медичних наук, професор Луйк Олександр Ігорович

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України завідувач відділу медико-біологічних досліджень

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Кібірєв Володимир Костянтинович Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України завідувач відділу хімії білка

кандидат хімічних наук, доцент Савранський Леонід Ісакович Київський університет ім. Тараса Шевченка доцент хімічного факультету

Провідна установа:

Інститут органічної хімії НАН України, м. Київ

Захист відбудеться “ 2&” -т|=хх&>Н9 1998 Р- о 10-00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 01.80.01 в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, вуя. Мурманська, 1

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, вул. Мурманська, 1

Автореферат розісланий“ 2Я” 1998р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

Д.М.Федоряк

Актуальність теми

Існуючі комп'ютерні методи молекулярного моделювання та розрахункового конструювання лікарських речовин ще недостатньо досконалі і не повною мірою відповідають потребам фармакологічної промисловості. Особливо це відчутно при роботі з конформаційно лабільними молекулами, такими як жирні кислоти чи пептиди. Ситуація ускладнюється тим, що при взаємодії з рецепторами ці сполуки можуть змінювати конформаційний стан, притаманний їм у розчині, на зовсім інший. Тому не дивно, що провідні фармакологічні фірми у своїй діяльності більше спираються на експериментальні дослідження, ніж на розрахункові методи. Але такий підхід вимагає дуже багато часу й коштів, потрібних для синтезу та випробування нових речовин у доклінічних та клінічних дослідах. Відомо, що для створення та впровадження в медичну практику навіть одного комерційного препарату необхідно перевірити понад 10000 речовин ( Knight P., 1990 ). На це витрачається 8-12 років роботи та 500-800 млн. доларів, і за останні роки ця ситуація суттєво не змінилася. Зрозуміло, що розробка нових більш простих та надійних методів для теоретичного ab initio відбору сполук з заданими властивостями була б дуже доречною.

Особливої уваги, на наш погляд, заслуговує розробка та впровадження розрахункових методів прогнозування активності пептидних сполук, тому що більшість високо активних природних речовин відносяться саме до конформаційно лабільних. Серед них особливу увагу привертають пептидні імуномодулятори, зокрема тафцин, тимозини, циклоспорини тощо. Окремий інтерес до пептидних препаратів обумовлений їх ключовим значенням для вирішення таких найважливіших медико-соціальних проблем сучасності як злоякісні новоутворення, СНІД, трансплантація органів і тканин, лікування хронічних інфекційних, алергічних, автоімунних захворювань та наслідків впливу на організм іонізуючого випромінювання. Останнє стало особливо актуальним після Чорнобильської катастрофи.

Зрозуміло, що пептидні імуномодулятори, як і інші фізіологічно активні пептиди {ендорфін, енкефаліни, брадикінін, окситоцин тощо), приваблюють природним сполученням таких властивостей як максимальна ефективність і селективність дії при мінімальній токсичності. Проте ознайомлюючись з будь-яким довідником або посібником з фармакології чи фармакотерапії не важко впевнитись, що кількість лікарських засобів пептидної природи, які застосовуються у клінічній практиці, незрівнянно менша ніж непептидних синтетичних органічних сполук. Це обумовлено наявністю цілого ряду труднощів, що виникають як на стадіях їх експериментальної розробки, так і створення технологій промислового виробництва. Подоланню їх у значній мірі можуть сприяти розрахункові методи. Проте застосування цих методів у

традиційних формах у відношенні до пептидних сполук у свою чергу наштовхується на цілий ряд нових ускладнень. Це, перш за все висока конформаційна лабільність пептидних молекул та необхідність урахування вирішального впливу факторів оптичної ізомерії. Тому використання методів розрахункового прогнозування властивостей фізіологічно активних речовин пептидної природи потребує принципово нових рішень, розробці та перевірці яких і присвячена ця робота.

В ході пошуку' нових представників імуномодулюючих пептидів перевагу слід віддавати олігопептидам, (наприклад, тетрапептид тафцин), бо синтез коротких амінокислотних фрагментів більш економічний та доступний, що необхідно враховувати при виробництві фармакологічних препаратів.

Крім практичного застосування таю методи також могли б стати у нагоді для всіх, хто займається дослідженнями взаємозв’язку між будовою та біологічною активністю речовин: фармакологам, хімікам, молекулярним біологам, спеціалістам у галузі біоорганічної хімії, імунології, ендокринології, онкології тощо.

Ступінь дослідженості тематики

Хоча багато досліджень присвячено вивченню механізмів дії тафцину на поліморфноядерні лейкоцити (ПЯЛ) та синтезу і біологічній перевірці як самого тафцину, так і його структурних аналогів на різноманітні види активності, досі залишається не розкритим питання, яким саме чином відбувається ця дія і яка конформація молекули відповідальна за Ті проявлення. Якщо методи розрахункового прогнозування біологічної активності пептидних сполук розроблені значно менше, ніж для інших органічних речовин, то питання про можливість екстраполяції прогнозів з пептидних речовин на непептидні взагалі не ставилося.

Дана робота є також продовженням досліджень по визначенню найбільш інформативних молекулярних ознак та методів їх чисельного вираження (кодування), що є одною з найважливіших і найменш досліджених проблем при побудові моделей “структура - активність".

Мета і задачі дослідження

Метою роботи було створити комп’ютерну експертну систему на основі банку даних відомих пептидних імуномодуляторів, за допомогою якої можна було б прогнозувати фізіологічну дію пептидних речовин, виходячи з їх хімічної будови, та пошук нових сполук цієї природи, що мали б тафциноподібну активність, з подальшою експериментальною перевіркою отриманих результатів.

Основні задачі дослідження:

1) Вивчити просторову будову тафцину.

2) Створити банк даних відомих імуномодуляторів та здійснити кодування будов молекул за допомогою топологічних індексів.

з

3) Розробити систему для вибору найбільш інформативних параметрів

та розрахункового прогнозування фізіологічної дії нових пептидних речовин.

4) Експериментально вивчити дію нових пептидних сполук на фагоцитарну активність поліморфноядерних лейкоцитів для перевірки результатів отриманих розрахункових прогнозів.

5) Оцінити можливості використання експертної системи, створеної для пептидних імуномодуляторів, для скрінінгу існуючих баз даних хімічних речовин іншої природи на наявність тафциноподібної активності.

6) Використати правила комплементарності амінокислотних залишків для моделювання нових пептидних сполук з заданим видом активності.

Наукова новизна одержаних результатів

1) Побудовані оригінальні ефективні класифікатори для пептидних сполук, що дозволяє з високим рівнем ймовірності відрізняти речовини, активні та неактивні у відношенні до фагоцитозстимулюючої активності поліморфноядерних лейкоцитів.

2) Показано, що експертна система, створена для пептидних сполук з кодуванням їх будови топологічними індексами спроможна прогнозувати відповідні види активності у речовин непептидної природи.

3) Вперше використано правила комплементарності амінокислотних залишків для моделювання нових пептидних сполук з заданим видом активності в комбінації з методами комп'ютерного моделювання - “к-найближчих сусідів” та нейронних мереж.

Теоретична цінність одержаних результатів

Результати роботи підтверджують доцільність та раціональність застосування запропонованих розрахункових методів дослідження зв’язку “будова-активність”, які базуються на кодуванні молекулярних будов пептидів топологічними індексами, та правилах комплементарності амінокислотних залишків для моделювання нових пептидних сполук з заданою біологічною активністю.

Отримані дані свідчать на користь того, що імуностимулююча активність пептидних та непептидних сполук обумовлена деякими спільними рисами хімічної будови, отже в її основі закладені спільні елементи молекулярного механізму дії.

Практичне значення одержаних результатів

Практичне значення одержаних результатів визначається високою ймовірністю вірних передбачень фармакологічної активності пептидних речовин на основі даних про їх хімічну будову. Описані методи дозволяють швидко будувати класифікатори та отримувати прогнозуючі системи для будь-яких видів біологічної активності хімічних речовин. Це відкриває широкі перспективи у галузі спрямованого створення нових високоефективних ліків.

Рівень реалізації

Розроблений комплекс програм для персонального комп’ютера, та створена експертна система можуть використовуватися для прогнозування імуномодулюючої дії нових пептидних сполук.

Особистий внесок здобувача

Розрахункове моделювання, комп’ютерне теоретичне дослідження та синтез пептидів здійснені особисто здобувачем. Автор щиро ВДЯЧНИЙ K.X.H. Поярковій С.О. за методичну допомогу при синтезі кіоторфін-подібних пептидів та к.б.н. Метелиці Л.О. за допомогу у проведенні біологічних досліджень.

Апробація результатів дисертації

Основні результати роботи були представлені на одинадцятій конференції у галузі математики, хімії та комп’ютерних наук ( МАТН/СНЕМ/СОМР '96 the eleventh Dubrovnik International Course & Conference on the interfaces among mathematics, chemistry and computer sciences June 1996, Dubrovnik, CROATIA ); четвертому світовому конгресі хіміків-теоретиків ( Fourth World Congress Of Theoretically Oriented Chemists, WATOC'96 July 1996, Jerusalem, ISRAEL (electronic conference)); п’ятій конференції з передової медичної хімії ( 5th Conference in Advanced Medicinal Chemistry May 1997, Thessaloniki, GREECE ); міжнародній конференції з структурної та теоретичної хімії на честь професора Нормана Алінгера ( WATOC sponsored "Structural and Mechanistic Organic Chemistry: An International Conference in Honor of Professor Norman L. Allinger" June 1997, the University of Georgia, Athens, USA); 36 конгресі “Кордони в хімії, нові перспективи до 2000 року” організований міжнародним союзом чистої та прикладної хімії ( 36th IUPAC Congress Frontiers in Chemistry, New Perspectives for the 2000s, August 1997, Geneva, SWITZERLAND ). Результати окремих етапів роботи доповідались і обговорювались на засіданнях вченої ради та наукових семінарах в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України.

Публікації

За матеріалами дисертації опубліковано 8 праць, з них 3 статті в наукових фахових журналах та 5 тез конференцій.

Структура та обсяг роботи

Дисертація складається з вступу, огляду літератури, 2-х розділів власних досліджень, заключної частини, яка включає обговорення результатів досліджень і висновки, списку використаної літератури та додатку. Робота викладена на 132 аркушах машинописного тексту й ілюстрована 10 рисунками та 15 таблицями. Список використаних джерел налічує 137 найменувань.

Методологія та методи дослідження

Комп’ютерне моделювання зв’язку між структурою та біологічною активністю хімічних сполук з подальшою експериментальною перевіркою отриманих

теоретичних розрахункових результатів. Моделювання здійснювали кодуванням хімічних будов за допомогою оригінальної процедури розрахунку топологічних індексів (Танчук В.Ю., 1996). Зменшення простору молекулярних ознак виконували за допомогою методу к-найближчих сусідів з застосуванням генетичного алгоритму, який належить до еволюційної теорії та є математичним аналогом біологічних генетичних мутацій (Tetko I.V. et al., 1994), та статистичного аналізу ряду незалежних прогнозів нейронними мережами (НМ ) або нейронними ансамблями (НА) (Tetko I.V et al., 1995). Перевірка впливу нових речовин на фагоцитарну активність нейтрофілів крові визначалася в суміші цільної крові щурів та добової живої культури Staph, aureus (штам 1474) за методикою (Кост Е.А., 1968). Нові пептидні сполуки синтезували сукцинімідним методом через третбутилоксикарбонільні похідні амінокислот.

ПОШУК НОВИХ СПОЛУК, ЩО МАЮТЬ ТАФЦИНОПОДІБНУ АКТИВНІСТЬ

Раціональний пошук сполук, що мають заданий профіль біологічної дії потребує знань про взаємозв'язок між молекулярною будовою та біологічною активністю. Ці знання необхідні при конструюванні лікарських засобів, а також інших видів біологічно активних сполук, таких як гербіциди, пестициди, стимулятори росту рослин, харчові домішки, парфуми тощо. На жаль, саме таких знань ще бракує для узагальнення механізмів дії, що лежать в основі як головного ( корисного ) механізму дії, так і токсичного, мутагенного або канцерогенного впливу цілого ряду хімічних сполук.

Головна ідея методів конструювання біологічно активних сполук грунтується на припущені, що близькі за будовою сполуки будуть діяти схожим чином. Згідно з цим припущенням, невеликі зміни у будові повинні призводити до незначних змін у активностях. Таким чином, якщо робити послідовні обмежені заміни у молекулярних структурах, в принципі можна отримати сполуку, яка буде мати необхідні біологічні властивості. Але, на жаль, навіть для невеликих молекул, кількість можливих замін у будові сягає астрономічних величин. Тему дослідникові, що працює в галузі медичної хімії, перш ніж синтезувати нову сполуку, необхідно вибрати потенційно активного кандидата серед величезної кількості можливих похідних.

Ефеїстивність біологічної дії лікарського засобу обумовлюється електронними та стеричними властивостями сполуки. Структурні зміни неоднаково впливають на кожний з цих факторів, тому подібність будови не завжди очевидна. Класичні методи QSAR описують біологічну активність у термінах фізико-хімічних властивостей замісників у певних позиціях молекули лікарської речовини. При прогнозуванні активності використовують різноманітні наближення. В нашій роботі ми спиралися головним чином на класичні методи QSAR, де біологічна активність переводилась у

терміни фізико-хімічних властивостей, але з урахуванням стереохімії та тримірної будови досліджуваних молекул.

При фракціонуванні плазми крові, яка містила основну масу G-імуноглобулінів, співробітникам лабораторії білку Тафського університету на чолі з ВАНайаром вдалося виділити фракції, які специфічно зв'язувались з лейкоцитами та підвищували і пролонгували їх фагоцитарну активність. В ході подальших досліджень було виділено активний фрагмент, який мав повну фагоцитозстимулюючу активність та являв собою тетрапептид Thr-Lys-Pro-Arg - тафцин ( Najjar V.А., 1970 ). Тафцин має широкий спектр біологічної' дії. Ефект стимулювання фагоцитозу він викликає у дуже низьких концентраціях 0,2мкг/мл (4х10'7 моль/л), тобто нічим не відрізняється від інших високоефективних пептидно-білкових гормонів, та проявляє стимулюючу дію незалежно від того, який вид бактерій підлягає фагоцитозу макрофагами (Staph, aureus, Staph. Londres, Staph. Smith, Lysteria monocytogenes ( Florentin I., 1983 ). В дослідах in vitro він також активує рухливість гранулоцитів та подовжує час їх життя ( Nishioka К., 1973). Встановлено, що тафцин знімає ефект інгібування міграції макрофагів, що викликається алогенними антигенами меланоми, та стимулює утворення антитіл до тимус-залежних (в 1,8-3,4 рази) та тимус-незалежних (в 1,4-1,8 рази) антигенів, підвищує цитотоксичну активність макрофагів проти лейкемічних клітин, пригнічує викликану мітогенами проліферацію клітин селезінки in vitro і при цьому не активує неспецифічні супресорні лімфоцити ( Florentin І., 1986 ).

Хоча дослідженню будови тафцину присвячено чимало робіт та синтезовано багато його аналогів, ще й досі питання про .активну конформацію молекули не з'ясоване повністю. .

Наші дослідження просторової будови молекули тафцину показали, що для нього не існує якоїсь певної переважної конформації. Тому для подальшої роботи ми використовували одну з низькоенергетичних структурних похідних молекули, яка була отримана за допомогою двох різноманітних програм молекулярного моделювання і співпадала з даними ЯМР, одержаними для водних розчинів тафцину ( Chipens G.I. et al., 1979 ).

Для виявлення цієї конформації були розраховані мінімуми для кожної окремої амінокислоти, що входять до складу тафцину, і потім для сполук, що утворюються при послідовному приєднанні кожного наступного амінокислотного залишку. Для отримання глобального мінімуму кінцевої сполуки ( тафцину ) було здійснено послідовне обертання навколо усіх рухомих зв’язків з інкриментом 10°, . та одночасною мінімізацією енергії нової просторової будови. Для початкового наближення геометрії молекули використовувався програмний пакет PCModel фірми Sirena ( версія 4.0 ) з подальшою повною оптимізацією геометрії з використанням

напівемпіричного методу АМ1 з квантовохімічного пакету програм МОРАС 5.0 (Stewart J.J.P., 1989 ). Отриманий таким чином глобальний мінімум використовувався для порівняння з отриманими іншим способом конформаціями тафцину.

Для знаходження низькоенергетичних конформацій широко застосовується конформаційний відбір ( conformational sampling ). Добрим методом для цих цілей є високотемпературна симуляція молекулярного відпалення (high temperature molecular simulated annealing (HT MSA)) (Kirkpatrick S. et al., 1983). Відомо, що MSA може успішно знаходити глобальний мінімум, якщо процедуру не обмежувати в часі. Але загально прийнято, що цього достатньо 1 наносекунди, чи трохи більше часу. Типова температура при роботі за методом HT MSA лежить у межах 5000К - 6000К. Але для малих пептидів типу тафцину здається доречним використання більш низьких температур 1000К - 2000К. Саме цей метод й був обраний для дослідження і візуалізації просторової будови тафцину. Всі розрахунки виконували на SGI Indigo workstation з використанням модулів Insightll та Discover (MSI/Biosym, San Diego, USA, 1995) та силового поля Biosym cff93.

Початковою була обрана температура 1200К і систему послідовно охолоджували до 300К з інкриментом 100К кожні 5ps. Кожні 52ps (52=2+10x5) відбирався новий конформер (frame), для нього проводилася мінімізація енергії і він запам’ятовувався. Було створено 500 конформерів, тобто загальний час симуляції становив 26ns.

HT MSA виявила багато низькоенергетичних конформерів тафцину, які не мають якогось одного переважного кластеру. В загальному вигляді молекула тафцину може бути зображена як “шпилька” з двома розщепленими кінцями. Після мінімізації, весь набір конформерів (sample) розсортували за величинами енергій і конформери, для яких різниця становила більше 2 kCal/mol з конформером з найнижчою енергією відкидалися.

Серед низькоенергетичних конформерів було знайдено конформацію, яка співпадала з просторовою будовою тафцину, отриманою раніше за допомогою першого методу (рис.1).

Наш вибір грунтувався на тому, що природно тафцин проявляє свою активність у фізіологічних розчинах, тобто в полярному водному середовищі. На наш погляд, ця конформація є критично важливою, оскільки саме вона бере участь у первинних взаємодіях з рецептором при утворенні ліганд-рецепторного комплексу. Тому вона була обрана як головна модель для процедури наближення активного аналогу (active analog approach) (Marshall G.R., 1985) й використовувалась для моделювання структурних аналогів тафцину.

Рис.1. Просторова будова тафцину, використана як модель для створення сполук, що увійшли у відбірку для навчання.

А - будова тафцину, отримана за допомогою програми молекулярної динаміки Discover (MSI/Biosym, San Diego, USA).

В - конформація, знайдена при використанні програмного пакету PCModel фірми Sirena (версія 4.0). з подальшою ловною оптимізацією геометрії з використанням напівемпіричного методу АМ1 з квантовохімічного пакету програм МОРАС 5.0.

Правильний вибір дескрипторів молекулярної будови є найбільш важливим етапом в дослідженні взаємозв’язку між структурою та активністю тому, що від інформативності відібраних дескрипторів залежить загальний успіх класифікації сполук.

В деяких випадках правильному вибору сприяє апріорна модель, в інших -наявність експериментальних даних. Таким чином, молекулярні дескриптори можуть бути розраховані виходячи з структурної інформації ( топологічні індекси ), або отримані експериментально. Перший підхід є більш перспективним тому, що дає змогу описувати будь-які гіпотетичні будови, для яких навіть немає даних біологічних випробувань. У своїй роботі ми використовували саме такі топологічні дескриптори -дескриптори фрагментів, які кодують типи атомів та хімічних зв’язків; які вказують на наявність чи відсутність певних структурних уфупувань; дескриптори оточення, зв'язності та геометричні дескриптори, що описують загальну форму та розмір

молекули. Окрім відомих двомірних індексів (індекси Халла і Кіра ( Hall L., Кіег В., 1991 ), Бариша, Тринайстича (Бариш М. з співавт., 1987 )) та тримірних ( 3-мірний індекс Вінера і функції диссиметрії ( Kuz’min V.E. et al, 1992 )), використовувалися також їх оригінальні модифікації (ТанчукВ.Ю., 1996). Загальна кількість розрахованих дескрипторів сягала 277.

Мала інформативність молекулярних ознак значно погіршує прогноз біологічної активності, а їх велика кількість призводить до значних затрат часу при роботі класифікаційного алгоритму. Тому перед класифікацією доцільно провести апріорний аналіз, щоб виключити надмірні (зайві) дескриптори. За допомогою простого порівняльного аналізу для пептидів, які відрізняються від тафцину лише тим, що містять у амінокислотній послідовності D-амінокислоти, було показано, що кількість молекулярних ознак може бути зменшена до 61. Використовуючи метод к-найближчих сусідів з генетичним алгоритмом нам вдалося показати, що з цих 61 параметрів можна вибрати лише 6 топологічних індексів, які описують тафциноподібну активність відомих сполук з 79-83% точністю на навчальній відбірці при застосуванні процедури плинного контролю, яка полягає у примусовому відкиданні від одної до чверті молекул з набору для навчання і є мірою стабільності прогнозу:

1) Нормований центричний індекс C’(G), що відображає форму

молекули:

C’(G) = |[C(G)-2N + 1-(-1)n], (1)

де N - число атомів (без атомів водню), a C(G) визначається за формулою:

c(G) = ix ,2)

і=і

де числа 5t - кількість вершин на зрізі при послідовному зрізанні зі ступенем 1; п - кількість послідовно зрізаних шарів.

2) Відношення модифікованого індексу Віннера W”(G) до звичайного індексу Віннера W(G):

W(U) - Zj!ldu-(k + l)-(I + k); (3)

W<G) = l£d,, ,4,

де dij є відповідним елементом модифікованої матриці відстаней D’(G);

N - кількість вершин у хімічному графі (без атомів водню); к- кількість найкоротших шляхів, що проходять через і та j;

І - кількість інших найкоротших шляхів (між іншими вершинами), що проходять через і та ¡.

3) функція диссиметрії віднесена до кількості електронів та нормована на кількість атомів у молекулі з урахуванням атомів водню:

К-ГЛТ77 ,-ктН

N

ЧОР=БР/Нн. (5)

де N - кількість атомів у молекулі;

4) функція диссиметрії віднесена до кількості електронів та нормована на суму квадратів радіусів інерції з урахуванням атомів водню:

/Ея?. (6)

к і

де И,- радіус інерції і-го атома;

5) функція диссиметрії нормована на кількість атомів з урахуванням атомів водню, але вагові коефіцієнти для кожного атома дорівнюють одиниці:

Т^БР/ІМ11. (Л

N Н

де N - кількість атомів у молекулі;

6) функція диссиметрії віднесена до кількості електронів та нормована на суму квадратів радіусів інерції без урахування атомів водню:

де Я)- радіус інерції і-го атома.

Перевірка отриманих результатів на контрольній відбірці підтвердила важливість відібраних параметрів. Те, що всі відібрані молекулярні ознаки необхідні для описання тафциноподібної активності, було також показано методом нейронних мереж. При застосуванні примусового відкидання із знайденого набору одного з параметрів, загальна прогнозуюча здатність системи погіршувалася до 70%.

Теоретичні передбачення підтверджені також експериментальним шляхом. У відділі хімії білка нашого інституту отриманий ряд пептидних сполук, які потенційно можуть бути тафцинолодібними стимуляторами. Частина з них синтезована безпосередньо автором даної роботи (сполуки 3 та 5, табл.1) При синтезі цих сполук за основу брався відомий дипептид кіоторфін ЬТуг-ЬАгд, що відноситься до нового типу морфін-подібних пептидів. Синтез здійснювався сукцинімідним методом через третбутилоксикарбонільні похідні амінокислот. При біологічній перевірці розрахункового прогнозування фагоцитозстимулюючої активності синтезованих

сполук у відношенні до ПЯЛ, була показана 83% точність прогнозу (п’ять з шести сполук підтвердили розрахункову активність ).

Таблиця 1

Результати біологічних досліджень.

Сполука Вплив на фагоцита за прогнозом к-сусіди НМ рну активність за екслеримеї юЛі іейтрофілів ■ггальними даними Ю^М

1 D-tyr-D-arg-Ome повинен стимулювати +30.7% [-7.7%]*

2 D-tyr-D-arg-OH теж +23.0% +30.7%

3 Tyr-D-arg-Ome КІІ +23.0% [+7.7%]

4 D-tyr-Arg-Ome III» +30.7% +30.7%

5 Tyr-Arg-Ome ми -53.9% -53.9%

6 Pro-Arg-Ome не повинен стимулювати [+7.7%] -23.0%

* У квадратних дужках наведені статистично невірогідні значення

Окремий інтерес являло вирішення питання про можливість застосування експертної системи, створеної на основі пептидних сполук, для прогнозування тафциноподібної активності непептидних речовин. Проведений скрінінг 545 структур з чотирьох банків речовин різного типу дії дозволив виявити лише сім сполук, що можуть за прогнозом стимулювати фагоцитоз ПЯЛ - толбутамід, фенобарбітал, РМІ-Р, фенігідин, лейкотриєн Д та два експериментальні інгібітори агрегації тромбоцитів Інг-АТ-2 та Інг-АТ-3 (табл. 2). Для біологічного випробування були доступними тільки чотири, три з яких дійсно виявили тафциноподібну активність.

Таблиця 2

Результати біологічних досліджень.

Сполука Вплив на фагоцитарну активність нейтрофілів

за прогнозом за експериментальними даними ЮЛі j 10'5М

Толбутамід повинен стимулювати +53.9% +15.4%

Фенобарбітал повинен стимулювати -38.5% -23.1%

FMLP повинен стимулювати +53.9% +53.9%

Фенігідин повинен стимулювати +23.1% +23.1%

Лейкотриєн Д повинен стимулювати - -

Інг -АТ-2 повинен стимулювати - -

Інг -АТ-3 повинен стимулювати - -

- біологічні дослідження не проводилися

Слід зазначити, що цих даних не достатньо для вагомої статистичної оцінки. Проте з суто якісної точки зору, результати, що отримані в даному розділі роботи, свідчать на користь наявності певної прогнозуючої спроможності "комп’ютерної експертної системи" у відношенні до речовин іншої природи.

При плануванні та виконанні цього розділу роботи ми не переслідували практичних цілей; для прогнозування активності пептидних сполук краще використовувати відповідні банки даних. Але, як ми вважаємо, результати цього фрагменту роботи мають певну фундаментальну цінність. Так, по-перше, вони свідчать про те, що кодування хімічної будови за допомогою топологічних індексів є універсальним методом кількісного відображення фізико-хімічної структури, і за допомогою цього методу можна судити про факт наявності спільних фармакофорних рис у речовин пептидної та непептидної природи. Останнє, в свою чергу, свідчить і про наявність спільних елементів молекулярного механізму їх дії.

Зокрема, прогнозована нами і підтверджена в біологічному експерименті наявність фагоцитозстимулюючої активності толбутаміду та фенігідину дозволяє говорити про те, що ці речовини мають якісь спільні з тафцином риси будови і впливають на той самий сайт клітинних рецепторів, які ініціюють фагоцитоз. Наскільки нам відомо, аналогічна ситуація була описана тільки для похідних морфіну, які моделюють дію ендогенних нейропептидів ендорфіну та Met- і Leu-енкефалінів. Переважна більшість інших непептидних модуляторів пептидних медіаторів та гормонів діють за алостеричними механізмами, тобто зв’язуються з сайтами рецепторів, просторово відокремленими від їх активних центрів. Тому не дивно, що з 545 досліджених речовин різної природи за допомогою нашої експертної системи фагоцитозстимулююча активність прогнозується лише для 7 сполук, та ще й одна з них ( FMLP) є пептидом. Відомо ( Кухарь В.П., Луйк А.И., 1992 ), що серед пептидних сполук, які були взяті в цей скрінінг є значно більше стимуляторів фагоцитозу, але завдяки проведеним дослідженням можна вважати, що їх дія не є тафциноподібною і розвивається за іншими молекулярними механізмами.

Таким чином, отримана прогнозуюча система є достатньо ефективним засобом відбору структур з потенційною фагоцитозстимулюючою активністю у відношенні до поліморфноядерних лейкоцитів й може використовуватися для розрахункового скрінінгу при розробці нових лікарських засобів саме з тафциноподібним механізмом дії.

ВИКОРИСТАННЯ ПРАВИЛА КОМПЛЕМЕНТАРНОСТІ АМІНОКИСЛОТНИХ

ЗАЛИШКІВ ДЛЯ МОДЕЛЮВАННЯ НОВИХ СПОЛУК З ЗАДАНИМ ВИДОМ

АКТИВНОСТІ

Спираючись на отриману комп’ютерну експертну систему, нами було здійснено спробу конструювання нових сполук, які б могли проявляти тафциноподібну

активність. Для цього була використана гіпотеза про просторове формування молекул протеїнів, згідно з якою взаємодія між амінокислотами відбувається на основі алгоритму генетичного коду, запропонована Меклером ще в 60-х роках (Меклер Л.Б., 1969, 1973; Меклер Л.Б., Идлис Р.Г., 1981 ). Ідея використати цю гіпотезу при конструюванні нових пептидних сполук виникла після ознайомлення з публікаціями американських авторів Блалока та Сміта ( Blalock J.E. & Smith Е. М., 1984; Blalock J.E., 1994, 1995), які синтезували комплементарні пептиди, і показали, що в розчині між ними відбуваються взаємодії згідно алгоритму генетичного коду.

Оскільки наша експертна система була створена, головним чином, для пептидів, ми вирішили здійснити моделювання нових сполук, які за згаданою гіпотезою повинні були б мати тафциноподібну активність, і перевірити результати передбачень за допомогою отриманого набору дескрипторів. На першому етапі були зроблені тільки заміни на повністю еквівалентні амінокислоти (АК) (табл. 3).

Таблиця З

Очікувана дія нових сполук на фагоцитоз ПЯЛ.

Сполука Прогноз методом к-сусідів Прогноз НМ

1 Л/a-Lvs-Pro-Arg повинна активувати не повинна активувати

2 Thr-G/y-Pro-Arg те ж те ж

3 Thr-Lvs-Pro-G/v ми повинна активувати

4 /4/a-Gfa-Pro-Arq ми те ж

5 Thr-G/u-Pro-G// ми

6 Л/a-Lvs-Pro-G/y ми ш*

7 Ala-Giu-Pro-Gly мм

Методом к-найближчих сусідів було визначено, що всі сім модельних пептидів повинні мати тафциноподібну активність. Метод НМ частково підтвердив результати прогнозу методом к-сусідів, і показав, що тільки п'ять з семи сполук можуть бути біологічно активними. За літературними даними лише одна сполука /Уа-1.уз-Рго-Ага була досліджена в біологічних експериментах і виявилась інгібітором фагоцитозу ПЯЛ, але вона на 530% стимулювала дію на імуногенез (для тафцину тільки 360% стимулювання імуногенезу). Якщо припустити, що між імуногенезом та фагоцитарною активністю є кореляційна залежність ( Кухарь В.П., Луйк А.И., 1992 ), то стає зрозумілим деяка розбіжність прогнозу двома методами. Метод к-найближчих сусідів визначив цю сполуку як активну, тобто таку, що може взаємодіяти з рецептором і активувати імуногенез, в той час як більш селективні НМ віднесли її до неактивних. Таким чином, комплексне застосування двох методів призвело до більш

точного прогнозу. Тому можна сподіватися, що сполуки, які обома методами були класифіковані як активні, з великою ймовірністю будуть активувати фагоцитоз ПЯЛ.

З іншого боку, виходячи з припущення, що активні сполуки зв’язуються з рецептором за амінокислотним кодом, ми спробували здійснити моделювання рецепторної амінокислотної послідовності. Тут під терміном "амінокислотна послідовність" рецептора ми маємо на увазі не чисто вторинну білкову структуру, тобто лінійну ділянку зв’язаних пептидними зв'язками одна з одною амінокислот на поверхні ПЯЛ, а сформовану певним чином у просторі комбінацію декількох амінокислотних залишків, що можуть належати до різних ділянок пептидних ланцюгів рецепторного комплексу, але таких, що мають змогу суміщатися у просторі і таким чином, взаємодіяти з амінокислотною послідовністю тафцину або близьких його аналогів. За гіпотезою Меклера заміна даного амінокислотного залишку на комплементарний йому, повинна призводити до втрати молекулою поліпептиду структурної цілісності і функціональної активності. Ми припустили, що сполуки, до складу яких входять амінокислоти, комплементарні до тафцину, і які можуть бути потенційними рецепторами, повинні мати суттєво іншу просторову організацію, і тому не будуть проявляти біологічної активності у відношенні до фагоцитарної функції ПЯЛ. Всього було здійснено моделювання 96 можливих сполук, серед яких методом к-найближчих сусідів виявлено 15, а НМ -16 потенційних рецепторів (табл.4).

Таблиця 4

Сполуки, що можуть бути потенційними рецепторами тафцину.

Прогноз методом к-найближчих сусідів Прогноз НМ

Бег-і-еи-Агд-ТИг

Бег-Ьеи-Агд-Зег Бег-Іеи-Агд-АІа

6Іу-1-еи-Агд-АІа вег-І-еи-Агд-Зег

Суэ^еи-Агд-ТИг Фу-І-еи-Агд-ТИг

Суз-1.еи-Агд-АІа ЄІу-І-еи-Агд-АІа

Суэ-Ьеи-Фу-ТИг вІу-І-еи-Агд-Рго

Сув-І-еи-СІу-АІа Фу-Ьеи-Агд-Бег

Суэ-Ьеи-Фу-вег Суэ-Ьеи-Агд-ТИг

ОІу-РИе-СІу-вег СуБ-Іеи-Агд-АІа

Суз-Рїіе-СІу-АІа Суз-І_еи-Агд-Рго

ЗІу-РИе-ауЛїіг Суз-Ьеи-Агд-Эег

вег-РЬе-СІу-АІа СІу-Іеи-Тгр-ТЬг

Бег-РЬе-Фу-Зег С1у-І.еи-Тгр-А1а

Єіу-РІїе-СІу-АІа СІу-1_еи-Тгр-Рго

СІу-Ріїе-СІу-Рго Зег-1_еи-Тгр-Рго

СІу-РЬе-Тгр-Рго Суэ-1еи-Тгр-А1а

Хоча частково ці прогнози співпадали, результати розрахунків не виявили якоїсь конкретної послідовності рецептора, але показали, що пептиди значно, або повністю втрачають біологічну активність, якщо заміни проведені у другому та третьому положеннях, згідно моделі Шехтера та Бергера ( Schechter І., Berger А., 1967 ). Тобто, ключовим фрагментом при зв’язуванні тафцину з рецептором є наявність залишку лейцину у другому положенні та аргініну або гліцину у третьому. Відповідно гіпотетичний рецептор тафцину може бути представлений як X-Leu-Arg(Gly)-X, де X - будь який амінокислотний залишок.

РЕЦЕПТОР

X Leu Arg (Gly) X

S1 S2 S3 S4

Цікаво також відзначити, що якщо зробити комплементарні заміни для рецептора (тобто моделювати потенційно активні сполуки ), то для отриманих таким чином пептидів є дані про біологічне випробування трьох сполук з замінами у третьому положенні, ТИг^уг-Зег-Агд, ТЬг-Іуз-Л^-Агд, ТЬг-Іуб-ТТтг-Агд і всі вони є активними у відношенні до фагоцитозу ПЯЛ ( КопоріпБка й., Ыа\лтоска Е., 1979; Чипенс Г.И. зі співавторами, 1980). Що стосується замін у другому положенні, то для того, щоб отримати активні сполуки, тут можливі заміни на глутамін або глутамінову кислоту. Такої ж думки притримуються польські автори, які повідомили про твердофазний синтез мутантного аналогу тафцину - ТЬг-в/ц-Рго-Ага (Копоріпзка О., 1981). На жаль, даних про його біологічні випробування знайти не вдалося.

Таким чином, можна вважати, що використання алгоритму генетичного коду при моделюванні нових пептидних сполук з заданим видом активності має сенс, що підтверджується нашими розрахунками.

ВИСНОВКИ

1) Розрахунковими методами досліджено просторову будову тафцину й показано відсутність якоїсь певної переважної конформації молекули. Для тафцину існує цілий спектр низькоенергетичних конформерів, які можуть у загальному вигляді бути представлені як “шпилька з двома розщепленими кінцями".

2) На основі створеного банку даних відомих пептидних імуномодуляторів розроблено комп’ютерну експертну систему, яка дозволяє швидко та ефективно прогнозувати тафциноподібну активність нових сполук.

3) Показана ефективність застосування еволюційної стратегії в комбінації з методом к-найближчих сусідів для пошуку найкращих наборів параметрів, з подальшою перевіркою отриманих результатів за допомогою НМ. При цьому середня

прогнозуюча здатність класифікатора при плинному контролі досягала 79-83%, в залежності від кількості відкинутих молекул ( від 2,5% до 25% молекул ).

4) Теоретичні передбачення підтверджені експериментальним шляхом. При біологічній перевірці розрахункового прогнозування фагоцитозстимулюючої активності синтезованих сполук у відношенні до ПЯЛ, була показана 83% точність прогнозу.

5) Вперше застосовано правило комплементарності амінокислотних залишків для моделювання нових пептидних сполук з заданим видом активності, та проведено моделювання гіпотетичного рецептора тафцину.

СПИСОК РОБІТ ОПУБЛІКОВАНИХ ПО ТЕМІ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Холодович В.В., Танчук В.Ю., Ковалішин В.В., Пояркова С.О., Метелиця Л.О., Луйк О.І. Розрахункове прогнозування імуномодулюючої активності пептидних речовин - аналогів тафцину // Доповіді НАН України -1997. - №6. -С. 170-175

2. Холодович В.В., Танчук В.Ю., Ковалишин В.В., Тетко І.В., Пояркова С.А., Метелица Л.А., Луйк А.И. Применение методов математического моделирования для предсказания иммуномодулирующей активности новых пептидных соединений // Теор. и экспериментальная химия -1997 -33 №2 -С. 100-104.

3. Холодович В.В. Поиск новых пептидных соединений, обладающих тафциноподобной активностью с помощью методов компьютерного моделирования и комплементарности аминокислот на основании алгоритма генетического кода // Український біохімічний журнал -1997 -69 №5-6 С. 203-208.

4. Kholodovich V.V. Usage of topological indexes in the study of biologically active peptides: tuftsin and its analogues // Third Electronic Computational Chemistry Conference - ECCC-3. —1996. - Internet: hup://hackb<;ny.chcm.mu.edu/F,CCC3/

5. Kholodovich V.V. Usage of topological indexes in the study of biologically active peptides: tuftsin and its analogues II Proc. MATH/CHEM/COMP '96. - Dubrovnik (Croatia).-1996.-P.57.

6. Kholodovych V.V., Kovalishyn V.V., Luik A.I. New approach in the combined usage of computer modeling methods and a complementary rule of the genetic code on the basis of prediction tuftsin-like activity of peptides II Proc. 36th IUPAC Congress Frontiers in Chemistry, New Perspectives for the 2000s. - Geneva (SWITZERLAND). -1997. ref. no 1178

7. Kholodovych V.V., Kovalishyn V.V., Luik Al. Search of new tuftsin-like peptides by the usage of computer modeling methods and a complementary rule of the genetic code.// Proc. Structural and Mechanistic Organic Chemistry: An International Conference in Honor of Professor Norman L. Allinger - Athens ( USA). -1997. - P. 179.

Холодович В. В. Розрахункове моделювання, синтез та біологічне випробування імуномодуляторів пептидної природи. — Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук за спеціальністю 02.00.10 - біоорганічна хімія. - Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, Київ, 1998.

Дисертацію присвячено питанням пошуку нових перспективних методів конструювання фізіологічно активних пептидних сполук на основі методів комп’ютерного моделювання у задачах дослідження взаємозв’язку “структура -активність". Наведено приклади використання розробленої комп’ютерної експертної системи для сполук, що мають тафциноподібну активність, за результатами розрахунків здійснено синтез пептидних речовин та проведено їх біологічне випробування. Запропоновано використання правила комплементарності амінокислотних залишків для моделювання нових пептидних сполук з заданим видом активності і його доцільність підтверджена розрахунковими прогнозами.

Ключові слова: комп’ютерне моделювання, струкггура-активність, ОЗАРЗ, синтез, тафцин, еволюційна стратегія.

Холодович В.В. Расчетное моделирование, синтез и биологические испытания иммуномодуляторов пептидной природы. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученной степени кандидата химических наук по специальности 02.00.10 - биоорганическая химия. -Институт биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины, Киев, 1998.

Диссертация посвящена вопросам поиска новых перспективных методов конструирования физиологически активных пептидных соединений на основе методов компьютерного моделирования в задачах исследования взаимосвязи “структура - активность”. Приведены примеры использования разработанной компьютерной экспертной системы для соединений, обладающих тафциноподобной активностью, по результатам расчетов осуществлен синтез новых пептидных веществ и проведены их биологические испытания. Предложено использование правила комплементарности аминокислотных остатков для моделирования новых пептидных соединений з заданным видом активности и его целесообразность подтверждена расчетными прогнозами.

Ключевые слова: компьютерное моделирование, структура-активность, (ЗвАК синтез, тафцин, эволюционная стратегия.

Kholodovych V.V. Computational modeling, synthesis and biological tests of peptide immunomodulators. - Manuscript.

Thesis for a candidate of sciences degree by speciality 02.00.10 - bioorganic chemistry. - The Institute of Bioorganic Chemistry and Petrochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 1998.

The dissertation is devoted to the development of new prospective methods for constructing of physiologically active peptides on the basis of computer-aided drug design and SAR - QSAR investigations. Examples of application of the created computer system for the compounds with tuftsin-like activity are described, including theoretical predictions for new peptide substances, their synthesis and results of biological tests. The complementary rule of aminoacids’ residues is suggested to be used for modeling of new compounds with desirable physiological activities and expediency of the rule is proved by the theoretical computational predictions.

Key words: computer modeling, structure-activity, QSAR, synthesis, tuftsin, evolutionary strategy.