Разработка физико-химических подходов к разделению и идентификации пептидных продуктов с антибактериальными свойствами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

804616512

На правах рукописи

ФЕДОТКИНА (СРИБНАЯ) ОЛЕСЯ СЕРГЕЕВНА

РАЗРАБОТКА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ К РАЗДЕЛЕНИЮ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ПЕПТИДНЫХ ПРОДУКТОВ С АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМИ СВОЙСТВАМИ

02.00.04 - физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

- 9 ДЕК 2010

Саратов-2010

004616512

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Самарский государственный университет»

Защита состоится «23» декабря 2010 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.243.07 при Саратовском государственном университете им. Н.Г. Чернышевского по адресу: 410012, Саратов, ул. Астраханская 83, Саратовский государственный университет, корпус 1, Институт химии.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор, заслуженный деятель науки и техники РФ Пурыгин Петр Петрович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Буланова Анджела Владимировна

доктор химических наук, профессор Штыков Сергей Николаевич

Ведущая организация:

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан « » ноября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор химических наук, доцент

Русанова Т.Ю.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы: В связи с резким ростом числа новых органических соединений пептидной природы, полученных при секвенировании, проблема установления взаимосвязи между физико-химическими свойствами этих пептидов и их структурой является одной из наиболее актуальных в жидкостной хроматографии. Наиболее информативными в этом плане являются современные варианты высокоэффективной жидкостной хроматографии ВЭЖХ, с применением матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации МАЛДИ и масс-селективного детектирования, особенно в тандемном варианте. В настоящее время теория сорбции и разделения органических, а тем более биоорганических, соединений находится практически в стадии разработки, что требует детального изучения адсорбционных свойств большого числа таких соединений, в частности, пептидов. Физико-химическое обоснование процессов в системе сорбат-сорбент-элюент в основном носит описательный характер. В связи с этим такие исследования важны, поскольку накопление физико-химических данных по удерживанию в условиях ВЭЖХ позволяет создавать модели физико-химического поведения соединений и обосновывать оптимальные условия разделения сложных смесей данным методом, а в сочетании с масс-спектроскопией - проводить идентификацию компонентов сложных смесей пептидов.

Пептидные продукты, получаемые на основе иммунных реакций насекомых, могут проявлять разнообразную биологическую активность и могут стать основой для разработки новых фармакологических средств. Врождённая иммунная система восковой моли (Gallería mellonella, GM) производит множество пептидов для защиты от болезнетворных микробов. Из GM выделили ряд пептидов бактерицидного и противогрибкового действия. Перспективным является использование GM в качестве модельной системы при изучении биосинтеза антибактериальных пептидных продуктов, благодаря ее доступности и законодательной урегулированное™ этической стороны исследований. Такое биопроиз-

водство требует комплексного подхода к исследованию пептидных продукте сочетающего физико-химические методы разделения и идентификации.

Физико-химической основой хромато-масс-спектрометрического метод-является возможность совместно использовать результаты хроматографически и масс-спектрометрических исследований. При разработке физико-химически основ разделения какого-либо класса соединений проводят определение термо динамических характеристик адсорбции, таких как величины удерживания - 1 к, изменение свободной энергии Гиббса - AG, изменение энтальпии - ДН, изменение энтропии - AS, отражающих связь между структурой молекул и их физико-химическими свойствами (ван-дер-Ваальсов объём, липофильность, поляризуемость, дипольный момент). Использование разных вариантов ВЭЖХ для таких исследований позволяет устанавливать закономерности удерживания пептидных продуктов и на их основе разделять смеси и идентифицировать отдельные компоненты смесей, оценивать молекулярные массы исследуемых молекул, отделять соли и низкомолекулярные компоненты. Применение метода МАЛДИ-МС/МС позволяет получать информацию о массовых числах, фрагментации пептидных молекул, определять структурные особенности и, таким образом, быстро и эффективно устанавливать аминокислотные последовательности пептидов, используя два подхода к интерпретации масс-спектров: поиск по базам данных и de novo секвенирование (установление аминокислотной последовательности).

Цель и задачи исследований:

Целью работы являлось установление закономерностей хроматографиче-ского удерживания антимикробных пептидов GM, полученных с помощью иммунных реакций, в условиях метода ВЭЖХ и выбор оптимальных условий разделения и идентификации, с использованием хромато-масс-спектрометрии.

Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:

1. Определить физико-химические характеристики удерживания исследуемых пептидов (фактора удерживания, разности дифференциальных мольных энер-

гий Гиббса). Оценить соответствие хроматографического поведения пептидов закономерностям двух наиболее надежных подходов к описанию их удерживания в условиях градиентной обращённо-фазовой (ОФ) ВЭЖХ.

2. Определить условия проведения иммунизации СМ для получения пептидных смесей с высоким содержанием антибактериальных пептидов.

3. Разработать методологию хроматографического разделения смесей индуцированных пептидов, используя разные режимы и сорбенты; подобрать параметры хроматографического разделения.

4. Масс-спектрометрически идентифицировать антимикробные пептиды. Изучить фрагментацию антибактериальных пептидов методом МАЛДИ-МС/МС.

5. На основании данных хроматографического и масс-спектрометрического исследования разных пептидных смесей разработать методику определения их состава.

6. Провести антибактериальное тестирование, выявить активные пептиды среди всех полученных фракций и разработать способ идентификации охарактеризованных пептидных продуктов, не предполагающий обязательного проведения антимикробного теста.

Научная новизна:

1. Получены термодинамические характеристики адсорбции антимикробных пептидов, описывающие их разделение в условиях ОФ и катионообменной ВЭЖХ. По результатам сопоставления реальных и расчетных времен удерживания для ряда антибактериальных пептидов проведена их хроматографическая идентификация, в том числе на основании физико-химических характеристик адсорбции и корреляций, связывающих структуру пептидов с удерживанием.

2. Определены условия проведения иммунизации БМ и получения пептидных смесей с высоким содержанием антибактериальных пептидов.

3. Изучено несколько хроматографических режимов при исследовании пептидных продуктов на трех различных сорбентах и подобраны оптимальные условия разделения сложных смесей пептидов. Впервые проведена ВЭЖХ пептидных продуктов СМ на сильном катионите.

4. На основе MC/MC масс-спектров изученных пептидных продуктов иденти фицированы как известные антимикробные пептиды, так и не описанные ране в литературе. Масс-спектрометрически установлена аминокислотная последо вательность впервые обнаруженных антимикробных пептидов.

5. Сочетание хроматографических и масс-спектрометрических данных позво лило подробно изучить состав различных пептидных смесей, прошедших раз ную пробоподготовку. Показано, что в пептидной смеси, полученной без им мунизации, содержатся три известных антимикробных пептида, а в пептидны смесях, полученных после обработки 1.1-диметилгидразином (НДМГ) и его производным, бактериями В. cereus, детектированы все известные антимикробные пептиды GM и ряд не описанных ранее.

Практическая значимость работы:

Хроматографическое выделение антибактериальных пептидных продуктов может являться альтернативой многостадийному пептидному синтезу, а совершенствование данных процессов и разработка стандартизированных методик могут стать основой для их препаративного и промышленного выделения при создании лекарственных средств.

Изучение действия токсичных компонентов ракетного топлива (НДМГ) на биологические организмы является важной практической задачей. Использование для таких испытаний модельного организма GM может внести существенный вклад в понимание механизмов токсического действия и в разработку средств повышения безопасности ракетно-космической деятельности.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Физико-химические характеристики удерживания пептидов в условиях ОФ и катионообменной ВЭЖХ (фактор удерживания k, Ink и дифференциальные мольные энергии Гиббса и их разности AG). Результаты сопоставления экспериментальных и расчетных времен удерживания.

2. Способы хроматографического разделения смеси природных пептидов с антибактериальной активностью с использованием различных вариантов ВЭЖХ: катионообменного и обращенно-фазового.

3. Результаты идентификации аминокислотных последовательностей антимикробных пептидов, полученные на основе исследования МС/МС масс-спектров. Результаты de novo секвенирования для ряда пептидов в составе антибактериальных фракций.

4. Результаты комплексного исследования пептидных смесей методами жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии МАЛДИ-МС/МС, полученные на основе использования хроматографической информации, характеристик удерживания и установленных физико-химических закономерностей, для увеличения достоверности идентификации пептидов.

Апробация работы: Результаты исследований докладывались на IV Всероссийской конференции-школе «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и ее аналитические применения» (Москва, 2010), на Всероссийской научно-практической конференции «Хроматография - народному хозяйству» (Дзержинск, 2010), на XIII Всероссийском симпозиуме «Актуальные проблемы теории адсорбции, пористости и адсорбционной селективности» (Москва, 2009), на Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия» (Москва, 2008).

Публикации: По результатам исследования опубликовано 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК, и 8 тезисов докладов.

Структура и объем работы: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы из 246 наименований, материал изложен на 199 страницах машинописного текста, включает 78 рисунков и 29 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность исследований, сформулирована цель работы и отражена ее практическая значимость. Обоснована необходимость сочетания физико-химических методов, в первую очередь, ВЭЖХ и МАЛДИ-МС при исследовании пептидов.

Глава 1. Обзор литературы. Проанализированы возможности хромато-графических и масс-спектрометрических методов при изучении антимикроб-

ных пептидов. Рассмотрено применение методов ВЭЖХ для получения физико химических характеристик адсорбции, установления закономерностей удержи вания, а также выделения, очистки и идентификации пептидов. Из обзора рабо по применению метода МАЛДИ-МС следует, что его использование для детек тирования и идентификации пептидов эффективно и надежно. Проанализиро ваны преимущества масс-спектрометрии МАЛДИ-МС/МС пептидов.

По итогам обзора литературы выбрано основное направление исследований: изучение хроматографического поведения антимикробных пептидов на различных сорбентах, получение термодинамических характеристик адсорбции рассматриваемых пептидов, поиск физико-химических закономерностей разделения и масс-спектрометрическое изучение пептидных продуктов.

Глава 2. Экспериментальная часть. В качестве объекта исследования выступали антибактериальные пептиды личинок GM, антибактериальные пептиды природного (низин) и синтетического происхождения (аналог цекропина В) (табл. 1).

В работе использовали следующие приборы: жидкостной хроматограф Agilent 1200 (Agilent Technologies, США) с диодно-матричным детектором и программой обработки данных ChemStation Rus версия А. 10.02; масс-спектрометры с времяпролётными масс-анализаторами и ионизацией МАЛДИ серии Ultraflex фирмы Bruker (Германия), оснащенные УФ лазерами: азотным с рабочей длиной волны 337 нм и неодимовым (Nd) - 355 нм и программным обеспечением flexControl и flexAnalysis.

Хроматографическое разделение проводили на колонках: Zorbax Eclipse XDB-C18 15074.6 мм, 5 мкм, 80 А и Zorbax SCX-300 15074.6 мм, 5 мкм, 250 А (Agilent Technologies, США). Детектирование осуществляли при 210, 214, 280 нм. Условия хроматографирования приведены в таблицах 2 (представлены только наиболее эффективные режимы) и 3.

Образцы для проведения МАЛДИ готовили на мишенях типа Anchor Chip с размером лунок 600 мкм. В работе использовали матрицы: а-циано-4-гидроксикоричную кислоту и2.5-дигидрооксибензойную кислоту (Bruker).

Гидролиз пептидов проводили при помощи трипсина (Ргоше§а) в течение 18 ч при 37 °С, полученные растворы исследовали масс-спектрометрически.

Таблица 1. Объекты исследования - антибактериальные пептиды.

Название пептида (английкое/русское) и номер Аминокислотная последовательность (однобуквенный код") Масса, Д N* Pi"

1) Proline-rich antimicrobial peptide 1 Пролин-содержащий антимикробный пептид 1 DIQIP- GIKKPTHRDII1PNWNPNVRTQP WQRFGGNKS 4320 37 10.99

2) Lebocin-like anionic peptide 1 Лебоцин анионный пептид 1 EADEPLWLYK.GDNIERAPTTA DHPILPSIIDDVKLDPNRRYA 4816 42 4.51

3) Defensin (Galiomicin) 1 Дефензин DTLIGSCVWGATNYTSDCNAECK RRGYKGGHCGSFLNVNCWCE 4715 43 7.25

4) Proline-rich antimicrobial peptide 2 Пролин-содержащий антимикробный пептид 2 EIRLPEPFRFPSPTVPKPIDID-PILPHPWSPRQTYPIIARRS 4929 42 9.97

5) Cecropin-D-like peptide Подобный цекропину D пептид ENFFKEIERAGQRIRDAIISAAP AVETLAQAQKIKG GD 4253 39 6.45

6) Anionic antimicrobial peptide 2 Анионный антимиктобный пептид 2 ETESTPDYLKNIQQQLEEYTKN FNTQVQNAFDSDKIK-SEVNNFIESLGKILNTEKKEAPK 6975 60 4.80

7) Defensin-Iike peptide Подобный дефензину пептид DK.LIGSCVWGATNYTSDCNAE-CKRRGYKGGHCGSFWNVNCWCEE 4949 44 7.46

8) Cecropin-B-analog Аналог цекропина В WKVFKKIEKIGRNIRNGIVKAG -PLIAVLGEAKAL 3728 34 11.02

9) Nisin from Lactococcus lactis Низин из Lactococcus lactis ITSISLCTPGCKTGALMGCNMK -TATCCSmVSK 3354 33 9.31

10) Lysozyme Лизоцим ktftrcelvqalrrqgfdeaklrdwvclvene srgrtdivgkpnkncsrdyglfqindkywcsn tskagkdcnncsqlltddrrvaskcakkvykr hnfmawy-gwrnhcqnkplpdiskc 14027 121 9.53

11) 27 kDa hemolymph protein precursor Белок гемолимфы 27 кД dtlkaqckkngaedkaqdvenaaknfvecvk glfdfstikkeiedakpngaldevfgkycaksp qlktcihtlttsatpcleasvreqvgpinngad qlidf1cykdgdrialfiaeggpecfqekseg1ra caeklknnvgsveaaqsltlveqcgkydelta ciiksleecstptpgnmaeslfrfvrkgspcn-kaaplkn 23764 219 5.3

12) Apolipophorin-3 Аполипофорин-3 dastplqdleiomaefqktfseqnaftnskdtk efntalkegsdsvlqqlnalasslqkalndan gkakealeqtrtnlertaeelrrahpdveroa galrdrlotavqatvqetqklaktvganleet nkklaqiksayddfvkqaqevqkklheaask 0 18075 186 8.59

- число аминокислотных остатков в пептиде, **р1 - изоэлектрическая точка, Каждой аминокислоте в соответствии с международной классификацией присваивается определенная латинская буква для сокращения.

Масс-спектры получены в режиме регистрации положительных ионов, как в линейном режиме, так и с использованием рефлектрона; точность измеренных моноизотопных масс [МН]+ в режиме рефлектрона составляла 0.007 %,

точность измеренных средних масс в линейном режиме составляла 0.05-0.1 % точность измеренных масс фрагментов в режиме МС/МС составляла 1-2 Д. Таблица 2. Условия хроматографирования на Zorbax Eclipse XDB-C18.

Элюенты Режим градиентного элюи-рования Скорость элю-ента, термостат колонки Объем вводимой пробы, диапазон сбора фракций

0.04 %ТФУ (А)вводе-ацетонитрил (В) 2) 5-80 % В - 0-30 мин, 80100% -30-32 мин. 0.5 мл/мин 25 °С 20 мкл, 1-30 мин по 1 мин.

0.04 % ТФУ в воде (А)-0.04 % ТФУ в аиетонитриле (В) 3) 5-80 % В - 0-30 мин, 80100% -30-32 мин. 0.5 мл/мин 25 °С 60 мкл, 3-9 мин по 3 мин, 9-21,5 мин по 30 сек, 21,5-30,5 мин по 3 мин.

0.04 % ТФУ в воде (А)-0.04 % ТФУ в аиетонитриле (В) 4) 10 % В - 0-10 мин, 1080% В - 10-50 мин. 0.5 мл/мин 40 "С 100 мкл, 10-50 мин по 1 мин.

0.04 % ТФУ в воде (А)-0.04 % ТФУ в аиетонитриле (В) 5) 10 % В - 0-5 мин, 10-80% В - 5-45 мин. 0.5 мл/мин 25 °С 25 мкл, 545 мин по пикам.

Таблица 3. Условия хроматографирования HaZorbax SCX-300

Элюенты Режим градиентного элюи-рования Скорость элю-ента, термостат колонки Объем вводимой пробы, диапазон сбора фракций

0.1 % ТФУ в воде (А1-0.04 % ТФУ в аиетонитриле (В), 2 М NHjCl (С) 7) 95 % А, 5 % В - 0-10 мин, 5-75 % В, 0-25 % С -10-30 мин. 0.5 мл/мин 40 °С 500 мкл, 3-10 мин по 3,5 мин, с 10-30 мин по 1 мин.

0.1 % ТФУ в воде (А)-0.04 % ТФУ в аиетонитриле (В), 2 М Ш4СНЗСОО (С) 8) 95% А, 5 %В-0-10 мин, 5-75% В, 0-25 % С -10-30 мин. 0.5 мл/мин 40 °С 25 мкл, 5-10 по 5 мин, с 10-30 мин по 2 мин.

*ТФУ -трифторуксусная кислота

Идентификацию пептидов осуществляли при помощи программного пакета Mascot. Поиск проводили по данным МС/МС спектров в базе данных NCBI среди белков всех организмов без указания типа гидролиза или с указанием на трипсин. При помощи программы Biotools 3.0 (опция rapid de novo sequencing -быстрое определение аминокислотной последовательности) сделана разметка спектров по возможным аминокислотным последовательностям.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Оценка эффективности пробоподготовки. Для индукции биосинтеза антимикробных пептидов проведена иммунизация гусениц GM бактериями Е. coli, Bacillus cereus и их сочетанием, а также НДМГ и его гидразоном с ацетоном. Проведена пробоподготовка пептидных продуктов иммунной гемолимфы для дальнейшего хроматографического разделения с использованием твердофазной экстракции и колоночной гель-хроматографии. Показано, что примене-

ние данных методов позволяет значительно упростить и улучшить вид хрома-тограммы, однако практически не влияет на содержание пептидов во фракциях.

Установлено, что для количественного выделения антимикробных пептидов необходимо: иммунизировать не менее 50 гусениц СЛ/, использовать при этом концентрацию бактерий не выше 106 КОЕ, вводить каждой особи не более 0.5-1 мкл данной суспензии, либо иммунизировать веществами, вызывающими иммунный ответ, в нашем случае НДМГ и его производным в концентрации 0.01 %, также вводя каждой особи не более 0.5-1 мкл данного раствора; собирать гемолимфу, применяя ингибитор меланизации, ингибитор протеаз или метанол, проводить осаждение белков органическими растворителями, доводя их концентрацию до 80 %.

3.2. Сравнение различных методов хроматографирования пептидов и выбор оптимальных хроматографических условий.

Сравнительное исследование пептидных фракций гусеницы СМ методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Выполнено разделение пептидных продуктов методом ОФ ВЭЖХ. Проведено варьирование хроматографических параметров: скорости и состава подвижной фазы, температуры колонки, протяженности градиента, времени изократической промывки перед началом градиента. Реализованы 6 режимов градиентного элюирования.

Проведено сравнение хроматограмм, полученных в одинаковых условиях, для различных образцов пептидных смесей (рис. 1). Наблюдается усложнение хроматографических профилей в ряду пептидных смесей, полученных без иммунизации, после иммунизации Е.соН, после иммунизации Е.соН и В.сегеш, за счет увеличения интенсивности сигналов и появления новых пиков. Особенно сложный характер хроматограммы в последнем случае, по-видимому, обусловлен использованием сочетания двух бактерий, вызывающих развитие более интенсивного иммунного ответа, синтез новых соединений и деструктивные процессы.

В результате исследований подобраны оптимальные условия разделения и пробоподготовки антибактериальных пептидов методом ОФ ВЭЖХ (рис. 2).

Ч- 1ц 11

1#/

и

\л/\>

Рис. 1. Сравнение хроматографических профилей трех образцов пептидных смесей: 1 - без иммунизации, 2 — иммунизация Е.соИ, 3 - иммунизация В.сегеия и Е.соИ. Режим градиентного элюирования № 4. Детектирование при 210 нм.

Установлено, что антимикробные пептиды, являющиеся объектами исследования элюируются в условиях хроматографического режима № 2 (25 °С) в диапазоне концентраций ацетонитрила 35-55 %, в условиях хроматографического режима № 4 (40 °С) в диапазоне концентраций ацетонитрила 40-80 %, в условиях хроматографического режима № 5 (25 °С) в диапазоне концентраций ацетонитрила 45-75 %. Столь большие различия в элюирующих концентрациях ацетонитрила между хроматографическими режимами № 2 и 4, 5 обусловлены присутствием в ацетонитриле в двух последних случаях ТФУ (см. табл. 2), которая является ион-парным агентом и способствует постоянному рН в течение всего разделения. Различия в элюирующей концентрации ацетонитрила в случае градиентов № 4 и № 5 не столь велики и, по-видимому, связаны с изменением температуры.

Полученные хроматографические данные были сопоставлены с результатами, полученными на основе двух подходов к описанию закономерностей хроматографического разделения пептидов в градиентной ОФ ВЭЖХ и предсказанию их времен удерживания. Это аддитивная модель 88ЯСа1с, основная на

предположении, что разделение пептидов реализуется через адсорбционное взаимодействие всей аминокислотной цепочки с поверхностью твердой фазы, и модель ВюЬССС, которая представляет собой макромолекулярный подход, основанный на концепции критической хроматографии биомолекул. Результаты представлены в таблице 4.

mAU 1000 -

Intens. х10£

Intens хЮ8

Intens X10«

Intens х106

4600 4700 m/z

Рис. 2. ОФ ВЭЖХ антибактериальных пептидов. Режим градиентного элюирования № 5. Детектирование при 214 нм. Иммунизация B.cereus. Хроматографированию данного образца предшествовала твердофазная экстракция. Картридж Sep-Pak (Waters) уравновешивали водным раствором 0.05 % ТФУ, содержащим 10 % ацетонитрила. После нанесения пептид-содержащего раствора картридж промывали 5 мл уравновешивающего раствора, затем элюировали пептиды 1.5 мл 0.05 % водного раствора ТФУ, содержащим 50 % ацетонитрила.

Модель хроматографии в критических условиях для хроматографического режима № 2 наиболее адекватно описывает сорбционное поведение пептидов № 5, 6, а аддитивная модель - пептидов № 1, 2, 3, 5, 6.

Разделение для хроматографического режима № 4 не подчиняется закономерностям описанных моделей, за исключением пептида № 1. По-видимому, это происходит из-за повышенной температуры (40 °С), которая изменяет адсорбционное равновесие и не позволяет реализовать критический режим.

Модель хроматографии в критических условиях для хроматографическогс^ режима № 5 наиболее реально описывает сорбционное поведение пептидов ^ 1, 2, 4, а аддитивная модель - пептидов № 8, 1, 2, 4. Для данной системы разде-1 ления в отличие от системы разделения № 2 неадекватно описаны моделями| пептиды № 3, 5, 6. )

Таблица 4. Разделение пептидов в хроматографическом режиме № 5.

Номер пептида tR, мин tR, МИН tfc, мин BioLCCC 1 SSRCalc k 8(AG). Дж/моль

9 31.2 24.3 22.5 11.48 стандарт

8 28.3 30.5 ^TOfT -20

1 ГЩбT^Z 25.8 9.56 450

2 292 28.7 283 10.68 180

3 30.9 Ж6 25.5 ПТзё" 25

4 29.1 31.1 \22~ -190

5 35.2 26.2 30.6 LiM*L -320

6 37.2 25.2 зол ЦМ1- -470

12 41.7 24.5 314 -770

Полученные данные выступают в качестве одной из физико-химических | характеристик разделения антимикробных пептидов, т.к. существуют группы | пептидов, для которых удается добиться адекватного описания хроматографи-ческого поведения. Внутри этих групп возможно предсказание величин удер- | живания для целей идентификации. |

Для того чтобы количественно оценить содержание пептидов во фракциях 1 проведена калибровка колонки антибактериальным пептидом низином. Так, в ^ образце на рис. 3 содержание пептидов находится в пределах 1-10 мкг. Изучены | формы пиков для данного стандарта и установлена концентрация пептида, при | которой пик перестает быть регистрируемым. Для низина пороговое значение | чувствительности при 214 нм составляет 0.6 мкг.

Катионообменное ВЭЖХ исследование пептидов СМ Для проведения катионообменной ВЭЖХ условия разделения были подобраны таким образом, чтобы сначала реализовалось изократическое разделение и одновременная промывка от несорбирующихся (нейтральных и анионных) компонентов, а затем произошло элюирование одновременными градиентами соли и органиче-

ского растворителя. В эксперименте использовали две соли (хлорид и ацетат аммония); соответствующие профили элюирования были проанализированы, сопоставлены и найдены хроматографические отличия.

Выявлено, что известные антимикробные пептиды присутствуют во фракциях, собранных ближе к концу градиента, и начинают элюироваться с катио-нообменной колонки при концентрации соли выше 0.3 моль/л и после достижения 50 % концентрации ацетонитрила (рис. 3).

8. Детектирование при 280 нм. Иммунизация B.cereus. Хроматографированию образца предшествовала твердофазная экстракция, условия проведения которой те же, что и у образца на рис. 2.

В таблице 5 представлены рассчитанные факторы удерживания к и мольные дифференциальные энергии Гиббса относительно выбранного стандарта (пептид № 3), характеризующие процесс разделения на сильном катионите.

Как видно из таблицы 5, все известные антимикробные пептиды при рН 2, соответствующему элюенту 0.1 % ТФУ, который был использован для уравновешивания и начальной промывки, являются многозаряднымй катионами, однако порядок элюирования определяется не только ионными взаимодействиями заряженных частиц. По-видимому, имеют место также дисперсионные и спе-

цифические взаимодействия исследуемых пептидов с ароматическими сульфо-кислотами, привитыми к силикагельной матрице, которые также влияют на порядок выхода пептидов с колонки.

Таблица 5. Физико-химическая характеристика разделения в условиях хроматографического режима № 7.

Номер пептида Масса, Д tR, мин к 6(AG), Дж/моль Е280 z

Не описанные ранее пептиды 4897,4970 20.5 5.8 1240 + -

4 4929 22.7 6.6 885 6970 7

5(21-36)* 1651 24.6 7.2 675 - 2

2 4820 24.9 7.3 650 8250 6

Не описанный ранее пептид 3480 27.0 8 390 - -

7 4949 29.7 8.9 105 19990 6

6 6980 29.9 9 80 2560 8

3 4715 30.9 9.3 стандарт 14300 5

Moricin-like peptide В 1599 31.3 9.4 -25 - 4

5(1-17)* 2078 31.7 9.6 -75 - 4

1 (1-26)* 3035 33.3 10.1 -225 5690 5

1 4320 35.9 10.9 -410 11380 7

Не описанные ранее пептиды 6320,9170 36 8 11.2 -475 + -

Е280 - известный из литературы коэффициент экстинкции при 280 нм, z - заряд пептида при рН 2. Знак «-» означает, что данных о заряде и поглощении нет. Знак «+» означает, что поглощение при 280 нм наблюдается экспериментально. * При интерпретации масс-спектров пептидную цепь размечают по номерам аминокислотных остатков.

Физико-химические характеристики удерживания, используемые для построения корреляций со свойствами исследуемых пептидов. Для того чтобы более надежно идентифицировать исследуемые пептиды предлагается сопоставить порядок элюирования в ОФ ВЭЖХ с мерой их гидрофобности, которая может выражаться разными способами. В работе использована величина логарифма относительной гидрофобности log Р, рассчитанная для исследуемых пептидов с помощью модели SSRCalc.

Так, для процесса разделения пептидов с номерами 1,2, 8,4, 5, 6, 10, 11,12 (табл. 1) в режиме градиентного элюирования № 5 наблюдается линейная зависимость (рис. 4) логарифма фактора удерживания от рассчитанного логарифма относительной гидрофобности, log Р, которую можно описать следующим уравнением у=0.9624х+0.5925. Следовательно, используя это уравнение и логарифм относительной гидрофобности log Р, можно предсказывать времена удерживания пептидов в данных хроматографических условиях.

Однако, для пептидов № 9 и 3 наблюдаются отклонения от линейной зависимости, по-видимому, из-за того, что они имеют в первичной структуре 2 и 3 дисульфидные связи, которые влияют на их взаимодействие с неполярной поверхностью силикагеля С18, в то время как остальные исследуемые пептиды не

Рис. 4. Зависимость логарифма фактора удерживания от рассчитанного логарифма относительной гидро-фобности для процесса разделения пептидов с № 1, 2, 8, 4, 5, 6, 10, 11, 12 (табл. 1).

3.3. Сравнительное масс-спектрометрическое исследование и идентификация пептидов.

Изучение пептидного состава фракций после ОФ ВЭЖХ. Масс-спектрометрическое изучение фракций после ОФ ВЭЖХ позволило оценить, как прошла иммунизация и пробоподготовка, узнать состав антибактериально активных фракций и предположить, чем обусловлено биологическое действие: известными антимикробными пептидами или ранее неизвестными. В результате работы пептидный состав гемолимфы неиммунизированных личинок, а также личинок, обработанных различными иммунизирующими агентами, полностью охарактеризован в диапазоне масс 5-30 кД. Наряду с известными антимикробными пептидами (табл. 1), выявленными в каждом варианте иммунизации, обнаружено много новых пептидов, не представленных в базах данных и свидетельствующих о том, что на сегодняшний день организм СМ, по-прежнему, представляет большой теоретический и практический интерес как источник пептидных продуктов с антибактериальными свойствами. Среди не описанных ранее пептидных продуктов можно выделить индуцированные пептиды с массами 3480, 4898, 4970, 6320, 9170 Д, проявляющие антибактериаль-

17

содержат дисульфидных связей.

I

0.95 1 1.05 1.1 1.15 1.2 1.25 log k I

ные свойства. Установлено, что в гемолимфе неиммунизированных личинок также содержатся некоторые из изученных антимикробных пептидов, в частности пептиды № 2, 3, 6, 5. До начала наших работ в неиммунизированных гусеницах антимикробные пептидные продукты не обнаруживали.

Образование большого числа неизученных пептидов с массами преимущественно до 3 кД, а также фрагментов от известных антимикробных пептидов в случае иммунизации Bacillus cereus, может быть связано с протеазными механизмами защиты этой бактерии от разрушения или с экспрессией пептидов именно такого состава в результате иммунного ответа.

В случае иммунизации высокими концентрациями НДМГ и его гидразона наряду с индукцией антимикробных пептидов, также наблюдали большое число неизученных пептидов с массами преимущественно до 3 кД, по-видимому, образовавшихся в результате окислительно-восстановительной деструкции для случая НДМГ и иммунного ответа в случае его производного.

В результате проведенных экспериментов отмечена тенденция увеличения числа и разнообразия пептидных продуктов с увеличением концентрации иммунизирующего агента, от преимущественного преобладания известных антимикробных пептидов до «обогащения» множеством новых пептидов.

Изучение пептидного состава фракций после катионообменной ВЭЖХ. Масс-спектрометрическое исследование пептидов после катионообменной ВЭЖХ затруднено из-за высокого содержания солей. Однако после проведения перекристаллизации образца на мишени и использования двух матриц для МАЛДИ-МС были получены масс-спектры, позволившие оценить прохождение процесса катионообменной хроматографии и описать состав полученных фракций. В условиях режима градиентного элюирования № 7 идентифицированы известные антибактериальные пептиды, а также новые пептиды с антибактериальными свойствами, представленные в таблице 6. Кроме представленных на рис. 3 известных антибактериальных пептидов, в условиях режима градиентного элюирования № 8 был детектирован ряд не описанных ранее пептидов, про-

являющих антибактериальные свойства, среди них пептиды с массами 3480, 4898,4970 Д.

Идентификация антибактериальных пептидов по базам данных. С помощью поисковой машины Mascot для каждого пептида оценена вероятность случайного совпадения экспериментальных масс фрагментов из МС/МС масс-спектров с рассчитанными теоретическими значениями, аннотированными в базах данных. В результате на основе 130 исследованных МС/МС спектров установлено, что 14 пептидов относятся к организму GM, имеют индекс достоверности выше порогового значения и рассматриваются как точные идентификации, см. таблицу 6.

Таблица 6. Фрагменты известных антимикробных пептидов, идентифицированные в работе.

Номер пептида Аминокислотная последовательность найденного фрагмента Масса, Д Индекс достоверности (Score)

5 А АР A VETLA Q AQK1K. 1651 99

ENFFKEIERAGQRIRDAIISAAPAVET 3030 88

ENFFK.EIERAGQR 1623 34

ENFFKEIERAGQRIRDA2078 62

12 SAYDDFVKQAQEVQKKLH 2133 77

1 DIQIPGIKKPTHRD1IIPNWNPNVR 2933 53

DIQ1PGIKKPTHRDIIIPNWNPNVRT 3035 69

4 FRFPSPTVPKPIDIDP 1825 31

Moricin-like peptide В STAHDIISQFKPKK 1599 70

6 FDSDKIKSEVNNFIESLGKILNTEKKEAPK 3420 120

2 ADHPILPSIIDDVKLDPNRRYA 2517 39

TTADHPILPSIIDDVKLDPNRRYA 2719 29

Гидролиз антибактериальных пептидов и масс-спектрометрическое изучение продуктов гидролиза. Поскольку изучаемые антибактериальные пептиды - это крупные молекулы, для которых при проведении МС/МС исследования возникают трудности, связанные с длиной молекул, то для увеличения достоверности их идентификации проведен гидролиз трипсином и получены МС/МС масс-спектры для продуктов гидролиза.

В результате триптического гидролиза пептидов во фракциях и последующего изучения его продуктов и поиска по базам данных (табл. 7) удалось идентифицировать фрагменты пептидов № 4, 2, 5,6,11,12.

19

Таблица 7. Гидролиз антибактериальных пептидов и его продукты.

Номер пептида. Аминокислотная последовательность. Индекс достоверности (Score) Масса, Д. Аминокислотная последовательность продукта гидролиза

2 EABEPLffiYK-GDNJEK-APTTADHPILPSODD W-LDPNRR YA 184 1262 ЕАГ)ЕР1тУК. 1133 АОЕРЬ\УЬУК 1902 АРТТАШРП.Р51ГООУК

5 ENFFKEniRAGQR-iRmH5/MJ>/lVETL4(>/l()Ar-IIKGGD 164 2065 НШАШААРАУЕТЬАОАОК

4 Ш-LPEPFRFPSPTVPKPIDIDPILPHPWSPR-qXYmARRS 159 757 ЬРЕРге 1610ЬРЕРРШ>ЗРТУРК 871 РР5РТУРК 1751 РГОЮР1ЬРНРШ8РЯ 1198 Р1ЬРНР\VSPR 1028 ЮТЯРТУРК

6 ETESTPDYLKNIQQQLEEYTKNFNTQVQNAFDSDKIKSEVNNFIESLG X-ILNTEKKEAPK 422 1181 ЕТЕЗТРОУЬК 1392 ЫадОЕЕЕУТК 1626 МШС)УСгЫАРОЗОК. 1867 №ЫТдУСгЫАР050К1К: 1576ЖЖУИШЕБиЗК 1335 5ЕУШИЕ5ШК

12 DASTPLQDLEK-UAAEVQK-TFSEQLNAFTNSK-DTK- efntalkegsdsvlqqinalasslqk-alndaugk-akealeqtr- imJER-TAEELRR-AHPDVERQAGALR-DRLQTAVQATVQETQK-LAK-TVGAVLEEmKK-hAPQJK-SAmDFVK-QkqZVQYXLUE\AS¥.<} 18075 171 1215 ОАЗТРЬООЬЕК. 1485 ТРБЕрЕМАРТИЗК 821 ЕЮТЛЬК 1987 ЕС5О5УЬ0<ЗШАЕА551Х)К. 1044 АКЕАЕЕСЗТК 873 ТАЕЕЕЯК 1814 ОШЗТАУОАТУОЕТОК 1543 ЬОТАУОАТУдЕТОК 1302 ТУОАМ.ЕЕТ№СК. 943 БАУЛОРУК

Физико-химическая характеристика пептидов на основе масс-спектрометрических данных. МС/МС спектры. Масс-спектрометрия позволяет получать информацию о массовых числах молекулярных ионов пептидов. Спектры МС/МС очень характеристичны и позволяют идентифицировать пептиды. Таким образом, информация о молекулярной массе, времени удерживания и МС/МС масс-спектр однозначно характеризуют биомолекулу и позволяют при изменении условий пробоподготовки и разделения идентифицировать пептиды с высокой надежностью.

Фрагментация пептида № 2 имеет характерные особенности, заключающиеся в преимущественном разрыве пептидной связи между тремя парами аминокислот DH, DD, DP (D - аспарагиновая кислота, Н - гистидин, Р - про-лин). По-видимому, именно здесь локализован отрицательный заряд, в силу чего протонирование этих участков первичной структуры облегчено.

'л: • та]

£1*4V7 -...............................................л- С i :'

f t-R-4-R4NtPtDfl + K4VtD»Dt-t-i"l4 i А

И >'p i'frfi

•»i.4Pi&m-H0<0«v»K4U0is," ни »-< ' -

.V KIE-UliDl j-YJ : r5- .i ID„ E-t L p

У 30

M t;

! bv] ) i) i: iyia!

Y?,

jfc }•'• ¡У 16 у '13 ; ь Ii у 19

У 57

у 34 ij

>f

N

v 33' .V«

"6r2 b'

f5)| y? i у

H Jo 7 , !

Ii

ii у 12 V 1

j t>;.3 ^ i 29 >33 t я i »J3 I 1

i ' " S l. t'« liiS " }i 6

Ö00 1000 1SC0 200D 2500 3000 3600 4 ООО 4500 Ö00I

Рис. 5. MC/MC спектр фрагментации пептида № 2.

В составе антимикробных фракций пептидных продуктов присутствуют два не описанных ранее пептида 4897 и 4967 Д, различающиеся концевым фрагментом 72 Д, МС/МС спектр фрагментации которых (рис. 6) имеет сходство с фрагментацией пептида № 2. Также ярко выражены три разрыва пептидной связи, по-видимому, обусловленные аспарагиновыми и глутаминовыми кислотами. Можно предполагать, что эти пептиды имеют анионный характер. Однако разрывы локализованы в иных положениях первичной структуры, чем у пептида № 2 и, следовательно, данные пептиды не являются его производными.

1 50 1 25

1 00 О 75 О 50 0.25

<м <п <g rv J § s I hemaf/m о ph6_msms4897\O_H4ÜV4097.OOOO.UFT\fa5t А Я 8 о. S « S J 1 lJL!_JLiJLAi

£ Т I I ---------J* CS So hematirn Я й ph6_m5ms4970\0_H4\D\49?O.CX300.LlFT\fas{ Б да £ Р S g 8 & - 1 ^

500 1000 1500 200 О 2S00 3000 3500 4000 4500

mfi

Рис. 6. МС/МС спектры фрагментации не описанных ранее индуцированных пептидов 4897 (А) и 4967 (Б) Д.

Применение алгоритмов секвенирования de novo для идентификации пептидов GM. Применение алгоритмов секвенирования de novo для масс-спектров МС/МС требует равномерного разбиения по ионам. Однако это не всегда возможно, поскольку первичные структуры пептидов и способность к протонированию аминокислот различны. Результаты определения аминокислотной последовательности по фрагментным ионам представлены в таблице 8. На рисунке 7 представлен масс-спектр пептида 1359 Д и его предполагаемая аминокислотная последовательность RRGNDNFRLDP.

Для увеличения достоверности идентификации каждая полученная аминокислотная последовательность была протестирована на соответствие экспериментального и рассчитанного с помощью модели SSRCalc времени удерживания согласно критерию из работы1. Найденные корреляции экспериментальных и теоретических времен удерживания свидетельствуют о потенциальной возможности пептидов описанного состава удерживаться на сорбенте в соответствии со своей относительной гидрофобностью, что соответствует определенному экспериментально времени удерживания.

Таблица 8. Предполагаемые аминокислотной последовательности новых пептидов в составе антибактериальных фракций, полученные на основе МС/МС масс-спектров.

№ Масса, Д Аминокислотная последовательность (однобуквенныи код)

1 1106 PTDERLGYR

2 1211 CAELEKWWF

3 1233 RELESTLETR

4 1241 GLSVAQGRDALPG

5 1359 RRGNDNFRLDP

6 1523 WRSPSNPYPYKK

7 1783 KHESESEFLSESTQF

8 1591 HPTVVAYYCPMYF

9 1928 RMNYAASPFPSAHPHFV

10 1947 LYYKKKYKSNYHPNT

И 2107 DWPTTHTWLFHGKTWPP

12 2185 KAPETESGAAGGGSHSCVRSPLS

13 2340 GGASGHFNPYDYSYPNSPKWP

15 2559 CMSMWMCGKSSRIRYMMIHAH

16 2563 DHWWLSRVNEGCVRSKDLEHP

18 3255 PGAYYMMKAEMSVTYTACDEAKNYKRFS

21 4047 RHALASLKDYTGTNKNHETHDKSKGCWWVSVVCYL

1 Тарасова А.И., Зубарев P.A., Голобородько A.A., Горшков A.B., Горшков М.В. Идентификация пептидов по хромато-масс-спектрометрическим данным с использованием расчета времен удерживания // Масс-спектрометрия, 2008. - Т. 5 (№. 1). - С. 7-22.

S№S. tnt ■ 1000!

Y1CM

ом г:б

У7В6 v-1 г г

R

I R

116 ¥1

1

_GNON y»6

rp-'..___

ImI e

FRLD

'»5ы0

1048 У-

У1 : у 5 7 2 !

£-55 V 1? 7

«77 V7

.U,I U...L..I

ilLk.

■ sio

56 ! ¡•Si. :

Ml

У 1С:

1000

1133

Mi

12J5

»to

1360 у 11

Рис. 7. Пример масс-спектрометрического секвенирования de «ovo пептида с массой 1359 Д.

3.4. Сочетание хроматографической и масс-спектрометрнческой идентификации. Для хроматографического режима № 2 обнаружены удовлетворительные корреляции экспериментальных и расчетных времен удерживания для пептидов № 3, 5, 6, 12 (табл. 1), а также для новых пептидов № 1, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9,10,11, 12,13, 16, 18, 21 (табл. 8) с предложенными в работе аминокислотными последовательностями (SSRCalc) (рис. 8).

о. «

2 и

EI IU 2

ф а a s

5*5

FP = o.e

10 15 20 25

Экспериментальное время удержвания, мин

I Рис. 8. Корреляции экспериментальных и рассчитанных по модели БВЯСак времен удерживания известных и не описанных ранее пептидов №1,3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,16, 18,21 (табл. 8) для хроматографического режима № 2.

При разделении в условиях режима № 5, хроматографическое поведение пептидов № 5, 6, напротив, описывается неточно, однако для других антибактериальных пептидов наблюдаются хорошие корреляции экспериментальных и

расчетных времен удерживания (табл. 4). Такие зависимости получены для пептидов № 8,1,4,2,10 (SSRCalc) и для пептидов № 8,1, 4, 2 (BioLCCC).

Важной характеристикой, подтверждающей достоверность масс-спектрометрической идентификации не описанных ранее пептидов, является наличие зависимости порядка элюирования от гидрофобности, рассчитанной для полученных последовательностей аминокислот. Для процесса разделения пептидов с номерами 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 15, 18 (табл. 8) в режиме градиентного элюирования № 3, получена корреляционная зависимость у = 1.7959х - 0.2683 (рис. 9) логарифма фактора удерживания от рассчитанного с помощью модели SSRCalc логарифма относительной гидрофобности, log Р.

2

1.8 -

1.6 -

1.4

0.

ci 1 '/

о

1

0.8

0.6 -

0.4 -

у= 1.7959Х-0.2683 R2 = 0.963

0.65

0.75

0.85 0.95 log к

1.05

Рис. 9. Зависимость логарифма фактора удерживания от рассчитанного логарифма относительной гидрофобности для аминокислотных последовательностей, не описанных ранее пептидов № 1, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 15, 18 (табл. 8), идентифицированных в работе.

Порядок элюирования антибактериальных пептидов с используемого в работе сорбента был сопоставлен с порядком элюирования данных пептидов с сорбента 8ире1соз11 ЬС-18, который известен из литературы2. Для антимикробных пептидов № 1, 2, 3, 4, 5, 6 (из табл. 1) получены высокие корреляции для соответствия порядков элюирования. Различие в удерживании на данных сорбентах наблюдается для пептида № 12. На сорбенте Бире1соз11 ЬС-18 указанный пептид удерживается слабее, чем пептиды № 5, 6. По-видимому, это связано с тем, что пептид является многозарядным (г = 27) в кислой среде, и поэтому на процесс его элюирования влияют полярные и ионные взаимодействия. Сорбент 2огЬах ХОВ-С18 имеет полностью гидрофобную поверхность и поэтому удер-

Cytrynska M„ Mak P., Zdybicka-Barabas A., Suder P., Jakubowicz T. Purification and characterization of eight peptides from Galleria mellonella immune hemolymph // Peptides Rev. 2007 - V. 285,- P. 533-546.

живание пептида № 12 в большей степени определяется дисперсионными взаимодействиями. При хроматографировании антимикробных пептидов, осуществленном в указанной работе, не удалось разделить пептиды № 3, 4, 7. В нашей работе в условиях 40-минутных градиентов (режимы № 4, 5) такое разделение достигнуто, что позволяет увеличить надежность их идентификации. Выводы:

1. Определены физико-химические характеристики удерживания исследуемых антибактериальных пептидов (фактор удерживания, разности дифференциальных мольных энергий Гиббса). Показано, что для ряда антибактериальных пептидов наблюдается удовлетворительная корреляция между расчетными и экспериментальными временами удерживания.

2. Определены условия проведения иммунизации GM и получения пептидных смесей с высоким содержанием антибактериальных пептидов. Твердофазная экстракция с использованием картриджа Sep-Pak С18.

3. Подобраны условия разделения антибактериальных пептидов при разных хроматографических режимах с использованием различных сорбентов. Показано, что антибактериальные пептиды следует разделять на катионообменных и обращенно-фазовых силикагелевых сорбентах.

4. Проведена идентификация антимикробных пептидов методом масс-спектрометрии МАЛДИ-МС/МС. Идентифицированы 20 известных антимикробных пептидов и 22 не описанных ранее, для которых установлены аминокислотные последовательности.

5. Установленные физико-химические закономерности хроматографического разделения и масс-спектрометрическая идентификация пептидных продуктов разных пептидных смесей позволили охарактеризовать пептидный состав, детектировать появление не известных ранее пептидных компонентов (94 пептида), установить постоянно присутствующие в гемолимфе GM пептиды (5 пептидов) и выявить пептиды, индукция которых не зависит от варианта иммунизации (7 пептидов).

Основное содержание диссертации отражено в следующих публикациях:

1.Срибная О.С., Пурыгин П.П., Буряк А.К. Особенности разделения биологически активных компонентов пчелиной огневки методом эксклюзионной ионообменной хроматографии и гель-электрофореза // Сорбционные и хроматографические процессы. -2008. - Т.6.(Вып. 6) - С.893-902.

2. Срибная О.С., Пурыгин П.П., Буряк А.К. Сравнение результатов исследования гемолимфы иммунизированных и неиммунизированных личинок Galleria mellonella // Биомедицинская химия. - 2009. - Т. 55.(Вып. 6) - С. 713-726.

3. Срибная О.С., Пурыгин П.П., Буряк А.К. Анализ и антибактериальная активность фракций гемолимфы иммунизированных личинок Galleria mellonella // Хим.-фарм. журнал. -2010. -Т. 44.(№ 1.) - С. 51-55.

4. Срибная О.С., Пурыгин П.П., Буряк А.К. Изучение пептидного состава антибактериально активных фракции методами жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии //Биомедицинская химия. -2010. - Т. 56 (Вып. 3) - С. 387-396.

5. Срибная О.С., Пурыгин П.П., Буряк А.К., Литвинова Е.Г., Клёнова H.A. Сравнительное исследование пептидов фракций гемолимфы Galleria mellonella // Биохимия. -2010. -Т. 75 (Вып. 9)-С. 1305-1313.

6.Срибная О.С., Буряк А.К., Серебрякова М.В. Применение тандемной масс-спектрометрии для идентификации антибактериальных пептидов гусеницы Gallería mellonella // III Всероссийская конференция «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы». - Москва, 2009. - С. 76.

7. Срибная О.С., Пурыгин П.П., Буряк А.К. Применение ВЭЖХ в сочетании с масс-спектрометрией для поиска и идентификации новых антибактериальных пептидов // Всероссийская конференция с международным участием «Теория и практика хроматографии. Хроматография и нанотехнологии». - Самара, 2009. - С. 198.

8. Срибная О.С. Создание модели биологически активного пептида на основе антибактериальных и противогрибковых пептидов Gallería mellonella // Всероссийская заочная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы естественных наук». -Тамбов, 2009.-С. 52-56.

9. Срибная О.С., Буряк А.К., Серебрякова М.В. Разделение, идентификация и секве-нирование de novo пептидов гусеницы большой восковой моли с использованием ВЭЖХ и масс-спектрометрии МАЛДИ-ТОФ-ТОФ // IV Российский симпозиум «Белки и пептиды». - Казань, 2009. - С. 299.

Ю.Срибная О.С. Твердофазный синтез модельного тетрапептида как структурного элемента антимикробных пептидов Galleria mellonella II IV Российский симпозиум «Белки и пептиды». - Казань, 2009. - С. 309.

11.Срибная О.С. Пурыгин П.П., Буряк А.К. Многомерное разделение смеси природных биологически-активных пептидов на фракции на сорбенте с пористой структурой // XIII Всероссийский симпозиум «Актуальные проблемы теории адсорбции, пористости и адсорбционной селективности». - Москва, 2009 - С.69.

12.Срибная О.С., Пурыгин П.П., Буряк А.К. Масс-спектрометрический анализ фракций гемолимфы иммунизированных личинок Galleria mellonella // Всероссийский симпозиум «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия». - Москва, 2008 - С. 73.

13.Срибная О.С., Пурыгин П.П., Буряк А.К., Серебрякова М.В. Применение ВЭЖХ для разделения пептидных продуктов с антибактериальными свойствами // Всероссийская научно-практическая конференция «Хроматография - народному хозяйству». -Дзержинск, 2010. - С. 57.

Подписано в печать 18 ноября 2010 г. Формат 60? 84/16. Бумага офсетная. Печать оперативная. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 1915. 443011, г. Самара, ул. Академика Павлова, 1 Отпечатано УОП СамГУ

Л

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ (ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ПРИ ВЫДЕЛЕНИИ И ОПРЕДЕЛЕНИИ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ).

1.1. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ РАЗДЕЛЕНИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ

1.1.1. Гель-проникающая колоночная хроматография и твердофазная экстракция как начальные этапы очистки пептидов.Л

1.1.2. Применение ВЭЖХ для установления физико-химических характеристик удерживания пептидов и условий их определения на силикагеле С18 и пористом графитированном углероде Гиперкарб.

1.1.3. ВЭЖХ исследование пептидов на катионообменных носителях.

1.1.4. Физико-химические основы хроматографической идентификации пептидов.

1.1.5. Физико-химические характеристики удерживания и их корреляции со свойствами исследуемых молекул.

1.2. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ ПЕПТИДОВ.

1.2.1. Основные используемые в масс-спектрометрии пептидов методы ионизации и типы масс-анализаторов.

1.2.2. Пробоподготовка и ионизация пептидов в методе МАЛДИ.

1.2.3. Особенности фрагментации пептидов в условиях получения МАЛДИ-МС/МС спектров.

1.2.4. Структурная информация, получаемая на основе МС/МС спектров и ее использование для идентификации пептидов.

1.2.5. Масс-спектр как физико-химическая характеристика пептида.

1.3. АНТИМИКРОБНЫЕ ПЕПТИДЫ: СВОЙСТВА, ЗНАЧЕНИЕ И МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ.

1.3.1. Значение и свойства антимикробных пептидов.

1.3.2. Пептиды в насекомых.

1.3.3. Биологическое тестирование.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Реагенты и оборудование.

2.2. Объекты и пробоподготовка.

2.3. Методики проведения физико-химического эксперимента.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОБОПОДГОТОВКИ.

3.2. АНТИМИКРОБНЫЙ ТЕСТ И ЕГО РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.3. СРАВНЕНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ХРОМАТОГРАФИРОВАНИЯ ПЕПТИДОВ И ВЫБОР ОПТИМАЛЬНЫХ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ УСЛОВИЙ.

3.3.1. Катионообменная гель-хроматография пептидов гусеницы Gallería mellonella на сефадексе СМ-50.

3.3.2. Сравнительное исследование пептидных фракций гусеницы Gallería mellonella методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.

3.3.3. Катионообменное ВЭЖХ исследование пептидов Gallería mellonella.

3.3.4. ВЭЖХ исследование пептидов гусеницы Gallería mellonella на сорбенте Гиперкарб и молекулярно-статистическая оценка теплот адсорбции пептидов

3.3.5. Физико-химические характеристики удерживания, используемые для построения корреляций со свойствами исследуемых пептидов.

3.4. СРАВНИТЕЛЬНОЕ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПЕПТИДОВ.

3.4.1. Изучение антибактериальных пептидных фракций после катионообменной гель-хроматографии методом МАЛДИ.

3.4.2. Изучение пептидного состава фракций после обращенно-фазовой ВЭЖХ для разных пептидных смесей.

3.4.3. Изучение пептидного состава фракций после катионообменной ВЭЖХ для разных пептидных смесей.

3.4.4. Идентификация пептидов Galleria mellonella по базам данных.

3.4.6. Гидролиз пептидов трипсином в антибактериальных фракциях и масс-спектрометрическое изучение продуктов гидролиза.

3.4.7. Применение алгоритмов секвенирования de novo для идентификации пептидов гусеницы Galleria mellonella.

3.4.8. Физико-химическая характеристика пептидов на основе массспектрометрических данных. МС/МС спектры.

3.5. СОЧЕТАНИЕ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ И МАСС

СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ.

Актуальность исследования. В связи с резким ростом числа новых органических соединений пептидной природы, полученных при секвенировании, проблема установления взаимосвязи между физико-химическими свойствами этих пептидов и их структурой является одной из наиболее актуальных в жидкостной хроматографии. Наиболее информативными в этом плане являются современные варианты высокоэффективной жидкостной хроматографии ВЭЖХ, с применением матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации МАЛ-ДИ и масс-селективного детектирования, особенно в тандемном варианте. В настоящее время теория сорбции и разделения органических, а тем более биоорганических, соединений находится практически в стадии разработки, что требует детального изучения адсорбционных свойств большого числа таких соединений, в частности, пептидов. Физико-химическое обоснование процессов в системе сорбат-сорбент-элюент в основном носит описательный характер. В связи с этим такие исследования важны, поскольку накопление физико-химических данных по удерживанию в условиях ВЭЖХ позволяет создавать модели физико-химического поведения соединений и обосновывать оптимальные условия разделения сложных смесей данным методом, а в сочетании с масс-спектроскопией - проводить идентификацию компонентов сложных смесей пептидов.

Актуальной задачей современной химии, биологии и медицины является поиск эффективных антибактериальных средств. Особый интерес представляют антимикробные пептиды, обнаруженные у млекопитающих, насекомых и растений [1]. Данные пептиды являются компонентами неспецифических врождённых механизмов борьбы с инфекциями.

Очень высок потенциал некоторых насекомых для химической и фармацевтической индустрии: область применения - от модельных систем в фармакологических исследованиях до источников новых антибиотиков, биологически активных веществ для защиты растений и ценных химических соединений. Пептидные продукты, получаемые на основе иммунных реакций насекомых, проявляют широкий спектр биологической активности и могут стать основой для разработки новых фармакологических средств.

Врождённая иммунная система восковой моли (Gallería mellonella) производит множество пептидов для защиты от болезнетворных микробов. Из гусеницы Gallería mellonella выделили ряд пептидов бактерицидного и противогрибкового действия. Перспективным является использование Gallería mellonella в качестве модельной системы биосинтеза антибактериальных пептидных продуктов, благодаря ее легкодоступное™ и тому, что этическая сторона исследований урегулирована законодательно. Однако такое биопроизводство требует комплексного подхода к анализу пептидных продуктов, сочетающего высокоэффективные методы разделения и идентификации.

В настоящее время одним из наиболее информативных методов анализа пептидов является хромато-масс-спектрометрия. Разнообразные масс-спектрометрические методы активно используются в физико-химических исс исследованиях, поскольку позволяют быстро и эффективно устанавливать аминокислотные последовательности полипептидов, используя два подхода к анализу и интерпретации масс-спектров: поиск по базам данных и масс-спектрометрическое установление аминокислотной последовательности {de novo секвенирование). Одним из наиболее привлекательных методов для проте-омного анализа является масс-спектрометрия матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (МАЛДИ), поскольку обладает чувствительностью, экспрессностью и информативностью.

Использование высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для разделения сложных смесей пептидов позволяет разделять смесь на отдельные компоненты, опираясь на закономерности удерживания, оценивать молекулярные массы исследуемых молекул, отделять соли и низкомолекулярные компоненты. Такая хроматографическая пробоподготовка позволяет упростить масс-спектрометрический анализ. Комбинация метода ВЭЖХ с тандемной масс-спектрометрией является эффективным инструментом анализа пептидных смесей, позволяющим идентифицировать биомолекулы с высокой чувствительностью и скоростью.

Физико-химической основой хромато-масс-спектрометрического метода является возможность совместно использовать результаты хроматографических и масс-спектрометрических исследований. В таких исследованиях хроматогра-фическим методом определяют термодинамические характеристики адсорбции, такие как величины удерживания k, AG - изменение свободной энергии, АН -изменение энтальпии, AS - изменение энтропии, отражающие связь между структурой и их хроматографическими и термодинамическими характеристиками (липофильность, lnk, AG). Масс-спектрометрическим методом изучают масс-спектры в разных режимах ионизации, что позволяет получать информацию о массовых числах и фрагментации молекул. Структурные особенности определяют с помощью тандемной масс-спектрометрии.

В связи с этим актуальным является создание физико-химических основ разделения и идентификации пептидных продуктов, полученных на основе иммунных реакций Gallería mellonella, включающее разработку комплекса высокоэффективных методов анализа пептидных продуктов, оптимизацию условий пробоподготовки и выделения целевых продуктов.

Научная новизна:

1. Получены термодинамические характеристики адсорбции антимикробных пептидов, описывающие их разделение в условиях ОФ и катионообменной ВЭЖХ. По результатам сопоставления реальных и расчетных времен удерживания для ряда антибактериальных пептидов проведена их хроматографическая идентификация, в том числе на основании физико-химических характеристик адсорбции и корреляций, связывающих структуру пептидов с удерживанием.

2. Определены условия проведения иммунизации Gallería mellonella и получения пептидных смесей с высоким содержанием антибактериальных пептидов.

3. Изучено несколько хроматографических режимов при исследовании пептидных продуктов на трех различных сорбентах и подобраны оптимальные условия разделения сложных смесей пептидов. Впервые проведена ВЭЖХ пептидных продуктов Galleria mellonella на сильном катеоните.

4. На основе МС/МС масс-спектров изученных пептидных продуктов идентифицированы как известные антимикробные пептиды, так и не описанные ранее в литературе. Масс-спектрометрически установлена аминокислотная последовательность впервые обнаруженных антимикробных пептидов.

5. Сочетание хроматографических и масс-спектрометрических данных позволило подробно изучить состав различных пептидных смесей, прошедших разную пробоподготовку. Показано, что в пептидной смеси, полученной без иммунизации, содержатся три известных антимикробных пептида, а в пептидных смесях, полученных после обработки 1.1-диметилгидразином (НДМГ) и его производным, бактериями В. cereus, детектированы все известные антимикробные пептиды Galleria mellonella и ряд не описанных ранее.

Практическая значимость:

Хроматографическое выделение антибактериальных пептидных продуктов может являться альтернативой многостадийному пептидному синтезу, а совершенствование данных процессов и разработка стандартизированных методик могут стать основой для препаративного, а в перспективе и промышленного выделения и создания лекарственных средств.

Изучение действия токсичных компонентов ракетного топлива (НДМГ) на биологические организмы является важной практической задачей. Использование для таких испытаний модельного организма Galleria mellonella может внести существенный вклад в понимание механизмов токсического действия и в разработку средств повышения безопасности жизнедеятельности.

Цель и задачи исследований:

Целью работы являлось установление закономерностей хроматографиче-ского удерживания антимикробных пептидов Galleria mellonella, полученных с помощью иммунных реакций, в условиях метода ВЭЖХ и выбор оптимальных условий разделения и идентификации, с использованием хромато-масс-спектрометрии.

Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:

1. Определить физико-химические характеристики удерживания исследуемых пептидов (фактора удерживания, разности дифференциальных мольных энергий Гиббса). Оценить соответствие хроматографического поведения пептидов закономерностям двух наиболее надежных подходов к описанию их удерживания в условиях градиентной обращённо-фазовой (ОФ) ВЭЖХ.

2. Определить условия проведения иммунизации Gallería mellonella для получения пептидных смесей с высоким содержанием антибактериальных пептидов.

3. Разработать методологию хроматографического разделения смесей индуцированных пептидов, используя разные режимы и сорбенты; подобрать параметры хроматографического разделения.

4. Масс-спектрометрически идентифицировать антимикробные пептиды. Изучить фрагментацию антибактериальных пептидов методом МАЛДИмс/мс.

5. На основании данных хроматографического и масс-спектрометрического исследования разных пептидных смесей разработать методику определения их состава.

6. Провести антибактериальное тестирование, выявить активные пептиды среди всех полученных фракций и разработать способ идентификации охарактеризованных пептидных продуктов, не предполагающий обязательного проведения антимикробного теста.

ВЫВОДЫ

1. Определены физико-химические характеристики удерживания исследуемых антибактериальных пептидов (фактор удерживания, разности дифференциальных мольных энергий Гиббса). Показано, что для ряда антибактериальных пептидов наблюдается удовлетворительная корреляция между расчетными и экспериментальными временами удерживания.

2. Определены условия проведения иммунизации Gallería mellonella и получения пептидных смесей с высоким содержанием антибактериальных пептидов: твердофазная экстракция с использованием картриджа Sep-Pak С18.

3. Подобраны условия разделения антибактериальных пептидов при разных хроматографических режимах с использованием различных сорбентов. Показано, что антибактериальные пептиды следует разделять на катионообменных и обращенно-фазовых силикагелевых сорбентах.

4. Проведена идентификация антимикробных пептидов методом масс-спектрометрии МАЛДИ-МС/МС. Идентифицированы 20 известных антимикробных пептидов и 22 не описанных ранее, для которых установлены аминокислотные последовательности.

1. Установленные физико-химические закономерности хроматографического разделения и масс-спектрометрическая идентификация пептидных продуктов разных пептидных смесей позволили охарактеризовать пептидный состав, детектировать появление не известных ранее пептидных компонентов (94 пептида), установить постоянно присутствующие в гемолимфе Gallería mellonella пептиды (5 пептидов) и выявить пептиды, индукция которых не зависит от варианта иммунизации (7 пептидов).

БЛАГОДАРНОСТИ

Осуществление данной работы оказалось возможным благодаря помощи многих людей, которым автор выражает свою глубокую признательность.

Автор искренне благодарен своему научному руководителю, заведующему кафедрой органической, биоорганической и медицинской химии СамГУ, заслуженному деятелю науки и техники Пурыгину Петру Петровичу.

Хотелось бы также выразить благодарность Кленовой Наталье Анатольевне, профессору кафедры биохимии СамГУ, оказавшей существенную помощь при анализе антимикробной активности.

Большое спасибо Серебряковой Марине Васильевне, специалисту по масс-спектрометрии из Института физико-химической медицины РАМН за обучение базисным методам и непосредственное участие в проведении исследования.

Особую благодарность автор адресует профессору Буряку Алексею Константиновичу, заведующему лабораторией физико-химических основ хроматографии и хромато-масс-спектрометрии ИФХЭ РАН, в которой была выполнена основная экспериментальная часть диссертационной работы; творческая и доброжелательная атмосфера этой лаборатории очень помогла автору при прове- -дении исследований и написании работы. Автор благодарит также сотрудников лаборатории ИФХЭ РАН за обучение методам лабораторной работы и организационную помощь.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выбранные нами объекты исследования - антимикробные пептиды являются сложными веществами для проведения физико-химических исследований из-за гетерогенной и полярной природы, однако представляют интерес в силу потенциальной биологической ценности. Важность выделения антибактериальных пептидов из природных источников связана с тем, что синтетические их аналоги могут не обладать антимикробной активностью из-за отсутствия стабилизации активной конформации посттрансляционными модификациями (т.е. химическими модификациями на последней стадии процесса биосинтеза белка).

Исследование антибактериальных пептидов проводилось по нескольким направлениям: применялись различные хроматографические режимы и сорбенты, для каждого режима оценивались термодинамические и кинетические характеристики сорбции, на основании физико-химических свойств проводился поиск закономерностей разделения, и осуществлялся поиск соответствия хро-матографического поведения современным представлениям о механизме разделения на обращенной фазе в градиентном режиме.

В результате работы подобраны физико-химические условия эффективного разделения антимикробных пептидов, позволяющие их количественно выделить, на двух сорбентах (на силикагеле С18 и сильном катионите). Показано, что применяемые в работе хроматографические режимы не позволяют провести элюирование антибактериальных пептидов с поверхности пористого графити-рованного углерода, поскольку теплоты адсорбции этих пептидов очень велики. Данный вывод подтверждается теоретическим расчетом и экспериментом. Сделано предположение, что разделение может быть достигнуто при переводе пептидов в глобулярную форму.

Полученные в работе корреляционные зависимости отражают закономерности хроматографического поведения сорбатов, а также связь удерживания и первичных структур антибактериальных пептидов.

В работе комплексно решена задача разделения и определения антибактериальных пептидов в составе сложных смесей. Решение этой задачи* основано на совместном использовании результатов хроматографических и масс-спектрометрических исследований и выборе оптимальных условий-разделения и пробоподготовки антибактериальных пептидных продуктов. По результатам работы предложен способ выделения и разделения антибактериальных пептидов, включающий в свою теоретическую часть определение значений физико-химических характеристик удерживания исследуемых антибактериальных пептидов (фактора удерживания, разности дифференциальных мольных энергий Гиббса), корреляционные зависимости между расчетными и реальными временами удерживания, зависимости, отражающие взаимосвязь структура-удерживание и порядок элюирования, а также данные о масс-спектрометрической фрагментации в условиях получения одномерных масс-спектров и масс-спектров МС/МС.

Созданный нами способ выделения антибактериально активных фракций позволяет получать достаточные количества пептидов из этих фракций для проведения широкомасштабных исследований их физико-химических и биолог гических свойств. Результаты проведенных исследований позволяют говорить о том, что разработаны физико-химические основы разделения и идентификации пептидных продуктов с антибактериальными свойствами на примере Galleria mellonella.

1. Bulet P., Stocklin R., Menin L. Antimicrobial peptides: from invertebrates to vertebrates // Immunol. Rev. 2004. V. 198. - P. 169-184.

2. Bulet P., Dimarcq J. L., Hetru C., Lagueux M., Charlet M., Van Dorsselaer A., Hoffmann, J. A. A novel inducible antibacterial peptide of Drosophila carries a O-glycosylated substitution I I J. Biol Chem. 1993. - V. 268 (14). - P. 893-897.

3. Cociancich S., DuPont A., HCgy G., Lanot R., Holder F., Hetru C., Hoffinann J. A., Bulet P. Novel inducible antibacterial peptides from a hemipteran insect Pyrrhocorls apterus // Biochem. J. 1994. - V. 300. - P. 567-575.

4. Dimarcq J.L., Hoffmann D., Metster M Bulet P., Lanot R., Reichhart J.M., Hoffinann J. A. Characterization and transcriptional profiles of a Drosophila gene encoding an insect defensin // Eur. J. Biochem. 1994. - V. 221. - P. 201-209.

5. Kamysz W., Okroj M., Lempicka E., Ossowski T., Lukasiak J. Fast and efficient purification of synthetic peptides by solid-phase extraction // Acta Chromatographica. -2004.-V. 14. P. 180-186.

6. Selsted M. E., Miller S. I., Henschen A. H., Ouellette A. J. Enteric defensins: antibiotic peptide components of intestinal host defense // J Cell Bio. 1992. - V. 118. - P. 929-936.

7. Harwig S. S. L., Ganz T., Lehrer R. I. Neutrophil defensins purification, characterization, and antimicrobial testing // Meth. in Enzymol. 1994. - V. 236. - P. 160-172".

8. Boman H. G. Peptide antibiotics and their role in innate immunity // Annu. Rev Immunol. 1995. - V. 13. - P. 62-92.

9. Martin E., Ganz T., Lehrer R. I. Defensins and other endogenous peptide antibiotics of vertebrates // J. Leukocyte Biol. 1995.- V. 58.- P. 128-136.

10. Ganz T., Selsted M. E., Szklarek D., Harwig S. S. L., Daher K., Bamton D. F., Lehrer R. I. Defensins. Natural peptide antibiotics of human neutrophils // Z Chn. Invest. 1985. - V. 76. - P. 1427-1435.

11. Lee J. -Y ., Boman A., Chuanxm S., Andersson M., Jornvall H., Mutt V., and Boman H. G. Antibacterial peptides from pig intestine: Isolation of a mammalian cecro-pin // Proc Nat. Acad Sci USA. 1989. - V. 86. - P. 9159-9162.

12. Zasloff M., Magainins, a class of antimicrobial peptides from Xenopus skin. Isolation, characterization of two active forms, and partial cDNA sequence of a precursor // Proc. Nat. Acad. Set USA. 1987. - V. 84. - P. 5449-5453.

13. Gennaro R., Skerlava J.B., Romeo D. Purification, composition, and activity of two bacterecins, antibacterial peptides of bovine neutrophils // Infect. Immun. 1989. -V. 57.-P. 3142-3146.

14. Ouellette A.J., Hsreh M.M., Nosek M.T., Cano-Gauci D.F., Huttner K.M., Buick R.N., Selsted M.E. Mouse paneth cell defensins primary structures and antibacterial activities of numerous cryptdm isoforms // Infect Immun. 1994 - V. 62 - P. 5040-5047.

15. Selsted M.E., Szklarek D., Lehrer R.I. Purification and antibacterial activity of antimicrobial peptides of rabbit granulocytes // Infect. Immun. 1984. - V.45. - P. 150154.

16. Ersenhauer P.B., Harwig S.S., Szklarek D., Ganz T., Selsted M.E., Lehrer R.I. Purification and antimicrobial properties of three defensins from rat neutrophils // Infect. Immun. 1989. - V. 57. - P. 2021-2027.

17. Selsted M.E., Brown D.M., De Lange R.J., Lehrer R.I. Primary structures of MCP-1 and MCP-2, natural peptide antibiotics of rabbit lung macrophages // J Biol. Chem. 1983.-Y. 258 (14).-P. 485-489.

18. Schonwetter B.S., Stolzenberg E.D., Zasloff M.A. Epithelial antibiotics induced at sites of inflammation // Science. 1995. -V. 267. - P. 1645-1648.

19. Harwig S.L., Swiderek K.M., Kokryakov V.N., Tan L., Lee T.D:, Panyutich E.A., Aleshma G.M., Shamova O.V., Lehrer R.I. Gallmacins cysteine-rich antimicrobial peptides of chicken leukocytes // FEBS Lett. 1994. - V. 342. - P. 281-285.

20. Hultmark D., Steiner H., Rasmuson Т., Boman H.G. Purification and properties of three inducible bactericidal proteins from hemolymph of immunized pupae of Hyalo-phora cecropia 11 Eur. J Biochem Insect immunity. 1980. - V. 106. - P. 7-16.

21. Romeo D., Skerlava J.B., Bolognesi M., Gennaro R. Structure and bactericidal activity of an antibiotic dodecapeptide purified from bovine neutrophils // J Biol. Chem. — 1988.- V. 263,- P. 9573-9575.

22. Selsted M.E., Novotny M.J., Morris W.L., Tang, Y.-Q., Smith W., Cullor J.S. In-dolicidin, a novel bactericidal tridecapeptide amide from neutrophils // J. Biol Chem. -1992. V. 267. - P. 4292 - 4295.

23. Mendol S., Faustinol N.A., Sarmentol A.C., Amado F., Moir A.J. Purification and characterization of a new peptide antibiotic produced by a thermo tolerant Bacillus li-cheniformis strain I I Biotechnology Letters. 2004. - V. 26. - P. 115-119.

24. Grande C., Falcon M.S., Perez-Lamela C., Cornesana M.R., Gandara J.S. Quantitative Analysis of Colistin and Tiamulin in Liquid and Solid Medicated Premixes by HPLC with Diode-Array Detection // Chromatographia. 2001. - V. 53. Suppl. - P. 460-463.

25. Guo D., Mant C.T., Hodges R.S. Effects of ion-pairing reagents on the prediction of peptide retention in reversed-phase high performance liquid chromatography // J. Chrom. 1987. - V. 386. - P. 205-222.

26. Щатц В.Д., Сахартова O.B. Высокоэффективная жидкостная хроматография: Основы теории. Методология. Применение в лекарственной химии. Рига: Зинат-не.-1988.-390 с.

27. Guiochon G., Mriziq К., Shalliker R.A. Implementations of two-dimensional liquid chromatography // Journal of Chromatography A. 2008.- V. 1189.- P. 109-168.

28. Roller A., Washburn M. P., Lange В. M., Andon N.L., Deciu C., Haynes P. A., Hays L., Schieltz D., Ulaszek R., Wei J., Wolters D., Yates J.R. Proteomic survey of metabolic pathways in rice // Plant biology. 2002- V. 99 (18). - P. 11969-11974.

29. Mikulikova K., Miksika I., Deyl Z. Non-enzymatic posttranslational modifications of bovine serum albumin by oxo-compounds investigated by chromatographic and elec-trophoretic methods // Journal of Chromatography B. 2005.- V. 815.- P. 315-3 31.

30. Lasserre J.-P., Nicaud J.-M., Pagot Y., Joubert-Caron R., Caron M., Hardouin J. First complexomic study of alkane-binding protein complexes in the yeast Yarrowia li-polytica II Talanta. 2010. - V. 80. - P. 1576-1585.

31. Gardner J.G., Grundy F.J., Henkin T.M., Escalante-Semerena J.C. Control of Acetyl-Coenzyme A Synthetase (AcsA) Activity by Acetylation/Deacetylation without NAD-Involvement in Bacillus subtilis II J. of Bacteriology. 2006. - V. 188 (15).- P. 5460-5468.

32. Trusch M., Bohlick A., Hildebrand D., Lichtner B., Bertsch A., Kohlbacher O., Bachmann S., Schluter H. Application of displacement chromatography for the analysis of a lipid raft proteome II Journal of Chromatography B. 2010. - V. 878. - P. 309-314.

33. Zachertowska A., Brewer D., Evans D.H. MALDI-TOF mass spectroscopy detects the capsid structural instabilities created by deleting the myxoma virus cupro-zinc SOD1 homolog M131R // Journal of Virological Methods. 2004. - V. 122. - P. 63-72.

34. Xiao N., Yu Y. B. Separation of fluorinated amino acids and oligopeptides from their non-fluorinated counterparts using high-performance liquid chromatography // Journal of Fluorine Chemistry. 2010. - V. 131. - P. 439^45.

35. Stoll D. R., Li X., Wang X., Carr P. W., Porter S. E., Rutan S.C. Fast, comprehensive two-dimensional liquid chromatography // Journal of Chromatography A. 2007 — V. 1168.-P. 3-43.

36. Zahariev S., Guarnaccia C., Pongor C.I., Quaroni L., Cemazar M., Pongora S. Synthesis of 'difficult' peptides free of aspartimide and related products, using peptoid methodology // Tetrahedron Letters. 2006. - V. 47. - P. 4121-4124.

37. Ho S.V., Mc Laughlin J.K., Thomas K.E., Suda E., Herberg J.T., Dufield R.L., Hunter A.K. Reaction kinetics and optimization of the copper-catalyzed oxidation of ApoA-lM // Chemical Engineering Science. 2009. - V. 64 (11). - P. 2623-2630.

38. Sirtori E., Resta D., Brambilla F., Zacherl C., Arnoldi A. The effects of various processing conditions on a protein isolate from Lupinus angiistifolius I I Food Chemistry. 2010. - V. 120. - P. 496-504.

39. Mandal S.M., Dey S., Mandal M., Sarkar S., Maria-Neto S., Franco O.L. Identification and structural insights of three novel antimicrobial peptides isolated from green coconut water // Peptides. 2009. - V. 30. - P. 633-637.

40. Ahmad C., Natascha C., Haiqin C., Jianxin Z., Jian T., Hao Z., Wei C. Bifidin I. A new bacteriocin produced by Bifidobacterium infantis BCRC 14602: Purification and partial amino acid sequence I I Food Control. 2010. - V. 21. - P. 746-753.

41. Shibue M., Mant C.T., Hodges R.S. Effect of anionic ion-pairing reagent concentration (1-60 mM) on reversed-phase liquid chromatography elution behavior of peptides // Journal of Chromatography A. 2005.- V. 1080.- P. 58- 67.

42. Careri M., Mangia A. Analysis of food proteins and peptides by chromatography and mass spectrometry // Journal of Chromatography A. 2003. - V. 1000. - P. 609635.

43. Prata-Vidal M., Bouhallab S., Henry G., Aimar P. An experimental study of case in o macropeptide hydrolysis by trypsin in a continuous membrane reactor // Biochemical Engineering Journal. 2001. - V. 8. - P. 195-202.

44. Nemeth-Kiss V., Forgacs E., Cserhati T. Anomalous retention behavior of peptides on porous graphitized carbon column // J. Chromatogr. A. 1997. - V. 776. - P. 147-152.

45. Nazir T., Gould L. A., Marriott C., Martin G.P., Brown M.B. High Performance Liquid Chromatography of a Cyclosporin A Formulation on a Porous Graphitic Carbon Column // Chromatographia. 1997. V. 46 (11/12). - P. 628-636.

46. Antibacterial Peptide Protocols. In Methods in Molecular Biology / edited by W.M. Shafer. Totowa: Humana Press, 2007. V. 78. - 250 p.

47. Stanton P. Ion-Exchange Chromatography. In HPLC of peptides and proteins: methods and protocols / edited by Marie-Isabel Aguilar // Methods in molecular biology. Humana Press. 2004. 251 p.

48. Snyder L.R., Kirkland J.J., Glajch J.L. Practical HPLC. Method Development, 2nd edn, Wiley-Interscience, New York. 1997.

49. Cin M.D., Davalli S., Marchioro C., Passarini M., Perini O., Provera S., Zaramel-laet A. Analytical methods for the monitoring of solid phase organic synthesis // I Farmaco. 2002. - V. 57. - P. 497-510.

50. Klampfl C.W. Review coupling of capillary electrochromatography to mass spectrometry // J. Chromatogr. A. 2004. - V. 1044. - P. 131-144.

51. Mirzaei H., Regnier F. Identification and quantification of protein carbonylation using light and heavy isotope labeled Girard's P reagent // J. Chromatogr. A. 2006. -V. 1134.-P. 122-133.

52. Hubbard B. K., Chen H., O'Connor S.E., Walsh C.T. Formation of Hydroxy His-tidine in the Biosynthesis of Nikkomycin // Antibiotics Chemistry & Biology. 2002. -V. 9.-P. 103-112.

53. Hesse A.M., Marcelo P., Rossier J., Vinh J. Simple and universal tool to remove on-line impurities in mono- or two-dimensional liquid chromatography-mass spectrometry analysis // Journal of Chromatography A. 2008.- V. 1189 - P. 175-182.

54. Lichtenstein A., Ganz T., Selsted M.E., Lehrer R.I. In vitro tumor cell cytolysis mediated by peptide defensins of human and rabbit granulocytes // Blood. 1986. - V. 68.-P. 1407-1410.

55. Bianco L., Lopez L., Scalone A.G., Di Carli M., Desiderio A., Benvenuto E., Per-rotta G. Strawberry proteome characterization and its regulation during fruit ripening and in different genotypes // J. of Proteomics. 2009. - V. 72. - P. 586 - 607.

56. Liu C., Zhang X. Multidimensional capillary array liquid chromatography and matrix-assisted laser desorption/ionization tandem mass spectrometry for high-throughput proteomic analysis // J. Chromatogr. A. 2007. V. 1139. - P. 191-198.

57. Nagele E., Vollmer M., Horth P. Two-dimensional nano-liquid chromatography-mass spectrometry system for applications in proteomics // J. Chromatogr. A. 2003. V. 1009.-P. 197-205.

58. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии: Пер. с англ. / Под ред. А. Хеншен и др.- М.: Мир, 1988. 688 с.

59. Hanai Т. HPLC: A Practical Guide // Health Research Foundation, Kyoto, Japan. 1999.-P. 144.

60. Meek J.L. Prediction of peptide retention times in high pressure liquid chromatography on the basis of amino acid composition // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. -V. 11.-P. 1632-1636.

61. Meek J.L., Rossetti Z.L. Factors affecting retention and resolution of peptides in high performance liquid chromatography // J. Chromatogr. 1981. V.211 (1). - P. 1528.

62. Su S.J., Grego B., Niven B., Hearn M.T. Analysis of Group retention contributions for peptides separated by reversed-phase high performance liquid chromatography // J. Liq. Chromatogr. 1981. V. 4. - P. 1745-1764.

63. Wilson K.J., Honegger A., Slottzel R.P., Hughes G.H. The behavior of peptides on reversed phase supports during high pressure liquid chromatography // Biochem. J.1981.- 199 (31).

64. Browne C.A., Bennett H.P., Solomon S. The isolation of peptides by highperformance liquid chromatography using predicted elution positions // Anal. Biochem.1982.-V. 124.-P. 201-208.

65. Sasagawa T., Okuyama T., Teller D.C. Prediction of peptide retention times in reversed phases high performance liquid chromatography during linear gradient elution // J. Chromatogr. 1982. V. 240 (2). - P. 329-340.

66. Sasagawa T., Ericsson L.H., Teller D.C., Titani K., Walsh K.A. Separation of peptides on a polystyrene resin column // J. Chromatogr. 1984. V. 307. - P. 29-38.

67. Sakamoto Y., Kawakami N., Sasagawa T. Prediction of peptide retention times // J. Chromatogr. 1988. V. 442. - P. 69-79.

68. Mant C.T., Burke T.W., Black J.A., Hodges R.S. Effect of peptide chain length on peptide retention behavior in reversed-phase chromatography // J Chromatogr. 1988. V. 458.-P. 193-205.

69. Тарасова А.И., Зубарев P.A., Голобородько AA, Горшков A.B., Горшков М.В. Идентификация пептидов по хромато-масс-спектрометрическим данным с использованием расчета времен удерживания // Масс-спектрометрия, 2008. Т. 5 (№. 1). - С. 7-22.

70. Scott P.W., Cases J. Chromatography Theory // Marcel Dekker, Inc. New Jork. -2002. P. 475.

71. Palmblad M., Ramstrom M., Markides K.E., Hakansson P., Bergquist J. Prediction of Chromatography Retention and Protein Identification in Liquid Chromatography/Mass Spectrometry // Anal. Chem. 2002. V. 74. - P. 5826-5830.

72. Palmblad M., Ramstrom M., Bailey C.G., Mc-Cutchen-Maloney S.L., Bergquist J., Zeller L.C. Protein identification by liquid chromatography using retention time prediction // J. Chromatogr. B. 2004.- V. 803. P. 131-135.

73. Baczek T., Wiczling P., Marszall M., Heyden Y.V., Kaliszan R. Prediction of peptide retention at different HPLC conditions from multiple linear regression models // J Proteome Res. 2004. V. 3. - P. 555-63.

74. Prediction of retention volumes and UV spectra of peptides in reversed phase HPLC // Russ. J. Bioorg. Chem. 2006. V. 32. - P. 50-56.

75. Klammer A.A., Yi X., Mac Coss M.J., Noble W.S. Peptide retention time prediction yields improved tandem mass spectrum identification for diverse chromatography conditions // Recomb. 2007. P. 459^172.

76. Буряк A.K. Применение молекулярно-статистических методов расчета термодинамических характеристик адсорбции при хромато-масс-спектрометрической идентификации органических соединений // Успехи химии. 2002. Т. 71. - № 8. -С. 788-800.

77. Mann M., Hendrickson R., Pandey A. Analysis of proteins and proteomes by mass spectrometry // Annu. Rev. Biochem. 2001. V. 70. - P. 437-473.

78. Лебедев A.T. Масс-спектрометрия в органической химии M.: Бином. Лаборатория знаний. 2003. 493 с.

79. Hillenkamp F., Karas M., Beavis R.C., Chait B.T. Matrix-assisted laser desorp-tion/ionization mass spectrometry of biopolymers // Anal. Chem. 1991. V. 63 (24). -P. 1193-1203.

80. Karas M., Kriiger R. Ion Formation in MALDI: The Cluster Ionization Mechanism // Chem. Rev. 2003. V. 103 (2). - P. 427-439.

81. Fenn J.B., Mann M., Meng C.K., Wong S.F. Whitehouse C.M. Electrospray ioni-zation-principles and practice // Mass Spectrom. Rev. 1990. -V. 9 (1). P. 37-70.

82. Hjerno K., Jensen O.N. MALDI-MS in Protein Chemistry and Proteomics. In: Hillenkamp F., Katalinic, J-P., editors. MALDI MS. A Practical Guide to Instrumentation, Methods and Applications // Munster: Wiley-vch. 2007. P. 83-104.

83. Jonscher K.R. and Yates J.R., 3rd. The quadrupole ion trap mass spectrometer a small solution to a big challenge // Anal Biochem. 1997. V. 244 (1). - P. 1-15.

84. Burlingame A.L., Boyd R.K., Gaskell S.J. Mass Spectrometry // Anal. Chem. 1994. -V.66 (12).-P. 634-683.

85. O'Connor P. B., Hillenkamp F. MALDI Mass Spectrometry Instrumentation. In: Hillenkamp F., Katalinic, J-P., editors. MALDI MS. A Practical Guide to Instrumentation, Methods and Applications // Münster: Wiley-vch. 2007. P. 29-75.

86. Karas M., Bachmann D., Hillenkamp F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet laser desorption mass spectrometry of organic molecules // Anal. Chem. 1985. V. 57. - P. 2935-2939.

87. Hillenkamp F. Laser desorption mass spectrometry. A review. In: A. Benninghoven, R.J. Colton, D.S. Simons, H.W. Werner (Eds.), Secondary Ion Mass Spectrometiy SIMS V // Springer Series in Chemical Physics. 1986. V. 44. - P. 471-475.

88. Karas M., Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10000 daltons // Anal. Chem. 1988. V. 60. - P. 2299-2301.

89. Deisewerd K. The desorption process in MALDI // Chem. Rev.2003. V. 103.-P. 395-425.

90. Knochenmuss R., Zenobi R. MALDI ionization: The role of in-plume processes // Chem. Rev.2003. V. 103. - P.441-452.

91. Jensen O.N., Mortensen P., Vorm O., Mann M. Automation of matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry using fuzzy logic feedback control // Anal. Chem. 1997.-V. 69.-P. 1706-1714.

92. Vorm O., Roepstorff P., Mann M. Improved resolution and very high sensitivity in MALDI TOF of matrix surfaces made by fast evaporation // Anal. Chem. 1994. V. 66.-P. 3281-3287.

93. Yu-Chie C. In Situ Determination of Organic Reaction Products by Combining Thin Layer Chromatography with Surface-assisted Laser Desorption/ionization Time-offlight Mass Spectrometry // Rapid Commun. Mass Spectrom. 1999. V. 13. - P. 821— 825.

94. Wan E. Chun-hong H.C., Wai-mei Sin D., Wong Yiu-Chung. Detection of residual bacitracin A, colistin A, and colistin B in milk and animal tissues by liquid chromatography tandem mass spectrometry // Anal Bioanal. Chem., 2006. V. 385. - P. 181188.

95. Gimon-Kiusel H., Preston-Schaffter L.M., Kinsel G.R., Russell D.H. Effects of Matrix Structure/Acidity on Ion Formation in Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry // J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119 (10). - P. 2534-2540.

96. Katayama H., Nagasu T., Oda Y. Improvement of in gel digestion protocol for peptide mass fmgeiprinting by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2001. V. 15. - P. 1416-1421.

97. Rappsilber J., Ishihama Y., Mann M. Stop and go extraction tips for matrixassisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics // Anal. Chem. 2003. V. 75. - P. 663-670.

98. Gliickmann M., Pfenniger A. at all. Mechanisms in MALDI analysis: surface interaction or incorporation of analytes? // International Journal of Mass Spectrometry. 2001.-V.210/211.-P. 121-132.

99. Strumpet K., Karas M., Hillenkamp F. 2.5-Dihydroxybenzoic acid: a new matrix for laser desorption-ionization mass spectrometry // Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes. 1991.-V. 111.-P. 89-102.

100. Strupat K., Kampmeier J., HornefFer V. Investigations of 2.5-DHB and succinic acid as matrices for UV and IR MALDI // Intern. J. of Mass Spectroscopy and ion Processes. 1997. V. 169. - P.43-50.

101. Allwood D.A., Dreyfus R.W., Perera I.K. Optical absorption of matrix compounds for laser-inducted desorption and ionization (MALDI) // Applied Surface Science. 1997.-V. 109/110.-P. 154-157.

102. Meier M.A., Adams N., and Schubert U.S. Statistical approach to understand maldi-tof ms matrices: discovery and evaluation of new maldi matrices // Anal. Chem. 2007.-V. 79.-P. 863-869.

103. Beavis R.C., Chait B.T. Matrix-assisted laser desorption ionization mass-spectrometry of proteins // Methods Enzymol. 1996. V. 270. - P. 519-551.

104. Cohen S.L., Chait B.T. Influence of matrix solution conditions on the MALDI-MS analysis of peptides and proteins //Anal. Chem. 1996. -V. 68. P. 31-37.

105. Beavis R.C., Chait B.T. Rapid, sensitive analysis of protein mixtures by mass spectrometry // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. - P. 6873-6877.

106. Kussmann M., Roepstorff P. Sample preparation techniques for peptides and proteins analyzed by MALDI-MS // Methods Mol. Biol. 2000. V. 146. - P. 405-424.

107. Laugesen S., Roepstorff P. Combination of two matrices results in improved performance of MALDI-MS for peptide mass mapping and protein analysis // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2003. V. 14. - P. 992-1002.

108. Kjellstrom S., Jensen O.N. In situ liquid-liquid extraction as a sample preparation method for matrix-assisted laser desorption/ionization MS analysis of polypeptide mixtures // Anal. Chem. 2003. V. 75. - P. 2362-2369.

109. Sunner J., Dratz E., Chen Yu-Chie. Graphite surface-assisted laser desorp-tion/ionization time-of-flight mass spectrometry of peptides and proteins from liquid solutions // Anal. Chem. 1995. -V. 67 (23). P. 4335-4342.

110. Beavis R.C., Bridson J.N. Epitaxial protein inclusion in sinapic acid crystals // Appl. Phys. 1993. -V. 26. P. 442-447.

111. Horneffer V. Matrix-Analyt-Wechelwirkungen bei der Matrix-Unterstutzten Laser desorptions/ionisations Mass spektrometrie (MALDI-MS). Dissertation, University of Munster. 2002.

112. Hillenkamp, F. Karas, M. The MALDI Process and Method. In: Hillenkamp F., Ka-talinic, J-P., editors. MALDI MS. A Practical Guide to Instrumentation, Methods and Applications // Münster: Wiley-vch. 2007. P. 1-23.

113. Schuerenberg M., Luebbert C., Eickhoff H., Kalkum M., Lehrach H., Nordhoff E. Prestructured MALDI-MS sample supports // Anal. Chem. 2000.- V. 72 P. 34363442.

114. Woods A.S., Huestis M.A. A Study of Peptide-Peptide Interaction by MatrixAssisted Laser Desorption/Ionization // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2001. V. 12. - P. 88-96.

115. Krause E., Wenschuh H., Jungblut P.R. The dominance of arginine-containing peptides in MALDI-derived tryptic mass fingerprints of proteins // Anal. Chem. 1999. -V. 71.-P. 4160-4165.

116. Aebersold R., Goodlett D.R. Mass spectrometry in proteomics // Chem. Rev 2001. -V. 101 (2).-P. 269-95.

117. Chaurand P., Lützenkirchen F., Spengler B. Peptide and protein identification by matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) and MALDI-post-source decay time-of-flight mass spectromeüy // J Am Soc Mass Spectrom. 1999. V. 10 (2). - P. 91-103.

118. Jensen O.N., Podtelejnikov A., Mann M. Delayed extraction improves specificity in database searches by matrix-assisted laser desorption/ionization peptide maps // Rapid Commun. Mass Spectrom. 1996. -V. 10. P. 1371-1378.

119. Артеменко К.А., Самгина Т.Ю., Лебедев A.T. Масс-спектрометрическое de novo секвенирование пептидов // Масс-спектрометрия. 2006- Т. 3 (4).- С. 225254.

120. Suckau D., Resemann A., Schuerenberg М., Hufhagel P., Franzen J., Holle A. A novel MALDI lift-TOF/TOF mass spectrometer for proteomics // Anal. Bioanal. Chem. 2003. V. 376. - P. 952-965.

121. Papayannopoulos I. A., The interpretation of collision-induced dissociation tandem mass spectra of peptides // Mass Spectrom. Rev. 1995. V.14 (1). - P. 49-73.

122. Johnson R.S., Martin S.A., Biemann K. Collision-induced fragmentation of (M+H)+ ions of peptides side-chain specific sequence ions // Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes. 1988.-V. 86.-P. 137-154.

123. Qin J., Chait B.T. Preferential fragmentation of protonated gas-phase peptide ions adjacent to acidic amino acid residues // J. Am. Chem. Soc. 1995. V. 117. - P. 54115412.

124. Wysocki V.H., Tsaprailis G., Smith L.L., Breci L.A. Mobile and localized protons: a framework for understanding peptide dissociation // J. Mass Spectrom. 2000. V. 35.-P. 1399-1406.

125. Keough Т., Youngquist R.S., Lacey M.P. Sulfonic acid derivatives for peptide sequencing // Anal. Chem. 2003. V. 75. - P. 156-165.

126. Мильман Б.Л. Введение в химическую идентификацию. СПб.: ВВМ, 2008. -180 с.

127. James P., Quadroni М., Carafoli Е., Gonnet G. Protein identification by mass profile fingerprinting // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. V. 195. - P. 58-64.

128. Mann M., Hojrup P., Roepstorff P. Use of mass spectrometric molecular weight information to identify proteins in sequence databases // Biol. Mass Spectrom. 1993. -V. 22.-P. 338-345.

129. Pappin D.J., Hojrup P., Bleasby A.J. Rapid identification of proteins by peptide-mass fingerprinting // Curr. Biol. 1993. V. 3. - P. 327-332.

130. Jensen O.N., Larsen M.R., Roepstorff P. Mass spectrometric identification and microcharacterization of proteins from electrophoretic gels: Strategies and applications // Proteins Structure Function Genet. 1998. V. 2. - P. 74-89.

131. Kinter M. Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry. New Jork: Wiley-vch. 2000.

132. Sechi S. Quantitative Proteomics by Mass Spectrometry. Totowa: Humana Press, 2007.-218 p.

133. Schroder J. M. Epithelial peptide antibiotics // Biochem. Pharmacol. 1999. V. 57.-P. 121-134.

134. Harder J., Bartels J., Christophers E., Schroder J.M. A peptide antibiotic from human skin // Nature. 1997. V. 387. - P. 861.

135. Stolzenberg E.D., Anderson G.M., Ackermann M.R., Whitlock R.H., Zasloff M. Epithelial antibiotic induced in states of disease // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. -V. 94.-P. 8686-8690.

136. Murphy C.J., Foster B.A., Mannis M.J., Selsted M.E., Reid T.W. Defensins are mitogenic for epithelial cells and fibroblasts // J. Cell Physiol. 1993. V. 155. - P.408-413.

137. Schroder J.M. Epithelial antimicrobial peptides: innate local host response elements // Cell Mol. Life Sci. 1999. V. 56. - P.32-46.

138. Li J., Post M., Volk R., Gao Y., Li M., Metais C., Sato K., Tsai J., Aird W., Rosenberg R. D., Hampton T. G., Sellke F., Carmeliet P., Simons M. PR-39, a peptide regulator of angiogenesis // Nat. Med. 2000.- V. 6.- P. 49-55.

139. Huang H. J., Ross C. R., Blecha F. Chemo attractant properties of PR-39, a neutrophil antibacterial peptide // J. Leukoc. Biol. 1997. V. 61. - P. 624-629.

140. Yang D., Chertov O., Oppenheim J.J. The role of mammalian antimicrobial peptides and proteins in awakening of innate host defenses and adaptive immunity // Cell Mol. Life Sci. 2001. -V. 58. P. 978-989.

141. Bulet P, Hetru C, Dimarcq J.L, Hoffmann D. Antimicrobial peptides in insects; structure and function // Dev Comp Immunol. 1999. V. 23. - P. 329-44.

142. Matsuzaki K. Why and how are peptide-lipid interactions utilized for self-defense? Magainins and tachyplesins as archetypes // Biochim Biophys Acta. 1999. V. 1462.-P. 1-10.

143. Yeaman M.R., Yount N.Y. Mechanisms of antimicrobial peptide action and resistance // Pharmacol Rev. 2003. V. 55. - P. 27-55.

144. Casteels P. Immune response in Hymenoptera. In: Brey P.T, Hultmark D., editors. Molecular mechanisms of immune responses in insects // London: Chapman & Hall. 1998.-P. 92-110.

145. Otvos J. L. The short proline-rich antibacterial peptide family // Cell Mol Life Sci. 2002.-V. 59.-P. 1138-50.

146. Brogden K.A., Ackermann M., Mc Cray J.P., Tack B.F. Antimicrobial peptides in animals and their role in host defences // Int J Antimicrob Agents. 2003. V. 22. - P. 465-78.

147. Lai R, Liu H., Hui Lee W., Zhang Y. An anionic antimicrobial peptide from toad Bombina maxima II Biochem Biophys Res Commun. 2002. V. 295. - P. 796-9.

148. Chen H.M., Wang W., Smith D., Chan S.C. Effects of the antibacterial peptide cecropin B and its analogs, cecropins B1 and B2, on liposomes, bacteria and cancer cells // Biochim Biophys Acta. 1997. V. 1336. - P. 171-179.

149. Moore A.J., Devine D.A., Bibby M.C. Preliminary experimental anticancer activity of cecropins // Pept Res. 1994. V. 7. - P.265-269.

150. Cruciani R.A., Barker J.L., Zasloff M., Chen H.C., Colamonici O. Antibiotic ma-gainins exert cytolytic activity against transformed cell lines through channel formation // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1991. V. 88. - P. 3792-3796.

151. Papo N., Shai Y. Host defense peptides as new weapons in cancer treatment // Cell Mol Life Sei. 2005. V. 62. - P. 784-90.

152. Boman H.G. Antibacterial peptides: basic facts and emerging concepts // J Intern Med. 2003.-V. 254.-P. 197-215.

153. Hetru C., Hoffmann D., Bulet P. Antimicrobial peptides from insects. In: Brey P.T., Hultmark D., editors. Molecular mechanisms of immune responses in insects. London: Chapman & Hall. 1998. P. 40-66.

154. Irving P., Troxler L., Hetru C. Is innate enough? The innate immune response in Drosophila II CR Biol. 2004. V. 327. - P. 557-570.

155. Tzou P., De Gregorio E., Lemaitre B. How Drosophila combats microbial infection: a model to study innate immunity and host-pathogen interactions // Curr Opin Microbiol. 2002. V. 5. - P. 102-110.

156. Boman H.G. Antibacterial peptides: key components needed in immunity // Cell. 1991.-V. 65.-P. 205-207.

157. Bulet P., Stocklin R. Insect antimicrobial peptides: structures, properties and gene regulation // Protein Pept. Lett. 2005. V. 12. - P. 3-11.

158. Jarosz J. Identification of immune inhibitor from Pseudomonas aeruginosa of inducible cell-free antibacterial activity in insects // Cytobios. 1997. -V. 89 P. 73-80.

159. Jarosz J., Glinski Z. Selective inhibition of cecropin-like activity of insect immune blood by protease from American foulbrood scales // J. Invertebr. Pathol. 1990. V. 56. -P. 143-149.

160. Lemaitre B., Reichhart J.M., Hoffmann J.A. Drosophila host defense: differential induction of antimicrobial peptide genes after infection by various classes of microorganisms // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1997. -V. 94. P. 14614-14619.

161. Barbault F., Landon C., Guenneugues M., Meyer J.P., Schott V., Dimarcq J. L., Vovelle F. Solution structure of Alo-3: a new knottin-type antifungal peptide from the insect Acrocinus longimanus II Biochemistry. 2003. V. 42. - P. 14434-14442.

162. Diamond G., Bevins C.L. beta-Defensins: endogenous antibiotics of the innate host defense response // Clin. Immunol. Immunopathol. 1998. V. 88. - P. 221-225.

163. Reeves E.P., Messina C.G., Doyle S., Kavanagh K. Correlation between gliotoxin production and virulence of Aspergillus fumigatus in Galleria mellonella II Mycopatho-logia. 2004. -V. 158. P. 73-9.

164. Leger R.J., Screen S.E., Shams-Pirzadeh B. Lack of host specialization in Aspergillus flavus II Appl. Environ Microbiol. 2000. V. 66. - P. 320-4.

165. Brennan M., Thomas D.Y., Whiteway M.3 Kavanagh K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae // FEMS Immunol Med Microbiol. 2002. V. 34. - P.153-157.

166. Cotter G., Doyle S., Kavanagh K. Development of an insect model for the in vivo pathogenicity testing of yeasts // FEMS Immunol Med Microbiol. 2000. V. 27. - P. 163-9.

167. Dunphy G.B., Oberholzer U., Whiteway M., Zakarian R.J., Boomer I. Virulence of Candida albicans mutants toward larval Galleria mellonella (Insect, Lepidoptera, Galleridae) // Can J Microbiol. 2003. V. 49. - P. 514-24.

168. Mylonakis E., Moreno R.E. Khoury J.B., Idnurm A., Heitman J., Calderwood S.B., et al. Galleria mellonella as a model system to study Cryptococcus neoformans pathogenesis. Infect Immun. 2005. V. 73. - P. 3842-50.

169. Kavanagh K., Reeves E.P. Exploiting the potential of insects for in vivo pathogenicity testing of microbial pathogens // FEMS Microbiol Rev. 2004. V. 28. - P. 101— 112.

170. Kim С., Lee J., Kim I., Seo S., Son S., Lee K., et al. Purification and cDNA cloning of a cecropin-like peptide from the great wax moth Gallería mellonella II Mol Cells. 2004.-V. 17.-P. 262-6.

171. Lee Y., Yun E., Jang W., Kim I., Lee J., Park S., et al. Purification, cDNA cloning and expression of an insect defensin from the great wax moth, Gallería mellonella И Insect Mol. Biol. 2004. V. 13. - P. 65-72.

172. Phipps D. Gallysin-1, an antibacterial protein isolated from hemolymph of Gallería mellonella II Dev. Сотр. Immunol. 1994. -V. 18 (1). P. 13-23.

173. Мак P., Chmiel D., Gacek G.J. Antibacterial peptides of the moth Gallería mellonella II J. Acta Biochimica Polonica. 2001. V. 4. - P. 1191-1195.

174. Cytrynska M., Мак P., Zdybicka-Barabas A., Suder P., Jakubowicz T. Purification and characterization of eight peptides from Gallería mellonella immune hemolymph //Peptides Rev. 2007.-V. 285.-P. 33-546.

175. Jarosz J. Simultaneous induction of protective immunity and selective Synthesis of hemolymph lysozyme protein in larvae of Gallería mellonella II Biol. Zentral. 1979. -V. 98-P.459-471.239. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/proteins/

176. Фролов Ю.П. Математические методы в биологии. ЭВМ и программирование: Теоретические основы и практикум. Самара: Самарский университет. 1997. -256 с.

177. Парамонов С.А., Ульянов А.В, Буряк А.К. Анализ 1.1-диметилгидразина в виде производных с изотиоционатами методом офф-лайн ВЭЖХ-МАЛДИ-МС // Сорбционные и хроматографические процессы, 2008. Т. 10. (Вып. 3) — С. 440449.

178. Султанов 3.3., Кулакова Л.С., Перепелица Л.Г., Абдулганиева С.К. Селективная питательная среда для выделения Bacillus cereus II Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2004. № 4. - С. 74-76.

179. Ross P., Knox J.H. Carbon-Based Packing Materials for Liquid Chromatography, Applications // In Advances in Chromatography. V. 37. Marcel Dekker, Inc., New York. 1997.-P. 120.

180. Койков B.B. Состояние окислительной модификации белков в крови растущих крыс при однократном введении несимметричного диметилгидразина на фоне алиментарного дисбаланса // Теоретическая и экспериментальная медицина246. http://www.uniprot.ors:/