Синтез гликопептидов глицирризиновой кислоты - новых иммуномодуляторов и анти-ВИЧ средств тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

РГ Б ОД РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

УФИМСКИЙ научный центр ИНСТИТУТ ОРГАНИЧЕСКОЙ химии

На правах рукописи

РЫЖОВА СВЕТЛАНА АЛЕКСАНДРОВНА

СИНТЕЗ ГЛШЭПЕПЩОВ ГЛЩИРРЙЗИЮВОИ кислоты - НОВЫХ ИШУНОШДУЛЯТОРОВ И АНГИ-ВИЧ СРЕДСТВ

02.00.03 -Органическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученей степени кандидата химических наук

Уфа-1994

Работа выполнена в Институте органической химии Уфимского научного центра Российской Академии наук.

Научше руководители:

академик РАН Г.А.Толстяков

кандидат химических неук, старший научный сотрудник Л.А.Бэлтана

официальные оппоненты:

доктор химических наук профессор Пасгупэнко Е.В.

кандидат химических наук, старший научный сотрудник Адлер М.Э.

Ведущая организация: Башкирский государственный

университет

Защита диссертации состоится. МаюНЛ .1994 года в, на заседании специализированного совета К 002.14.01 при Институте органическая химии УЩ РАН, по адресу: 460054, г. Уфа, проспект Октября, 71, зал заседаний.

С диссертацией мокко ознакомиться в научной библиотеке УВД РАН

Автореферат разослан 1994 ГОда.

Ученый секретарь специализированного совета

доктор химических наук р~ Б.М.Лерман

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ

Актуальность тома.Поиск новнх веществ, обладающих шшукостиму-лирущим действием, является в настоящее время одной из ваетейшчх задзч современной органической химм. Зто связано с широким распространением иммунодефщитов различной этиологии, среди которых СПИД, онкозаболевания, аллергии, инфекционные болезни и т.д.

Для повышения иммунного стаг'уса организма перспективны!® соединениями зарекомендовал: себя производные трятерпенового глико-зила - глщлрризиновой кислоты (ГК) .являющейся основным биологически активным компонентом экстракта корней солодки голой к уральской (Glycyrrfiizae glabra и Ol.uralensis).

Интерес к пронзводнш ГК вызван высокой и разнообразной биологической активностью указанного глккозида, низкой токсичностью, доступностью исходного сырья и наличием обширной сырьевой Оази в стране. Среда производных этого гликозида особкй ¡штерес представляют соединения нового класса - тритерпеновые гликопептиды, моделирующих амидный тип связи природных глякопротеинов, которые обладают широкой л разнообразной: биологической активностью .

Поэтому синтез гликопептидов ГК - потенциальных иммунсмоду-ляторов и разработка удобных и селективных способов их синтеза являются важной н актуальной задачей.

Цель работы состоит в синтезе гликопептидов ГК на основа доступной ПС н оптически чистых аминокислот и пептидов с привлечением современных методов пептидного н гликопептидного синтеза, разработка технологичных способов получения гликопептидов, обладающих поливалентной биологической активностью и представляющих интерес для медицины в качестве иммуномодуляторов и анти-ВИЧ средств.

Работа выполнялась по теме "Разработка эффективных путей и методов полного синтеза природных соединений: и их аналогов с практически вэкной биологической активностью" (регистрационный N 01.90.0 011565) (1990-1994) и "Изучение биологической активности новых органических соединений и изыскание новых эффективных лекарственных препаратов" (регистрационный N 01.9.10 053653) (19911995 Г).

Научная новизна. Проведеш целенаправленные хишче craie модификации гликозида по карбоксильным группам с введением аминокислотных и пептидных фрагментов в углеводную и тритерпеновую части

/

молекула. Синтезированы новые гликогоптида ПС, содержащие фрагменты кврбоксизадащешшк к свободных оптически активных аминокислот и пептидов с применением различных защитных групп для С-конца ами-нокомпонентов (алкиловых, трет-бутиловых, бвнзиловых, п-нитробен-зиловых эфкров). Разработаны новые методы конденсации аминокомпо-нента с гликозидом без предварительной защиты гидроксильных групп углеводной части молекулы при использовании К-гидроксибензотриазо-ла (HOBt) - Н,И -дациклогексилкарбодашмида (ДСС), N-гидроксифтали-мида (HOPht) - ДСС, пентахлорфенола (РсрОН) - ДСС и комплекса пен-• тафторфенола с ДСС в соотношения 3:1 (комплекс ?).

Предложен- новый селективный и технологичный способ синтеза карбоксизащшцешшх гликопептвдов ГК с использованием метода активированных эфиров (оксибензотриазольных эфиров), позволяющий получать целевые соединения с высоким выходом.

Впервые разработан препаративно удобный способ синтеза гликоле птидов ГК, содержащих свободные аминокислотные и дипвптиднш фрагменты с использованием "npsmuscna минимальной защиты" амшюком-покента. Получены водорастворимые натриевые соли ряда гликопепти-дов ГК, из которых могут быть изготовлены инъекционные формы.

Осуществлен синтез ряда гликопептидов монометипового эфира ГК (ШЭ ГК), содержащих аминокислотные и пептидные цепи, которые входят в состав иммуяоакгивных аналогов известного иммуностимулятора - И-ацегилмурамоидщшептида (ВДЕТ).

Практическая значимость. Разработаны новые рационэльные способы синтеза гликопептвдов ГК, пригодные для проведения укрупненных синтезов без предварительной зацдаты гидроксильных групп углеводной цели с использованием различных защитных груш. Синтезировано 73 производных ГК, среди которых обнаружены вещества, эффективно ингибирующие вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) in vitra.

Синтетические гликогоптида ГК обладают высокой иммунотропной активностью. Среди синтезированных соединений обнаружены вещества, стимулирующие первичный иммунный ответ и клеточный иммунитет аналогично или эффективнее МДП. Иммуномоделируицие и антивирусные свойства ряда гликопептидов ГК сочетаются с выраженной противовоспалительной (ПВ) и противоязвенной (ПЯ) активностью и низкой токсичностью.

Апробация работы. Результаты исследований долокены на Всесо-езной конференции "Химия природных ккзхомолехулчркых биорегуляторов"

(Ереван, 1ЭЭ0 г), IV Всесоюзном симпозиуме "Изучение и использо-зованив солодки в народном хозяйстве" (Алма-Ата, 1991 г),Республиканской конференции "Современные проблемы синтеза биологически активных веществ и биотехнологий" (Ъ'фа, 1990 г), Международной конференции по молекулярно-Сиологическим аспектом диагностики и терапии СПИДа (Новосибирск, 1ЭЭ1 г).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 2 статьи и тезисы 5 докладов на конференциях.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на IS?, страницах машинописного текста и включает введение, литературный обзор, обсуждение экспериментальных данных, эксперюданталь-ную часть, выводы, список литературы (198 наименований) и приложения (акты биологических испытания, спектры ЯМР13С). Работа содержит 35 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Тритерпеновые гликопепгиды ГК представляют большой интерес для фармакологии вследствие своей высокой и разнообразной биологической активности.

Синтезированы глжопептиды двух структурных типов (производные ГК и производные ММЭ ГК путем введения аминокислотных и пеп-тицных фрагментов в молекулу ГК и ММЭ.

В диссертации описан синтез тритерпеловых гликопептидов, полученных различными методами конденсации и с использованием разнообразных сложноэфирных защитных группировок.

1. Конденсация с использованием N-гидрокоиоукцинимида -N.N -дициклогексилкарбодиимида

Осуществлен синтез карбоксизащищеншх гликопептидов ГК, содержащих фрагменты низших элкиловых эфиров аминокислот (метиловых, этиловых, н-пропиловых, н-бутнловах). Конденсация гликозида с эмирами Ъ-аминокислот проводилась методом активированных эфиров с помощью HOSu - ДСС, без предварительной защиты гвдроксильных груш углеводной части молекулы ГК. Активированный трис-оксисукцинимидныЛ эфир ГК, полученный путем обработки гликозида Н-гидроксисукциниш-дом (HOStt) и N.N_-дицилгюгексилкарбодиимвдом (ДСС) в среде ТРФ или

диокеача б*з бнд*л*»м ис«голь*уетея на отадки шкнолйза-пцялирс«-ввдия якинокомпонента, цг>лучп»мого in situ иг гидрсослоридов гфгроя шинокис-пот в присутствии небольшого из'нтая основания (БЦК или W-мвтшвюрфэлниа). Время образования {¡ктиьироь«нкого эфира 1S-S4 ч, время обрязовшшя гликодаптадной свйзи-л4 ч. Выход ц«левь:х зещшд^н-тх гюкотлтидов (1-14) ссотатш в! -755. Аналитически частно образцу (1-14) были получена дареосаждакийм из метанола з<$аром или xpovaгогр&1мей на колонке о сядждомвм с енходом 2.5-48,

Рее полученные гликопептиды ГК лшш хромотогруфичлски однородны по данннм тонкослойной хроматографии (ТО") и охчршскрк&о-ввнн спектральными методами, а тпкж* данными ел4м»нтноги анализа.

Схема 1

('OR

О,.

СОН 0 _

Et3ri; II

ОН

КОЗи -'c-X'.ip га

< jpfoJiiiH Q

n) =GlyOEt (Г

(10) R =Д1о0Рг

(11) К^СШОРгЬОРг

(12) г?1 =А1а0Вц

(13) R1=Val03u

(1) R^ProCfe (14) R1 =G 1 u(OBu)-OBu

(2) К1=СлК9СН(Шг)ССЮСН3(1б) ^ =MetCBu

t

(3) R^SInOMe

(4) R^Aspia-CMe)

(5) R1«=Glu(a-OMo)

(6) R^AlsOSt

(7) RH=VslOEt

(8) H*pG2u(0Et)-0St

1

(15) R^LouOBu (17) Rf=IleOBu

=V&!0Eu =?roOBu

(13) R( (!0) R,

Метод конденсат«! о использованием НОБи - ЛСС в экспериментальном исполнении и проводится в мягких условиях. Однако недостатком этого способа является возможность протекания побочной реакции, подобной перегруппировке Лоооена, приводящей к образованию нежелательных продуктов, что снижает выход целевых соединений и требует в ряде случаев применения колоночной хроматографии для получения аналитически чистых образцов.

Поэтому разработай! новые селективные способы получения гли-копептидов ГК, позволяющие получать аналитически чисть» продукты с более высоким выходом и пригодные для проведения укрупненных синтезов.

Синтез гликопепгидов глицирризиновой кислоты с использованием трет-бутиловых ефщюв аминокислот. Гликопепгиды ГК, содержаще ал-киловые рфиры Х-авднокислот, оказались нерастворимыми в воде, что ¡затрудняет их биологические испытания. Попытки омылить метиловые ' офиры гликопеитидов ПС 5£-янм меганольным раствором КОН били безуспешными, так как в результате образовывалась трудно разделяемая смесь продуктов.

Поэтому были синтезированы гликопептиды ГК с использованием •/¡егкоудвляемнх трет-бутиловых: сложноэфирных защитных групп Ь-ами-нокислот. Применение грег-бугяловых защитных групп значительно ¡¡прощает процесс деблокирования, который сводится к обработке кар-оох сиз ащшце иных соединений (15-19) трифторуксусной кислотой в те-■'ении 0,5-1 ч.

Конденсация гликозида с трет-йутилоными эфярами Ь-вминокис-.чог проводилась с применением НОЗи - ДСС. Выход защищенных глико-пептидов, содержащих трет-бутиловые эфиры Ъ-аминокислот после очистки составил 48-6955.

Деблокированные продукты (38-43), полученные гидролизом СГ^СООН. были выделены в индивидуальном состоянии с помощью колоночной хроматографии на силикагэле, с выходом 39-47Х. Строение полученных соединений подтверждено данными элементного анализа и спектрами ИК, УФ, ПМР,ЭС.

2. Конденсация с использованием К-гидроксибеязотриазола-

i

- дициклогексилкарбодяшида :

Разработан новый селективный и технологичный способ получения

карбокси-защищенных гликопептидов ГК, позволяющий использовать для конденсации различные типы эфиров аминокислот, получать целевые продукты с высоким выходом и пригодный для проведения укрупненных синтезов.

В качестве карбокси-компонента использовалась ГК без предварительной защиты гидрокси-групп углеводной части молекулы. В качестве аминокомпонентов использовались метиловые, Оензиловые(п-нитробензиловые) и трет-бутиловые вфиры аминокислот и дапептидов,-получаемы© in situ из .соответствующих солей с помощью третичного основания (Et3N, трибутиламин, К-метилморфолин, пиридин). .

(Активированный IQI уй HOBt - эфир ГК)

А- •

(26) R =11еОМе

(27) R =LeuOHe

(28) R =Glu(OBzl)-OBzl

(29) R =PheOBzl

(30) К =AlaOBsl

(31) R =Gly-LeuOBzl

(32) R =Ala-GlyOBzl

(33) H =MetOBzl

(34) R -LeuONBzl

(35) R -TyrONBzl

Активация карбокси-групп ГН проводилась о применением N-гидро-ксибензотряазола (HOBt) - ДСС в среде диоксана или ТГФ. Полученный активированный трис-Ы-оксибензотриазольный эфир ГК подвергался взаимодействию с аминокомпонентом. Время образования активированного интермедиата 7-8 ч, время образования гликопептидной связи-24 ч. Образования побочных продуктов не наблюдалось. Очистка полученных соединений проводилась путем переосавдения или перекристаллизации из смеси хлороформ-мэтанол (5:1) эфиром, из ацетона-rsKcauo™ кли из метанола—эфиром.

Выход целевых карбоксизащщанных гликопептидов (16-18,20-35), хроматогрвфичвски однородных-до ТСХ, составил 7Э-95Ж;' причем наиболее

C0R

(20) Е =PheOBu

(21 ) R =MetOMa

(22) R =ValOMe

(23) R =Glu(OMe)-ОМе

(24) R =А1аОМе

(25) R =PheOWe

высокие выходы продуктов были получены при использовании в качестве оснований К-метилморфолина и Е1ЭН. Высокая степень оптической чистоты продуктов, синтезированных с помощью К0В1; - ДСС, соответствует образцам, виделешшм колоночной хроматографией.

Все полученные гликопептидн были охарактеризованы спектральными методами и данными элементного анализа.

Синтез гликопептидов ГК с использованием бензиловых (п-нитро-бензиловых) эфиров Ь-аминокислот и пептидов. Среда карбоксизащи-щенных гликопептидов ГК наибольший интерес представляют соединения (29-35), содержащие фрагменты'бензиловых (4-нитробензиловых) афи-ров вминокислот и дштептидов, вследствие легкости их деблокирования, проходящего в мягких условиях о хорошим выходом (65-75%).

Гликопептидн 56-38,40-42,44-46, деблокированные путем каталитического гидрогенолиза в присутствии ЮХ-кого РД/С в 75%-ной СТ^СООН, были выделены в индивидуальном по ТСХ состоянии колоночной хроматографией на оиликягелп и охарактеризованы данными элементного анализа и спектральными методами.

Ме. .СОН

(35) Е =1>-А1в

(37) Я »Ъ-С1и

(38) Я -Ь-Ьеи

(39) Я =Ь-11е

(40) Я -Ъ-ШЬ

(41) И =Ь-Уа1

(42) И =1г-РПе

(43) Я =1г-Рго

(44) Я =Ь-Туг

Ме

(45) Я =Иу-Ь-Ьеи

(46) Я =Ь-А1а-01у

(47) Я =Ь-УаЮВг1

6н

(31-47)

3. Конденсация с использованием Ц-гидроксифталимида -дициклогекс-илкврбодиимида

Кроме нуклеофоьных агентов (НОВг, НбЗи), в качестве добавок к карбодаимиду в гликопепгидаом синтезе применяется ряд других

N-оксисоединекий-производных гидроксамовой кислоты.

Для изучения юс реакционкоспособности и пригодности примени • тельно к синтезу гликопептидов ГК, был выбран N-гидроксифталимид (HOPht), вследствие его структурного сходства с HOSu и HOBt.

Синтез гликопептидов ГК с применением HOPht - ДСС проводился в условиях, аналогичных конденсации гликопептидов с вфирами аминокислот при использовании HOSu - ДСС и HOBt - ДСС -методов. Активированный трис-оксифталимидный эфир ГК, полученный путем обработки глицирризиновой кислоты HOPht и ДСС, подвергался взаимодействию с трет-бутиловыми и бензиловыми афирами Ь-аминокислот и дипептидов, получаемыми in situ из соответствующих солей в присутствии Et3N. Время образования активированного штермедиата 4-5 ч, гликопеп-тидной связи - 18 ч.

Установлено, что KOPht пригоден для синтезов гликопептидов ГК и вероятно другие производные гидроксиламика также могут быть использованы для гликопептидаого синтеза на основе ГК.

Однако, выход целевых гликопептидов 15,16,18,20.28-33, в HOFUt - ДСС -методе оказался ниже чем в HOSu - ДСС и HOBt - ДСС методе, что вероятно связано с протеканием побочных процессов и образованием нежелательных продуктов, состав которых не уточнялся.

Способ синтеза с помощью HOPht - ДСС оказался пригодным при использовании для конденсации только трет-бутиловых и бензоловых эфиров аминокислот, устойчивых к действию щелочей, поскольку выделение целевых гликопептидов из реакционной смеси связано с щелочной обработкой водным NaHC03-

Me. .COR

¡0 (Активированный

Л_о_ оксиФталими-Шшй эфир ГК)

01 (Активированный 1 01 пентахлор<1ениловнй 01 S4SIP ГК)

4. Конденсация с использованием тонтахлорфенола -

*

Н,Н - дициклогексилкарбодиимида

В качестве ацилирукчцих агентов для синтеза гликопептидов ГК были использованы замещенные фениловые эфира ГК, содержащие сильные электроакценторнне группы (С1, 1).

Активированный пентахлорфениловый эфир ГК, полученный при обработке гликозида пентахлорфе колом (РсрОК) в присутствии ДСС в диоксане, использован в реакции конденсации с гидрохлоридами трзт-бутиловых эфиров Ь-вминокислог в присутствии избытка Е1;3М. Выход целевых защищенных гликопептадов ГК (14,16,18-20), синтезированных этим способом после очистки переосавдеюгем из хлорофор-ма-мэтакола (5:1) эфиром, составил 77-88%.

Активированный пентахлорфениловый эфир ГК оказался пригодным для конденсации только с трет-бутюговыми эфирами Ь-аминокис-лот, что объясняется пространственным экранированием, обусловленным наличием двух заместителей в орто-положении.

5. Конденсация с помощью комплекса f

5.1. Синтез карбокси-завдщенннх гликопептидов

Для активации карбоксильных групп бил применен комплекс Г .

Активированный трис-пентафторфениловый интермедиат,полученный обработкой ГК комлексом Р в диоксане или ДМФА$ использовался для ац!Шф0вания трет-бутиловых и бензиловых эфиров Ь-аминокислот и пептидов в присутствии небольшого избытка Е^Л. Выход кврбокси-эанрпценных гликопептидов (15,16,18,28), после очистки переосаждэ-нием из хлороформа-метанола (5:1) афгром составил 75-92%.

Использование комплекса Р приводит к сокращению времени обра-разования активированного эфира до 4 ч. Однако, для аминолиза оказались предпочтительными только трет-бутиловые эфиры аминокислот.

5.2. Синтез'свободных тритерпшовых гликопептидов с

использованием принципа "минимальной защиты"

Синтез свободных тригарпеновых гликопептидов является актуальным для получения водорастворимых инъекционных форм, пригодных для биологических испытаний, тек как кзрбсксизааденнка глжопзктйдн ГК

оказались kg раогаорцшш о водо. Осиошым нидостатком ыгиояргои»;«:. ных способов синтеза гликотютдов ГК являете« иснояьзоъыш ю к:>-чэство аминокомпоиентов сложных эфиров аминокислот и датшгидои, ьс торыэ ведут к получению карооксизаодицвишх гликопептидов IK и требует применения, дополнительной стадии их. деблокирования.

Схема 2

ГК +

f,io. .СОЯ

0,1 R NaOH

ВКК,*К01, Et0U

—>

Комплекс i

Активированный пентафторфвниловый эфир ГК

>C0Ri

(48-53)

(43) Н1=Ь-Тге

(49) Н^Х-Ггу

(50) E1=Gly-L-Val

(51) E1=Gly-L-Asn

(52) Rt=Gly-Ir-Pto

(53) E1=ß-Ala-ß-Ala

Поэтому разработан новый упрощенный экономичный способ сентэ-

за свободных тритерпвнавых глнкопептвдов с использованием прияш-па "канишлыгой защити" карооксигрупп ажагакомпонента, исклэчаюпиЛ процесс двблокироваштя.

Для времонноЛ защити СОСН-групп актаюкислот и пептидов попользовались их натриевые соли, полученные при обработке аминоком-понентз раствором КаОН, которые вводились в реакцию конденсация с активированным трис-пентафгорфэвиювшл эфиром ГК.

Способ синтеза с использованием принципа "минимальной заиитв** позволяет получать свободнш трптерпеновые гликопептиды 36,37,39-41, 45,48-53 с хорошим БНТ.ОДОИ (52,5-91«) по упрощенной технологи:.

Обработкой свободных гллкопептидов (15,36-38,40-42) водко-кэта-нолькшд раствором Ма2С03 получены водорастворимые натриевно соли, пригодные для изготовление шъекциошш: £юрм.

Сравнительная оценка оптической чистоты гликопепткдов глицирркзиновой гаыгагц, полученных различными метода??:?

Для сравгсдальноЯ оценки оптической чистоты активированзк" эфиров ГК, полученных различными способам;!, проведен синтоз глтгко-пептида (9), содержащего оптически неактивный этиловый эфир глпик-на с применением различных, методов конденсации (НОВЬ - ДСС, НОРМ -ДСС, РсрОН - ДОС, НОБи - ДСС).

При использовании различных способов активации карбоксильных групп ГК, степень оптической частоты продуктов различается на +3 что находится в пределах ошибки измерения.

Таблица

Гл1'ии<.<>куч чистота микои'чплдэ (Э), СОД«?ркя!е'?ГО фр^ГМ'ЖТ С <¿031

Метод синтеза Оптическое вращение £а]|°, °(с 0.04,СНзОН) Метод синтеза Оптическое вращение Са]|°, °(с О.04,СНз0Н)

Стандарт* НОВИ - ДСС НОБи - ДСС +45,4 +45,0 1-48,4 КОРШ; -ДСС РсрОН -ДСС +42,0 +42,4

"стандартный аналитически чистый образец получен НОБи - ДСО методом н выделен колоночной хроматографией на сшмкагеле.

Продукт, полученный при использовании НОВг - ДСС метода, имеет

наиболее высокую степень оптической чистоты, практически совпадающую со стандартным образцом. Оптическая чистота гликопептидов ГК зависит от наличия примесей и побочных продуктов реакции.

7. Синтез гликопептидов мономегилового эфира

глицирризиновой кислоты Осуществлен синтез гликопептидов второго структурного типа-про-изводннх (ЫМЭ ГК), содержащих по два аминокислотных или пептидных фрагмента, связанных амидной связью с дяглюкуронидной частью молекулы ГК. Синтетические гликопепгиды МЮ ГК, моделирующие амидный тш связи ряда природных гдикопротеинов, представляют интерес в плане получения нового класса иммунорегулирукщих биологически активных веществ.

Осуществлена конденсация ММЭ ГК без предварительной защиты гидрокси-групп углеводной части с эфирами аминокислот или пептидов, защищенными с С-конца, при использовании реагента Вудворда К,

ДСС-метода или метода активированных эфиров. ■

схем А 3.

Ме,

СООН

РООСН3

Ре актив Вудворда. ДСС-метод, ч. Н(

НОБи - ДОС, НОВ« - ДСС,

Е-Ж,, Е^И

№ ММЭ ГК

(54) Й=Ь-1еиОЫе ■

(55) Й=Ь-А1аОМе

(56) 11=1г-С1и

(57) Й=Ь-А1а-Ь-С1и(ОЫе),

ООСНд

(54-62)

(58) К=Ь-А1а-Б-С1и(0Ме)2

(59) Н=С1у-Ь-ЬеиОМ0

(60) Н=р-А1а-ИуОМ9

(61) Н=Ь-А1а-В-С1и

(62) Й=Ь-Л1а-£-СВг-Т,-г,1п(изо)-1-Ц'2 (0!.!с) Гликопептиды ШЭ ГК 54-56, содержащие фрагменты ашшокислот,

были синтезированы ДСС-методом. В качестве аминокомпош'нтов исполь-

зовались метиловые и бензиловые эфиры L-аминокислог. Конденсация •проводилась в присутствии избытка основания с выходом 64,2-85,7%.

Структура синтезированных соединений подтверждена данными элементного анализа, ИК-.УФ-, ЯМР13С-спектрами.

Гликопептиды ММЭ ГК 57-62, содержащие пептидные цепи, которые входят всостав МДП и его иммуноактивных аналогов, можно рассматривать как глицирризил-аналоги МДП, обладающие низкой токсичностью..

Синтез пептидных производных ММЭ ГК осуществлялся фрагмвнт-ной конденсацией с помощью реактива Вудворда К, ДСС-методом или методом активированных эфиров (HOSu - ДСС, HOBt - ДОС). Для конденсации с ММЭ ГК использовались метиловые и бензиловые эфиры ди-и трипептидов, получаемые In situ из их солей в присутствии основания Et3N.

Выход карбоксизащиденных пептидных производных ММЭ ГК составил 38,6-88,7S. Хроматографически гомогенные продукты выделены в индивидуальном состоянии колоночной хроматографией на сшшкагеле и охарактеризованы данными элементного анализа, ИК-,УФ-,ЯМР13С-спектрами.

8. Спектры ЯМР13С гликопептидов глицирризиновой кислоты

Отнесение резонансных сигналов в спектрах гликопептидов сделано на основании литературных данных для агликона, самого глико- . зида, аминокислотных фрагментов и сопоставления значений химических сдеигов в рядах соединений.

Химические сдвиги сигналов атомов С углеводной и аглмконовой части молекул исследованных гликопептидов ГК (36-44) аналогичны спектрам ЯМР13С исходного гликозида-ГК и его агликона - (З-глицерре-товой кислоты. Сигналы аномерннх С-1 и 0-1 атомов углеводной цепи обнаруживаются в области слабого поля при 6 104-106 м.д. Введение аминокислотных фрагментов в молекулу гликозвда приводит к появлению дополнительного набора сигналов карбонилов СООК-грушы в области 173-178 м.д. ф-СЩ,), 52-56-м.д. (а-СН). Алкильные цепи сложноэфирных групп в соединениях 6-8,10,13,14,21-26 дают дополнительные группы сигналов (СНд- и СЬ^-) в области сильного поля. Сигналы углеводов слохноэфирных СНд-групп обнаруживаются в области 52-53 м.д.

Спектры гликопептидов (25,43,44) содержат в области слабого-поля дополнительные сигналы ароматических атомов углерода в об-

ласти 128-130, 137-139 м.д., указывающие на присутствие ароматической аминокислоты в молекуле ГК.

Химические сдвиги спектров ЯМР13С гликопептидов ММЭ ГК аналогичны спектрам гликопептидов ГК.

В спектрах ЯМР13С гликопептидов ММЭ ГК 54-61 карбонильный атом углерода (С30) обнаруживается при 176-178 м.д. Сигнал С31сло*но-эфирной группы СООСНд имеет значение химического сдвига 52,7-53,2 м.д. Сигналы углеродов С=0-групп концавых аминокислотных остатков (СООСНд) пептидных цепей идентифицируются в области 172-174,5 м.д., СОШ-групп пептидных цепей -в области 169-174 м.д. В большинстве спектров гликопептидов ММЭ ГК в этой области можно выделить одну или две группы из двух и более сигналов, внутри которых идентификация сигналов практически невозможна. Полноо отнесение сигналов в спектрах ЯМР13С пептидных производных ММЭ ГК (57-61), содержащих по два аминокислотных остатка, затруднено из-за большого количества углеродных атомов, поэтому соотнесение сигналов в пептидных фрагментах можно рассматривать лишь Как условное.

29 30

9. Биологическая активность гликопептидов глицирризиновой кислоты

Фармакологические свойства гликопептидов ГК изучались в лаборатории новых лекарственных средств ИОХ УЩ РАН и в отделе культивирования и диагностики ретровирусов НПО "Вектор" (г.Новосибирск,

пос.Кольцово).

Испытанные соединения на основании Постановления Госкомитета стандартов СМ СССР от 20 марта 1976 Н 579 относятся к 111-1У классу умеренно-опасных веществ.

О влиянии гликопептидов на иммунный статус организма судили по изменении первичного иммунного ответа (выработка антителообра-зувдих клеток ЦОК) ) и клеточного иммунитета (тест гиперчувстви-. тельности замедленного типа (ГЗТ)).

Иммуностимулирующая активность гликопептидов 40,42 в 1,5-3,5 раза более выражена чем у МДП в выработке АОК. Соединения 23,24,27 стимулируют клеточно опосредованную реакцию организма в 2-5 раз эффективнее МДП в тесте ГЗТ в концентрации 2-5 мг/кг. Гликопептид 61 эффективно стимулирует клеточно-опосредованную реакцию организма в тесте ГЗТ.Более перспективными в качестве иммуностимуляторов оказались соединения 23,24, стимулирующие антителогенез аналогично или эффективнее известных иммуностимуляторов - ЫДП и Т-активина. В отличии от МДП,производные ГН менее токсичны.

Высокая иммуностимулирующая активность ряда соединений сочетается с ПВ и ПЯ действием, не уступающим шрокоприменяемым в медицине антифлогишстикам - преднизолону и вольтарену. В отличие от последних гликопептида ГК менее токсичны.

Исследована анти-ВИЧ активность гликопептидов 14,23,24 на модели первичноинфицированных ВИЧ-1 лимфоиданх клеток МТ-4 и хронически инфицированных ВИЧ-1моноцитах человека 1Г-937. Об ингибирова-нии репродукции ВИЧ 'в клетках судили по снижению обратной транс-криптазы и снижению накопления вирусного антитела.

Установлено, что исследованные гликопептида эффективно инги-бируют (95-99%) репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4 в концентрациях от 100 до 1000 мкг/мл. По уровню выявленной антивирусной активности производные ГК не уступают известному анти-СПИД препа-рату-азидотимидину и не токсичны для культуры клеток.

Выявлено, что гликопептид (14) имеет самый высокий эффект (93,5-93,8Ж) ингибирования вирусного антигена в концентрации 250 и 500 мкг/мл. Установлено, что модификация аминокислотных остатков приводит к усилению анти-ВИЧ активности на модели первичной инфекции.

Гликопептида ГК 23,24 являются более эффективными ингибиторами ВИЧ-1 на модели хронической инфекции по сравнению с азидо-

тимидином.

Изучение биологической активности гликопептидов ГК показало, что введение аминокислотных, и пептидных фрагментов в молекулу гли-цирризиновой кислоты с целью поиска и создания новых малотоксичных иммуностимулирующих и анти-ВИЧ средств является вполне оправданным. Ряд синтезированных соединений представляют интерес для медицины в качестве потенциальных высокоэффективных иммуностимуляторов и ингибиторов размножения вируса иммунодефицита человека.

ВЫВОДЫ

1. Проведены химические трансформации глицирризиновой кислоты по карбоксильным группам с введением аминокислотных и пептидных фрагментов в углеводную и гениновую части молекулы, в результате которых синтезированы новые биологически активные вещества, перспективные для применения в медицине.

2. Разработаны новые метода конденсации гликозида без предварительной защиты гидроксильных групп с эфирами аминокислот и дштаптидов, базирующиеся на активации карбоксильных груш ГК с использованием КГ-гидроксибензотриазола - И.И -дициклогексилкарбоди-кмида, И-гидроксифталимида - N,11 -дициклогексилкарбодиимида, нен-тахлорфенола - Н.Ы -дициклогексилкарбодиимида, комплекса Р, с применением различных защитных групп для С-конца аминокомпонента.

3. Предложен новый селективный способ получения карбоксиза-щищенных гликопептидов ГК методом активированных (оксибензотриа-зольшх) эфиров, позволяющий получать целевые соединения с высоким выходом и пригодный для проведения укрупненных синтезов.

4. Разработан технологичный метод синтеза гликопептидов,содержащих фрагменты свободных аминокислот или дипептидов с использованием принципа "минимальной защиты". Свободные гликогоптиды применены для создания водорастворимые инъекционных форм.

5. Осуществлен синтез гликопептидов монометилового эфира ГК, содержащих аминокислотные и пептидные фрагменты иммуноактивных аналогов известного иммуностимулятора -М-ацегилмурамклдипептида.

6. Проведены фармакологические испытания рада синтезированных соедкнекнй. Среди них обнаружены вещества,спшулируыцне первичный иммунный ответ (тест ГЗТ) аналогичноили эффективнее МДП. В отличии от последнего производные ГК менее токсичны.

7. Впервые установлена способность гликопептидов ПС ингибиро-вать репродукцию ВИЧ-I в культуре клеток НТ—1 эффективнее азидоти-кидгаю. Гликолептиды ГК перспективны для применения в медицине, как малотсксичнш эффективные препараты для борьбы с ВИЧ-инфокцней .

Основные результаты йиссертащш изложены в следующих публикациях:

1. Л.А. Балтика, С.Л.Зиновьева, Г.М.Сахаутдинова, А.Г.Покровский, О.А.Нлясунсьа, Г.А.Толстяков. Гликопопкды глицярризиновой кислоты-новый класс иммуностимуляторов и анти-ЕИЧ агентов.//Тезисы докладов Всесоюзной конференции. "Химия природных нлзксмолекулярных биорегуляторов". Ереван, 1990, с.84.

2. "Л.А. Балиша, С.Л.Зиновьева, Г.М.Сахаутдакова, Ф.С.Зару-

Г.А.Толстгкоб. Синтез новых гликопептидов ¡З-глнцирризинозо^

клслохв. Цммуномоделируккцие свойства.//Гегиси докладов республи-к'.яской 1сон1теренц;а1."СоЕр-з;.'е!п;чо проблемы статэза биологически "■'ЛТКВИЯХ. B0R9CTB Я СЯ0Т9Х1ЮЛ0ГНИ" .Уфз, 1900, с.16.

3. р.АЛ'с.теткков, Л.А.Бзл-йка, С.Л.Ип.ово, А.Г.ЕокроЕскхЗ, О.Д.Пляс/нова, ЮЛ1.М7ринов, Л.С.Сендзхчиев. Разработка новых с..-.'дстз для борьбы с ЕмЧ-жфккцией на оснснэ гяширргскновой кп-сг«и.//Тезвси докладов IV Всесоюзного с;з?лозяука "Лзучениэ л мс-пэ.:ьэовзиз0 солодки в СССР".Л_-ма-Ата, 19?!. с.160-151.

'*,, G.A.ro]stl>-.o7, L.A.B'iltlna, S.Л.Sjreshova, Yu.IJlurinov, A.G.I-okrovcky, О.А.Нувзчшуа, L.S.SaiuMhtchiev. Eorielq::;<;nt of тл-я antl-HlVagentc tissd on glycyrrhisio scid.//Ab3trs3t of International conference on molecular biology aspects oA <Иг»яюз-tic3 and therapy oi AIES. 'TovoalbiralcJJSSA, 19015, p.14,

5. Д.А.Балтика, C.A.Fi;:.«Ba, В.В.Васильззо, ЛЛЬКспгяа, Г.А. Toicthkob. Трзнсформавш глицарргкновоЗ гаслоru. IV. го:;;Л1 способ получения карбокся-зашдавццх гл«ко!1впгядов.//К.сбз;.х;»зш, 1 £93, Т.6-3, U 9, с.2140-2147.

G. Л.А.Зэлтета, С.Л.Рыкова, Е.В.Еасшь&ва, Г.А.Толстикоз. Трансформации гжццрризгаювой кислстн.ГЛСннтез траторпововях г.^лкопепгидов.//й;ооргашгч.ггажл, 1994, т.20, iJ 1, с.55-62.

V. С.Л.Рыжова, Л,Л.Болтам, С.А.йшовьева.Новый синтез тхя-копептидов г.тициррнгчгновой кислоты и их биологическая активность. //Тезисы докладов наушга-топппеской кокфэретдш студентов, аспирантов и молодых учопнх.Уфэ, 1994, с.25.

Сожямм» С.А.Р^ова